Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Screeningpeptider som aktiverar MRGPRX2 med hjälp av konstruerade HEK-celler

Published: November 6, 2021 doi: 10.3791/62448

Summary

Tekniker för att generera ett bibliotek med korta peptider som kan aktivera mastceller via MRGPRX2-receptorn beskrivs. Associerade tekniker är enkla, billiga och kan utökas till andra cellreceptorer.

Abstract

Att identifiera ligands som är specifika för terapeutiskt signifikanta cellreceptorer är avgörande för många tillämpningar, inklusive design och utveckling av nya terapier. Masrelaterad G-proteinreceptor-X2 (MRGPRX2) är en viktig receptor som reglerar mastcellsaktivering och därmed styr det allmänna immunsvaret. Många ligands för MRGPRX2 har identifierats och inkluderar endogena peptider som PAMPs, defensins, LL-37 och andra proteinfragment (dvs. försämrat albumin). Ytterligare identifiering av MRGPRX2 specifika ligands kräver screening av ett stort antal peptider (dvs. peptidbibliotek); Mastceller är dock svåra och dyra att upprätthålla in vitro och därför inte ekonomiska att använda för screening av ett stort antal molekyler. Det nuvarande dokumentet visar en metod för att designa, utveckla och screena ett bibliotek med små peptidmolekyler med MRGPRX2 som uttrycker HEK-celler. Denna cellinje är relativt enkel och billig att underhålla och kan användas för in vitro-analys med hög genomströmning. Ett kalciumkänsligt Fura-2 fluorescerande färgämne för att markera intracellulärt kalciumflöde vid aktivering användes för att övervaka aktiveringen. Förhållandet mellan fluorescensintensiteten hos Fura-2 vid 510 nm mot excitation våglängder på 340 och 380 nm användes för att beräkna kalciumkoncentrationen. Peptidbiblioteket som används för att verifiera detta system baserades på den endogena proadrenomedullin N-terminal 12 (PAMP-12) secretagogue, som är känd för att binda MRGPRX2 med hög specificitet och affinitet. Efterföljande peptider genererades genom aminosyra trunkering och alanin skanning tekniker tillämpas på PAMP-12. Metoden som beskrivs här är enkel och billig men ändå robust för screening av ett stort bibliotek av föreningar för att identifiera bindande domäner och andra viktiga parametrar som spelar en viktig roll i receptoraktivering.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mastceller är en integrerad del av immunsystemet och spelar en avgörande roll i både medfödda och adaptiva immunsvar. Mastceller aktiveras främst antingen genom bindning av ett antigen till immunglobulinet E (IgE) - FcεRI-receptorkomplexet eller av den nyligen upptäckta masrelaterade G-proteinreceptorn-X2 (MRGPRX2)1. MRGPRX2 aktivering har kopplats till flera immuna och inflammatoriska sjukdomar, och därför är det viktigt att förstå receptorns bindande mekanism till dess ligands2. För att göra det utvecklades ett bibliotek med små peptidmolekyler och screenades mot MRGPRX2-receptorer som var överuttryckta i HEK-celler. I studien konstruerades peptidbiblioteket med hjälp av de enkla och mångsidiga teknikerna för alaninskanning och aminosyra trunkering. Alaninskanning innebär att ersätta specifika aminosyror med en alanin rester. Alanin är liten och neutral, tar bort peptiden av de specifika egenskaper som de ersatta resterna ger och belyser i följd betydelsen av aminosyrans respektive fysiokemiska egenskaper i receptorinteraktioner. Tvärtom, i aminosyra trunkering, peptidsekvenser är utformade så att det saknar en eller flera aminosyrarester från N-terminalen, C-terminalen eller båda. Denna uppsättning peptider användes för att identifiera aminosyra sekvenser avgörande för MRGPRX2 bindning.

Erfarenhet av mänskliga mastceller linjer (LAD-2) har visat att dessa celler är svåra att odla och upprätthålla in vitro:en fördubblingstid på två veckor, dyra medelstora kosttillskott, och direkt uppmärksamhet krävs under passaging3. Dessa attribut gör cellerna olämpliga för storskalig screening av potentiella ligands. Häri användes stabilt transfected HEK celler uttrycker MRGPRX2 receptor (HEK-X2) för att screena peptidbiblioteket1. HEK-293 celler används ofta och studeras för heterologa uttryck av ytreceptorer på grund av deras höga transfection effektivitet, snabbare fördubbling hastighet och behovet av icke-dyra medelstora kosttillskott att odlas i laboratorium4. Protokollet för att transfekt hek-293 cellinje har visats och är väletablerat5. HEK-293 celler stabilt uttrycker MRGPRX2 receptor (passage 13-19) aktiverades med peptider genereras genom N-trunkering, C-trunkering, N +C-trunkering och alanin skanning1. Vilda HEK-celler (HEK-WT) (passage 16-21) användes som kontroll. Intracellulär kalciumfrisättning vid aktivering övervakades för att studera MRGPRX2-baserad aktivering.

Cellaktivering av MRGPRX2 följs av en cytosolisk kalciummobilisering. Denna reglerade intracellulära kalciumfrisättning i mastceller regleras av den butiksdrivna kalciumposten (SOCE), samordnad av den stromala interaktionsmolekylen 1 (Stim1); och är centralt för immunsvarskaskaden6,7. Olika metoder har använts för att upptäcka intracellulär kalciumkoncentration, inklusive patchklämmor och fluorescerande färgämnen8. Av alla tillgängliga tekniker används fluormetriska kalciumfärgämnen vid konjugation med olika detektionstekniker i stor utsträckning9. Två typer av fluorometriska färgämnen som har fått intressen är nämligen envågiga färgämnen som Fluo-4 och dubbla våglängdsförhållanden som Indo -1 och Fura-2. Fördelen med att dubbla våglängds ratiometriska färgämnen ger över envåglängdsfärgämnen är att ratiometriska färgämnen korrekt för experimentella fel som färgbelastning, fotoblekning ochfokusering 10,11.

Fura-2 acetoxymethyl ester (Fura-2 AM) är en cell genomträngande, grön-fluorescerande färgämne vars excitation skiftar till en lägre våglängd vid kalciumbindning. Experimentellt är Fura-2 upphetsad på 340 och 380 nm, medan utsläppet registreras vid 510 nm. Vid kalciumbindning ökar fluorescerande intensitet vid 340 nm medan den på 380 nm minskar, vilket visas i figur 1. Data representeras som ett förhållande mellan fluorescensintensitet efter excitation vid 340 nm (F340) och intensiteten efter excitation vid 380 nm (F380), dvs. F340/F380. F340/F380-förhållandet är proportionellt mot intracellulärt kalcium, vars värde kan beräknas med Grynkiewicz ekvation12. Eftersom fluorescenssignalen erhålls från excitationen av färgämnet vid två våglängder (340 nm och 380 nm), korrigerar förhållandet mellan fluorescenssignalerna för experimentella faktorer som färgbelastning, färgläckage, fotoblekning och celltäthet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Design och utveckling av peptidbibliotek

  1. För att identifiera liganderna i mastcellen MRGPRX2-receptorn baserat på en känd ligand, dvs PAMP-1213, följ stegen nedan.
    1. Generera N-trunkerade peptidbibliotek genom att trunkera N-terminala aminosyraresterna i ligand, i följd, genom fast faspeptidsyntes (SPPS).
    2. Generera C-trunkerade peptidbibliotek genom att trunkera C-terminala aminosyraresterna i den kända ligand, i följd, av SPPS.
    3. Baserat på resultaten av 1.1.1 och 1.1.2, generera ett N + C-trunkerat peptidbibliotek med hjälp av SPPS genom att trunkera önskade rester från N- respektive C-terminalen.
    4. Använd peptidsyntesen i solidfas för att syntetisera peptiderna13.
    5. Ändra N-terminalen till acetylgruppen (Ac) och C-terminalen till mittgruppen.
    6. Karakterisera peptiden för dess renhet med hjälp av högtrycksvätskakromatografi (HPLC) och för massan med hjälp av en masspektrofotometer.
  2. För att studera betydelsen av specifika aminosyror inom den överordnade PAMP-12-molekylen, följ stegen nedan.
    1. Generera ett alaninskanningspeptidbibliotek genom att ersätta respektive aminosyrarester i peptidmolekylen med alanin, en i taget med SPPS. Ändra N-terminalen till acetylgruppen (Ac) och C-terminalen till mittgruppen.
    2. Karakterisera peptiden för dess renhet med hjälp av högtrycksvätskakromatografi (HPLC) och för massan med hjälp av en masspektrofotometer.
      OBS: Se till att de syntetiserade peptiderna är av hög renhet. Karakterisera peptiderna med hjälp av masspektroskopi och HPLC.

2. In vitro-cellkultur

  1. Kultur HEK-X2- och HEK-WT-celler genom att följa stegen nedan.
    1. Förbered odlingsmediet genom att komplettera dmem med hög glukos med 10% fetala nötkreatursserum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin.
    2. Passage cellerna i vävnadskultur (TC) behandlade T-75 odlingskolvar och växer i en inkubator vid 37 °C som innehåller 5% CO2, tills de är 75-80% konfluenta.
    3. En gång 75% konfluent, tvätta cellerna och tillsätt 2-3 ml trypsin i 2- 3 min. Inkubera i en 37 °C, 5% CO2 inkubator för att lossa cellerna.
    4. När cellerna har lossnat samlar du cellerna i trypsin. Tillsätt 6-9 ml färskt medium.
    5. Centrifugera cellerna vid 1620 x g i 3-5 min.
    6. Efter centrifugation, kassera supernatanten för att samla pelleten. Återanvänd cellerna i ett nytt odlingsmedium. Späd cellerna enligt önskad koncentration.
      OBS: HEK-celler är snabbväxande celler och optimerar därmed cellmediets kosttillskott. HEK-celler är vidhäftande celler; passage dem i TC-behandlade odlingsflaskor för att stödja vidhäftning.
  2. Förbered en 96 brunnsanalysplatta för experimentet.
    1. Tillsätt 200 μL av cellupphängningen i varje brunn, med en koncentration på 200 000 celler/ml, för att så 40 000 celler/brunn.
    2. Odla cellerna i 24 timmar i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
      OBS: Optimera celltätheten per brunn baserat på plåtstorleken och cellstamtypen. Utför experimentet i triplikater i en svart TC-behandlad 96 brunnsplatta med platt transparent botten.

3. Fura-2 AM kalciumtest

  1. Förbered färgämnet genom att följa stegen nedan.
    1. Använd Fura-2 AM färgämne för experimentet.
    2. Förbered HEPES-Tyrodes buffertbuffert (HTB) som innehåller 25 mM HEPES-buffert, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mg/ml glukos, 1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) och ny tillsatt 1,8 mM CaCl2 i autoklavsteriliserat vatten.
    3. Tillsätt 50 μL DMSO i 50 μg Fura-2 AM injektionsflaska för att förbereda 1 mM stamlösning av Fura-2 AM färgämne. Tillsätt 1 μL 1 mM Fura-2 AM färgämne per ml färskt medium för att förbereda färgbelastningsmediet med 1 μM färgkoncentration.
    4. Ta bort 96 brunnsplattan från inkubatorn och kassera mediet. Byt ut mediet mot ett nytt färgämnesbelastningsmedium. Tillsätt 200 μL färgbelastningsmedium i varje brunn. Inkubera cellerna i 30-40 min i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
    5. Efter 40 min inkubation, ta bort mediet. Tvätta cellerna med HTB-bufferten. Tillsätt 100 μL HTB-buffert för fluorescensavläsning. Ta plattan för fluorescensavläsning.
      OBS: Optimera färgkoncentrationen i färgämnets belastningsmedium. Färgläckage och fotoblekning är möjliga problem i samband med färgämnet. Tillsätt CaCl2 färsk i HTB-bufferten för att undvika nederbörd.

4. Cellaktivering och fluorescerande avläsning

OBS: Fluorescensplatta med ett automatiserat rörsystem möjliggör automatisk överföring av föreningar från en sammansatt källa till analysplattan utan att ta ut plattan ur plåtläsaren.

  1. Medan cellerna inkuberas ställer du in plattläsaren.
    1. Ställ in temperaturen på 37 °C.
    2. Välj Flexi Inställningar.
    3. Ställ in läsläget på Fluorescens och nederkantsläsning.
    4. I Våglängder, ställ in antalet Våglängder till 2. Ställ excitationen på 340 nm och 380 nm. Ställ in utsläppet på 510 nm.
    5. Lämna känsligheten till standard.
    6. Ställ in intervallet 3,9 s i Tidsinställning. Ställ in körtid på 94 s för att få 25 läsningar.
    7. Välj sedan analysskylttypen.
    8. Välj sedan de brunnar som ska läsas.
    9. Vid sammansatt överföringställer du in överföringar på 1 och initial volym till 100 μL. Ställ in pipetthöjden på 100 μL, volym till 50 μL och tidspunkt till 36 s, för att lägga till föreningen vid den 10: e avläsningen.
    10. Välj sedan typen Sammansatt källa.
    11. Låt Triturate inte användas.
    12. Markera tipsen i layouten Pipetttips.
    13. För sammansatta kolumner och spetspelare,se till att de föreningar som ska överföras finns i kolumn 1 på den sammansatta plattan. Ställ in tipskolumnen på 1 och sammansatt kolumn till 1.
    14. Lämna autokalibrering som .
    15. Klicka på OK.
  2. När temperaturen har nått 37 °C, ladda plattorna i plattläsaren.
    1. Tryck på läskammaren för att sätta assayplattan i fluorescensplattans läsare.
    2. Tryck på källan för att sätta compound plate. Förbered compound plate genom att tillsätta 200 μL av respektive peptider, jonomycin och etylenglykol-bis(β-aminoetyleter)-N,N,N′,N′-tetraacetikasyra (EGTA)-Triton X-100 lösningar.
    3. Tryck på tip rack för att sätta tip box . Använd en svart spets för att undvika spets autofluorescens.
    4. När plattorna är laddade granskar du programvarans inställningar och trycker på Läs.

5. Dataanalys

  1. Bestäm kalciumkoncentrationen från fluorescensförhållandet med Grynkiewicz-ekvationen -
    Equation 1
    där Kd är dissociationskonstanten för Fura-2 AM, R är utsläppskvoten efter excitation vid 340 nm och 380 nm (F340/F380) för respektive peptider, Rmax är det maximala fluorescensförhållandet som observerats vid tillsats av 50 μL 30 μM jonomycin, Rmin är det minsta fluorescens som observerats vid tillsats av 50 μL 100 mM EGTA/2,5%Triton X-100, och F380min och F380max är den absoluta fluorescensintensiteten hos Fura-2 AM i kalciumfritt respektive bundet tillstånd.
    OBS: Maskinen dispenserar vätskan med viss kraft. Ställ inte in peptiddispenseringshöjden för nära botten av plattan; det kan lossa cellerna. Använd svarta pipettspetsar för att undvika autofluorescens. Läs den maximala fluorescensen och minsta fluorescens för varje platta för varje experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tabell 1 innehåller de peptidsekvenser som genereras genom terminal aminosyra trunkering och alanin skanning. Som visas i tabell 1saknar peptidsekvensen RKKWNKWALSR N-terminal fenylalanin (F) med avseende på sin förälder PAMP-12 och är därför en representativ peptid i N-trunkerat bibliotek. På samma sätt, i FRKKWNKWALS, PAMP-12 C-terminal serin har tagits bort, representerar ett C-trunkerat peptidbibliotek som härrör från PAMP-12. I N+C-trunkerat peptidbibliotek avlägsnas aminosyra från både N- och C-terminalen. Trunkering av 4 aminosyra från N-terminal och 1 rester från C-terminalen av PAMP-12 resulterar i WNKWALS. Peptidbibliotek som härrör från alaninskanning har en aminosyra ersatt med alanin, som med ARKKWNKWALSR, där N-terminal fenylalanin ersätts med alanin. Fura-2 AM färgämne användes för att studera aktiveringspotentialen hos peptider mot MRGPRX2 transfected HEK celler1. Uppgifterna registrerades på en fluorescensplatta läsare. Om peptidligand aktiverade cellen ökar fluorescensen vid 340 nm (F340), medan samma minskar för 380 nm våglängd (F380) (Figur 1a). För en blank (eller för den delen icke-aktiverande peptid- eller HEK-WT-kontroll) skulle dock den relativa ökningen respektive minskningen vara låg, vilket visas i figur 2a. Kalciumkoncentrationen representeras dock av förhållandet F340/F380 enligt figur 1b,2b. Förhållandet F340/F380 kan ersättas ytterligare i Grynkiewicz-ekvationen för att få kalciumkoncentrationen med hjälp av in situ-kalibreringar (figur 3). De peptider som anges i tabell 1 kännetecknades av masspektroskopi (figur 4a) och HPLC (Figur 4b) och visade sig vara av hög renhet.

Peptidteknik Representativ peptid
Föräldrapeptid Ac-FRKKWNKWALSR-Amide
N-Trunkering Ac-RKKWNKWALSR-Amide
Trunkering Ac-FRKKWNKWALS-Amide
N+C-trunkering Ac-WNKWALS-Amide
Alaninskanning Ac-ARKKWNKWALSR-Amide

Tabell 1: Representativa peptidsekvenser som genereras efter N, C och N+C - trunkering och alaninskanning. N-terminalen av peptiderna var acetyl modifierade medan C-Terminal innehöll en amide grupp.

Figure 1
Figur 1: Representativa data för en aktiverande peptid. (a) Fluorescenssignalerna för en aktiverande peptid. Representerade data motsvarar PAMP-12 (FRKKWNKWALSR). Peptid lades till efter att ha genererat en baslinje för 10 avläsningscykler (36 s), vilket visas av pilen. b)Förhållandet mellan fluorescensutsläppen efter excitation vid 340 nm (F340) och fluorescensutsläppet efter excitation vid 380 nm (F380) (F340/F380). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Representativa uppgifter för det tomma. a)Fluorescenssignalerna för blankrummet. HTB lades till efter att ha genererat en baslinje för 10 läscykler (36 s), vilket visas av pilen. b)Förhållandet mellan fluorescensutsläppen efter excitation vid 340 nm (F340) och fluorescensutsläppet efter excitation vid 380 nm (F380) (F340/F380). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Representativa uppgifter för normerna för färgkalibrering. a)Jonomycin lades till vid 10:e avläsningen, vilket visas av pilen, för att få maximal fluorescens i ca+2-bundet tillstånd. EGTA-Triton X-100 lades till efter 20 avläsningar, vilket visas av pilen, för att få en minsta signal. b)Förhållandet mellan fluorescensutsläppen efter excitation vid 340 nm (F340) och fluorescensutsläppet efter excitation vid 380 nm (F380) (F340/F380). Dessa värden sätts vidare i Grynkiewicz ekvationen för att få den intracellulära kalciumkoncentrationen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Karakterisering av en representativ peptid för att bekräfta sekvensen och renheten. a)Den teoretiska massan av den representativa peptidsekvensen WNKWAL var 857,90 Da, vilket visades av m/z-förhållandet i masspektroskopi. b)Peptidens renhet på 99% enligt HPLC: s bekräftad. Denna peptid tillhör N+C-trunkerat peptidbibliotek. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kalciumsignalering är centralt för mastcellsdegranulering och har använts i stor utsträckning i studien av receptor-ligand interaktioner, ligand identifiering och läkemedelsupptäckt14. MRGPRX2 är en nyligen upptäckt mastcellsreceptor som har visat sig spela en nyckelroll i många inflammatoriska sjukdomar som kliande, astma och atopisk dermatit, blandandra 2. Dessutom har flera godkända läkemedel visat sig framkalla ett inflammatoriskt svar genom MRGPRX2-receptorn15. Det är därför absolut nödvändigt att studera ligand-receptorinteraktionen, identifiera nya ligander och förstå aktiveringsmekanismen. Denna studie visar användningen av vanliga peptidtekniker för att utforma ett peptidbibliotek (tabell 1) och för att studera MRGPRX2-baserad mastcellsaktivering. Den underliggande kalcium mobilisering användes som indikator på mast cell aktivering.

Fura-2 är ett kalciumkänsligt färgämne som används för att mäta intracellulär kalciumkoncentration. Acetoxymethyl ester varianten (Fura-2 AM) ökar permeabiliteten hos cellmembranet som ger en enkel metod för kvantifiering av cytoplasmic kalciumfrigivningar. Färgämnet har ofta använts med olika karakteriseringstekniker som flödescytometer, mikroskopi och fluorimetrar9,16,17. Även om det används i stor utsträckning finns det utmaningar förknippade med färgämnet, som måste åtgärdas innan dessa kan användas effektivt. Intracellulär kalciumbindning förlitar sig på avesterifieringen av färgämnet, som till stor del är beroende av färgbelastningsförhållandena, cellsystemet och cellkulturtyperna. Partiell de-esterifiering resulterar i otillräckliga fluorescens signaler. Dessutom resulterar ofullständig avesterifiering också i lokalisering av färgämne i cellorganellerna vilket resulterar i felaktiga data. Läckage av de-esterifierat färgämne från cellen är ett annat problem som står inför Fura-210,11.

Förutom färgbelastningen spelar användningen av detektionstekniken också en viktig roll. Oförmågan hos flödescytometrar att arbeta med UV-lasrar gör dem ogynnsamma förfärgämnet 9. På samma sätt kräver fluorescerande bildteknik avancerad utbildning i mikroskopdrift. Den övergående karaktären av kalciumfrisättning vid ligandaktivering kräver ett snabbt svar i förändringen av våglängder och därmed en snabbare slutartid för mikroskopet. Dessutom gör användningen av specialiserade celltomografikammare, användning av täcklips och konstant bildinriktning det till en besvärlig teknik för storskalig screening16.

En betydande tid investerades i metodoptimeringen. Cuvette-baserad fluorometer, där celler efter detkning från odlingskolven inkuberades med det färgämnesbelastade mediet i mörker och tvättades och återanvändes i HTB-bufferten för studien. Celler upphängda i HTB buffert togs i en cuvette och lästes med hjälp av en photomultiplier baserade fluorometer. Detektionssystemen kunde bara rymma få (2-4) cuvettes åt gången och var därför inte lämpliga för storskalig screening av peptider. Vidare, HEK celler är vidhäftande celler, cell suspension läsning visade stora variationer inom enskilda repetitioner inom ett experiment. Följaktligen användes fluorescerande bildframställningsteknik, som återigen visade sig vara tråkig och långsam. Kravet på ett avancerat mikroskop med snabb våglängdsförändrande förmåga, mikroskopspecifika cellkammare och utmärkta bildframställningsfärdigheter hindrade studien. Dessutom var in situpeptidsimulering tids omfattande och resulterade i förlust av viktiga data. Ineffektiv cellbearbetningsteknik resulterade i cellflottationer under avläsningar vilket gjorde det svårt att fokusera och gav inkonsekventa resultat.

Ett fluorescensplatta avläsarsystem med ett automatiserat rörsystem som kan dispensera föreningar under experiment användes för studien. Det faktum att många prover läses i snabb följd i en 96 brunnsplatta är en extra fördel med denna teknik. Resultaten visade att avläsningarna var mer konsekventa när celler var kopplade jämfört med suspension. Cellantalet 40 000 celler/brunn i en TC-behandlad 96 brunnsplatta som odlats för en dag gav bäst resultat. En färginkubationstid på 30-40 min vid 37 °C inkubator var optimal. Men när experiment gjordes med experimentella upprepningar observerades variationer i motsvarande brunnar i olika kolumner. För att övervinna detta användes en positiv (PAMP-12) och en negativ kontroll (Tom) för varje kolumn på plattan. Detta gav mer konsekventa och reproducerbara data. Metoden som beskrivs här är en enkel och mångsidig metod som effektivt kan användas för storskalig kalciumbaserad screening. Det finns dock flera faktorer som bestämmer datakvaliteten och därför måste metoden optimeras för ett visst cellinstrumentsystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författare förklarar inga konkurrerande intressen.

Acknowledgments

SR och LDU vill uppmärksamma Alberta Innovates strategic research project, NRC och NSERC-Discovery grant för detta projekt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich 5470
Calcium Chloride Sigma Aldrich 793939
Corning 96 Well Sigma Aldrich CLS3603
Black Polystyrene Microplate Sigma Aldrich CLS3603
DMEM Thermo Fischer 11995065 High Glucose
DMSO Thermo Fischer D12345 Sterile, biological grade
EGTA Sigma Aldrich E3889
Fetal Bovine Serum Thermo Fischer 12483-020
Flexstation 3 Molecular devices FV06060
Fura-2 AM Thermo Fischer F1221
Glucose Sigma Aldrich D8270
HEPES buffer Thermo Fischer 15630-080
Ionomycin Sigma Aldrich I9657
L Glutamine Thermo Fischer 25030-081
Pen Strep Thermo Fischer 15140122
Peptides RS Syntehsis Custom ≥95% pure;
N terminal - acetyl group
C terminal - amide group
Potassium Chloride Sigma Aldrich 12636
Sodium Chloride Sigma Aldrich S9888
TritonX-100 DOW Chemical 166704

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519, (7542), 237-241 (2015).
  2. Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138, (3), 700-710 (2016).
  3. Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. Chapter 7, Unit-7.37 (2010).
  4. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51, (3), 187-200 (2005).
  5. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568 (2015).
  6. Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143 (2020).
  7. Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9, (1), 81-88 (2008).
  8. Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355, (6358), 353-356 (1992).
  9. Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10, (4), 0122527 (2015).
  10. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11, (2-3), 63-73 (1990).
  11. Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105, (5), 2145-2155 (1987).
  12. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260, (6), 3440-3450 (1985).
  13. Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10, (7), 6107-6117 (2018).
  14. Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13, (5), 529-536 (2017).
  15. Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8, (1), 11628 (2018).
  16. Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. 163-172 (2019).
  17. Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269, (3), 212-220 (2018).
Screeningpeptider som aktiverar MRGPRX2 med hjälp av konstruerade HEK-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raj, S., Lu, L., Unsworth, L. D. Screening Peptides that Activate MRGPRX2 using Engineered HEK Cells. J. Vis. Exp. (177), e62448, doi:10.3791/62448 (2021).More

Raj, S., Lu, L., Unsworth, L. D. Screening Peptides that Activate MRGPRX2 using Engineered HEK Cells. J. Vis. Exp. (177), e62448, doi:10.3791/62448 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter