Summary

Screeningpeptider som aktiverar MRGPRX2 med hjälp av konstruerade HEK-celler

Published: November 06, 2021
doi:

Summary

Tekniker för att generera ett bibliotek med korta peptider som kan aktivera mastceller via MRGPRX2-receptorn beskrivs. Associerade tekniker är enkla, billiga och kan utökas till andra cellreceptorer.

Abstract

Att identifiera ligands som är specifika för terapeutiskt signifikanta cellreceptorer är avgörande för många tillämpningar, inklusive design och utveckling av nya terapier. Masrelaterad G-proteinreceptor-X2 (MRGPRX2) är en viktig receptor som reglerar mastcellsaktivering och därmed styr det allmänna immunsvaret. Många ligands för MRGPRX2 har identifierats och inkluderar endogena peptider som PAMPs, defensins, LL-37 och andra proteinfragment (dvs. försämrat albumin). Ytterligare identifiering av MRGPRX2 specifika ligands kräver screening av ett stort antal peptider (dvs. peptidbibliotek); Mastceller är dock svåra och dyra att upprätthålla in vitro och därför inte ekonomiska att använda för screening av ett stort antal molekyler. Det nuvarande dokumentet visar en metod för att designa, utveckla och screena ett bibliotek med små peptidmolekyler med MRGPRX2 som uttrycker HEK-celler. Denna cellinje är relativt enkel och billig att underhålla och kan användas för in vitro-analys med hög genomströmning. Ett kalciumkänsligt Fura-2 fluorescerande färgämne för att markera intracellulärt kalciumflöde vid aktivering användes för att övervaka aktiveringen. Förhållandet mellan fluorescensintensiteten hos Fura-2 vid 510 nm mot excitation våglängder på 340 och 380 nm användes för att beräkna kalciumkoncentrationen. Peptidbiblioteket som används för att verifiera detta system baserades på den endogena proadrenomedullin N-terminal 12 (PAMP-12) secretagogue, som är känd för att binda MRGPRX2 med hög specificitet och affinitet. Efterföljande peptider genererades genom aminosyra trunkering och alanin skanning tekniker tillämpas på PAMP-12. Metoden som beskrivs här är enkel och billig men ändå robust för screening av ett stort bibliotek av föreningar för att identifiera bindande domäner och andra viktiga parametrar som spelar en viktig roll i receptoraktivering.

Introduction

Mastceller är en integrerad del av immunsystemet och spelar en avgörande roll i både medfödda och adaptiva immunsvar. Mastceller aktiveras främst antingen genom bindning av ett antigen till immunglobulinet E (IgE) – FcεRI-receptorkomplexet eller av den nyligen upptäckta masrelaterade G-proteinreceptorn-X2 (MRGPRX2)1. MRGPRX2 aktivering har kopplats till flera immuna och inflammatoriska sjukdomar, och därför är det viktigt att förstå receptorns bindande mekanism till dess ligands2. För att göra det utvecklades ett bibliotek med små peptidmolekyler och screenades mot MRGPRX2-receptorer som var överuttryckta i HEK-celler. I studien konstruerades peptidbiblioteket med hjälp av de enkla och mångsidiga teknikerna för alaninskanning och aminosyra trunkering. Alaninskanning innebär att ersätta specifika aminosyror med en alanin rester. Alanin är liten och neutral, tar bort peptiden av de specifika egenskaper som de ersatta resterna ger och belyser i följd betydelsen av aminosyrans respektive fysiokemiska egenskaper i receptorinteraktioner. Tvärtom, i aminosyra trunkering, peptidsekvenser är utformade så att det saknar en eller flera aminosyrarester från N-terminalen, C-terminalen eller båda. Denna uppsättning peptider användes för att identifiera aminosyra sekvenser avgörande för MRGPRX2 bindning.

Erfarenhet av mänskliga mastceller linjer (LAD-2) har visat att dessa celler är svåra att odla och upprätthålla in vitro:en fördubblingstid på två veckor, dyra medelstora kosttillskott, och direkt uppmärksamhet krävs under passaging3. Dessa attribut gör cellerna olämpliga för storskalig screening av potentiella ligands. Häri användes stabilt transfected HEK celler uttrycker MRGPRX2 receptor (HEK-X2) för att screena peptidbiblioteket1. HEK-293 celler används ofta och studeras för heterologa uttryck av ytreceptorer på grund av deras höga transfection effektivitet, snabbare fördubbling hastighet och behovet av icke-dyra medelstora kosttillskott att odlas i laboratorium4. Protokollet för att transfekt hek-293 cellinje har visats och är väletablerat5. HEK-293 celler stabilt uttrycker MRGPRX2 receptor (passage 13-19) aktiverades med peptider genereras genom N-trunkering, C-trunkering, N +C-trunkering och alanin skanning1. Vilda HEK-celler (HEK-WT) (passage 16-21) användes som kontroll. Intracellulär kalciumfrisättning vid aktivering övervakades för att studera MRGPRX2-baserad aktivering.

Cellaktivering av MRGPRX2 följs av en cytosolisk kalciummobilisering. Denna reglerade intracellulära kalciumfrisättning i mastceller regleras av den butiksdrivna kalciumposten (SOCE), samordnad av den stromala interaktionsmolekylen 1 (Stim1); och är centralt för immunsvarskaskaden6,7. Olika metoder har använts för att upptäcka intracellulär kalciumkoncentration, inklusive patchklämmor och fluorescerande färgämnen8. Av alla tillgängliga tekniker används fluormetriska kalciumfärgämnen vid konjugation med olika detektionstekniker i stor utsträckning9. Två typer av fluorometriska färgämnen som har fått intressen är nämligen envågiga färgämnen som Fluo-4 och dubbla våglängdsförhållanden som Indo -1 och Fura-2. Fördelen med att dubbla våglängds ratiometriska färgämnen ger över envåglängdsfärgämnen är att ratiometriska färgämnen korrekt för experimentella fel som färgbelastning, fotoblekning ochfokusering 10,11.

Fura-2 acetoxymethyl ester (Fura-2 AM) är en cell genomträngande, grön-fluorescerande färgämne vars excitation skiftar till en lägre våglängd vid kalciumbindning. Experimentellt är Fura-2 upphetsad på 340 och 380 nm, medan utsläppet registreras vid 510 nm. Vid kalciumbindning ökar fluorescerande intensitet vid 340 nm medan den på 380 nm minskar, vilket visas i figur 1. Data representeras som ett förhållande mellan fluorescensintensitet efter excitation vid 340 nm (F340) och intensiteten efter excitation vid 380 nm (F380), dvs. F340/F380. F340/F380-förhållandet är proportionellt mot intracellulärt kalcium, vars värde kan beräknas med Grynkiewicz ekvation12. Eftersom fluorescenssignalen erhålls från excitationen av färgämnet vid två våglängder (340 nm och 380 nm), korrigerar förhållandet mellan fluorescenssignalerna för experimentella faktorer som färgbelastning, färgläckage, fotoblekning och celltäthet.

Protocol

1. Design och utveckling av peptidbibliotek För att identifiera liganderna i mastcellen MRGPRX2-receptorn baserat på en känd ligand, dvs PAMP-1213, följ stegen nedan. Generera N-trunkerade peptidbibliotek genom att trunkera N-terminala aminosyraresterna i ligand, i följd, genom fast faspeptidsyntes (SPPS). Generera C-trunkerade peptidbibliotek genom att trunkera C-terminala aminosyraresterna i den kända ligand, i följd, av SPPS. Baser…

Representative Results

Tabell 1 innehåller de peptidsekvenser som genereras genom terminal aminosyra trunkering och alanin skanning. Som visas i tabell 1saknar peptidsekvensen RKKWNKWALSR N-terminal fenylalanin (F) med avseende på sin förälder PAMP-12 och är därför en representativ peptid i N-trunkerat bibliotek. På samma sätt, i FRKKWNKWALS, PAMP-12 C-terminal serin har tagits bort, representerar ett C-trunkerat peptidbibliotek som härrör från PAMP-12. I N+C-trunkerat peptidbibliotek avlägsnas am…

Discussion

Kalciumsignalering är centralt för mastcellsdegranulering och har använts i stor utsträckning i studien av receptor-ligand interaktioner, ligand identifiering och läkemedelsupptäckt14. MRGPRX2 är en nyligen upptäckt mastcellsreceptor som har visat sig spela en nyckelroll i många inflammatoriska sjukdomar som kliande, astma och atopisk dermatit, blandandra 2. Dessutom har flera godkända läkemedel visat sig framkalla ett inflammatoriskt svar genom MRGPRX2-receptorn…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SR och LDU vill uppmärksamma Alberta Innovates strategic research project, NRC och NSERC-Discovery grant för detta projekt.

Materials

Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich 5470
Calcium Chloride Sigma Aldrich 793939
Corning 96 Well Sigma Aldrich CLS3603
Black Polystyrene Microplate Sigma Aldrich CLS3603
DMEM Thermo Fischer 11995065 High Glucose
DMSO Thermo Fischer D12345 Sterile, biological grade
EGTA Sigma Aldrich E3889
Fetal Bovine Serum Thermo Fischer 12483-020
Flexstation 3 Molecular devices FV06060
Fura-2 AM Thermo Fischer F1221
Glucose Sigma Aldrich D8270
HEPES buffer Thermo Fischer 15630-080
Ionomycin Sigma Aldrich I9657
L Glutamine Thermo Fischer 25030-081
Pen Strep Thermo Fischer 15140122
Peptides RS Syntehsis Custom ≥95% pure;
N terminal – acetyl group
C terminal – amide group
Potassium Chloride Sigma Aldrich 12636
Sodium Chloride Sigma Aldrich S9888
TritonX-100 DOW Chemical 166704

References

  1. McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
  2. Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).
  3. Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. , (2010).
  4. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  5. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568 (2015).
  6. Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143 (2020).
  7. Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).
  8. Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).
  9. Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10 (4), 0122527 (2015).
  10. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  11. Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).
  12. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  13. Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).
  14. Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).
  15. Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8 (1), 11628 (2018).
  16. Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. , 163-172 (2019).
  17. Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).

Play Video

Cite This Article
Raj, S., Lu, L., Unsworth, L. D. Screening Peptides that Activate MRGPRX2 using Engineered HEK Cells. J. Vis. Exp. (177), e62448, doi:10.3791/62448 (2021).

View Video