Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Screeningpeptider som aktiverer MRGPRX2 ved hjelp av konstruerte HEK-celler

Published: November 6, 2021 doi: 10.3791/62448

Summary

Teknikker for å generere et bibliotek med korte peptider som kan aktivere mastceller via MRGPRX2-reseptoren er beskrevet. Tilknyttede teknikker er enkle, billige og kan utvides til andre cellereseptorer.

Abstract

Identifisering av ligander som er spesifikke for terapeutisk signifikante cellereseptorer er avgjørende for mange bruksområder, inkludert design og utvikling av nye terapeutiske stoffer. Mas relatert G-protein reseptor-X2 (MRGPRX2) er en viktig reseptor som regulerer mastcelleaktivering og dermed styrer den generelle immunresponsen. Tallrike ligander for MRGPRX2 har blitt identifisert og inkluderer endogene peptider som PAMPs, defensiner, LL-37 og andre proteinfragmenter (dvs. degradert albumin). Videre identifisering av MRGPRX2 spesifikke ligander krever screening av et stort antall peptider (dvs. peptidbibliotek); Mastceller er imidlertid vanskelige og dyre å opprettholde in vitro og derfor ikke økonomisk å bruke til screening av et stort antall molekyler. Det nåværende dokumentet demonstrerer en metode for å designe, utvikle og screene et bibliotek med små peptidmolekyler ved hjelp av MRGPRX2 som uttrykker HEK-celler. Denne cellelinjen er relativt enkel og billig å vedlikeholde og kan brukes til in vitro high-throughput analyse. En kalsiumsensitiv Fura-2 fluorescerende fargestoff for å markere intracellulær kalsiumfluks ved aktivering ble brukt til å overvåke aktiveringen. Forholdet mellom fluorescensintensiteten til Fura-2 ved 510 nm mot eksitasjonsbølgelengder på 340 og 380 nm ble brukt til å beregne kalsiumkonsentrasjon. Peptidbiblioteket som ble brukt til å verifisere dette systemet var basert på den endogene proadrenomedullin N-terminal 12 (PAMP-12) secretagogue, som er kjent for å binde MRGPRX2 med høy spesifisitet og affinitet. Etterfølgende peptider ble generert gjennom aminosyreavkorting og alaninskanningsteknikker anvendt på PAMP-12. Metoden beskrevet her er enkel og billig, men robust for screening av et stort bibliotek med forbindelser for å identifisere bindende domener og andre viktige parametere som spiller en viktig rolle i reseptoraktivering.

Introduction

Mastceller er en integrert del av immunsystemet og spiller en avgjørende rolle i både medfødte og adaptive immunresponser. Mastceller aktiveres primært enten ved binding av et antigen til immunglobulin E (IgE) - FcεRI reseptorkompleks, eller av det nylig oppdagede mas-relaterte G-proteinreseptor-X2 (MRGPRX2)1. MRGPRX2-aktivering har vært knyttet til flere immun- og inflammatoriske sykdommer, og derfor er det viktig å forstå reseptorens bindende mekanisme til ligandene2. For å gjøre dette ble et bibliotek med små peptidmolekyler utviklet og screenet mot MRGPRX2-reseptorer som var overekspressert i HEK-celler. I studien ble peptidbiblioteket konstruert ved hjelp av de enkle og allsidige teknikkene for alaninskanning og aminosyreavkorting. Alaninskanning innebærer å erstatte spesifikke aminosyrer med en alaninrester. Alanin er liten og nøytral, striper peptiden til de spesifikke egenskapene som er gitt av de erstattede rester og fremhever fortløpende betydningen av de respektive fysiokjemiske egenskapene til aminosyren i reseptorinteraksjoner. Tvert imot, i aminosyreavkorting, er peptidsekvenser utformet slik at den mangler en eller flere aminosyrerester fra N-terminalen, C-terminalen eller begge deler. Dette settet med peptider ble brukt til å identifisere aminosyresekvensene som er avgjørende for MRGPRX2-bindingen.

Erfaring med menneskelige mastcellelinjer (LAD-2) har vist at disse cellene er vanskelige å kultur og opprettholde in vitro: en doblingstid på to uker, dyre mellomstore kosttilskudd og direkte oppmerksomhet som kreves under passaging3. Disse egenskapene gjør cellene uegnet for storskala screening av potensielle ligander. Heri ble stabilt transfekerte HEK-celler som uttrykker MRGPRX2-reseptor (HEK-X2) brukt til å screene peptidbiblioteket1. HEK-293 celler er mye brukt og studert for det heteroologe uttrykket av overflatereseptorer på grunn av deres høye transfeksjonseffektivitet, raskere doblingshastighet og behovet for ikke-dyre mellomstore kosttilskudd som skal dyrkes i laboratoriet4. Protokollen for å transfekte HEK-293 cellelinje er demonstrert og er godt etablert5. HEK-293 celler som stabilt uttrykker MRGPRX2-reseptor (passasje 13-19) ble aktivert med peptidene generert gjennom N-avkorting, C-avkorting, N +C-avkorting og alaninskanning1. Wild type HEK-celler (HEK-WT) (passasje 16-21) ble brukt som kontroll. Intracellulær kalsiumfrigjøring ved aktivering ble overvåket for å studere MRGPRX2-basert aktivering.

Celleaktivering av MRGPRX2 etterfølges av en cytosolisk kalsiummobilisering. Denne regulerte intracellulære kalsiumutslippet i mastceller reguleres av den butikkopererte kalsiuminngangen (SOCE), koordinert av det stromale interaksjonsmolekylet 1 (STIM1); og er sentral i immunresponsen kaskade6,7. Ulike metoder har blitt brukt til å oppdage intracellulær kalsiumkonsentrasjon, inkludert patch-klemmer og fluorescerende fargestoffer8. Av alle tilgjengelige teknikker blir fluorometriske kalsiumfarger i konjugering med ulike deteksjonsteknikker mye brukt9. To typer fluorometriske fargestoffer som har fått interesser er nemlig enkeltbølgelengdefarger som Fluo-4, og dual wavelength ratiometric fargestoffer som Indo -1 og Fura-2. Fordelen med at dual wavelength ratiometric fargestoffer bringer over enkelt bølgelengde fargestoffer er at ratiometric fargestoffer riktig for eksperimentelle feil som fargestoff lasting, foto bleking, og fokusering10,11.

Fura-2 acetoksymetyl ester (Fura-2 AM) er en celle gjennomtrengende, grønn fluorescerende fargestoff hvis eksitasjon skifter til en lavere bølgelengde ved kalsiumbinding. Eksperimentelt er Fura-2 spent på 340 og 380 nm, mens utslippet er registrert på 510 nm. Ved kalsiumbinding øker fluorescerende intensitet ved 340 nm mens den på 380 nm minker, som vist i figur 1. Data er representert som et forhold mellom fluorescensintensitet etter eksitasjon ved 340 nm (F340) til intensitet etter eksitasjon ved 380 nm (F380) dvs. F340 / F380-forholdet er proporsjonalt med intracellulært kalsium, hvis verdi kan beregnes av Grynkiewicz-ligningen12. Siden fluorescenssignalet er hentet fra eksitasjonen av fargestoffet ved to bølgelengder (340 nm og 380 nm), korrigerer forholdet mellom fluorescenssignalene for eksperimentelle faktorer som fargestoffbelastning, fargelekkasje, fotobleaching og celletetthet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design og utvikling av peptidbibliotek

  1. Følg fremgangsmåten nedenfor for å identifisere ligandene til mastcellen MRGPRX2-reseptoren basertpå en kjent ligand, dvs.
    1. Generer N-avkortet peptidbibliotek ved å avkorte N-terminal aminosyrerester av liganden, etter hverandre, ved fastfase peptidsyntese (SPPS).
    2. Generer C-avkortet peptidbibliotek ved å avkorte C-terminal aminosyrerester av den kjente liganden, etter hverandre, av SPPS.
    3. Basert på resultatene fra 1.1.1 og 1.1.2, generer et N+C-avkortet peptidbibliotek ved hjelp av SPPS ved å avkorte de ønskede rester fra henholdsvis N- og C-terminalen.
    4. Bruk fastfase peptidsyntese for å syntetisere peptidene13.
    5. Endre N-terminalen til acetylsgruppen (Ac) og C-terminalen til amidgruppen.
    6. Karakteriser peptidet for renheten ved hjelp av høytrykks væskekromatografi (HPLC) og for massen ved hjelp av et massespektrofotometer.
  2. For å studere betydningen av spesifikke aminosyrer i foreldre PAMP-12-molekylet, følg trinnene nedenfor.
    1. Generer et alaninskanningspeptidbibliotek ved å erstatte de respektive aminosyrerester i peptidmolekylet med alanin, en om gangen ved hjelp av SPPS. Endre N-terminalen til acetylsgruppen (Ac) og C-terminalen til amidgruppen.
    2. Karakteriser peptidet for renheten ved hjelp av høytrykks væskekromatografi (HPLC) og for massen ved hjelp av et massespektrofotometer.
      MERK: Påse at de syntetiserte peptidene har høy renhet. Karakteriser peptidene ved hjelp av massespektroskopi og HPLC.

2. In vitro cellekultur

  1. Kultur HEK-X2- og HEK-WT-celler ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Forbered kulturmediet ved å supplere høy glukose DMEM med 10% fetal bovin serum (FBS), 2 mM L-Glutamine, 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin.
    2. Passasje cellene i vev kultur (TC) behandlet T-75 kultur kolber og vokse i en inkubator ved 37 °C inneholder 5% CO2, til de er 75-80% confluent.
    3. Når 75% sammenfallende, vask cellene og tilsett 2-3 ml trypsin i 2 - 3 min. Inkuber i en 37 °C, 5 % CO 2-inkubator for å løsne cellene.
    4. Når cellene har løsnet, samle cellene i trypsin. Tilsett 6-9 ml friskt medium.
    5. Sentrifuger cellene på 1620 x g i 3-5 min.
    6. Etter sentrifugering, kast supernatanten for å samle pelletsen. Resuspend cellene i et friskt kulturmedium. Fortynn cellene i henhold til ønsket konsentrasjon.
      MERK: HEK-celler er raskt voksende celler og optimaliserer dermed cellemedietilskuddene. HEK-celler er adherentceller; passasje dem i TC-behandlet kultur kolber for å støtte vedheft.
  2. Forbered en 96 brønnanalyseplate for eksperimentet.
    1. Tilsett 200 μL av celleopphenget i hver brønn, med en konsentrasjon på 200 000 celler/ml, i frø 40 000 celler/brønn.
    2. Vokse cellene i 24 timer i en 37 °C, 5 % CO2 inkubator.
      MERK: Optimaliser celletettheten per brønn basert på platestørrelsen og cellestammetypen. Utfør eksperimentet i triplikater i en svart TC-behandlet 96 brønnplate med flat gjennomsiktig bunn.

3. Fura-2 AM kalsiumanalyse

  1. Forbered fargestoff ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Bruk Fura-2 AM fargestoff til eksperimentet.
    2. Klargjør HEPES-Tyrodes bufferbuffer (HTB) som inneholder 25 mM HEPES-buffer, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mg/ml glukose, 1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) og nytilsatt 1,8 mM CaCl2 i autoklavert sterilisert vann.
    3. Tilsett 50 μL DMSO i 50 μg Fura-2 AM hetteglass for å forberede 1 mM lagerløsning av Fura-2 AM fargestoff. Tilsett 1 μL 1 mM Fura-2 AM fargestoff per ml friskt medium for å forberede fargestoffbelastningsmediet med 1 μM fargekonsentrasjon.
    4. Fjern 96 brønnplaten fra inkubatoren og kast mediet. Bytt ut mediet med et friskt fargestoffbelastningsmedium. Tilsett 200 μL fargestoffbelastningsmedium i hver brønn. Inkuber cellene i 30-40 min i en 37 °C, 5 % CO2 inkubator.
    5. Etter 40 min inkubasjon, fjern mediet. Vask cellene med HTB-bufferen. Tilsett 100 μL HTB-buffer for fluorescensavlesning. Ta platen for fluorescensavlesning.
      MERK: Optimaliser fargekonsentrasjonen i fargestoffets lastemedium. Fargelekkasje og fotobleaching er mulige bekymringer forbundet med fargestoffet. Tilsett CaCl2 friskt i HTB-bufferen for å unngå nedbør.

4. Celleaktivering og fluorescerende avlesning

MERK: Fluorescensplateleser med et automatisert pipetteringssystem gjør det mulig å overføre forbindelser automatisk fra en sammensatt kilde til analyseplaten uten å ta platen ut av plateleseren.

  1. Mens cellene inkuberes, angir du Plateleser.
    1. Sett temperaturen til 37 °C.
    2. Velg Fleksiunder Innstillinger.
    3. Sett lesemodus til Fluorescens og Bunnlesing.
    4. I Bølgelengder setter du antall bølgelengder til 2. Sett Excitation til 340 nm og 380 nm. Sett utslippet til 510 nm.
    5. La følsomheten være standard.
    6. I Tidsberegningsetter du Intervall til 3,9 s. Sett Kjøretid til 94 s for å få 25 lesinger.
    7. Deretter velger du Analyseplatetype.
    8. Deretter velger du Brønnene som skal leses.
    9. I Sammensatt overføringsetter du Overføringer til 1 og Startvolum til 100 μL. Sett pipettehøyden til 100 μL, Volum til 50 μL og Time Point til 36 s, for å legge til forbindelsen ved 10.
    10. Velg deretter platetypen Sammensatt kilde.
    11. La Triturate være Til Ikke i bruk.
    12. Velg tipsene i pipettespissoppsettet.
    13. For sammensatte kolonner og spisskolonnermå du kontrollere at forbindelsene som skal overføres, er i kolonne 1 i forbindelsesplaten. Sett tipskolonnen til 1 og sammensatt kolonne til 1.
    14. La autokalibreringen være .
    15. Klikk OK.
  2. Når temperaturen har nådd 37 °C, legger du platene i plateleseren.
    1. Trykk lesekammeret for å sette analyseplaten inn i fluorescensplateleseren .
    2. Trykk på kilden for å sette den sammensatte platen. Forbered den sammensatte platen ved å tilsette 200 μL respektive peptider, ionomycin og etylenglykol-bis (β-aminoetyl eter)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)-Triton X-100 løsninger.
    3. Trykk på spissstativet for å sette inn tipsboksen. Bruk en svart spiss for å unngå autofluorescens.
    4. Når platene er lastet inn, ser du gjennom innstillingene for programvaren og trykker på Les.

5. Dataanalyse

  1. Bestem kalsiumkonsentrasjonen fra fluorescensforholdet ved Grynkiewicz-ligningen -
    Equation 1
    hvor, Kd er dissosiasjonskonstanten til Fura-2 AM, R er utslippsforholdet etter eksitasjon ved 340 nm og 380 nm (F340/F380) for respektive peptider, Rmax er det maksimale fluorescensforholdet som observeres ved tilsetning av 50 μL 30 μM ionomycin, Rmin er det minste fluorescens observert ved tilsetning av 50 μL 100 mM EGTA / 2,5% Triton X-100, og F380min og F380max er den absolutte fluorescensintensiteten til Fura-2 AM i kalsiumfri og bundet tilstand.
    MERK: Maskinen dispenserer væsken med en viss kraft. Ikke still inn peptidutleveringshøyden for nær bunnen av platen; Det kan løsne cellene. Bruk svarte pipettespisser for å unngå autofluorescens. Les maksimal fluorescens og minimum fluorescens for hver plate for hvert eksperiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tabell 1 inneholder peptidsekvensene generert gjennom terminal aminosyreavkorting og alaninskanning. Som vist i tabell 1mangler peptidsekvensen RKKWNKWALSR N-terminal fenylalanin (F) med hensyn til foreldre-PAMP-12 og er derfor et representativt peptid i N-avkortet bibliotek. På samme måte, i FRKKWNKWALS, er PAMP-12 C-terminal serin fjernet, noe som representerer et C-avkortet peptidbibliotek avledet fra PAMP-12. I N+C-avkortet peptidbibliotek fjernes aminosyre fra både N- og C-terminalen. Avkorting av 4 aminosyre fra N-terminal og 1 rester fra C-terminal av PAMP-12 resulterer i WNKWALS. Peptidbibliotek avledet fra alaninskanning har en aminosyre erstattet med alanin, som med ARKKWNKWALSR, hvor N-terminal fenylalanin erstattes med alanin. Fura-2 AM fargestoff ble brukt til å studere aktiveringspotensialet for peptider mot MRGPRX2 transfekterte HEK-celler1. Dataene ble registrert på en fluorescensplateleser. Hvis peptidligaen aktiverte cellen, øker fluorescensen som pumpes ved 340 nm (F340), mens den samme reduseres for 380 nm bølgelengde (F380) (Figur 1a). For en tom (eller for den saks skyld ikke-aktiverende peptid- eller HEK-WT-kontrollen) vil imidlertid den relative økningen og reduksjonen være henholdsvis lav, som vist i figur 2a. Kalsiumkonsentrasjon er imidlertid representert av F340/F380-forholdet som vist i figur 1b,2b. Forholdet F340/F380 kan erstattes ytterligere i Grynkiewicz-ligningen for å få kalsiumkonsentrasjonen ved hjelp av in situ-kalibreringer (figur 3). Peptidene som er oppført i tabell 1, var preget av massespektroskopi (figur 4a) og HPLC (figur 4b) og viste seg å være av høy renhet.

Peptid Teknikk Representativ peptid
Overordnet peptid Ac-FRKKWNKWALSR-Amide
N-avkorting Ac-RKKWNKWALSR-Amide
C-avkorting Ac-FRKKWNKWALS-Amide
N+C-avkorting Ac-WNKWALS-Amide
Alanine skanning Ac-ARKKWNKWALSR-Amide

Tabell 1: Representative peptidsekvenser generert etter N-, C- og N+C - avkorting og alaninskanning. N-terminalen til peptidene ble acetyl modifisert mens C-terminalen inneholdt en amidgruppe.

Figure 1
Figur 1: Representative data for et aktiverende peptid. (a) Fluorescenssignalene for et aktiverende peptid. Representerte data tilsvarer PAMP-12 (FRKKWNKWALSR). Peptid ble lagt til etter å ha generert en basislinje for 10 lesesykluser (36 s), som vist av pilen. (b) Forholdet mellom fluorescensutslippet etter eksitasjon ved 340 nm (F340) til fluorescensutslipp etter eksitasjon ved 380 nm (F380) (F340/F380). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative data for feltet. (a) Fluorescenssignalene for blank. HTB ble lagt til etter å ha generert en grunnlinje for 10 lesesykluser (36 s), som vist av pilen. (b) Forholdet mellom fluorescensutslippet etter eksitasjon ved 340 nm (F340) til fluorescensutslipp etter eksitasjon ved 380 nm (F380) (F340/F380). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative data for standarder for fargekalibrering. (a) Ionomycin ble lagt til ved 10avlesninger, som vist av pilen, for å få maksimal fluorescens i Ca+2 bundet tilstand. EGTA-Triton X-100 ble lagt til etter 20 avlesninger, som vist av pilen, for å få et minimumssignal. (b) Forholdet mellom fluorescensutslippet etter eksitasjon ved 340 nm (F340) til fluorescensutslipp etter eksitasjon ved 380 nm (F380) (F340/F380). Disse verdiene settes videre i Grynkiewicz-ligningen for å få den intracellulære kalsiumkonsentrasjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Karakterisering av et representativt peptid for å bekrefte sekvensen og renheten. (a) Den teoretiske massen av den representative peptidsekvensen WNKWAL var 857,90 Da, som ble vist ved m/z-forholdet i massespektroskopi. (b) Peptidets renhet på 99 % som bekreftet av HPLC. Dette peptidet tilhører N+C-avkortet peptidbibliotek. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kalsiumsignalering er sentralt for mastcellederiangulering og har blitt mye brukt i studiet av reseptor-ligand interaksjoner, ligandidentifikasjon og legemiddeloppdagelse14. MRGPRX2 er en nylig oppdaget mastcellereseptor som har vist seg å spille en nøkkelrolle i mange inflammatoriske sykdommer som kløe, astma og atopisk dermatitt, blant annet2. Videre har flere godkjente legemidler vist seg å fremkalle en inflammatorisk respons gjennom MRGPRX2-reseptoren15. Det er derfor viktig å studere ligandreseptorinteraksjonen, identifisere nye ligander og forstå aktiveringsmekanismen. Denne studien viser bruk av vanlige peptidteknikker for å designe et peptidbibliotek (tabell 1) og i å studere MRGPRX2-basert mastcelleaktivering. Den underliggende kalsiummobiliseringen ble brukt som indikator på mastcelleaktivering.

Fura-2 er et kalsiumfølsomt fargestoff som brukes til å måle intracellulær kalsiumkonsentrasjon. Acetoksymetylstervarianten (Fura-2 AM) øker permeabiliteten til cellemembranen og gir en enkel metode for kvantifisering av cytoplasmatiske kalsiumutslipp. Fargestoffet har ofte blitt brukt med ulike karakteriseringsteknikker som strømningscytometer, mikroskopi og fluorimeter9,16,17. Selv om det er mye brukt, er det utfordringer knyttet til fargestoffet, som må løses før disse effektivt kan brukes. Intracellulær kalsiumbinding er avhengig av av-esterifisering av fargestoffet, som i stor grad er avhengig av fargestoffbelastningsforhold, cellesystem og cellekulturtyper. Delvis av-esterifisering resulterer i utilstrekkelige fluorescenssignaler. Videre resulterer ufullstendig de-esterifisering også i lokalisering av fargestoff i celleorganellene, noe som resulterer i unøyaktige data. Lekkasje av avtestert fargestoff fra cellen er et annet problem som står overfor Fura-210,11.

Bortsett fra fargebelastningen, spiller bruken av deteksjonsteknikken også en viktig rolle. Manglende evne til strømningscytometere til å operere med UV-lasere gjør dem ugunstige for fargestoffet9. På samme måte krever fluorescerende avbildningsteknikker avansert opplæring i mikroskopdrift. Den forbigående karakteren av kalsiumfrigjøring ved ligandaktivering krever en rask respons i endringen i bølgelengder og dermed en raskere lukkertid på mikroskopet. I tillegg gjør bruk av spesialiserte celleavbildningskamre, bruk av coverlips og konstant bildefokusering det til en tungvint teknikk for storskala screening16.

Det ble investert betydelig tid i metodeoptimaliseringen. Cuvette-basert fluorometer, hvor celler etter avløsning fra kulturflasken, ble inkubert med det fargebelastede mediet i mørket og deretter vasket og resuspendert i HTB-bufferen for studien. Celler suspendert i HTB-buffer ble tatt i en cuvette og ble lest ved hjelp av et fotomultiplierbasert fluorometer. Deteksjonssystemene kunne bare holde få (2-4) cuvettes om gangen og var dermed ikke egnet for storskala screening av peptider. Videre viste HEK-celler som er tilhengerceller, celleopphengsavlesningen store variasjoner innen individuelle repetisjoner i et eksperiment. Følgelig ble fluorescerende bildeteknikk brukt, som igjen viste seg å være kjedelig og langsom. Kravet til et avansert mikroskop med rask bølgelengdeskifteevne, mikroskopspesifikke cellekamre og utmerkede bildeferdigheter hindret studien. I tillegg var in situ peptidsimulering tidsinnstrakt og resulterte i tap av viktige data. Ineffektiv cellebehandlingsteknikk resulterte i celleflotasjoner under avlesninger som gjorde det vanskelig å fokusere og ga inkonsekvente resultater.

Et fluorescensplatelesersystem med et automatisert pipetteringssystem som kan dispensere forbindelser under eksperimenter ble brukt til studien. Det faktum at mange prøver leses i rask rekkefølge i en 96 brønnplate er en ekstra fordel med denne teknikken. Resultatene viste at målingene var mer konsistente når cellene var festet sammenlignet med suspensjon. Celletellinger på 40 000 celler/brønn i en TC-behandlet 96 brønnplate dyrket for en dag ga de beste resultatene. En inkubasjonstid på 30-40 min ved 37 °C inkubator var optimal. Men når eksperimenter ble gjort med eksperimentelle repetisjoner, ble variasjoner i de tilsvarende brønnene i forskjellige kolonner observert. For å overvinne dette ble det brukt en positiv (PAMP-12) og en negativ kontroll (Blank) for hver kolonne på platen. Dette ga mer konsistente og reproduserbare data. Metoden som er beskrevet her er en enkel og allsidig metode, som effektivt kan brukes til storskala kalsiumbasert screening. Det er imidlertid flere faktorer som bestemmer kvaliteten på dataene, og dermed må metoden optimaliseres for et gitt celleinstrumentsystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

SR og LDU ønsker å anerkjenne Alberta Innovates Strategic Research Project, NRC og NSERC-Discovery-stipend for dette prosjektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich 5470
Calcium Chloride Sigma Aldrich 793939
Corning 96 Well Sigma Aldrich CLS3603
Black Polystyrene Microplate Sigma Aldrich CLS3603
DMEM Thermo Fischer 11995065 High Glucose
DMSO Thermo Fischer D12345 Sterile, biological grade
EGTA Sigma Aldrich E3889
Fetal Bovine Serum Thermo Fischer 12483-020
Flexstation 3 Molecular devices FV06060
Fura-2 AM Thermo Fischer F1221
Glucose Sigma Aldrich D8270
HEPES buffer Thermo Fischer 15630-080
Ionomycin Sigma Aldrich I9657
L Glutamine Thermo Fischer 25030-081
Pen Strep Thermo Fischer 15140122
Peptides RS Syntehsis Custom ≥95% pure;
N terminal - acetyl group
C terminal - amide group
Potassium Chloride Sigma Aldrich 12636
Sodium Chloride Sigma Aldrich S9888
TritonX-100 DOW Chemical 166704

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
  2. Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).
  3. Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. , Chapter 7, Unit-7.37 (2010).
  4. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  5. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568 (2015).
  6. Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143 (2020).
  7. Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).
  8. Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).
  9. Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10 (4), 0122527 (2015).
  10. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  11. Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).
  12. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  13. Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).
  14. Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).
  15. Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8 (1), 11628 (2018).
  16. Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. , 163-172 (2019).
  17. Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).

Tags

Immunologi og infeksjon Utgave 177 Mastceller MRGPRX2 Fura-2 Kalsiumanalyse HEK-celler Plateleser
Screeningpeptider som aktiverer MRGPRX2 ved hjelp av konstruerte HEK-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raj, S., Lu, L., Unsworth, L. D.More

Raj, S., Lu, L., Unsworth, L. D. Screening Peptides that Activate MRGPRX2 using Engineered HEK Cells. J. Vis. Exp. (177), e62448, doi:10.3791/62448 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter