Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Analyse av levermikromiljøet under tidlig progresjon av alkoholfri fettleversykdom-assosiert hepatocellulært karsinom i sebrafisk

Published: April 1, 2021 doi: 10.3791/62457
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3,4
1Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Medicine (Hepatology), Albert Einstein College of Medicine, 3Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center, Albert Einstein College of Medicine, 4Marion Bessin Liver Research Center, Albert Einstein College of Medicine

Summary

Her presenterer vi hvordan man genererer en alkoholfri fettleversykdom (NAFLD) -assosiert hepatocellulært karsinom (HCC) sebrafiskmodell for å studere effekten av kolesteroloverskudd på levermikromiljø og immuncellelandskap.

Abstract

Leverkreft er for tiden den tredje ledende årsaken til kreftrelatert død over hele verden, og hepatocellulært karsinom (HCC) står for 75-90% av alle leverkrefttilfeller. Med introduksjonen av effektive behandlinger for å forebygge og behandle hepatitt B / C, blir alkoholfri fettleversykdom (NAFLD), og den mer aggressive formen kjent som alkoholfri steatohepatitt (NASH), raskt de viktigste risikofaktorene for å utvikle HCC i moderne samfunn. For bedre å forstå rollen NASH har på utviklingen av HCC, designet vi en NASH-assosiert HCC sebrafisk. Den optiske klarheten og genetiske trekkbarheten til sebrafisklarvene gjør dem til en tiltalende og kraftig modell for å studere levermikromiljøet og immuncellesammensetningen ved hjelp av ikke-invasiv fluorescerende levende bildebehandling. Denne protokollen beskriver hvordan man bruker en NASH-assosiert HCC sebrafiskmodell for å undersøke effekten av kolesteroloverskudd i leverens mikromiljø og dens innvirkning på immuncellesammensetningen i tidlige stadier av sykdommen. Først mater vi HCC-larver (s704Tg), som uttrykker hepatocyttspesifikk aktivert beta-catenin, med et 10% høyt kolesterol diett i 8 dager for å utvikle en NASH-assosiert HCC-modell. Her beskriver vi hvordan man kan bruke ulike transgene linjer for å evaluere flere tidlige malignitetstrekk i leveren ved ikke-invasiv konfokal mikroskopi, som leverområde, celle og nukleær morfologi (hepatocytterområde, nukleært område, nukleært: cytoplasmatisk forhold (N: C-forhold), nukleær sirkularitet, mikronuklei / nukleær herniation scoring) og angiogenese. Deretter viser vi ved hjelp av transgene linjer med merkede immunceller (nøytrofiler, makrofager og T-celler) hvordan man analyserer leverimmuncellesammensetning i NASH-assosierte HCC-larver. De beskrevne teknikkene er nyttige for å evaluere levermikromiljø og immuncellesammensetning ved tidlige hepatocarcinogenese-stadier, men de kan også modifiseres for å studere slike funksjoner i andre leversykdomsmodeller.

Introduction

Hepatocellulært karsinom (HCC) er en aggressiv kreft med begrensede terapeutiske muligheter. Det har blitt funnet at opptil 30% av alle pasienter med HCC er overvektige og har NASH, en aggressiv form for NAFLD 1,2,3,4. Forbruk av kaloririke dietter øker fettsyretilgjengeligheten drastisk som forårsaker lokale og systemiske metabolske skift og utløser steatose, hepatocyttskade, betennelse og fibrose - alle viktige funksjoner i NASH. NASH-progresjon til HCC innebærer akkumulering av lipider i leveren, noe som utløser betennelse og endret immuncellesammensetning 5,6,7. Det er av spesiell interesse og betydning å forstå hvordan leverens mikromiljø og immuncellelandskap endres under leversykdomsprogresjon, og hvordan det endres på grunn av visse etiologiske faktorer. For bedre å identifisere hvilken innvirkning kolesteroloverskudd har på levermikromiljøet og immuncellelandskapet, har vi utviklet en unik sebrafiskmodell av NASH-assosiert HCC. Bruken av denne modellen har gitt oss en bedre forståelse av virkningen av kosthold og overernæring på levermikromiljø og leversykdomsprogresjon.

Pattedyrmodeller, som mus og humane vevsprøver, har vært avgjørende for å forstå patogenesen av steatohepatitt og steatose8. Mus er den foretrukne modellen for leversykdom og kreft, men de mangler optisk klarhet på mobilnivå, mens menneskelige vevsprøver ofte mangler 3D-miljøet som dyremodeller er i stand til å etterligne. Disse hindringene har gjort sebrafisk til en kraftig modell i forskningsmiljøet. Sebrafisk har bemerkelsesverdige likheter med mennesker, med minst 70% genbevaring. De opprettholder levermikromiljø, hepatisk cellulær sammensetning, funksjon, signalering og respons på skader 9,10. Ved hjelp av et høyt kolesterol diett (HCD) i kombinasjon med en etablert transgen sebrafiskmodell av HCC, har vi utviklet en sebrafiskmodell av NASH-assosiert HCC.

Her presenterer vi en protokoll som forklarer hvordan man genererer en NASH-assosiert HCC sebrafiskmodell og hvordan man studerer levermikromiljø og adresserer tidlige malignitetsfunksjoner in vivo. Ved hjelp av ikke-invasiv konfokalmikroskopi i kombinasjon med sebrafisktransgene linjer med fluorescerende merket hepatocytmembran og kjerne, kan vi adressere tidlige malignitetsfunksjoner ved å analysere levermorfologi (område, volum og overflateareal), celle- og nukleærmorfologi (hepatocytterområde, nukleært område, N: C-forhold, nukleær sirkularitet, mikronuklei / nukleær herniation scoring) og angiogenese (fartøytetthet). Immuncellemikromiljø er også en viktig funksjon på hepatocarcinogenese11,12,13,14, derfor viser vi også hvordan man analyserer leverimmuncellesammensetning i NASH-assosierte HCC-larver, ved hjelp av transgene sebrafisklinjer med merkede immunceller (nøytrofiler, makrofager og T-celler). De beskrevne teknikkene er unike for modellen og ekstremt nyttige for å evaluere levermikromiljø og immuncellesammensetning i leversykdomsprogresjon.

Protocol

Dyreforsøk utføres etter prosedyrer godkjent av den institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteen (IACUC) ved Albert Einstein College of Medicine. For oppskrifter på buffere og løsninger som brukes i protokollen, se supplerende tabell 1.

1. Forberedelse av 10% kolesterolberiket diett for akutt kolesteroloverskudd.

  1. Vei 2 x 4 g Golden Pearl Diet 5-50 nm Active Spheres (GPAS) i to 25 ml glassbeger - en for normal diett (ND) og den andre for 10% høyt kolesterol diett (HCD).
    MERK: Enhver kommersiell tørr mat diett for sebrafisk larver kan brukes.
  2. Veie 0,4 g kolesterol i et 10 ml glassbeger. Dekk begeret med litt folie.
  3. Mål opp 5 ml dietyleter ved hjelp av en 10 ml sprøyte med en 20 G kanyle. Deretter legger du dietyleteren til ND-begeret og blander det umiddelbart med tørrmaten ved hjelp av en slikkepott.
    FORSIKTIG: Dietyleter forårsaker irritasjon i øye, hud og luftveier. Bruk bare i en kjemisk avtrekkshette.
  4. Mål igjen 5 ml dietyleter med en 10 ml sprøyte med en 20 G nål og legg den til 10 ml begeret med kolesterol, bland umiddelbart opp og ned med sprøyten.
  5. Tilsett raskt kolesteroloppløsningen til HCD-begeret og bland den umiddelbart med en slikkepott til løsningen er jevn.
  6. La beger ligge i hetten i opptil 24 timer for å fordampe dietyleteren helt. Neste dag, slip opp GPAS dietter i fine partikler ved hjelp av en pestle og mørtel.
    MERK: Sliping av diettene er et avgjørende skritt, larver vil ikke kunne spise partikler større enn 50 nm.
  7. Overfør hvert kosthold til en liten, merket plastpose eller til et 50 ml sentrifugerrør og oppbevar ved -20 °C.

2. NASH-induksjon med kortsiktige larver som fôrer med kolesterolberiket diett - statiske forhold.

  1. Sett opp transgene fiskelinjer på dag -1 (tabell 1). Neste morgen (dag 0), etter at fisken har gytt, samle egg i en maskesil.
  2. Bruk en vaskeflaske med embryovann (E3), skyll eggene grundig og overfør eggene forsiktig til en 10 cm petriskål med E3 medium.
  3. Rengjør platene for alt rusk som kan ha samlet seg i avlsboksene, inkludert eventuelle døde eller ubefruktede egg.
    MERK: Skylling av eggene og rengjøring av platene er avgjørende for å unngå ukontrollert dyrking av mikroorganismer og påfølgende defekter på larveutvikling.
  4. Del egg i en tetthet på 70/80 per 10 cm petriskåler (i 25 ml E3). På dag 1, under et disseksjonsomfang utstyrt med en transilluminasjonsbase, sjekk og rengjør døde embryoer eller embryoer med utviklingsdefekter.
    MERK: Bruk transillumination base darkfield-modus for å identifisere embryoer med utviklingseffekter og for å se etter vekst av mikroorganismer i platene. Ulike anlegg har forskjellig mikroorganismeutbytte i sine systemer. Bytt E3 medium og / eller servise om nødvendig, for å unngå negative effekter.
  5. På dag 5, kombiner larver fra alle rettene i en 15 cm petriskål, tilsett E3 uten metylenblå. Del deretter larvene i fôringsboksene som følger (tabell 2).
    MERK: Under kontrollforhold, for å generere sunne larver uten å utløse systemisk kronisk betennelse, bør larver mates med rundt 0,1 mg mat per larver per dag. Legg merke til at total mengde mat (tabell 2) deles likt i to feedings per dag.
  6. Hold larvene i en inkubator ved 28 °C, i en mørk lyssyklus (f.eks. 14 timer lys/10 timer mørk syklus), og mate larver to ganger om dagen fra dag 5 til dag 12.
  7. Aspirer daglig matrester, samt 90-95% av mediet ved hjelp av et vakuumsystem festet til en 1 ml pipettespiss. Hell deretter ny E3 uten metylenblå forsiktig i det ene hjørnet av fôringsboksen for å unngå å skade larvene.
    MERK: Daglig rengjøring av fôringsboksene er avgjørende for å unngå ukontrollert vekst av mikroorganismer.

3. Innsamling av 13 dager etter befruktning larver fra fôringsbokser.

  1. På dag 13 tilbereder du oppsamlingsretter i henhold til antall eksperimentelle forhold som ble satt opp. Med en permanent tusjpenn lager du et merke på siden av oppvasken (lokk og bunn) for å unngå å bytte prøver, for eksempel en svart stripe for normalt kosthold (ND) og to svarte striper for HCD.
  2. Hell nok E3 uten metylenblått til å dekke bunnen av hver tallerken. Bruk vakuumsystemet forsiktig til å aspirere vannet fra fôringsboksene, prøv å aspirere rusk eller døde larver fra bunnen for å unngå å overføre disse materialene til oppsamlingsrettene.
  3. Når vannstanden begynner å bli lav, løft sakte fôringsboksen for å få larver til å svømme til et av hjørnene, og aspirer deretter i motsatt retning.
    MERK: Bruk 1 ml pipette med kuttede spisser, i forskjellige høyder, for å tillate forskjellige diametre når du aspirerer vannet. Veksle mellom de forskjellige størrelsene, start med en større diameter, og bytt til en mindre etter hvert som vannvolumet reduseres og larvenes tetthet øker.
  4. Når det bare er ca 20-30 ml væske, dekanter larver forsiktig inn i samlingen petriskål tilberedt i trinn 1. Plasser merket tape fra fôringsboksen på lokket på fatet.
  5. Gjenta trinn 3.2–3.4 for alle mateboksene.

4. Kontrollanalyse for diettindusert hepatisk steatose - Oljerød O (ORO) farging, avbildning og scoring.

  1. Bruk et glass Pasteur-pipette, overfør 15-20 larver til et 2 ml rundbunnsrør og legg på is i ca 15-30 min. Fjern det meste av mediet fra røret.
  2. Tilsett 2 ml 4 % paraformaldehyd (PFA) for å fikse larver og rug ved 4 °C over natten.
  3. Neste morgen, fjern 4% PFA-løsning og vask larver tre ganger med 2 ml 1x PBS.
  4. Forbered en 12-brønnplate (figur 2A) per tilstand med en maskebrønninnsats.
  5. Bruk en glasspipette til å overføre larve fra 2 ml røret til innsatsen som tidligere er plassert i brønnen, tilsett 5 ml 1x PBS. Lagre 2 ml rørene for prøvelagring etter farging.
    FORSIKTIG: Larver er ekstremt klissete på dette stadiet, ikke bruk plastpipetter.
  6. Overfør innsats med larver til en annen brønn med 5 ml 60% isopropanoloppløsning. Inkuber larver i 30 min romtemperatur (RT).
  7. I mellomtiden forbereder du en 0,3% oljerød O i 60% isopropanolløsning. Filtrer 0,3 % oljerød oppløsning to ganger med et 0,45 μm sprøytefilter.
    MERK: Forbered 5 ml oppløsning per brønn ved å blande 3 ml 0,5% oljerød O i isopropanol med 2 ml destillert vann. 0,3% oljerød O i 60% isopropanoloppløsning må tilberedes.
  8. Deretter overfører du nettinnsatsen med larver til en annen brønn med 5 ml nylaget 0,3% oljerød O i 60% isopropanolløsning. Inkuberte larver i 3 timer ved RT med forsiktig rocking.
  9. Etter ORO-farging, skyll larver ved å overføre innsats til en annen brønn med 60% isopropanol. Vask larver to ganger i 60% isopropanol i 30 minutter hver gang ved å overføre innsats sekvensielt til brønner med 60% isopropanol.
  10. Vask larver tre ganger i 5 minutter i 1x PBS-0,1% Tween ved å overføre innsats sekvensielt til brønner med 1x PBS-0,1% Tween.
  11. Overfør larver til 2 ml rørene. Fjern PBST, tilsett 1 ml 80 % glyserol og oppbevar ved 4 °C til avbildning.
  12. For bedre bildebehandling, overfør larver til 1x PBS-0,1% Tween og under et disseksjonsomfang dissekere lever ved å trekke vev forsiktig ved hjelp av to # 55 tang.
    MERK: Hvis du bruker en Casper, kan bakgrunnsbilder utføres ved hjelp av hele larver.
  13. Bruk en glasspipette til å overføre lever forsiktig til en brønn på en porselenspotplate med 50% glyserol. Plasser lever ved hjelp av et lite verktøy for å manipulere larver (f.eks. Øyenvippeverktøy - Figur 2B). Bilde lever i et stereomikroskop utstyrt med et fargekamera.
  14. Skår hepatisk steatose (ingen ORO-farging = ingen; lys rød ORO-farging = mild; rød-mørk rød ORO-farging = moderat/alvorlig).

5. Ikke-invasiv konfokal avbildning ved bruk av sebrafiskens sår- og innfangningsanordning for vekst og bildebehandling (zWEDGI).

  1. Forbered en 10 cm petriskål med 15-20 ml 1x Tricaine-E3, akkurat nok til å dekke bunnen.
    MERK: En 1x Tricaine-E3 arbeidsløsning (0,16 mg/ml) kan oppnås ved å fortynne 2 ml av en 25x Tricaine stamløsning (4 mg/ml) i 48 ml E3. Trikainkonsentrasjonen må ikke overstige 0,16 mg/ml siden larvene er ekstremt følsomme for anestesi i dette utviklingsstadiet.
  2. Overfør 15-20 larver med en plast Pasteur-pipette til petriskålen som inneholder 1x Tricaine-E3 og bedøve larver i 5 min.
  3. Forbered en 6 brønnplate med 2-3 ml E3 uten metylenblå per brønn.
  4. På et fluorescerende stereomikroskop, skjerm de bedøvede larvene for ønskede fluorescerende markører (tabell 1). Overfør skjermede larver i minimum Tricaine i E3 og la dem komme seg i 6-brønnplaten til det er på tide å avbilde.
    MERK: Screening av doble, trippel og firedoble transgene larver tar tid, plasserer larver i E3 og bytter media fra 6-brønnplaten ofte for å redusere unødvendig eksponering for Tricaine. Også larver på dette utviklingsstadiet flyter, så bruk et øyenvippeverktøy for å plassere larver for screening uten å indusere vevskader.
  5. Etter screening, tilbered en 10 cm petriskål med 25 ml 1x Tricaine-E3. Overfør 15-20 larver med en plast Pasteur-pipette til petriskålen som inneholder 1x Tricaine-E3 og bedøve larver i 5 min.
  6. I mellomtiden legger du under stereomikroskopet 1x Tricaine-E3 inn i kamrene til sår- og innfangningsanordningen (f.eks. zWEDGI)15,16. Fjern luftbobler fra kamrene og fastholdingstunnelen ved hjelp av en P200 mikropipette. Fjern alt overskudd av 1x Tricaine-E3 og la bare nok volum til å fylle kamrene.
  7. Overfør en bedøvet larve inn i lastekammeret til zWEDGI, og plasser den ved hjelp av et øyenvippeverktøy under stereomikroskopet. Trykk forsiktig på larvers hode og skyv det slik at halen kommer inn i begrensningstunnelen. I tillegg fjerner du 1x Tricaine-E3 fra sårkammeret ved hjelp av mikropipetten for å hjelpe larven inn i tunnelen. Sørg for at larven er plassert riktig for avbildning av venstre lobe - Invertert mikroskop: venstre side vendt ned; Oppreist mikroskop: venstre side vendt opp.
    MERK: Hvis en zWEDGI ikke er tilgjengelig, kan fisk monteres og plasseres i 1% lavt smeltepunkt agarose i 1x Tricaine-E3, men agarose nedsenking kan brukes bare for rask avbildning (opptil 15 min).
  8. For hepatocytt- og nukleærmorfologianalyse, bildelever med konfokalt mikroskop ved bruk av et 40x luftmål og z-stabler med 2 μm optiske seksjoner. For levermorfologi, angiogenese og immuncellerekruttering analyserer bildelever ved hjelp av et 20x luftmål og z-stabler med 5 μm optiske seksjoner. For larver med store lever, bør 2 x 2 flisbilder tas for å sikre avbildning av all lever og omegn på 75 μm.
  9. Etter avbildning, bruk en plast Pasteur-pipette med 1x Tricaine-E3 for å trekke larver fra fastholdelsestunnelen og overfør til en petriskål med E3 uten metylenblå.

6. Analyse av levermorfologiske variasjoner.

MERK: Trinnene nedenfor utføres for leveroverflate og volumkvantifisering:

  1. Åpne bildebehandlingsprogramvare. Legg til mappe som inneholder bildefiler som skal analyseres til Arena ved å velge Observer mappeikon . Deretter, ved å høyreklikke på miniatyrbilder, velg Konverter til innfødt Imaris-filformat for å konvertere filer til formatet (.ims).
  2. På undermenyen Overgå justerer du lysstyrken og kontrasten for hver kanal. Deretter lager du en overflate fra leveren ved å klikke på den blå knappen Legg til nye overflater.
  3. Deretter velger du Segment bare et område av interesse på overflateopprettingspanelet for å manuelt opprette en overflate av leveren.
  4. Klikk på Hopp over automatisk oppretting | Rediger manuelt alternativ. Velg Kontur og fjern merket for "Volum" i scenepanelet.
    MERK: Volumvisningsalternativet må ikke velges, ellers vil valg av interesseområde i forskjellige z-stabler ikke kunne.
  5. Naviger gjennom z-stabler og tegn interesseområder i hvert plan ved å velge Modus, velg tegnemodusen du foretrekker. For å begynne å tegne endringspeker til Velg modus og ikke Naviger, klikk deretter på Tegn og begynn å dra pekeren gjennom leveren for å tegne en avkastning.
  6. Når du har valgt en ROI i de forskjellige fokalplanene, velger du Opprett en overflate for å slå sammen alle de valgte ROIene og opprette leveroverflate.
  7. Deretter bruker du den nyopprettede overflaten en maske av hepatocyttsignalet. Klikk på overflaten og velg Masker alle under Rediger-fanen (blyanten). I vinduet som vises, velg kanalen du vil maskere som skal brukes til å kvantifisere levervolum og overflateareal. Velg deretter sett voxels utenfor overflaten til 0 og merk av på Dupliser kanal alternativet før du bruker maske.
  8. Bruk leveroverflateareal og levervolumverdier fra statistisk analysemeny for analyse.

MERK: Utfør følgende trinn for kvantifisering av leverområdet.

  1. Åpne Fiji-programvare. På Plugins-menyen velger du Bio-formater etterfulgt av Bio-formats Importer, merk av på Split channels-alternativet for å åpne bildefilen.
  2. På Bilde-menyen velger du Egenskaper for å kontrollere at bildet har riktig bildepunktstørrelse og voxeldybde, hvis ikke riktige verdier. Gå deretter til Bilder-menyen, klikk på Juster etterfulgt av Lysstyrke og kontrast, juster bildets lysstyrke og kontrast.
  3. Deretter skaper bruk av hepatocytter kanal en maksimal intensitetsprojeksjon av leveren. Gå til Bilder-menyen, klikk på Stabler etterfulgt av Z-prosjekt. Velg Maksimal intensitetsprojeksjon.
  4. Ved hjelp av frihåndsvalgsverktøyet kan du manuelt opprette en region med interessert (ROI) rundt larveleveren. Deretter klikker du på Analyser menyen Mål for å oppnå leverområde. Lagre resultatene som regneark for videre analyse.

7. Hepatocytt og nukleær morfologisk analyse.

  1. Åpne Fiji-programvare. På Plugins-menyen velger du Bio-formater etterfulgt av Bio-formater Importer kryss av på Split channels-alternativet for å åpne bildefilen.
  2. På Bilde-menyen velger du Egenskaper for å kontrollere at bildet har riktig bildepunktstørrelse og voxeldybde, hvis ikke riktige verdier. Gå deretter til Bilder-menyen, klikk på Juster etterfulgt av Lysstyrke og kontrast, juster bildets lysstyrke og kontrast.
  3. På menyen Analyser velger du Angi målinger og merker av for alle parameterne du vil analysere (f.eks. område, perimeter og formbeskrivelser). Velg hepatocytmembranfluorescerende kanal. Naviger gjennom Z, bruk frihåndsvalgverktøyet for å tegne perfekt avkastning rundt en hepatocytt. Deretter klikker du på Analyser menyen på Mål for å beregne hepatocytterområdet.
  4. Gjenta trinn 7,3 for 15-30 hepatocytter. Lagre resultatene som regneark for videre analyse.
  5. Velg deretter kjernefluorescerende kanal. Naviger gjennom Z, bruk frihåndsvalgverktøyet for å tegne perfekt avkastning rundt hepatocyttkjernen. Deretter klikker du på Analyser-menyen Mål for å beregne kjernefysisk areal og sirkularitet.
  6. Gjenta trinn 7,5 for 15-30 hepatocytter. Lagre resultatene som et regneark for videre analyse, inkludert kvantifisering av kjernefysisk: cytoplasmatisk forhold.
  7. Skåringsprøver for tilstedeværelse av mikronuklei og prolaps som følger (tabell 3).

8. Angiogenese analyse.

  1. Opprett en overflate for leveren manuelt som beskrevet i avsnitt 6 i denne protokollen. Navngi denne overflaten som "Leveroverflate".
  2. Lag en maske for endotelcellesignalet inne i leveren. Klikk på overflaten og velg Masker alle under redigeringsfanen (blyanten). I vinduet som vises, velg endotelcellekanalen for å isolere fartøysignaler bare fra leveren. Velg sett voxels utenfor overflaten til 0 og merk av på Dupliser kanal alternativet før du bruker Maske.
  3. Gi nytt navn til nye endotelceller maskert kanal som levervaskulatur.
  4. For å måle fartøyets volum og overflateareal, opprett en annen overflate. Klikk på den blå knappen Legg til nye overflater . I det første trinnet i opprettingen av overflaten må du kontrollere at alle alternativene ikke er valgt for å opprette en overflate automatisk.
  5. I det andre trinnet velger du Liver Vasculature kanal for å lage en overflate over. Fjern merket for utjevningsalternativ for å oppdage så mange detaljer fra fartøy som mulig, og aktiver bakgrunnssubtraksjon i terskelalternativet.
  6. Juster terskelverdien for å sikre at oppdaget overflate er colocalizing med levervaskulatursignal. Bruk overflateareal og volumverdier fra statistisk analysemeny. Beregn fartøyets tetthetsindeks ved hjelp av følgende ligninger:
    Kartetthetsindeks (ved lever μm 2) = (karoverflateareal (μm 2)) / (leveroverflateareal (μm2))
    Kartetthetsindeks (ved lever μm 3) = (karvolum (μm 3)) / (levervolum (μm3))

9. Immuncelle rekruttering analyse.

  1. Åpne Fiji-programvare. På Plugins-menyen velger du Bio-formater etterfulgt av Bio-formater Importer kryss av på Split channels-alternativet for å åpne bildefilen.
  2. På Bilde-menyen velger du Egenskaper for å kontrollere at bildet har riktig bildepunktstørrelse og voxeldybde, hvis ikke riktige verdier. Gå deretter til Bilder-menyen , klikk på Juster etterfulgt av Lysstyrke og kontrast, juster bildets lysstyrke og kontrast (f.eks. Makrofager - mCherry eller dTomato; nøytrofiler - BFP; T-celler - EGFP; hepatocytter - EGFP eller mCherry).
  3. Deretter oppretter du maksimale intensitetsprojeksjoner til hver kanal.
  4. Som beskrevet i avsnitt 6 (trinn 6.9-6.12), opprett en ROI rundt larveleveren og mål leverområdet. Opprett en ny avkastning inkludert leverområde og 75 μm omegn ("Rekrutteringsområde").
  5. Deretter velger du Valgalternativ på Rediger-menyen etterfulgt av Legg til i leder. Ved å velge en medfødt immuncellekanal Maximum Intensity Projection, klikker du på leveravkastningen fra ROI Manager-vinduet for å angi rekrutteringsområdet.
  6. På Plugins-menyen velger du Analyser-alternativet etterfulgt av Cell Counter og teller immunceller inne i rekrutteringsområdet. Rekordmange rekrutterte immunceller til leverområdet på et regneark.
  7. Beregn nøytrofil, makrofag og T-celletettheter ved å normalisere antall immunceller per leverområde.

Representative Results

Ved å introdusere et kortsiktig høyt kolesterol diett i en hepatocellulært karsinom (HCC) sebrafiskmodell, som overuttrykker en hepatocyttspesifikk konstitutivt aktiv form for beta-catenin (s704Tg; Tg(fabp10a:pt-B-cat, cryaa:Venus)17, vi er i stand til å lage en ikke-pattedyrs virveldyrmodell av NASH-assosiert HCC. Leversykdomsprogresjon kan overvåkes tidlig ved å måle hepatisk steatose, leverstørrelse, hepatocytt, nukleærmorfologi, angiogenese og immuncelleinfiltrasjon (figur 1).

HCC larver matet med et normalt kosthold viser ingen til mild hepatisk steatose, målt ved oljerød O-farging. HCC-larver fôret med høyt kolesterol diett viser imidlertid en signifikant økning i hepatisk steatose (figur 2).

En kjent markør for leversykdom er hepatomegali17. For å evaluere leverstørrelsen kan HCC-larver krysses ut med en transgen linje som spesifikt uttrykker en fluorescerende markør på hepatocytter, for eksempel Tg (fabp10a: H2BmCherry). For å vurdere hepatomegali utføres evaluering av leverområdet (2D), leveroverflate og levervolum (3D). Etter 8 dagers eksponering for kolesteroloverskudd ble det observert leverforstørrelse hos HCC-larver (figur 3).

Ved bruk av ikke-invasiv levende avbildning kan transgene fiskelinjer som uttrykker fluorescerende proteiner i hepatocytmembraner (som Tg (fabp10a: Life-actin-EGFPP) og i hepatocyttkjerner (som Tg (Fabp10a: H2B-mCherry) brukes til å vurdere cellulære og nukleære morfologiendringer assosiert med malignitet i hepatocytter. Hepatocyttområdet var økt i NASH-assosiert HCC (figur 4A, B, D), samt nukleært område (figur 4C, E) og nukleært: cytoplasmatisk forhold (figur 4F). En signifikant reduksjon i nukleær sirkularitet ble også observert i HCD+HCC-gruppen (figur 4G). Lipotoksisitet utløser DNA-skade, et trekk ved karsinogenese i nærvær av mikronuklei. Ved hjelp av H2B-mCherry-markøren observerte vi en større forekomst av mikronuklei i HCC-larvene som ble matet med høyt kolesterol diett (figur 4H).

Hepatisk vaskulatur kan enkelt evalueres i sebrafiskmodeller ved hjelp av en transgen merket linje, for eksempel Tg (kdrl: mCherry eller Tg (fli: EGFP), som merker vaskulatur. En signifikant økning i fartøytettheten ble observert hos HCC+HCD-larver (figur 5).

For å observere den inflammatoriske responsen som ble utløst tidlig i NASH-assosiert HCC, ble en transgen fiskelinje som uttrykker fluorescerende proteiner i makrofager og nøytrofiler, som Tg (mfap4: tdTomato-CAAX; lyz: BFP), krysset ut med HCC-transgenlinjen. Infiltrasjon av nøytrofiler og makrofager forekommer i både HCC og HCC matet med HCD, som ble vurdert ved kvantifisering av antall og tetthet av nøytrofiler/makrofager i lever og omegn (omegn opptil 75μm) (figur 6A-H). Likevel viste HCC + HCD en signifikant økning i nøytrofilt antall og tetthet (figur 6F-H). Ved 13 dager etter befruktning er det adaptive immunsystemet allerede funksjonelt. Ved hjelp av en transgen fiskelinje som uttrykker fluorescerende protein i T-celler, slik som Tg (lck: EGFP), og i kombinasjon med HCC-transgenlinjen; vi evaluerte effekten av kolesteroloverskudd på rekruttering av T-celler til leveren. En signifikant reduksjon i T-celletetthet og totalt antall ble observert hos HCC-larver fôret med HCD (figur 6I-K).

Transgene sebrafisklinjer ZFIN-referanse Analyse
Casper RoyA9; MITFAW2 Hepatisk steatose
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus / fabp10a:H2B-mCherry ) s704Tg / uwm41Tg Levermorfologi
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP) s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg Hepatocytter og nukleær morfologi
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_ cryaa:Venus; fli:EGFP) s704Tg / y1Tg Angiogenese
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus;  mfap4:Tomat-CAAX; lyzC: BFP) s704Tg / xt6Tg / zf2171Tg Makrofag og nøytrofil rekruttering
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; lck:EGFP) s704Tg / cz1Tg T-celler rekruttering

Tabell 1: Transgene sebrafisklinjer til bruk i ulike analyser.

Antall larver Fôringsboks størrelse Mengde mat per dag (mg) E3 Volum (ml)
30-40 Liten avlsboks 3-4 200
60-80 Liten/stor avlsboks 6-8 400
100-150 Stor avlsboks 10-15 500

Tabell 2: Angi betingelser for fôringsbokser.

Fenotype Scoring metode
Ingen Normale kjerner, ingen mikronuklei eller prolaps
Litt Lavt antall mikronuklei (mindre enn 5 per synsfelt) og/eller prolaps
Moderat/alvorlig Moderat til høyt antall mikronuklei (mer enn 5 per synsfelt) og/eller prolaps

Tabell 3: Mikronuklei og nukleær herniation scoring.

Figure 1
Figur 1: Protokolldiagram som oppsummerer de viktigste eksperimentelle trinnene og analysetilnærmingen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Kontrollanalyse for leversteatose - ORO-farging. HCC-larver ble fôret med normal eller høyt kolesteroldiett og oljerød O (ORO)-farging ble utført for å vurdere hepatisk steatose. (A) Diagram over 12-brønnplaten for å utføre sekvensiell ORO-farging ved hjelp av maskebrønninnsatsene. (B) Bilde av øyenvippeverktøy som brukes til å manipulere larver. (C) Representative bilder av lever farget med oljerød; HCC og HCC + HCD larver. (D) Khikvadratgraf som viser prosentandel larver med ulik skåring av leversteatose. Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative bilder fra leverstørrelse. Transgene HCC-larver som uttrykker en levermarkør (Tg(fabp10a:H2B-mCherry)) ble avbildet levende og ikke-invasivt, på et omvendt spinnende diskkonfokalt mikroskop ved hjelp av et zWEDGI. (A) Representative 3D-rekonstruksjoner av lever i HCC- og HCC+HCD-larver. (B-D) Graf som viser levermorfologiske endringer, inkludert leverareal (B) leveroverflateareal (C) og levervolum (D) i HCC og HCC + HCD larver. Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative bilder fra hepatocytter og kjernemorfologi. Transgene HCC-linjer som uttrykker fluorescerende proteiner i hepatocyttmembraner (Tg(fabp10a:Life-actin-EGFP) og i hepatocyttkjerner (Tg(fabp10a:H2B-mCherry) ble avbildet. (AC) Representative 3D-rekonstruksjoner av F-aktin- og hepatocyttkjerner av HCC- og HCC+HCD-larver. Åpne pilspisser viser forstørrede kjerner; hvite pilspisser viser kjernen med endret form; og røde piler viser mikrokjerner og kjernefysisk prolaps. (D-G) Grafer som viser gjennomsnitt av celle- og kjerneparametere i HCC og HCC + HCD 13-dagers gamle larver. (D) Hepatocytter-området. (e) Kjernefysisk område. (F) Kjernefysisk: Cytoplasma forhold. (G) Nukleær sirkularitet. Hver prikk representerer gjennomsnitt per larve. Punktplott viser gjennomsnittlige ±SEM (H) Chi-kvadratgrafer som viser prosentandel larver med forskjellig skåring av mikronuklei og nukleær prolaps. Skala bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Representative bilder fra levervaskulatur. Transgene HCC-linjer som uttrykker fluorescerende proteiner i hepatocyttkjerner (Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) og i endotelceller (Tg)fli:EGFP)). (A) Representative 3D-rekonstruksjoner av levervaskulatur hos HCC- og HCC+HCD-larver. (B-C) Graf som viser fartøyets tetthetsindeks etter leveroverflateareal (B) volum (C) i HCC og HCC + HFCD larver. Punkttegninger viser gjennomsnitt ±SEM. Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Representative bilder fra immuncellelandskap i lever. Transgen HCC-linje som uttrykker fluorescerende proteiner i makrofager og nøytrofiler (Tg (mfap4: tdTomato-CAAX; lyz: BFP) eller i T-celler (Tg (lck-EGFP). (A,C,F) Representative 3D-rekonstruksjoner av lever og leukocyttrekruttering til leverområde hos 13 dager gamle HCC- og HCC+HCD-larver. (B) Diagram over avbildet leverområde. (D-E) Graf som viser makrofagtetthet (D) og antall (E) i leverområdet hos HCC- og HCC+HCD-larver. (G-H) Graf som viser nøytrofil tetthet (G) og antall (H) i leverområdet i HCC og HCC + HCD larver. (G) Representative 3D-rekonstruksjoner av T-cellerekruttering til leverområde i HCC og HCC + HCD larver. (H-I) Graf som viser T-celletetthet (H) og antall (I) i leverområdet hos HCC- og HCC+HCD-larver. Punkttegninger viser gjennomsnitt ±SEM. Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende tabell 1: Tabell over buffere og løsninger Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Med økt forekomst av HCC, spesielt NASH-indusert HCC, er det av stor betydning å ha mer effektive modeller for å studere de cellulære og molekylære mekanismene som er involvert i NASH-assosiert HCC. Dekonvolusjon av cellecelleinteraksjoner i leveren er avgjørende for å bedre forstå leversykdomsprogresjon og hepatocarcinogenese. Tilnærmingen beskrevet i denne protokollen gir en unik måte å analysere leversykdomsprogresjon in vivo og ikke-invasivt.

Forberedelse av diett er avgjørende for suksessen med å etablere en NASH-assosiert HCC-modell. Det er viktig å la dietyleter fordampe helt inne i røykhetten for å unngå skadelige effekter, mens du forbereder dietter for sebrafisk. For å bruke disse diettene med larver (5-12 dager etter befruktning), er det ekstremt viktig å male opp diettene til fine partikler for å sikre matinntaket av larver. Bruken av fluorescerende merkede fettsyreanaloger kan brukes til å evaluere matinntaket hos larver.

Før larvene legges i avlsboksene og starter fôringsprosedyren, er det avgjørende å sikre at eksperimentell prøvetaking uniformeres ved å blande larver fra forskjellige plater. Dette trinnet er viktig siden forskjellige mikromiljøer, som begynner på dag 0, fremmes i hver av platene og kan påvirke inflammatorisk respons.

Et annet viktig skritt er å telle larver, for å vite hvor mye mat som trengs for hver fôringsboks. Hvis mengden mat ikke er tilstrekkelig for antall larver som er tilstede i hver boks, vil en av de to scenariene oppstå: 1) larver vil bli underfødt; 2) larver vil bli overfødt. Unøyaktig fôring vil føre til usunne forhold forbundet med underernæring eller overernæring, for eksempel betennelse, noe som vil påvirke leverens mikromiljø drastisk. Hvis unøyaktig fôring oppstår, vil larver vise bevegelsesproblemer. På dette utviklingsstadiet bør larver svømme intensivt, derfor hvis bevegelsesproblemer blir lagt merke til, ble larver reist under usunne forhold (underernæring eller eksponering for giftige doser kolesterol på grunn av overfeeding). Av denne grunn må fôringsprosedyrer kontrolleres nøye for både dietter, normal og kolesterolberiket. Noen analyser kan utføres for raskt å adressere nøyaktigheten av larvens fôring og helse, inkludert tilstedeværelse av hepatomegali (leverstørrelse) og betennelse i vev og organer, spesielt lever og tarm (synlig økt infiltrasjon av nøytrofiler og makrofager).

Daglig rengjøring og utskifting av 95% av E3 er avgjørende for å redusere veksten av mikroorganismer i fôringsboksene og forbedre larvenes helse og overlevelse. Alternativt kan larver plasseres i et frittstående racksystem. For best resultat, plasser 60-80 larver i en 3-liters tank. Hold vanngjennomstrømningen på minimumsnivået ved å justere strømmen til en hurtigdryppende modus og mate larver 3-4 mg to ganger daglig (AM og PM). Vannføringen bør kontrolleres regelmessig for å sikre riktig gjennomstrømning i hver tank. I vårt laboratorium gir denne metoden oss 95-100% overlevelse med korttidsfôring av 10% HCD. I tillegg reduserte denne metoden i stor grad arbeidsbelastningen som ligger i den daglige rengjøringen og vannutvekslingen som er nødvendig i den beskrevne statiske fôringsprotokollen.

Mens vi brukte et 10% kolesterolberiket kosthold for å indusere NASH ved kortvarig eksponering (5 dager er nok til å indusere steatohepatitt), kan diettendringer utføres og utvides til å bruke fruktose 18, fettsyrer (som palmitinsyre)19, eller fôringsprotokoller som kan utvides ved hjelp av et 4% kolesterolberiket diett20. For tiden er det få vellykkede terapeutiske mål for HCC og ingen for NASH. Bruken av sebrafiskmodeller gir en unik mulighet til å utvide vår kunnskap om hepatocarcinogenese, men også et unparallel vertebrate system for å utføre store gjennomstrømningsmedikamentscreeninger. Teknikkene beskrevet i denne protokollen vil lette fremtidige funn og terapeutiske mål for leversykdom og hepatocarcinogenese.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatteren ønsker å anerkjenne Albert Einstein College of Medicine Zebrafish Core Facility teknikere Clinton DePaolo, og Spartak Kalinin for hjelp og vedlikehold av våre sebrafisk linjer. FJMN støttes av Cancer Research Institute og Fibrolamellar Cancer Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cholesterol Sigma C8667-25G Easily degraded. Store -20°C.
Corning Netwells carrier kit 15 mm Fisher 07-200-223
Corning Netwells inserts Fisher 07-200-212
Diethyl ether Fisher 60-046-380 Highly Volatile.
Dumont forceps #55 dumostar Fisher NC9504088
Fisherbrand Pasteur Pipets 5.75in Fisher 22-183624
4% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 15710
Golden Pearl Diet 5–50 nm Active Spheres Brine Shrimp Direct - Any commercial dry powder food for larvae can be used.
Graduated Transfer Pipets Fisher 22-170-404
Isopropanol Fisher BP26181
PBS, pH7.4, 10X, 10 Pack Crystalgen 221-1422-10
Petri Dishes 100X20MM Fisher 08-747D
Tricaine Sigma A-5040
Tween 20 Fisher BP337-500
Oil Red O solution 0.5% isopropanol Sigma O1391-500ML
Tricaine Sigma A-5040
Tween 20 Fisher BP337-500
Vactrap VWR 76207-630 Vacuum system for larvae collection
Microscopes
Fluorescent Stereomicroscope Leica M205 FCA THUNDER Imager Model Organism Large
Spinning Disk Confocal Microscope Nikon Nikon CSU-W1
Stereomicroscope Leica S9i with transilluminated base
Software
Fiji Open-source Java image processing program.
Imaris 9.6 Bitplane; Oxford Instruments.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic Fatty Liver Disease-Related Hepatocellular Carcinoma: A Problem of Growing Magnitude. Seminals in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
  2. El-Serag, H. B., Kanwal, F. Epidemiology of hepatocellular carcinoma in the United States: where are we? Where do we go. Hepatology. 60 (5), 1767-1775 (2014).
  3. Estes, C., et al. Modeling NAFLD disease burden in China, France, Germany, Italy, Japan, Spain, United Kingdom, and United States for the period 2016-2030. Journal of Hepatology. 69 (4), 896-904 (2018).
  4. Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease. Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).
  5. Meli, R., Mattace Raso, G., Calignano, A. Role of innate immune response in non-alcoholic Fatty liver disease: metabolic complications and therapeutic tools. Frontiers in Immunology. 5, 177 (2014).
  6. Ganz, M., et al. Progression of non-alcoholic steatosis to steatohepatitis and fibrosis parallels cumulative accumulation of danger signals that promote inflammation and liver tumors in a high fat-cholesterol-sugar diet model in mice. Journal of Translational Medicine. 13, 193 (2015).
  7. Ma, C., et al. NAFLD causes selective CD4(+) T lymphocyte loss and promotes hepatocarcinogenesis. Nature. 531 (7593), 253-257 (2016).
  8. Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. New drugs for NAFLD: lessons from basic models to the clinic. Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).
  9. Wrighton, P. J., Oderberg, I. M., Goessling, W. There is something fishy about liver cancer: Zebrafish models of hepatocellular carcinoma. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 347-363 (2019).
  10. Goessling, W., Sadler, K. C. Zebrafish: An important tool for liver disease research. Gastroenterology. 149 (6), 1361-1377 (2015).
  11. Huo, X., et al. Transcriptomic profiles of tumor-associated neutrophils reveal prominent roles in enhancing angiogenesis in liver tumorigenesis in zebrafish. Science Reports. 9 (1), 1509 (2019).
  12. Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-associated neutrophils and macrophages promote gender disparity in hepatocellular carcinoma in zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
  13. Capece, D., et al. The inflammatory microenvironment in hepatocellular carcinoma: A pivotal role for tumor-associated macrophages. Biomed Research International. 2013, 187204 (2013).
  14. de Oliveira, S., et al. Metformin modulates innate immune-mediated inflammation and early progression of NAFLD-associated hepatocellular carcinoma in zebrafish. Journal of Hepatology. 70 (4), 710-721 (2019).
  15. Huemer, K., et al. Long-term live imaging device for improved experimental manipulation of zebrafish larvae. Journal of Visualized Experiments. (128), e56340 (2017).
  16. Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and entrapment device for imaging live zebrafish larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
  17. Evason, K. J., et al. Identification of chemical inhibitors of beta-catenin-driven liver tumorigenesis in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
  18. Sapp, V., Gaffney, L., EauClaire, S. F., Matthews, R. P. Fructose leads to hepatic steatosis in zebrafish that is reversed by mechanistic target of rapamycin (mTOR) inhibition. Hepatology. 60 (5), 1581-1592 (2014).
  19. Park, K. H., Ye, Z. W., Zhang, J., Kim, S. H. Palmitic acid-enriched diet induces hepatic steatosis and injury in adult zebrafish. Zebrafish. 16 (6), 497-504 (2019).
  20. Progatzky, F., et al. Dietary cholesterol directly induces acute inflammasome-dependent intestinal inflammation. Nature Communication. 5, 5864 (2014).

Tags

Kreftforskning utgave 170
Analyse av levermikromiljøet under tidlig progresjon av alkoholfri fettleversykdom-assosiert hepatocellulært karsinom i sebrafisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Michael, C., Martínez-Navarro,… More

Michael, C., Martínez-Navarro, F. J., de Oliveira, S. Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. J. Vis. Exp. (170), e62457, doi:10.3791/62457 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter