Un metodo semplificato per la generazione di organoidi renali da cellule staminali pluripotenti umane
Summary
Qui descriviamo un protocollo per generare organoidi renali da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC). Questo protocollo genera organoidi renali entro due settimane. Gli organoidi renali risultanti possono essere coltivati in fiaschi spinner su larga scala o piastre magnetiche multi-pozzo per approcci paralleli di test antidroga.
Abstract
Gli organoidi renali generati dalle hPSC hanno fornito una fonte illimitata di tessuto renale. Gli organoidi renali umani sono uno strumento inestimabile per studiare malattie e lesioni renali, sviluppare terapie cellulari e testare nuove terapie. Per tali applicazioni è necessario un gran numero di organoidi uniformi e saggi altamente riproducibili. Abbiamo costruito sul nostro protocollo organoide renale precedentemente pubblicato per migliorare la salute generale degli organoidi. Questo semplice e robusto protocollo 3D prevede la formazione di corpi embrioidi uniformi in un mezzo componente minimo contenente lipidi, integratore di insulina-transferrina-selenio-etanolammina e alcool polivinilico con inibitore GSK3 (CHIR99021) per 3 giorni, seguito da coltura in mezzo contenente siero sostitutivo knock-out (KOSR). Inoltre, i saggi di agitazione consentono di ridurre l’aggregazione dei corpi embrioidi e di mantenere una dimensione uniforme, che è importante per ridurre la variabilità tra gli organoidi. Nel complesso, il protocollo fornisce un metodo veloce, efficiente ed economico per generare grandi quantità di organoidi renali.
Introduction
Negli ultimi anni, sono stati sviluppati una serie di protocolli per differenziare le cellule staminali pluripotenti umane in organoidi renali 1,2,3,4,5. Gli organoidi renali hanno fornito uno strumento importante per aiutare la ricerca su nuovi approcci di medicina rigenerativa, modellare malattie renali, eseguire studi di tossicità e sviluppo di farmaci terapeutici. Nonostante la loro ampia applicabilità, gli organoidi renali hanno limitazioni come la mancanza di maturazione, la limitata capacità di coltura a lungo termine in vitro e una scarsità di diversi tipi di cellule presenti nel rene umano 6,7,8. Recenti lavori si sono concentrati sul miglioramento del livello di maturazione organoide, estendendo i periodi di coltura ed espandendo la complessità delle popolazioni di cellule renali modificando i protocolli esistenti 9,10,11,12. In questa attuale iterazione del nostro protocollo stabilito 5,13, abbiamo modificato i componenti medi nella prima fase del protocollo in un mezzo base privo di siero integrato con insulina-transferrina-selenio-etanolammina (ITSE), lipidi, alcool polivinilico (E5-ILP) e CHIR99021 (Figura 1). Questi cambiamenti forniscono un mezzo completamente definito, privo di siero, a basso contenuto proteico, con meno componenti rispetto alla nostra precedente composizione media 5,13 e senza ulteriori fattori di crescita. Di conseguenza, il mezzo di prima fase è meno laborioso da preparare rispetto alla nostra versione pubblicata in precedenza e può ridurre la variabilità da lotto a lotto5. Studi precedenti hanno dimostrato che sia l’insulina che la transferrina sono importanti nella coltura priva di siero14,15, tuttavia, alti livelli di insulina possono essere inibitori della differenziazione del mesoderma16. Abbiamo mantenuto i bassi livelli di insulina come previsto nel protocollo originale e ulteriormente ridotto i livelli di KOSR (contenente insulina) nella seconda fase del test. In linea con altri protocolli per la formazione di organoidi renali, livelli più bassi di KOSR sono utili per mantenere un equilibrio tra proliferazione e differenziazione del tessuto renale17. Inoltre, abbiamo abbassato la concentrazione di glucosio nel nostro mezzo di stadio II13.
Il nostro metodo descrive una configurazione per il dosaggio in sospensione di organoidi renali, producendo fino a ~ 1.000 organoidi da una piastra di coltura iniziale di hPSC 100 mm confluente al ~ 60% come descritto nella pubblicazione originale 5,13. Questo protocollo può essere facilmente scalato fino a partire da più piastre da 100 mm o 150 mm per aumentare ulteriormente i numeri organoidi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studi precedenti hanno dimostrato che le fasi iniziali del protocollo sono fondamentali per la differenziazione del mesoderma intermedio 5,19,20 e, pertanto, è essenziale implementare una composizione media rigorosa in questa fase. La rimozione di componenti indefiniti come siero, albumina, ibridoma medio II privo di proteine dal primo stadio del protocollo può aiutare a migliorare l’efficienza di differenziazione coerente tra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata dal National Institutes of Health R01 DK069403, UC2 DK126122 e P30-DK079307 e ASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program to AP.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| Anti-adherence rinsing solution | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
| Corning disposable spinner flasks | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Corning Slow-Speed Stirrers | Fisher Scientific | 11-495-03 | Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot and freeze |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| Egg / Oval Stirring Bars | 2mag | PI20106 | |
| Excelta General-Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 17-456-103 | Keep sterile in the cell culture hood |
| EZBio Single Use Media Bottle, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Used to make PVA 10% |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand Cell Lifters – Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand Multi Function 3D Rotators | Fisher Scientific | 88-861-047 | Orbital shaker |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex. |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamine supplement. |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut Serum Replacement – Multi-Species | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquot and freeze |
| Lipid Mixture 1, Chemically Defined | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X Cleaning Solution | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. |
| Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquot and freeze |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze |
| pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
| pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
| Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS |
| ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Sterile Disposable Serological pipette – 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Serum-free, low protein base medium for E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | If you use more than one MIXdrive |
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