Summary
هنا ، نقدم كيفية توليد نموذج الزرد المرتبط بمرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) المرتبط بسرطان الخلايا الكبدية (HCC) لدراسة تأثير فائض الكوليسترول على البيئة الدقيقة للكبد ومشهد الخلايا المناعية.
Abstract
سرطان الكبد هو حاليا السبب الرئيسي الثالث للوفاة المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم، وسرطان الخلايا الكبدية (HCC) يمثل 75-90٪ من جميع حالات سرطان الكبد. مع إدخال علاجات فعالة للوقاية من التهاب الكبد B / C وعلاجه ، أصبح مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) ، والشكل الأكثر عدوانية المعروف باسم التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) ، بسرعة عوامل الخطر رقم واحد لتطوير HCC في المجتمعات الحديثة. لفهم الدور الذي تلعبه NASH بشكل أفضل في تطوير HCC ، قمنا بتصميم سمكة حمار وحشي HCC مرتبطة ب NASH. الوضوح البصري والجاذبية الجينية ليرقات الزرد تجعلها نموذجا جذابا وقويا لدراسة البيئة الدقيقة للكبد وتكوين الخلايا المناعية باستخدام التصوير الحي الفلوري غير الغازي. يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام نموذج الزرد HCC المرتبط ب NASH للتحقيق في تأثير فائض الكوليسترول في البيئة الدقيقة للكبد وتأثيره على تكوين الخلايا المناعية في المراحل المبكرة من المرض. أولا ، نقوم بتغذية يرقات HCC (s704Tg) ، والتي تعبر عن بيتا كاتينين المنشط الخاص بخلايا الكبد ، مع اتباع نظام غذائي عالي الكوليسترول بنسبة 10٪ لمدة 8 أيام لتطوير نموذج HCC المرتبط ب NASH. هنا نصف كيفية الاستفادة من الخطوط المعدلة وراثيا المختلفة لتقييم العديد من ميزات الأورام الخبيثة المبكرة في الكبد عن طريق المجهر البؤري غير الغازي ، مثل منطقة الكبد والخلية والمورفولوجيا النووية (منطقة خلايا الكبد ، المنطقة النووية ، النسبة النووية: السيتوبلازمية (نسبة N: C) ، الدائرية النووية ، تسجيل النوى الدقيقة / الفتق النووي) وتكوين الأوعية. ثم ، باستخدام خطوط معدلة وراثيا مع خلايا مناعية موسومة (العدلات ، البلاعم ، والخلايا التائية) ، نوضح كيفية تحليل تكوين خلايا الكبد المناعية في يرقات HCC المرتبطة ب NASH. التقنيات الموصوفة مفيدة لتقييم البيئة الدقيقة للكبد وتكوين الخلايا المناعية في مراحل تكوين الكبد المبكرة ، ولكن يمكن أيضا تعديلها لدراسة هذه الميزات في نماذج أمراض الكبد الأخرى.
Introduction
سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو سرطان عدواني مع خيارات علاجية محدودة. وقد وجد أن أكثر من 30٪ من جميع المرضى الذين يعانون من HCC يعانون من السمنة المفرطة ولديهم NASH ، وهو شكل عدواني من NAFLD1،2،3،4. استهلاك الوجبات الغذائية الغنية بالسعرات الحرارية يزيد بشكل كبير من توافر الأحماض الدهنية التي تسبب تحولات الأيض المحلية والجهازية وتؤدي إلى تنكس دهني ، وإصابة خلايا الكبد ، والالتهاب ، والتليف - وكلها ميزات رئيسية ل NASH. يتضمن تقدم NASH إلى HCC تراكم الدهون في الكبد ، مما يؤدي إلى التهاب وتغيير تكوين الخلايا المناعية5،6،7. من الأهمية بمكان والأهمية بمكان فهم كيفية تغيير البيئة الدقيقة للكبد ومشهد الخلايا المناعية أثناء تطور أمراض الكبد ، وكيف تتغير بسبب بعض العوامل المسببة. لتحديد تأثير فائض الكوليسترول بشكل أفضل على البيئة الدقيقة للكبد ومشهد الخلايا المناعية ، قمنا بتطوير نموذج فريد من نوعه لسمك الزرد من HCC المرتبط ب NASH. لقد أعطانا استخدام هذا النموذج فهما أفضل لتأثير النظام الغذائي والتغذية الزائدة على البيئة الدقيقة للكبد وتطور أمراض الكبد.
كانت نماذج الثدييات ، مثل الفئران وعينات الأنسجة البشرية ، ضرورية في فهم التسبب في التهاب الكبد الدهني و steatosis8. الفئران هي النموذج المفضل لأمراض الكبد والسرطان ، لكنها تفتقر إلى الوضوح البصري على المستوى الخلوي ، في حين أن عينات الأنسجة البشرية غالبا ما تفتقر إلى بيئة 3D التي تستطيع النماذج الحيوانية تقليدها. وقد جعلت هذه العقبات من الزرد نموذجا قويا في مجتمع البحوث. الزرد لديها أوجه تشابه ملحوظة مع البشر ، مع الحفاظ على الجينات بنسبة 70٪ على الأقل. أنها تحافظ على البيئة الدقيقة للكبد ، والتركيب الخلوي الكبدي ، والوظيفة ، والإشارات ، والاستجابة للإصابات 9,10. باستخدام نظام غذائي عالي الكوليسترول (HCD) بالاشتراك مع نموذج الزرد المعدل وراثيا من HCC ، قمنا بتطوير نموذج الزرد من HCC المرتبط ب NASH.
نقدم هنا بروتوكولا يشرح كيفية إنشاء نموذج الزرد HCC المرتبط ب NASH وكيفية دراسة البيئة الدقيقة للكبد ومعالجة ميزات الورم الخبيث المبكر في الجسم الحي. باستخدام المجهر البؤري غير الغازي بالاشتراك مع الخطوط المعدلة وراثيا لأسماك الزرد مع غشاء ونواة خلايا الكبد الموسومة بالفلورسنت ، يمكننا معالجة ميزات الورم الخبيث المبكر من خلال تحليل مورفولوجيا الكبد (المساحة والحجم ومساحة السطح) ، ومورفولوجيا الخلايا والنووية (منطقة خلايا الكبد ، المنطقة النووية ، نسبة N: C ، الدائرية النووية ، تسجيل النوى الدقيقة / الفتق النووي) وتكوين الأوعية (كثافة الأوعية). البيئة الدقيقة للخلايا المناعية هي أيضا ميزة مهمة في تكوين الكبد11،12،13،14 ، لذلك ، نعرض أيضا كيفية تحليل تكوين الخلايا المناعية للكبد في يرقات HCC المرتبطة ب NASH ، باستخدام خطوط الزرد المعدلة وراثيا مع الخلايا المناعية الموسومة (العدلات ، البلاعم ، والخلايا التائية). التقنيات الموصوفة فريدة من نوعها للنموذج ومفيدة للغاية لتقييم البيئة الدقيقة للكبد وتكوين الخلايا المناعية في تطور أمراض الكبد.
Protocol
يتم إجراء الدراسات على الحيوانات وفقا للإجراءات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة لكلية ألبرت أينشتاين للطب. للحصول على وصفات للمخازن المؤقتة والحلول المستخدمة في البروتوكول ، يرجى الرجوع إلى الجدول التكميلي 1.
1. إعداد نظام غذائي غني بالكوليسترول بنسبة 10٪ لفائض الكوليسترول الحاد.
- يزن 2 × 4 غرام من حمية اللؤلؤة الذهبية 5-50 نانومتر من الكرات النشطة (GPAS) في دورقين زجاجيين سعة 25 مل - أحدهما للنظام الغذائي العادي (ND) والآخر للنظام الغذائي عالي الكوليسترول بنسبة 10٪ (HCD).
ملاحظة: يمكن استخدام أي نظام غذائي تجاري للأغذية الجافة ليرقات أسماك الزرد. - يزن 0.4 غرام من الكوليسترول في كوب زجاجي 10 مل. غطي الكأس ببعض الرقائق.
- قياس 5 مل من ثنائي إيثيل الأثير باستخدام حقنة 10 مل مع إبرة 20 غرام. بعد ذلك ، أضف ثنائي إيثيل الأثير إلى كوب ND واخلطه على الفور مع الطعام الجاف باستخدام ملعقة.
تنبيه: يسبب ثنائي إيثيل الأثير تهيج العين والجلد والجهاز التنفسي. استخدم فقط في غطاء الدخان الكيميائي. - قم بقياس 5 مل من ثنائي إيثيل إيثر مرة أخرى باستخدام حقنة 10 مل مع إبرة 20 جم وأضفها إلى الكأس سعة 10 مل مع الكوليسترول ، واخلطها على الفور مع الشفط لأعلى ولأسفل مع المحقنة.
- أضف محلول الكوليسترول بسرعة إلى كوب HCD واخلطه على الفور مع ملعقة حتى يصبح المحلول موحدا.
- اترك الأكواب في غطاء المحرك لمدة تصل إلى 24 ساعة لتبخر ثنائي إيثيل إيثر تماما. في اليوم التالي ، قم بطحن وجبات GPAS الغذائية إلى جزيئات دقيقة باستخدام مدقة وهاون.
ملاحظة: يعد طحن الوجبات الغذائية خطوة حاسمة ، ولن تتمكن اليرقات من تناول جزيئات أكبر من 50 نانومتر. - انقل كل نظام غذائي إلى كيس بلاستيكي صغير يحمل علامة أو إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل وخزنه على درجة حرارة -20 درجة مئوية.
2. تحريض NASH مع تغذية اليرقات على المدى القصير مع اتباع نظام غذائي غني بالكوليسترول - ظروف ثابتة.
- إعداد خطوط الأسماك المعدلة وراثيا في اليوم -1 (الجدول 1). في صباح اليوم التالي (اليوم 0) ، بعد أن تفرخ الأسماك ، قم بجمع البيض في مصفاة شبكية.
- باستخدام زجاجة غسيل بماء الجنين (E3) ، اشطف البيض جيدا وانقل البيض بعناية إلى أطباق بتري 10 سم مع وسط E3.
- نظف الألواح من جميع الحطام الذي قد يكون تراكم في صناديق التكاثر ، بما في ذلك أي بيض ميت أو غير مخصب.
ملاحظة: شطف البيض وتنظيف الألواح أمر بالغ الأهمية لتجنب النمو غير المنضبط للكائنات الحية الدقيقة وما يترتب على ذلك من عيوب في تطور اليرقات. - قسم البيض بكثافة 70/80 لكل أطباق بتري 10 سم (في 25 مل من E3). في اليوم 1 ، تحت نطاق تشريح مجهز بقاعدة إضاءة ، قم بفحص وتنظيف الأجنة الميتة أو الأجنة ذات العيوب التنموية.
ملاحظة: استخدم وضع الحقل المظلم لقاعدة الإضاءة الشفافة لتحديد الأجنة ذات تأثيرات التطور وللتحقق من نمو الكائنات الحية الدقيقة في اللوحات. المرافق المختلفة لها عائد مختلف من الكائنات الحية الدقيقة في أنظمتها. تغيير E3 المتوسطة و / أو الأطباق إذا لزم الأمر ، لتجنب الآثار السلبية. - في اليوم الخامس ، امزج اليرقات من جميع الأطباق في طبق بتري 15 سم ، أضف E3 بدون أزرق الميثيلين. بعد ذلك ، قسم اليرقات في صناديق التغذية على النحو التالي (الجدول 2).
ملاحظة: في ظروف التحكم ، لتوليد يرقات صحية دون إثارة التهاب مزمن جهازي ، يجب تغذية اليرقات بحوالي 0.1 ملغ من الطعام لكل يرقات يوميا. لاحظ أن إجمالي كمية الطعام (الجدول 2) مقسمة بالتساوي على وجبتين يوميا. - احتفظ باليرقات في حاضنة عند 28 درجة مئوية ، في دورة ضوء مظلم (على سبيل المثال ، 14 ساعة ضوء / 10 ساعات دورة مظلمة) ، وتغذية اليرقات مرتين في اليوم من اليوم 5 إلى اليوم 12.
- استنشق يوميا أي حطام طعام ، وكذلك 90-95٪ من الوسط باستخدام نظام فراغ متصل بطرف ماصة 1 مل. بعد ذلك صب بعناية E3 الجديد بدون أزرق الميثيلين في زاوية واحدة من صندوق التغذية لتجنب إتلاف اليرقات.
ملاحظة: التنظيف اليومي لصناديق التغذية أمر بالغ الأهمية لتجنب النمو غير المنضبط للكائنات الحية الدقيقة.
3. جمع يرقات 13 يوما بعد الإخصاب من صناديق التغذية.
- في اليوم 13 ، قم بإعداد أطباق المجموعة وفقا لعدد الظروف التجريبية التي تم إعدادها. باستخدام قلم تحديد دائم ، ضع علامة على جانب الأطباق (الغطاء والأسفل) لتجنب تبديل العينات ، على سبيل المثال شريط أسود واحد للنظام الغذائي العادي (ND) وخطين أسودين ل HCD.
- صب ما يكفي من E3 بدون أزرق الميثيلين لتغطية الجزء السفلي من كل طبق. باستخدام نظام التفريغ بعناية ، قم بشفط الماء من صناديق التغذية ، حاول شفط أي حطام أو يرقات ميتة من القاع لتجنب نقل هذه المواد إلى أطباق التجميع.
- عندما يبدأ مستوى الماء في الانخفاض ، ارفع صندوق التغذية ببطء لجعل اليرقات تسبح إلى أحد الزوايا ، ثم تستنشق في الاتجاه المعاكس.
ملاحظة: استخدم ماصة 1 مل مع أطراف قطع ، على ارتفاعات مختلفة ، للسماح بأقطار مختلفة عند شفط الماء. قم بالتناوب بين الأحجام المختلفة ، وابدأ بقطر أكبر ، وتغير إلى قطر أصغر مع انخفاض حجم الماء وزيادة كثافة اليرقات. - بمجرد أن يكون هناك حوالي 20-30 مل فقط من السائل ، قم بصب اليرقات بعناية في طبق بتري المعد في الخطوة 1. ضع الشريط الملصق من صندوق التغذية على غطاء الطبق.
- كرر الخطوات من 3.2 إلى 3.4 لكافة مربعات التغذية.
4. فحص التحكم في التنكس الدهني الكبدي الناجم عن النظام الغذائي - تلطيخ الزيت الأحمر O (ORO) والتصوير والتسجيل.
- باستخدام ماصة باستور الزجاجية ، انقل 15-20 يرقات إلى أنبوب سفلي مستدير سعة 2 مل وضعه على الجليد لمدة 15-30 دقيقة. قم بإزالة معظم الوسائط من الأنبوب.
- أضف 2 مل من 4٪ من بارافورمالدهيد (PFA) لإصلاح اليرقات واحتضانها عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة محلول PFA بنسبة 4٪ واغسل اليرقات ثلاث مرات باستخدام 2 مل من 1x PBS.
- قم بإعداد لوحة بئر 12 (الشكل 2A) لكل حالة مع إدراج شبكة واحدة بشكل جيد.
- باستخدام ماصة زجاجية ، انقل اليرقة من أنبوب 2 مل إلى الإدراج الذي تم وضعه مسبقا في البئر ، وأضف 5 مل من 1x PBS. احفظ أنابيب 2 مل لتخزين العينات بعد التلطيخ.
تحذير: اليرقات لزجة للغاية في هذه المرحلة لا تستخدم الماصات البلاستيكية. - نقل إدراج مع اليرقات إلى بئر آخر مع 5 مل من محلول الأيزوبروبانول 60٪. احتضان اليرقات لمدة 30 دقيقة درجة حرارة الغرفة (RT).
- وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد 0.3٪ Oil Red O في محلول Isopropanol بنسبة 60٪. قم بتصفية محلول الزيت الأحمر بنسبة 0.3٪ مرتين باستخدام فلتر حقنة 0.45 ميكرومتر.
ملاحظة: تحضير 5 مل من المحلول لكل بئر عن طريق خلط 3 مل من 0.5٪ زيت أحمر O في الأيزوبروبانول مع 2 مل من الماء المقطر. يجب إعداد 0.3٪ Oil Red O في محلول Isopropanol بنسبة 60٪ طازجا. - بعد ذلك ، انقل إدراج الشبكة مع اليرقات إلى بئر آخر مع 5 مل من 0.3٪ من الزيت الأحمر الطازج O في محلول Isopropanol بنسبة 60٪. اليرقات المحتضنة لمدة 3 ساعات في RT مع هزاز لطيف.
- بعد تلطيخ ORO ، شطف اليرقات عن طريق نقل إدراج إلى بئر آخر مع 60 ٪ Isopropanol. اغسل اليرقات مرتين في 60٪ Isopropanol لمدة 30 دقيقة في كل مرة عن طريق نقل الإدراج بالتتابع إلى الآبار مع 60٪ Isopropanol.
- اغسل اليرقات ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في 1x PBS-0.1٪ Tween عن طريق نقل الإدراج بالتتابع إلى الآبار مع 1x PBS-0.1٪ Tween.
- نقل اليرقات إلى أنابيب 2 مل. إزالة PBST، إضافة 1 مل من 80٪ الجلسرين، وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى التصوير.
- للحصول على تصوير أفضل ، قم بنقل اليرقات إلى 1x PBS-0.1٪ Tween وتحت نطاق تشريح الكبد عن طريق سحب الأنسجة بعناية باستخدام ملقطين # 55.
ملاحظة: إذا كنت تستخدم تصوير خلفية كاسبر يمكن أن يتم باستخدام اليرقات بأكملها. - باستخدام ماصة زجاجية ، انقل الكبد بعناية إلى بئر من لوحة بقعة البورسلين مع 50٪ جلسرين. ضع الكبد باستخدام أداة صغيرة للتعامل مع اليرقات (على سبيل المثال ، أداة الرموش - الشكل 2B). صورة الكبد في المجهر ستيريو مجهزة بكاميرا ملونة.
- سجل التنكس الدهني الكبدي (لا تلطيخ ORO = لا شيء ؛ تلطيخ ORO أحمر فاتح = خفيف ؛ تلطيخ ORO أحمر داكن = معتدل / شديد).
5. التصوير البؤري غير الغازي باستخدام جهاز جرح وانحباس الزرد للنمو والتصوير (zWEDGI).
- تحضير طبق بتري 10 سم مع 15-20 مل من 1x Tricaine-E3 ، وهو ما يكفي فقط لتغطية القاع.
ملاحظة: يمكن الحصول على محلول عمل 1x Tricaine-E3 (0.16 ملغم / مل) عن طريق تخفيف 2 مل من محلول مخزون تريكاين 25x (4 ملغ / مل) في 48 مل من E3. يجب ألا يتجاوز تركيز التريكائين 0.16 ملغم / مل لأن اليرقات حساسة للغاية للتخدير في مرحلة التطور هذه. - انقل 15-20 يرقات باستخدام ماصة باستور بلاستيكية إلى طبق بتري الذي يحتوي على 1x Tricaine-E3 وقم بتخدير اليرقات لمدة 5 دقائق.
- تحضير لوحة 6 بئر مع 2-3 مل من E3 دون الميثيلين الأزرق لكل بئر.
- على المجهر الاستريو الفلوري ، قم بفحص اليرقات المخدرة بحثا عن علامات الفلورسنت المطلوبة (الجدول 1). انقل اليرقات التي تم فحصها في الحد الأدنى من Tricaine في E3 واتركها تتعافى في لوحة البئر 6 حتى يحين وقت التصوير.
ملاحظة: يستغرق فحص اليرقات المعدلة وراثيا المزدوجة والثلاثية والرباعية وقتا ، ويضع اليرقات في E3 ويغير الوسائط من لوحة البئر 6 في كثير من الأحيان لتقليل التعرض غير الضروري للتريكايين. أيضا ، تطفو اليرقات في هذه المرحلة التنموية ، لذا استخدم أداة رموش لوضع اليرقات للفحص دون التسبب في تلف الأنسجة. - بعد الفحص ، قم بإعداد طبق بتري 10 سم مع 25 مل من 1x Tricaine-E3. انقل 15-20 يرقات باستخدام ماصة باستور بلاستيكية إلى طبق بتري الذي يحتوي على 1x Tricaine-E3 وقم بتخدير اليرقات لمدة 5 دقائق.
- وفي الوقت نفسه ، تحت المجهر المجسم ، أضف 1x Tricaine-E3 إلى غرف جهاز الجرح والانحباس (على سبيل المثال ، zWEDGI) 15،16. قم بإزالة فقاعات الهواء من الغرف ونفق التقييد باستخدام ماصة دقيقة P200. قم بإزالة كل ما يزيد عن 1x Tricaine-E3 تاركا حجما كافيا فقط لملء الغرف.
- انقل يرقة مخدرة إلى غرفة التحميل في zWEDGI ، وضعها باستخدام أداة رموش تحت المجهر المجسم. بلطف ، اضغط على رأس اليرقات وادفعها بحيث يدخل الذيل نفق التقييد. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام الماصة الدقيقة إزالة 1x Tricaine-E3 من غرفة الجرح لمساعدة اليرقة على دخول النفق. تأكد من وضع اليرقة بشكل مناسب لتصوير الفص الأيسر - المجهر المقلوب: الجانب الأيسر يواجه لأسفل ؛ المجهر المستقيم: الجانب الأيسر مواجه لأعلى.
ملاحظة: إذا لم يكن zWEDGI متوفرا ، فيمكن تركيب الأسماك ووضعها في أغاروز منخفض درجة الانصهار بنسبة 1٪ في 1x Tricaine-E3 ، ومع ذلك ، يمكن استخدام غمر الأغاروز فقط للتصوير السريع (حتى 15 دقيقة). - لتحليل خلايا الكبد والمورفولوجيا النووية ، صور الكبد باستخدام مجهر متحد البؤرة باستخدام هدف هوائي 40x وأكوام z من مقاطع بصرية 2 ميكرومتر. بالنسبة لمورفولوجيا الكبد ، وتكوين الأوعية الدموية ، وفحوصات توظيف الخلايا المناعية ، صور الكبد باستخدام هدف هوائي 20x وأكوام z من 5 ميكرومتر من الأقسام البصرية. بالنسبة لليرقات ذات الكبد الكبير ، يجب التقاط صور بلاط 2 × 2 لضمان تصوير جميع الكبد والمنطقة المحيطة به من 75 ميكرومتر.
- بعد التصوير ، استخدم ماصة باستور بلاستيكية مع 1x Tricaine-E3 لسحب اليرقة من نفق التقييد ونقلها إلى طبق بتري مع E3 بدون أزرق الميثيلين.
6. تحليل الاختلافات المورفولوجية الكبدية.
ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات المذكورة أدناه لمساحة سطح الكبد وتحديد حجمه:
- افتح برنامج التصوير. أضف مجلدا يحتوي على ملفات صور ليتم تحليلها إلى Arena مع تحديد رمز مجلد المراقبة . بعد ذلك ، بالنقر بزر الماوس الأيمن على الصور المصغرة ، حدد تحويل إلى تنسيق ملف Imaris الأصلي لتحويل الملفات إلى التنسيق (.ims).
- في القائمة الفرعية Surpass، اضبط السطوع والتباين لكل قناة. بعد ذلك ، قم بإنشاء سطح من الكبد بالنقر فوق الزر الأزرق إضافة أسطح جديدة .
- بعد ذلك ، في لوحة إنشاء السطح ، حدد تقسيم منطقة ذات أهمية فقط لإنشاء سطح الكبد يدويا.
- انقر على تخطي | الإنشاء التلقائي خيار التحرير يدويا. حدد كفاف وقم بإلغاء تحديد خيار "مستوى الصوت" في لوحة المشهد.
ملاحظة: يجب إلغاء تحديد خيار عرض وحدة التخزين، وإلا فلن يتمكن من تحديد المنطقة ذات الأهمية في مكدسات z مختلفة. - انتقل عبر مكدسات z وارسم المنطقة ذات الأهمية في كل مستوى عن طريق تحديد الوضع ، واختر وضع الرسم الذي تفضله. لبدء رسم مؤشر التغيير إلى وضع التحديد وليس التنقل ، انقر بعد ذلك على رسم وابدأ في سحب المؤشر من خلال الكبد لرسم عائد الاستثمار.
- بعد تحديد عائد استثمار في المستويات البؤرية المختلفة ، حدد إنشاء سطح لدمج جميع عائد الاستثمار المحدد وإنشاء سطح كبد.
- بعد ذلك ، باستخدام السطح الذي تم إنشاؤه حديثا ، قم بإنشاء قناع لإشارة خلايا الكبد. انقر على السطح وضمن علامة التبويب تحرير (القلم الرصاص) اختر قناع الكل. في النافذة التي تظهر ، اختر القناة التي ترغب في إخفائها والتي سيتم استخدامها لتحديد حجم الكبد ومساحة السطح. ثم، اختر تعيين voxels خارج السطح إلى 0 وحدد خيار مضاعفة القناة قبل تطبيق القناع.
- استخدم قيم مساحة سطح الكبد وحجمه من قائمة التحليل الإحصائي للتحليل.
ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات التالية لقياس مساحة الكبد.
- افتح برنامج فيجي. في قائمة المكونات الإضافية، حدد التنسيقات الحيوية متبوعة بمستورد التنسيقات الحيوية، وحدد خيار تقسيم القنوات لفتح ملف الصورة.
- من القائمة صورة، حدد خصائص للتحقق من أن الصورة تحتوي على حجم البكسل الصحيح وعمق voxel، إن لم يكن القيم الصحيحة. بعد ذلك ، انتقل إلى قائمة الصور ، وانقر فوق ضبط متبوعا بالسطوع والتباين ، واضبط سطوع الصورة وتباينها.
- بعد ذلك ، باستخدام قناة خلايا الكبد إنشاء إسقاط أقصى كثافة للكبد. انتقل إلى قائمة الصور ، وانقر فوق Stacks متبوعا ب Z Project. حدد الحد الأقصى لإسقاط الكثافة.
- باستخدام أداة الاختيار الحر ، قم يدويا بإنشاء منطقة مهتمة (ROI) تحيط بكبد اليرقات. بعد ذلك ، في قائمة تحليل ، انقر فوق قياس للحصول على منطقة الكبد. احفظ النتائج كجدول بيانات لمزيد من التحليل.
7. خلايا الكبد والتحليل المورفولوجي النووي.
- افتح برنامج فيجي. في قائمة المكونات الإضافية، حدد التنسيقات الحيوية متبوعة بصيغة مستورد التنسيقات الحيوية حدد خيار تقسيم القنوات لفتح ملف الصورة.
- من القائمة صورة، حدد خصائص للتحقق من أن الصورة تحتوي على حجم البكسل الصحيح وعمق voxel، إن لم يكن القيم الصحيحة. بعد ذلك ، انتقل إلى قائمة الصور ، وانقر فوق ضبط متبوعا بالسطوع والتباين ، واضبط سطوع الصورة وتباينها.
- في القائمة تحليل ، حدد تعيين القياسات على جميع المعلمات التي تريد تحليلها (على سبيل المثال، واصفات المساحة والمحيط والشكل). حدد قناة غشاء خلايا الكبد الفلورية. عند التنقل عبر Z ، استخدم أداة التحديد الحر لرسم عائد استثمار مثالي حول خلية كبدية واحدة. بعد ذلك ، في قائمة تحليل ، انقر فوق قياس لحساب مساحة خلايا الكبد.
- كرر الخطوة 7.3 ل 15-30 خلية كبدية. احفظ النتائج كجدول بيانات لمزيد من التحليل.
- بعد ذلك ، حدد قناة الفلورسنت النواة. عند التنقل عبر Z ، استخدم أداة التحديد اليدوية لرسم عائد استثمار مثالي حول نواة خلايا الكبد. بعد ذلك ، في قائمة التحليل ، انقر فوق قياس لحساب المنطقة النووية والدائرية.
- كرر الخطوة 7.5 ل 15-30 خلية كبدية. احفظ النتائج كجدول بيانات لمزيد من التحليل ، بما في ذلك تحديد نسبة الطاقة النووية: السيتوبلازمية.
- تسجيل عينات لوجود النوى الدقيقة والفتق على النحو التالي (الجدول 3).
8. تحليل تولد الأوعية.
- قم بإنشاء سطح للكبد يدويا كما هو موضح في القسم 6 من هذا البروتوكول. قم بتسمية هذا السطح باسم "سطح الكبد".
- إنشاء قناع لإشارة الخلايا البطانية داخل الكبد. انقر على السطح وتحت علامة التبويب تحرير (القلم الرصاص) اختر قناع الكل. في النافذة التي تظهر ، اختر قناة الخلايا البطانية لعزل إشارات الأوعية الدموية فقط من الكبد. اختر تعيين voxels خارج السطح إلى 0 وحدد خيار تكرار القناة قبل تطبيق قناع.
- إعادة تسمية الخلايا البطانية الجديدة المقنعة قناة باسم الكبد الوعائي.
- لقياس حجم السفينة ومساحة السطح إنشاء سطح ثان. انقر على الزر الأزرق إضافة أسطح جديدة . في الخطوة الأولى من إنشاء السطح، تأكد من إلغاء تحديد جميع الخيارات لإنشاء سطح تلقائيا.
- في الخطوة الثانية ، اختر قناة الكبد الوعائية لإنشاء سطح فوق. قم بإلغاء تحديد خيار التجانس للكشف عن أكبر عدد ممكن من التفاصيل من السفن وتمكين طرح الخلفية في خيار العتبة.
- اضبط العتبة للتأكد من أن السطح المكتشف يتزامن مع إشارة الأوعية الدموية في الكبد. استخدم قيم مساحة السطح والحجم من قائمة التحليل الإحصائي. احسب مؤشر كثافة الأوعية باستخدام المعادلات التالية:
مؤشر كثافة الأوعية الدموية (بواسطة الكبد ميكرومتر 2) = (مساحة سطح الوعاء (μm 2)) / (مساحة سطح الكبد (μm2))
مؤشر كثافة الأوعية الدموية (بواسطة الكبد μm 3) = (حجم الأوعية (μm 3)) / (حجم الكبد (μm3))
9. تحليل تجنيد الخلايا المناعية.
- افتح برنامج فيجي. في قائمة المكونات الإضافية، حدد التنسيقات الحيوية متبوعة بصيغة مستورد التنسيقات الحيوية حدد خيار تقسيم القنوات لفتح ملف الصورة.
- من القائمة صورة ، حدد خصائص للتحقق من أن الصورة تحتوي على حجم البكسل الصحيح وعمق voxel، إن لم يكن القيم الصحيحة. بعد ذلك ، انتقل إلى قائمة الصور ، وانقر فوق ضبط متبوعا بالسطوع والتباين ، واضبط سطوع الصورة وتباينها (على سبيل المثال ، البلاعم - mCherry أو dTomato. العدلات - BFP ؛ الخلايا التائية - EGFP ؛ خلايا الكبد - EGFP أو mCherry).
- بعد ذلك ، قم بإنشاء إسقاطات قصوى الكثافة لكل قناة.
- كما هو موضح في القسم 6 (الخطوات 6.9-6.12) ، قم بإنشاء عائد استثمار يحيط بالكبد اليرقي وقياس منطقة الكبد. قم بإنشاء عائد استثمار ثان بما في ذلك منطقة الكبد والمنطقة المحيطة ب 75 ميكرومتر ("منطقة التوظيف").
- بعد ذلك ، في القائمة تحرير ، حدد خيار التحديد متبوعا بإضافة إلى المدير. عند اختيار قناة خلية مناعية فطرية الحد الأقصى للكثافة ، انقر فوق عائد الاستثمار على الكبد من نافذة ROI Manager لتعيين منطقة التوظيف.
- في قائمة المكونات الإضافية، حدد خيار تحليل متبوعا بعداد الخلايا وقم بحساب الخلايا المناعية داخل منطقة التوظيف. سجل عددا من الخلايا المناعية المعينة في منطقة الكبد على جدول بيانات.
- حساب العدلات والبلاعم وكثافات الخلايا التائية عن طريق تطبيع عدد الخلايا المناعية لكل منطقة كبد.
Representative Results
عن طريق إدخال نظام غذائي قصير الأجل عالي الكوليسترول في نموذج الزرد لسرطان الخلايا الكبدية (HCC) ، والذي يبالغ في التعبير عن شكل نشط محدد من خلايا الكبد من بيتا كاتينين (s704Tg; Tg (fabp10a: pt-B-cat, cryaa:Venus)17 ، نحن قادرون على إنشاء نموذج فقاري غير ثديي من HCC المرتبط ب NASH. يمكن مراقبة تطور أمراض الكبد في وقت مبكر عن طريق قياس التنكس الدهني الكبدي ، وحجم الكبد ، وخلايا الكبد ، والتشكل النووي ، وتكوين الأوعية الدموية ، وتسلل الخلايا المناعية (الشكل 1).
لا تظهر يرقات HCC التي تتغذى على نظام غذائي طبيعي أي شيء إلى تنكس دهني كبدي خفيف ، يتم قياسه بواسطة تلطيخ Oil Red O. ومع ذلك ، فإن يرقات HCC التي تتغذى على نظام غذائي عالي الكوليسترول تظهر زيادة كبيرة في التنكس الدهني الكبدي (الشكل 2).
علامة معروفة لأمراض الكبد هي تضخم الكبد17. لتقييم حجم الكبد ، يمكن تجاوز يرقات HCC بخط معدل وراثيا يعبر على وجه التحديد عن علامة فلورسنت على خلايا الكبد ، مثل Tg (fabp10a: H2BmCherry). لتقييم تضخم الكبد ، يتم إجراء تقييم لمنطقة الكبد (2D) ، ومنطقة سطح الكبد ، وحجم الكبد (3D). بعد 8 أيام من التعرض لفائض الكوليسترول ، لوحظ تضخم الكبد في يرقات HCC (الشكل 3).
باستخدام التصوير الحي غير الغازي ، يمكن استخدام خطوط الأسماك المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت في أغشية خلايا الكبد (مثل Tg (fabp10a: Life-actin-EGFPP) وفي نوى خلايا الكبد (مثل Tg (Fabp10a: H2B-mCherry) لتقييم تغيرات المورفولوجيا الخلوية والنووية المرتبطة بالورم الخبيث في خلايا الكبد. وزادت مساحة الخلايا الكبدية في HCC المرتبط ب NASH (الشكل 4A و B و D) ، وكذلك المنطقة النووية (الشكل 4C ، E) والنسبة النووية: السيتوبلازمية (الشكل 4F). ولوحظ أيضا انخفاض كبير في الدائرية النووية في مجموعة HCD+HCC (الشكل 4G). تؤدي السمية الشحمية إلى تلف الحمض النووي ، وهي سمة من سمات التسرطن في وجود النوى الدقيقة. باستخدام علامة H2B-mCherry ، لاحظنا حدوث أكبر للنوى الدقيقة في يرقات HCC التي تتغذى على نظام غذائي عالي الكوليسترول (الشكل 4H).
يمكن بسهولة تقييم الأوعية الدموية الكبدية في نماذج أسماك الزرد باستخدام خط موسوم معدل وراثيا ، مثل Tg (kdrl: mCherry أو Tg (fli: EGFP) ، والتي تسمي الأوعية الدموية. لوحظت زيادة كبيرة في كثافة الأوعية في يرقات HCC + HCD (الشكل 5).
لمراقبة الاستجابة الالتهابية التي تم تشغيلها في وقت مبكر من HCC المرتبط ب NASH ، تم تجاوز خط الأسماك المعدلة وراثيا الذي يعبر عن البروتينات الفلورية في البلاعم والعدلات ، مثل Tg (mfap4: tdTomato-CAAX ؛ lyz: BFP) ، مع خط HCC المعدل وراثيا. يحدث تسلل العدلات والبلاعم في كل من HCC و HCC التي تتغذى على HCD ، والتي تم تقييمها من خلال تحديد كمية عدد وكثافة العدلات / البلاعم في الكبد والمناطق المجاورة (المنطقة المحيطة حتى 75μm) (الشكل 6A-H). ومع ذلك، أظهر HCC + HCD زيادة كبيرة في عدد العدلات وكثافتها (الأشكال 6F-H). في 13 يوما بعد الإخصاب ، يكون الجهاز المناعي التكيفي يعمل بالفعل. استخدام خط أسماك معدل وراثيا يعبر عن بروتين الفلورسنت في الخلايا التائية ، مثل Tg(lck: EGFP) ، وبالاشتراك مع خط HCC المعدل وراثيا ؛ قمنا بتقييم تأثير فائض الكوليسترول على توظيف الخلايا التائية في الكبد. ولوحظ انخفاض كبير في كثافة الخلايا التائية والعدد الإجمالي في يرقات HCC التي تتغذى على HCD (الشكل 6I-K).
| خطوط الزرد المعدلة وراثيا | مرجع ZFIN | تحليل |
| كاسبر | رويa9; ميتفاW2 | التنعيم الكبدي |
| Tg (fabp10a: pt-β-catenin_cryaa: فينوس / fabp10a: H2B-mCherry) | s704Tg / uwm41Tg | مورفولوجيا الكبد |
| Tg (fabp10a: pt-β-catenin_cryaa: Venus; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP) | s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg | خلايا الكبد والمورفولوجيا النووية |
| Tg (fabp10a: pt-β-catenin_ cryaa: Venus; fli:EGFP) | s704Tg / y1Tg | تولد الأوعية الدموية |
| Tg (fabp10a: pt-β-catenin_cryaa: كوكب الزهرة; mfap4: الطماطم CAAX. ليزك: BFP) | s704Tg / xt6Tg / zf2171Tg | توظيف البلاعم والعدلات |
| Tg (fabp10a: pt-β-catenin_cryaa: الزهرة؛ lck: EGFP) | s704Tg / cz1Tg | تجنيد الخلايا التائية |
الجدول 1: خطوط الزرد المعدلة وراثيا لاستخدامها في فحوصات مختلفة.
| عدد اليرقات | حجم صندوق التغذية | كمية الطعام يوميا (ملغ) | حجم E3 (مل) |
| 30-40 | صندوق تربية صغير | 3-4 | 200 |
| 60-80 | صندوق تربية صغير / كبير | 6-8 | 400 |
| 100-150 | صندوق تربية كبير | 10-15 | 500 |
الجدول 2: إعداد شروط صناديق التغذية.
| الظاهري | طريقة تسجيل النقاط |
| اي | النوى الطبيعية، لا توجد نوى دقيقة أو فتق |
| متوسط | انخفاض عدد النوى الدقيقة (أقل من 5 لكل مجال رؤية) و / أو الفتق |
| معتدل / شديد | عدد معتدل إلى مرتفع من النوى الدقيقة (أكثر من 5 لكل مجال رؤية) و / أو الفتق |
الجدول 3: تسجيل النوى الدقيقة والفتق النووي.
الشكل 1: مخطط البروتوكول الذي يلخص الخطوات التجريبية الرئيسية ونهج التحليل.
الشكل 2: فحص التحكم في تنكس دهني الكبد - تلطيخ ORO. تم تغذية يرقات HCC بنظام غذائي طبيعي أو مرتفع الكوليسترول وتم إجراء تلطيخ Oil Red O (ORO) لتقييم التنكس الدهني الكبدي. (أ) رسم تخطيطي للوحة البئر 12 لإجراء تلطيخ ORO متسلسل باستخدام إدخالات البئر الشبكية. (ب) صورة لأداة الرموش المستخدمة في التعامل مع اليرقات. (ج) صور تمثيلية للكبد الملطخ باللون الأحمر الزيتي؛ HCC و HCC + HCD يرقات. (د) رسم بياني مربع كاي يوضح النسبة المئوية لليرقات ذات الدرجات المختلفة للتنكس الدهني الكبدي. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور تمثيلية من حجم الكبد. تم تصوير يرقات HCC المعدلة وراثيا التي تعبر عن علامة الكبد (Tg(fabp10a:H2B-mCherry)) حية وغير غازية ، على مجهر مقلوب دوار القرص البؤري باستخدام zWEDGI. (أ) إعادة بناء الكبد 3D التمثيلية في يرقات HCC و HCC + HCD. (ب-د) رسم بياني يوضح التغيرات المورفولوجية في الكبد بما في ذلك منطقة الكبد (B) ومساحة سطح الكبد (C) وحجم الكبد (D) في يرقات HCC و HCC + HCD. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور تمثيلية من خلايا الكبد ومورفولوجيا النوى. تم تصوير خطوط HCC المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت في أغشية خلايا الكبد (Tg(fabp10a:Life-actin-EGFP) وفي نوى خلايا الكبد (Tg(fabp10a:H2B-mCherry). (أ-ج) إعادة بناء 3D تمثيلية لنوى F-actin وخلايا الكبد من يرقات HCC و HCC + HCD. تظهر رؤوس الأسهم المفتوحة نوى متضخمة. تظهر رؤوس الأسهم البيضاء نواة ذات شكل متغير ؛ وتظهر الأسهم الحمراء النوى الدقيقة والفتق النووي. (D-G) رسوم بيانية توضح متوسطات المعلمات الخلوية والنووية في يرقات HCC و HCC + HCD البالغة من العمر 13 يوما. (د) منطقة خلايا الكبد. (ه) المنطقة النووية. (و) النووية: نسبة السيتوبلازم. (ز) التعميم النووي. تمثل كل نقطة متوسطات لكل يرقة. تظهر مخططات النقاط متوسط الرسوم البيانية المربعة Chi-square ±SEM (H) التي تظهر النسبة المئوية لليرقات ذات الدرجات المختلفة للنوى الدقيقة والفتق النووي. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صور تمثيلية من الأوعية الدموية الكبدية. خطوط HCC المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية في نوى خلايا الكبد (Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) وفي الخلايا البطانية (Tg)fli:EGFP)). (أ) إعادة بناء تمثيلية ثلاثية الأبعاد للأوعية الدموية الكبدية في يرقات HCC و HCC + HCD. (ب-ج) رسم بياني يوضح مؤشر كثافة الأوعية حسب مساحة سطح الكبد (B) الحجم (C) في يرقات HCC و HCC + HFCD. تظهر مخططات النقاط متوسط ±SEM. شريط المقياس = 50 ميكرومتر .
الشكل 6: صور تمثيلية من مشهد خلايا الكبد المناعية. خط HCC المعدل وراثيا الذي يعبر عن البروتينات الفلورية في البلاعم والعدلات (Tg(mfap4: tdTomato-CAAX؛ lyz: BFP) أو في الخلايا التائية (Tg(lck-EGFP). (أ، ج، و) ممثل 3D إعادة بناء الكبد وتجنيد الكريات البيض إلى منطقة الكبد في 13 يوما HCC و HCC + HCD يرقات. (ب) رسم تخطيطي لمنطقة الكبد المصورة. (مد إلى هاء) رسم بياني يوضح كثافة البلاعم (D) وعددها (E) في منطقة الكبد في يرقات HCC و HCC + HCD. (G-H) رسم بياني يوضح كثافة العدلات (G) وعددها (H) في منطقة الكبد في يرقات HCC و HCC + HCD. (ز) إعادة بناء تمثيلية ثلاثية الأبعاد لتوظيف الخلايا التائية في منطقة الكبد في يرقات HCC و HCC + HCD. (H-I) رسم بياني يوضح كثافة الخلايا التائية (H) وعددها (I) في منطقة الكبد في يرقات HCC و HCC + HCD. تظهر مخططات النقاط متوسط ±SEM. شريط المقياس = 50 ميكرومتر .
الجدول التكميلي 1: جدول المخازن المؤقتة والحلول يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
Discussion
مع زيادة حدوث HCC ، وتحديدا HCC الناجم عن NASH ، من الأهمية بمكان أن يكون لديك نماذج أكثر كفاءة لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية المشاركة في HCC المرتبطة ب NASH. يعد فك الالتفاف بين التفاعلات بين الخلايا والخلايا في الكبد أمرا بالغ الأهمية لفهم تطور أمراض الكبد وتكوين الكبد بشكل أفضل. يوفر النهج الموصوف في هذا البروتوكول طريقة فريدة لتحليل تطور أمراض الكبد في الجسم الحي وغير الغازي.
يعد إعداد النظام الغذائي أمرا بالغ الأهمية لنجاح إنشاء نموذج HCC المرتبط ب NASH. من المهم السماح لثنائي إيثيل الأثير بالتبخر تماما داخل غطاء الدخان لتجنب الآثار الضارة ، أثناء إعداد الوجبات الغذائية لسمك الزرد. لاستخدام هذه الوجبات الغذائية مع اليرقات (5-12 يوما بعد الإخصاب) ، من المهم للغاية طحن الوجبات الغذائية إلى جزيئات دقيقة لضمان تناول الطعام من قبل اليرقات. يمكن استخدام نظائر الأحماض الدهنية الموسومة بالفلورسنت لتقييم تناول الطعام في اليرقات.
قبل وضع اليرقات في صناديق التكاثر وبدء إجراء التغذية ، من الأهمية بمكان التأكد من توحيد العينات التجريبية عن طريق خلط اليرقات من لوحات مختلفة. هذه الخطوة مهمة لأن البيئات الدقيقة المختلفة ، بدءا من اليوم 0 ، يتم الترويج لها في كل لوحة من اللوحات وقد تؤثر على الاستجابة الالتهابية.
خطوة أخرى مهمة هي حساب اليرقات ، لمعرفة كمية الطعام اللازمة لكل صندوق تغذية. إذا كانت كمية الغذاء غير كافية لعدد اليرقات الموجودة في كل صندوق ، فسيحدث أحد السيناريوهين: 1) ستعاني اليرقات من نقص التغذية. 2) سيتم الإفراط في تغذية اليرقات. ستؤدي التغذية غير الدقيقة إلى ظروف غير صحية مرتبطة بسوء التغذية أو الإفراط في التغذية ، مثل الالتهاب ، مما سيؤثر بشكل كبير على البيئة الدقيقة للكبد. في حالة حدوث تغذية غير دقيقة ، ستظهر اليرقات مشكلات في الحركة. في مرحلة التطور هذه ، يجب أن تسبح اليرقات بشكل مكثف ، لذلك إذا لوحظت مشاكل في الحركة ، فقد أثيرت اليرقات في ظل ظروف غير صحية (سوء التغذية أو التعرض لجرعات سامة من الكوليسترول بسبب الإفراط في التغذية). لهذا السبب ، يجب التحكم في إجراءات التغذية بإحكام لكل من الوجبات الغذائية ، الطبيعية والمخصبة بالكوليسترول. يمكن إجراء بعض الفحوصات لمعالجة دقة تغذية وصحة اليرقات بسرعة بما في ذلك وجود تضخم الكبد (حجم الكبد) والتهاب الأنسجة والأعضاء ، وخاصة الكبد والأمعاء (زيادة واضحة في تسلل العدلات والبلاعم).
يعد التنظيف اليومي واستبدال 95٪ من E3 أمرا محوريا للحد من نمو الكائنات الحية الدقيقة في صناديق التغذية وتحسين صحة اليرقات وبقائها. بدلا من ذلك ، يمكن وضع اليرقات في نظام حامل مستقل. للحصول على أفضل النتائج ، ضع 60-80 يرقات في خزان سعة 3 لترات. حافظ على تدفق المياه عند الحد الأدنى من المستوى عن طريق ضبط التدفق على وضع التنقيط السريع وتغذية اليرقات 3-4 ملغ مرتين في اليوم (صباحا ومساء). يجب فحص تدفق المياه بانتظام لضمان التدفق الصحيح في كل خزان. في مختبرنا ، تعطينا هذه الطريقة البقاء على قيد الحياة بنسبة 95-100٪ مع تغذية قصيرة الأجل بنسبة 10٪ HCD. بالإضافة إلى ذلك ، قللت هذه الطريقة بشكل كبير من عبء العمل المتأصل في التنظيف اليومي وتبادل المياه الضروري في بروتوكول التغذية الثابتة الموصوف.
بينما استخدمنا نظاما غذائيا غنيا بالكوليسترول بنسبة 10٪ لتحفيز NASH في التعرض على المدى القصير (5 أيام كافية للحث على التهاب الكبد الدهني) ، يمكن إجراء تعديلات النظام الغذائي وتوسيعها لاستخدام الفركتوز 18 ، أو الأحماض الدهنية (مثل حمض البالمتيك) 19 ، أو بروتوكولات التغذية التي يمكن تمديدها باستخدام نظام غذائي غني بالكوليسترول بنسبة 4٪20. حاليا ، هناك عدد قليل من الأهداف العلاجية الناجحة ل HCC ولا شيء ل NASH. يوفر استخدام نماذج الزرد فرصة فريدة لتوسيع معرفتنا حول تكوين الكبد ولكن أيضا نظام الفقاريات غير المسبوق لإجراء فحوصات كبيرة للعقاقير. ستسهل التقنيات الموصوفة في هذا البروتوكول النتائج المستقبلية والأهداف العلاجية لأمراض الكبد وتكوين الكبد.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يود المؤلف أن يعرب عن تقديره لفنيي مرفق الزرد الأساسي في كلية ألبرت أينشتاين للطب كلينتون ديباولو وسبارتاك كالينين للمساعدة والصيانة لخطوط أسماك الزرد لدينا. يتم دعم FJMN من قبل معهد أبحاث السرطان ومؤسسة سرطان Fibrolamellar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Easily degraded. Store -20°C. |
| Corning Netwells carrier kit 15 mm | Fisher | 07-200-223 | |
| Corning Netwells inserts | Fisher | 07-200-212 | |
| Diethyl ether | Fisher | 60-046-380 | Highly Volatile. |
| Dumont forceps #55 dumostar | Fisher | NC9504088 | |
| Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in | Fisher | 22-183624 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Golden Pearl Diet 5–50 nm Active Spheres | Brine Shrimp Direct | - | Any commercial dry powder food for larvae can be used. |
| Graduated Transfer Pipets | Fisher | 22-170-404 | |
| Isopropanol | Fisher | BP26181 | |
| PBS, pH7.4, 10X, 10 Pack | Crystalgen | 221-1422-10 | |
| Petri Dishes 100X20MM | Fisher | 08-747D | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| Oil Red O solution 0.5% isopropanol | Sigma | O1391-500ML | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| Vactrap | VWR | 76207-630 | Vacuum system for larvae collection |
| Microscopes | |||
| Fluorescent Stereomicroscope | Leica | M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Large | |
| Spinning Disk Confocal Microscope | Nikon | Nikon CSU-W1 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9i with transilluminated base | |
| Software | |||
| Fiji | Open-source Java image processing program. | ||
| Imaris 9.6 | Bitplane; Oxford Instruments. |
References
- Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic Fatty Liver Disease-Related Hepatocellular Carcinoma: A Problem of Growing Magnitude. Seminals in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
- El-Serag, H. B., Kanwal, F. Epidemiology of hepatocellular carcinoma in the United States: where are we? Where do we go. Hepatology. 60 (5), 1767-1775 (2014).
- Estes, C., et al. Modeling NAFLD disease burden in China, France, Germany, Italy, Japan, Spain, United Kingdom, and United States for the period 2016-2030. Journal of Hepatology. 69 (4), 896-904 (2018).
- Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease. Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).
- Meli, R., Mattace Raso, G., Calignano, A. Role of innate immune response in non-alcoholic Fatty liver disease: metabolic complications and therapeutic tools. Frontiers in Immunology. 5, 177 (2014).
- Ganz, M., et al. Progression of non-alcoholic steatosis to steatohepatitis and fibrosis parallels cumulative accumulation of danger signals that promote inflammation and liver tumors in a high fat-cholesterol-sugar diet model in mice. Journal of Translational Medicine. 13, 193 (2015).
- Ma, C., et al. NAFLD causes selective CD4(+) T lymphocyte loss and promotes hepatocarcinogenesis. Nature. 531 (7593), 253-257 (2016).
- Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. New drugs for NAFLD: lessons from basic models to the clinic. Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).
- Wrighton, P. J., Oderberg, I. M., Goessling, W. There is something fishy about liver cancer: Zebrafish models of hepatocellular carcinoma. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 347-363 (2019).
- Goessling, W., Sadler, K. C. Zebrafish: An important tool for liver disease research. Gastroenterology. 149 (6), 1361-1377 (2015).
- Huo, X., et al. Transcriptomic profiles of tumor-associated neutrophils reveal prominent roles in enhancing angiogenesis in liver tumorigenesis in zebrafish. Science Reports. 9 (1), 1509 (2019).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-associated neutrophils and macrophages promote gender disparity in hepatocellular carcinoma in zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Capece, D., et al. The inflammatory microenvironment in hepatocellular carcinoma: A pivotal role for tumor-associated macrophages. Biomed Research International. 2013, 187204 (2013).
- de Oliveira, S., et al. Metformin modulates innate immune-mediated inflammation and early progression of NAFLD-associated hepatocellular carcinoma in zebrafish. Journal of Hepatology. 70 (4), 710-721 (2019).
- Huemer, K., et al. Long-term live imaging device for improved experimental manipulation of zebrafish larvae. Journal of Visualized Experiments. (128), e56340 (2017).
- Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and entrapment device for imaging live zebrafish larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of chemical inhibitors of beta-catenin-driven liver tumorigenesis in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Sapp, V., Gaffney, L., EauClaire, S. F., Matthews, R. P. Fructose leads to hepatic steatosis in zebrafish that is reversed by mechanistic target of rapamycin (mTOR) inhibition. Hepatology. 60 (5), 1581-1592 (2014).
- Park, K. H., Ye, Z. W., Zhang, J., Kim, S. H. Palmitic acid-enriched diet induces hepatic steatosis and injury in adult zebrafish. Zebrafish. 16 (6), 497-504 (2019).
- Progatzky, F., et al. Dietary cholesterol directly induces acute inflammasome-dependent intestinal inflammation. Nature Communication. 5, 5864 (2014).
