Tekniker för att generera ett bibliotek med korta peptider som kan aktivera mastceller via MRGPRX2-receptorn beskrivs. Associerade tekniker är enkla, billiga och kan utökas till andra cellreceptorer.
Att identifiera ligands som är specifika för terapeutiskt signifikanta cellreceptorer är avgörande för många tillämpningar, inklusive design och utveckling av nya terapier. Masrelaterad G-proteinreceptor-X2 (MRGPRX2) är en viktig receptor som reglerar mastcellsaktivering och därmed styr det allmänna immunsvaret. Många ligands för MRGPRX2 har identifierats och inkluderar endogena peptider som PAMPs, defensins, LL-37 och andra proteinfragment (dvs. försämrat albumin). Ytterligare identifiering av MRGPRX2 specifika ligands kräver screening av ett stort antal peptider (dvs. peptidbibliotek); Mastceller är dock svåra och dyra att upprätthålla in vitro och därför inte ekonomiska att använda för screening av ett stort antal molekyler. Det nuvarande dokumentet visar en metod för att designa, utveckla och screena ett bibliotek med små peptidmolekyler med MRGPRX2 som uttrycker HEK-celler. Denna cellinje är relativt enkel och billig att underhålla och kan användas för in vitro-analys med hög genomströmning. Ett kalciumkänsligt Fura-2 fluorescerande färgämne för att markera intracellulärt kalciumflöde vid aktivering användes för att övervaka aktiveringen. Förhållandet mellan fluorescensintensiteten hos Fura-2 vid 510 nm mot excitation våglängder på 340 och 380 nm användes för att beräkna kalciumkoncentrationen. Peptidbiblioteket som används för att verifiera detta system baserades på den endogena proadrenomedullin N-terminal 12 (PAMP-12) secretagogue, som är känd för att binda MRGPRX2 med hög specificitet och affinitet. Efterföljande peptider genererades genom aminosyra trunkering och alanin skanning tekniker tillämpas på PAMP-12. Metoden som beskrivs här är enkel och billig men ändå robust för screening av ett stort bibliotek av föreningar för att identifiera bindande domäner och andra viktiga parametrar som spelar en viktig roll i receptoraktivering.
Mastceller är en integrerad del av immunsystemet och spelar en avgörande roll i både medfödda och adaptiva immunsvar. Mastceller aktiveras främst antingen genom bindning av ett antigen till immunglobulinet E (IgE) – FcεRI-receptorkomplexet eller av den nyligen upptäckta masrelaterade G-proteinreceptorn-X2 (MRGPRX2)1. MRGPRX2 aktivering har kopplats till flera immuna och inflammatoriska sjukdomar, och därför är det viktigt att förstå receptorns bindande mekanism till dess ligands2. För att göra det utvecklades ett bibliotek med små peptidmolekyler och screenades mot MRGPRX2-receptorer som var överuttryckta i HEK-celler. I studien konstruerades peptidbiblioteket med hjälp av de enkla och mångsidiga teknikerna för alaninskanning och aminosyra trunkering. Alaninskanning innebär att ersätta specifika aminosyror med en alanin rester. Alanin är liten och neutral, tar bort peptiden av de specifika egenskaper som de ersatta resterna ger och belyser i följd betydelsen av aminosyrans respektive fysiokemiska egenskaper i receptorinteraktioner. Tvärtom, i aminosyra trunkering, peptidsekvenser är utformade så att det saknar en eller flera aminosyrarester från N-terminalen, C-terminalen eller båda. Denna uppsättning peptider användes för att identifiera aminosyra sekvenser avgörande för MRGPRX2 bindning.
Erfarenhet av mänskliga mastceller linjer (LAD-2) har visat att dessa celler är svåra att odla och upprätthålla in vitro:en fördubblingstid på två veckor, dyra medelstora kosttillskott, och direkt uppmärksamhet krävs under passaging3. Dessa attribut gör cellerna olämpliga för storskalig screening av potentiella ligands. Häri användes stabilt transfected HEK celler uttrycker MRGPRX2 receptor (HEK-X2) för att screena peptidbiblioteket1. HEK-293 celler används ofta och studeras för heterologa uttryck av ytreceptorer på grund av deras höga transfection effektivitet, snabbare fördubbling hastighet och behovet av icke-dyra medelstora kosttillskott att odlas i laboratorium4. Protokollet för att transfekt hek-293 cellinje har visats och är väletablerat5. HEK-293 celler stabilt uttrycker MRGPRX2 receptor (passage 13-19) aktiverades med peptider genereras genom N-trunkering, C-trunkering, N +C-trunkering och alanin skanning1. Vilda HEK-celler (HEK-WT) (passage 16-21) användes som kontroll. Intracellulär kalciumfrisättning vid aktivering övervakades för att studera MRGPRX2-baserad aktivering.
Cellaktivering av MRGPRX2 följs av en cytosolisk kalciummobilisering. Denna reglerade intracellulära kalciumfrisättning i mastceller regleras av den butiksdrivna kalciumposten (SOCE), samordnad av den stromala interaktionsmolekylen 1 (Stim1); och är centralt för immunsvarskaskaden6,7. Olika metoder har använts för att upptäcka intracellulär kalciumkoncentration, inklusive patchklämmor och fluorescerande färgämnen8. Av alla tillgängliga tekniker används fluormetriska kalciumfärgämnen vid konjugation med olika detektionstekniker i stor utsträckning9. Två typer av fluorometriska färgämnen som har fått intressen är nämligen envågiga färgämnen som Fluo-4 och dubbla våglängdsförhållanden som Indo -1 och Fura-2. Fördelen med att dubbla våglängds ratiometriska färgämnen ger över envåglängdsfärgämnen är att ratiometriska färgämnen korrekt för experimentella fel som färgbelastning, fotoblekning ochfokusering 10,11.
Fura-2 acetoxymethyl ester (Fura-2 AM) är en cell genomträngande, grön-fluorescerande färgämne vars excitation skiftar till en lägre våglängd vid kalciumbindning. Experimentellt är Fura-2 upphetsad på 340 och 380 nm, medan utsläppet registreras vid 510 nm. Vid kalciumbindning ökar fluorescerande intensitet vid 340 nm medan den på 380 nm minskar, vilket visas i figur 1. Data representeras som ett förhållande mellan fluorescensintensitet efter excitation vid 340 nm (F340) och intensiteten efter excitation vid 380 nm (F380), dvs. F340/F380. F340/F380-förhållandet är proportionellt mot intracellulärt kalcium, vars värde kan beräknas med Grynkiewicz ekvation12. Eftersom fluorescenssignalen erhålls från excitationen av färgämnet vid två våglängder (340 nm och 380 nm), korrigerar förhållandet mellan fluorescenssignalerna för experimentella faktorer som färgbelastning, färgläckage, fotoblekning och celltäthet.
Kalciumsignalering är centralt för mastcellsdegranulering och har använts i stor utsträckning i studien av receptor-ligand interaktioner, ligand identifiering och läkemedelsupptäckt14. MRGPRX2 är en nyligen upptäckt mastcellsreceptor som har visat sig spela en nyckelroll i många inflammatoriska sjukdomar som kliande, astma och atopisk dermatit, blandandra 2. Dessutom har flera godkända läkemedel visat sig framkalla ett inflammatoriskt svar genom MRGPRX2-receptorn…
The authors have nothing to disclose.
SR och LDU vill uppmärksamma Alberta Innovates strategic research project, NRC och NSERC-Discovery grant för detta projekt.
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal – acetyl group C terminal – amide group |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |