Summary
يوفر هذا البروتوكول خطوات مفصلة لمهمة موقع الكائن مع أربعة تكرارات باستخدام نفس الفوج من الفئران. الترميز الضعيف والقوي يمكن أن ينتج ذكريات قصيرة وطويلة الأجل. يمكن أن تكون مرونة البروتوكول مع التكرار مفيدة للدراسات التي تنطوي على العمليات الجراحية عن طريق توفير الوقت والعمل.
Abstract
التعرف على مكان الكائن هو طريقة بارزة تستخدم للتحقيق في الذاكرة المكانية في القوارض. تشكل ذاكرة التعرف على مكان الكائن هذه أساس مهمة موقع الكائن. توفر هذه الورقة بروتوكولا شاملا لتوجيه إنشاء مهمة موقع الجسم مع خيار ما يصل إلى أربعة تكرارات باستخدام نفس الفوج من الفئران. ويمكن استخدام بروتوكولات الترميز الضعيفة والقوية على حد سواء لدراسة الذكريات المكانية القصيرة والطويلة الأجل ذات القوة المتفاوتة ولتمكين تنفيذ التلاعبات ذات الصلة التي تمنع الذاكرة أو تعززها. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تكرار الاختبار مع التوازن المعروض هنا يسمح بمزيج من النتائج من اختبارين أو أكثر للمقارنة داخل الموضوع لتقليل التباين بين الفئران. يساعد هذا الأسلوب على زيادة القوة الإحصائية وينصح بشدة، لا سيما عند تشغيل التجارب التي تنتج تباينا كبيرا في السلوك الفردي. وهذا يصقل الدراسة بشكل مباشر من خلال زيادة البيانات التي تم الحصول عليها من كل وتقليل العدد الإجمالي للحيوانات اللازمة. وأخيرا، تنفيذ مهمة موقع الكائن المتكرر يزيد من كفاءة الدراسات التي تنطوي على العمليات الجراحية عن طريق توفير الوقت والعمل.
Introduction
وقد استخدمت مهام التعرف التلقائي(على سبيل المثال، التعرف على الكائن، والتعرف على مكان الكائن) إلى حد كبير في التحقيق في الذاكرة في القوارض. هذه الاختبارات هي على عكس مجموعة متنوعة من الاختبارات المستخدمة لتقييم الذاكرة التي تقوم على تكييف الخوف أو مكافأة الدافع، في أن مهام الاعتراف العفوية تستند فقط على السلوك الاستكشافي التلقائي نحو المحفزات الجديدة. هذا السلوك، ويشار إلى "تفضيل نيوتيك"1،هو متأصل في القوارض وكذلك في الأنواع الثديية الأخرى وبعض غير الثدييات مثل الطيور والأسماك2. يمكن ملاحظة التعرف على مكان الكائن، الذي يعتمد على الذاكرة المكانية، باستخدام مهمة موقع الكائن (المعروفة أيضا باسم مهمة التعرف على الكائنات المكانية)3. وقد أظهرت الدراسات الآفات أن التعرف على مكان الكائن يتطلب قرن آمون سليمة4,5. وبسبب بروتوكول التدريب البسيط نسبيا وعدم وجود أي تعزيز، فإن هذه المهمة هي الأفضل في العديد من الدراسات. غياب التعزيز الإيجابي والسلبي يقلل من المعلمات الإضافية ومناطق الدماغ التي قد تدفع السلوك. وبالتالي ، فإن السلوك هنا محايد ويستند إلى الفضول والذاكرة المكانية ، مما يسمح بالتحقيق في الآليات التي تشارك في ترميز الذاكرة المكانية وتوحيدها واسترجاعها.
بروتوكول لمهمة موقع الكائن يتكون عادة من جلسات التعود تليها جلسة واحدة من الترميز واختبار التجارب، مفصولة بفترة تأخير، والتي تختلف من عدة دقائق إلى ساعات. يوصى بشدة بالتعامل مع الفئران مسبقا لتقليل مستوى الإجهاد للحيوانات ، وبالتالي السلوك الذي يمكن أن يؤثر على ذاكرة التعرف ، مثل النفور من الجدة. وبالمثل ، فإن بروتوكول التعود المصمم بشكل جيد يلعب دورا أساسيا في منع الإجهاد الذي قد يعوق السلوك الطبيعي للجرذ أثناء المهمة. ومع ذلك ، فإن مدى المناولة والتعود يختلف إلى حد كبير بين المختبرات والمجربين ، مما قد يساهم في انخفاض قابلية النسخ6و7و8. في محاكمة الترميز ، يتم إعطاء الفئران الوقت لاستكشاف الساحة مع اثنين من الكائنات متطابقة تقع في ركنين معينين. في تجربة الاختبار ، والتي تتأخر لفترة ، يتم إعطاء الفئران الوقت لاستكشاف الساحة مع نفس الزوج من الأشياء ، ولكن هذه المرة تم نقل واحد منهم إلى موقع جديد. التفضيل التلقائي الذي أظهرته الفئران وما ينتج عنه من زيادة في الوقت الذي يقضيه في استكشاف الكائن في الموقع الجديد يدل على التعرف المكاني وذاكرة مواقع الكائن3. يؤثر تعديل تجربة الترميز (مدة التكرار وعدده) على قوة الذاكرة.
اعتمادا على الهدف من الدراسة، يمكن تعديل طول التأخير بين الترميز واختبار التجارب لنموذج البروتين تخليق مستقلة الذاكرة على المدى القصير أو البروتين التوليف تعتمد على الذاكرة على المدى الطويل. وبالتالي، يمكن استخدام مهمة موقع الكائن لمجموعة واسعة من الدراسات عن طريق تكييف البروتوكول حسب الحاجة. علاوة على ذلك، فإن تنفيذ التلاعب التجريبي، مثل التدخلات الدوائية والبتوجينية، ممكن أيضا بين هذه التجارب، كما هو الحال في التصوير الحي. هناك العديد من الدراسات9،10 التي تبلغ عن التكرارات المتكررة لمهمة موقع الكائن داخل نفس مجموعة الفئران. وهذا يتناقض مع الاستخدام التقليدي الذي واحد لديه جلسة واحدة مع عدم التكرار. ومع ذلك، لم يتم التحقيق بدقة في فعالية هذه النماذج، كما لا توجد أي أوراق طريقة تصف هذه النماذج. على حد علمنا ، وهذا هو أول وصف المبلغ عنها من البروتوكول الذي يصف بالتفصيل مهمة موقع الكائن مع ما يصل الى أربعة التكرار باستخدام نفس الفوج الفئران ، والتي تقارن أيضا بشكل منهجي النتائج من كل تكرار. يمكن استخدام التكرار لموازنة الظروف التجريبية للسماح بالمقارنة داخل الموضوع مع انخفاض التباين بين الاختبارات. ويسمح التكرار الموثوق به للمهمة بتجميع البيانات، مما يعني أنه يمكن توليد كمية كبيرة بما فيه الكفاية من البيانات باستخدام عدد صغير نسبيا من الفئران. وأخيرا، يمكن أن يكون التكرار باستخدام نفس الجرذ مفيدا في التجارب التي تنطوي على عمليات جراحية وغرسات عن طريق خفض عدد الفئران المطلوبة التي توفر بالتالي الوقت وتكاليف العمالة.
تقدم هذه الدراسة بروتوكولا شاملا يفصل كيفية أداء مهمة موقع الجسم في الفئران البالغة باستخدام تجارب ترميز قوية وضعيفة تليها تجارب اختبار مع تأخير 1-h و 24-h. ينتج بروتوكول الترميز القوي ذاكرة التعرف ذات الأهمية الإحصائية عند اختباره بتأخير 1-h و 24-h وبالتالي يمكن استخدامه لدراسة الذكريات قصيرة الأجل وطويلة الأجل على حد سواء عند تنفيذ التلاعب لمنع هذه الذكريات11. وعلى النقيض من ذلك، فإن بروتوكول الترميز الضعيف ينتج ذاكرة كبيرة على المدى القصير فقط عند اختباره بتأخير 1 ساعة. يمكن استخدام غياب الذاكرة على المدى الطويل لدراسة التلاعب لتعزيز الاحتفاظ بالذاكرة11،12. يتضمن هذا البروتوكول أيضا جلسات معالجة مفصلة وجلسات عمل خاصة بالسكن، والتي تهدف إلى زيادة قابلية النسخ المتماثل لمهمة موقع الكائن. كما توضح هذه الورقة تكرار المهمة في أربعة سياقات متميزة مع نفس الفوج من الفئران باستخدام بروتوكول الترميز الضعيف، الذي تأكد أنه يؤدي إلى نتائج قابلة للتكرار ومتسقة في كل مرة.
Protocol
جميع الطرق المذكورة هنا قد تمت الموافقة عليها من قبل السلطات الوطنية الدنماركية (رقم الترخيص: 2018-15-0201-01405) وفقا لتشريعات الرفق بالحيوان الدنماركية والاتحاد الأوروبي.
1. الإعداد التجريبي وإعداد سياقات متميزة
- ساحة موقع الكائن مع السياق
ملاحظة: يظهر الإعداد أدناه في صندوق عازل للصوت(الشكل 1B)مع مصدر الضوء الموجود على طول حواف السقف والكاميرا الموجودة في وسط سقف الصندوق. الساحة، 60 سم × 60 سم مع الجدران التي هي 100 سم عالية (الشكل 1B)،يتم وضعها داخل منطقة الجزاء ومعزولة تماما عن الغرفة المحيطة بها. جميع الإشارات المكانية داخل الحلبة. وهذا يبسط عملية إنشاء سياقات متميزة. ويمكن تحقيق مستوى مماثل من العزلة عن الغرفة المحيطة بها من خلال إحاطة ساحة مفتوحة طبيعية مع ستارة موحدة حول الجدران.- الحصول على ساحة مربعة مصنوعة من البلاستيك الصلب غير المسامية مع عرض 60 سم كحد أدنى وارتفاع لا يقل عن 50 سم. اختيار لون للأرضية المتناقضة مع لون الجرذ لتسجيل ناجح لحركات الفئران من قبل البرنامج الآلي (إذا كان ذلك ممكنا). ضع الحلبة إما داخل مربع(الشكل 1B)أو على منصة محاطة بستارة.
- لإنشاء سياق، احصل على طبقة ثانية من الجدران القابلة للإنشاء(على سبيل المثال، تغطية الجدار المصنوعة من نفس المادة مثل الساحة، أو ورق الجدران البلاستيكي الذي يمكن تنظيفه بسهولة) بألوان و/أو أنماط مختلفة(على سبيل المثال، أسود أو أبيض أو خطوط أو نقاط). إدراج الطبقة الثانية من الجدران في الساحة بحيث أنها متميزة عن بعضها البعض.
- الحصول على إشارات مكانية ثلاثية الأبعاد (3D) (1-2 لكل سياق) مع أبعاد تتراوح بين 10 سم × 10 سم × 5 سم و 20 سم × 15 سم × 15 سم (العرض × الطول × الارتفاع) ولها (1) أشكال هندسية متميزة و (2) ألوان تتناقض مع لون الجدار. علقها على الجدران عالية بما فيه الكفاية بحيث الفئران لا يمكن أن تصل إلى هذه الإشارات.
- الحصول على أزواج مختلفة من الكائنات (مثل عدد السياق) التي هي غير مسامية، غير قابل للمضغ، وسهلة التنظيف. تهدف إلى أن يكون لها أشكال هندسية متميزة والقوام لكل كائن جديد. اختر الكائنات التي يتراوح عرضها بين 5 و15 سم (تجنب أي كائنات أعلى). انظر الشكل 1D للحصول على أمثلة من أربعة كائنات متميزة (المخاريط وكرة القدم والمناشير المستطيلة والمناشير الثلاثية).
ملاحظة: يجب أن يكون كل كائن من نفس الفائدة للفئران، بحيث تكون أوقات الاستكشاف الإجمالية لجميع الكائنات قابلة للمقارنة. - العثور على أفضل حل لربط الكائنات على أرضية الساحة(على سبيل المثال، باستخدام الحصير لزجة، الشريط على الوجهين، إرفاق لوحة معدنية تحت الكائن ومغناطيس الاقتران تحت الساحة الخ ).
- عند إنشاء سياق آخر، إعادة إنشاء الجدران بحيث أنها تتناقض مع توزيع اللون ونمط الجدران من السياق السابق (السياقات). استخدم إشارات مكانية ثلاثية الأبعاد جديدة تختلف عن جميع الإشارات السابقة وتتناقض معها. انظر الشكل 1C للاطلاع على أمثلة لأربعة سياقات متميزة.
- الحصول على مصدر الضوء التي من شأنها ضمان الإضاءة المنتشرة والمتساوية داخل الساحة، وهذا لديه خيار باهتة. ضبط شدة الضوء إلى ما يقرب من 100-120 لوكس في زوايا الساحة بعد إنشاء كل سياق. الحصول على كاميرا ووضعها في وسط سقف مربع.
ملاحظة: يمكن ضبط شدة الضوء إلى مستوى أدنى إذا لم يتم استخدام برنامج تسجيل تلقائي.
- دلو الكائن
- الحصول على دلو (قطرها >50 سم). لا تختار شكل مربع لتجنب أي تشابه مع الساحة التجريبية. ملئه بمواد الفراش.
- الحصول على 5-10 كائنات من مختلف الأشكال والأحجام (مختلفة عن الكائنات التي سيتم استخدامها في التجربة) ووضعها عشوائيا كل منهم في دلو(الشكل 1A).
الشكل 1:الإعداد التجريبي، بما في ذلك أربعة سياقات وكائنات متميزة. (أ) دلو الكائن للتعود على الكائن. (ب) جهاز التجربة (يسار)، مرفقا بساحة موقع الكائن والكاميرا ومصدر الضوء. مربع التجريبية والساحة قبل الإعداد السياق (وسط) والساحة مع الإعداد السياق (حق). (ج) أربعة سياقات (1-4) مع ألوان ونقوش جدار متميزة، فضلا عن الإشارات المكانية ثلاثية الأبعاد. (D) أربعة كائنات التي يتم استخدامها في سياقات 1-4، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- الكاميرا وبرامج التتبع (اختياري)
- الحصول على البرامج التي يمكن استخدامها للتحكم عن بعد في مسجل الكاميرا التي يمكن أن تتبع أنوف الفئران. إجراء تعديلات البرنامج لكل سياق محدد وسلالة الفئران قبل كل تجربة.
- موازنة مواقع الأجسام والمجموعات التجريبية
- قم بإعداد مجموعات ممكنة من مواقع الكائنات لاختبارات الترميز والاختبار، واسم هذه كعدادات. إنشاء تركيبات بحيث تغطي جميع الزوايا كمواقع الكائن، وحركة الكائن من المجاورة إلى زوايا قطري والعكس بالعكس (الشكل 2A).
- إعداد جدول زمني للتجربة المحددة، مطابقة كل فأر في مجموعة تجريبية واحدة مع عداد. استخدام كل زوج من اثنين من العدادات المقترنة(الشكل 2A)داخل مجموعة واحدة، إذا كان هناك ما يكفي من الفئران. استخدم نفس مجموعة العدادات لكلا المجموعتين التجريبيتين في جلسة ترميز/اختبار واحدة(الشكل 2B). إعادة تعيين العدادات للجلسات التالية(أي كل سياق جديد).
ملاحظة: تشغيل الفئران في ترتيب مختلط أثناء جلسات الترميز / الاختبار(على سبيل المثال،لا تقم بتشغيل جميع الفئران في قفص واحد تلو الآخر؛ بدلا من ذلك، تدوير الأقفاص لضمان بيئة هادئة داخل قفص من أكثر من فأر واحد). - عند استخدام سياقين أو أكثر لموازنة المجموعات التجريبية(على سبيل المثال، ذاكرة 1-h مقابل مجموعات ذاكرة 24 ساعة)، قم بتعيين الفئران لكل مجموعة، وغير المجموعات في السياقات التالية (الشكل 2B).
الشكل 2: طرق موازنة تمثيلية. (أ) يتم تسمية التوجهات المحتملة للكائنات في الساحة في الترميز واختبار التجارب كعدادات. الكائن 1 هو الكائن المتحرك دائما. يتم موازنة كل عدادين بحيث يتغير موقع الكائن المتحرك. يتم احتلال كل ركن مرتين، ويتم نقل الكائن 1 من قطري إلى مجاور والعكس بالعكس لعدد متساو من المرات. (ب)مثال على جدول الترميز/الاختبار لدورتين متوازنتين(على سبيل المثال، السياقان 1 و2). يتم تعيين الفئران لظروف تجريبية في السياق 1 (الدورة العاشرة، إلى اليسار). يتم اختيار مجموعة من أزواج العداد(أي 1-2 و 3-4 و 5-6 و 7-8) وتعيينها لكل فأر في مجموعة تجريبية واحدة. يتم تعيين نفس المجموعة من العدادات للفئران في كلتا المجموعتين التجريبيتين. في الجلسة التالية في السياق 2 (الدورة X+1؛ إلى اليمين)، يتم تغيير الفئران في المجموعات التجريبية للموازنة، ويتم تعيين مجموعة جديدة من أزواج العداد. وينبغي ملاحظة الوقت في بداية الترميز واختبار التجارب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ملاحظة: تم تحسين كافة جلسات المعالجة والتعود والترميز/الاختبار في هذا البروتوكول أثناء مرحلة الضوء لدورة ضوء/غامق 12 ساعة، ومن ثم يوصى بإجراء التجارب أثناء مرحلة الضوء.
2. المناولة والتعود
- ابدأ في التعامل مع الفئران بداية إما من الفطم (إذا تم تربية الفئران في المنشأة المنزلية) أو قبل أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من بدء التجارب (في حالة طلب الفئران من منشأة خارجية ، بعد السماح لها بالتأقلم لمدة أسبوع واحد بعد الوصول).
- قضاء ما لا يقل عن 10-15 دقيقة على كل قفص من 4 فئران لمدة 2 أو 3 أيام في الأسبوع حتى الفئران مريحة يجري لمسها والتقاطها من قبل المجرب. ضبط الوقت المخصص لكل قفص اعتمادا على عدد الفئران في قفص.
ملاحظة: من المهم أن جميع المجربين الذين يتوقعون العمل مع الفئران موجودون أثناء التعامل معها. - في الحالات التي يبدأ فيها التعامل مع الفطم، قم بتخفيض المعالجة إلى الحد الأدنى (اختياري) بمجرد الوصول إلى هذا المستوى. إذا بدأت قبل 2-3 أسابيع من التجارب، استمر في التعامل حتى بداية جلسات التعود.
- جلب الفئران في أقفاصهم إلى غرفة التجارب لتعود الفئران على النقل وكذلك إلى الغرفة التجريبية. السماح للفئران بالجلوس لمدة 30 دقيقة على الأقل لمنحهم الوقت للهدوء والتعود. بعد هذا الوقت، والعودة الفئران / أقفاص إلى غرفة السكن.
ملاحظة: الخطوة 2.4 يمكن دمجها مع معالجة وتكرار عدة مرات حسب الحاجة. ويمكن تنفيذ التعود إضافية في هذه الخطوة إذا كان البروتوكول يتضمن أي تلاعبات أخرى(على سبيل المثال، التعامل مع إجراء الحقن الخ). - إجراء التعود على الكائن لتعود الفئران على التفاعل مع الأشياء وتقليل مستويات الإجهاد العامة الناجمة عن تجربة بيئات جديدة.
- للجلسة 1، أحضر جميع الأقفاص المنزلية إلى غرفة التجارب، ودع الفئران تعودت على الغرفة واستقر لمدة 30 دقيقة على الأقل. وضع الفئران (2-4 الفئران) من نفس القفص معا في دلو لمدة 20 دقيقة. تنظيف دلو عن طريق إزالة أي البراز بين كل مجموعة من الفئران. كرر الإجراء لجميع الأقفاص. وضع جميع الفئران في أقفاص منازلهم والعودة إلى غرفة السكن.
- للجلسة 2، في يوم منفصل جلب جميع الأقفاص إلى غرفة التجربة وترك لمدة 30 دقيقة على الأقل. وضع كل الفئران بشكل فردي في دلو لمدة 10 دقيقة. ضع الجرذ مرة أخرى في قفص المنزل وتنظيف دلو بعد كل الفئران. أعد جميع الأقفاص إلى غرفة السكن.
- بالنسبة للجلسة 3، كرر الخطوة 2.5.2 في يوم منفصل.
- إذا كان الجهاز التجريبي هو مربع المغلقة (الشكل 1B)، تختار لأداء التعود مربع فارغ لتعود الفئران إلى الجهاز التجريبي الجديد. في الجلسة 4، أحضر جميع الأقفاص إلى غرفة التجارب واتركها لمدة 30 دقيقة على الأقل. وضع الفئران من نفس القفص معا (2-4 الفئران) في الساحة فارغة مع عدم وجود سياق أو العظة المكانية(الشكل 1B،وسط) لمدة 20 دقيقة. ضع جميع الفئران مرة أخرى في القفص المنزلي ، ومسح الحلبة مع الإيثانول بنسبة 70٪ بعد كل مجموعة من الفئران.
ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوتين 2.5 و 2.6 في أسبوع واحد، يسبق أسبوع التعود على السياق (الخطوة 2.7؛ انظر الشكل 3). استراحة لبضعة أيام خلال هذه الخطوات مقبولة. ومع ذلك، بعد بدء الخطوة 2.7، يجب تنفيذ كل خطوة في أيام متتالية كما هو محدد، حتى نهاية اختبار التجربة (الخطوة 2.9). - القيام بعادات السياق لتعود الفئران على السياق والإشارات ثلاثية الأبعاد ، لتقليل مستويات الإجهاد العامة ودعم التعلم المكاني للبيئة.
- تعديل arena فارغة لإنشاء السياق الأول كما هو موضح في المقطع 1.1 ولكن لا تضع الكائنات في arena. إعداد معدات التسجيل.
- للجلسة 1، أحضر جميع الأقفاص إلى غرفة التجارب واتركها لمدة 30 دقيقة على الأقل. بدء تشغيل المسجل إذا كان القيام بذلك يدويا. ضع الجرذ الأول في وسط الحلبة، والسماح للفأر لاستكشاف الساحة لمدة 10 دقائق. ثم، وقف مسجل (إذا دليل)، ووضع الفئران مرة أخرى في قفص المنزل. مسح الساحة بدقة مع الإيثانول 70٪ بعد كل فأر، والعودة جميع الأقفاص إلى غرفة الإسكان عند الانتهاء.
- بالنسبة للدورتين 2 و3، كرر الخطوة 2.7.2 لكل فأر على مدى يومين متتاليين بحيث يكون هناك 3 جلسات من عادات السياق لكل فأر في المجموع.
ملاحظة: النظر في خلط الترتيب الذي الفئران تذهب إلى الساحة، وخاصة عند التعامل مع مجموعة كبيرة. وهذا يتجنب تشغيل فئران محددة بشكل متكرر في نفس الوقت من اليوم.
الشكل 3:تصميم التجربة السلوكية بما في ذلك المناولة والتعود وبروتوكولات مهام موقع الكائن. يجب التعامل مع الفئران بانتظام بدءا من أسابيع قليلة قبل أسبوع التعود. في الأسبوع 0 ، يتم إجراء العادات الكائن والتجريبي مربع أكثر من 4 جلسات مع فترات 24 ساعة على الأقل في ما بين. في الأسبوع الأول، يتم إجراء إعادة التعود على السياق على مدى 3 جلسات متتالية مع فترات 24 ساعة بينهما، تليها تجارب الترميز والاختبار. يجب أن يكون الحد الأدنى 48 ساعة وفترة أسبوع واحد قبل الشروع في الدورة التالية(على سبيل المثال، بدء التعود على السياق التالي في الأسبوع 2 أو 3). اختصار: هاب، التعود. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- ترميز المحاكمة (الدورة 4)
ملاحظة: في حالة التلاعب الدوائي، يمكن أن يكون الوقت المعقول لإدارة العامل إما قبل أو بعد تجربة الترميز مباشرة و/أو قبل تجربة الاختبار اعتمادا على طبيعة العامل الدوائي.- أحضر جميع الأقفاص إلى غرفة التجارب واتركها لمدة 30 دقيقة على الأقل. باستخدام الجدول الزمني المعد مسبقا(الشكل 2B)،ضع أول زوج متطابق من الأشياء في المواقع المحددة (في 2 زوايا وعلى مسافة >10 سم من كل جدار؛ ويمكن استخدام قطعة من الورق المقوى على شكل حرف L للحفاظ على نفس المسافة في كل مرة) باستخدام الحصير لزجة أو الشريط على الوجهين.
- بدء تشغيل المسجل (إذا كان يدوي). ضع الجرذ الأول في الحلبة التي تواجه جدار أو زاوية التي لا يشغلها أي كائن (على مسافة متساوية لكل كائن).
ملاحظة: اتبع الخطوات التالية إما ترميز ضعيف أو قوي. - لضعف الترميز (1 المحاكمة)، والسماح للفأر لاستكشاف الساحة والكائنات لمدة 20 دقيقة. ثم، وقف مسجل (إذا كان يدويا)، ووضع الفئران مرة أخرى في قفص المنزل. إزالة الكائنات، ومسح كل من الكائنات والساحة تماما مع الإيثانول 70٪.
- كرر الخطوة 2.8.3 لجميع الفئران بحيث يتلقى كل فأر تجربة ترميز واحدة من 20 دقيقة.
- لترميز قوي (3 التجارب)، والسماح للفأر لاستكشاف الساحة والكائنات لمدة 5 دقائق. ثم، وقف مسجل (إذا كان يدويا)، ووضع الفئران مرة أخرى في قفص المنزل. لا تقم بإزالة الكائنات. مسح الساحة والأشياء مع الإيثانول 70٪.
- كرر الخطوة 2.8.5 مرتين أخريين مع نفس الجرذ بحيث يكون هناك 3 تجارب في المجموع. ضع الجرذ مرة أخرى في قفص المنزل عندما يحين الوقت. إزالة الكائنات لتنظيف شامل، ومسح الكائنات والساحة مع الإيثانول 70٪.
ملاحظة: يجب أن يكون الفاصل الزمني بين التجارب للفئران حوالي 1-2 دقيقة. - كرر الخطوات 2.8.5-2.8.6 لكل فأر.
- إذا كان وقت التأخير أقصر من 24 ساعة، احتفظ بالأقفاص في غرفة التجربة حتى تجربة الاختبار. إذا لم يكن كذلك، إعادة جميع الأقفاص إلى غرفة السكن عند الانتهاء.
- اختبار التجربة (الجلسة 4)
ملاحظة: يجب حساب فترة التأخير من بداية التجربة الترميز.- في حالة التأخير لمدة 24 ساعة (أو أي تأخير يتطلب إجراء تجربة الاختبار في اليوم التالي) ، أحضر جميع الأقفاص إلى غرفة التجربة ، مما يترك وقتا كافيا قبل الاختبار الأول بحيث يمكن ترك الفئران لمدة 30 دقيقة على الأقل. وفقا للجدول الزمني، ضع الكائنات في المواقع المحددة (أحد الكائنات في موقع جديد).
- عندما يحين الوقت، ابدأ تشغيل المسجل (إذا كان يدويا). ضع الجرذ الأول في الحلبة التي تواجه جدار أو زاوية التي لا يشغلها أي كائن (على مسافة متساوية لكل كائن).
- السماح للجرذ لاستكشاف الساحة والكائنات لمدة 5 دقائق. ثم أوقف المسجل (إذا كان يدويا). ضع الجرذ مرة أخرى في قفص المنزل. إزالة الكائنات، ومسح كل من الكائنات والساحة تماما مع الإيثانول 70٪.
- كرر الخطوات 2.9.2-2.9.3 لكل فأر. أعد جميع الأقفاص إلى غرفة السكن.
ملاحظة: في كل جلسة ترميز/اختبار التالية بدء بروتوكول التعود من الخطوة 2.7 (تعود السياق) بعد فاصل زمني لا يقل عن 48 ساعة وإلى أسبوع واحد.
3. تحليل البيانات
- لكل فأر، قم بتسجيل وقت الاستكشاف لكل كائن في كل من الترميز واختبار التجارب باستخدام البرامج المصممة لهذا الغرض أو باستخدام إعداد يدوي. تسجيل تجارب الترميز طوال المدة. اختبار التجارب النتيجة لمدة 2 دقيقة لأفضل أداء التمييز3. إذا كنت تستخدم تسجيل البرامج عبر الإنترنت تلقائيا، قم بتصدير بيانات التسجيل من البرنامج.
- عد وقت الاستكشاف عندما يكون الجرذ على اتصال مع الكائن، وشم الكائن أو مواجهة الكائن على مسافة أقل من 2 سم. وتشمل التسلق والجلوس على الكائن والاستكشاف ما لم يكن انتباه الفئران ويبدو أن في مكان آخر غير الكائن(على سبيل المثال، يبحث بعيدا عن الكائن).
- حساب إجمالي وقت الاستكشاف لكلا الكائنين لكل فأر. النظر في استبعاد أي الفئران التي لديها وقت استكشاف مجموع أقل من 10 ثانية في تجربة اختبار (لتسجيل 2 دقيقة) من هذا الاختبار، لأنها قد تعكس استكشاف لا يمكن الاعتماد عليها.
- حساب النسبة المئوية للاستكشاف لكل كائن (المعادلة 1) أو مؤشر التمييز (DI) لكل فأر (المعادلة 2)، وحساب متوسط القيم للمجموعات.
(1)
ملاحظة: إذا كان ٪ استكشاف 50٪ أو DI هو 0، فهذا يعني أن الأداء في مستوى فرصة، و الفأر لديه أي تفضيل لأي كائن. يجب أن يكون متوسط نسبة الاستكشاف وDI أثناء تجارب الترميز ~ 50٪ أو 0، على التوالي. وينبغي استبعاد أي فأر يظهر تفضيلا أعلى من [متوسط ± (2 × SD)] لأي من الكائنين في تجربة الترميز من تحليل الاختبار المعني. وهذا يسمح لتفسير موثوق للتفضيل في تجربة الاختبار كذاكرة لموقع الكائن المستقر. يمكن حساب هذه القيمة لاختبار فردي أو لبيانات الترميز المجمعة من عدة اختبارات. - تحليل البيانات من خلال الطريقة التي تناسب أفضل الإعداد التجريبي. استخدم عينة واحدة t-testللكشف عن تفضيل كبير فوق مستوى الفرصة.
- أثناء استخدام أكثر من سياق واحد مع التوازن ، اجمع نتائج نفس الحالة التجريبية عبر السياقات.
ملاحظة: سيؤدي هذا إلى مجموعات تتكون من نفس الجرذان، مما يتيح المقارنة داخل الموضوع باستخدام اختبار tمقترن لمجموعتين واستخدام تحليل مقاييس متكررة للتباين (ANOVA) لأكثر من مجموعتين.
(1)
Representative Results
تظهر هنا النتائج التمثيلية لكل من بروتوكولات الترميز القوية والضعيفة الموصوفة باستخدام الذكور التيروزين هيدروكسيلوكس (Th) - Cre الجرذان المعدلة وراثيا13 مع سلالة Long-Evans عبرت أربع مرات إلى سلالة ليستر هود والجرذان المقنعة ليستر البرية. تم استخدام الفئران المعدلة وراثيا Th-Cre كما سيتم استخدام هذا الخط الفئران في الدراسات المستقبلية التي تنطوي على علم الوراثة البصرية. باستخدام كل بروتوكول، تم اختبار الذاكرة مع تأخير 1 و 24 ساعة. تظهر الاختبارات التي تبلغ سرعتها ساعة واحدة الذاكرة قصيرة المدى، في حين تظهر الاختبارات التي تبلغ سرعتها 24 ساعة ذاكرة طويلة الأجل. تم حساب قيمة الاستبعاد لتفضيل الترميز كما هو موضح في البروتوكول، باستخدام البيانات المجمعة من خمسة اختبارات (بروتوكولات ترميز قوية وضعيفة) ك [50.8٪ ± (2×10.8٪)]. واستبعدت الفئران التي كان لها تفضيل الترميز فوق هذه القيم وأقل منها من تحليلات الاختبارات المعنية.
وفي تجارب الترميز القوية، استخدم 16 فأرا، واستخدمت 19 فأرا لتجارب الترميز الضعيفة. خلال التجارب ترميز قوية (3 × 5 دقيقة ترميز; الشكل 4A)، لم يكن هناك تفضيل كبير لأي من الكائنين (52.0 ± 1.9٪، n = 16، t15 = 1.1، p = 0.29؛ عينة واحدة t-testمقابل مستوى الفرصة). هذا البروتوكول ترميز قوي أدى إلى تفضيل للكائن في موقع الرواية، كما هو مبين من حيث متوسط نسبة الاستكشاف، التي كانت أعلى بكثير من مستوى الفرصة (50٪) في الاختبارات مع كل من تأخير 1 ساعة و 24 ساعة (ذاكرة 1 ساعة، 77.9 ± 2.4٪، n = 8، t7 = 11.8، p < 0.001؛ ذاكرة 24 ساعة، 65.2 ± 5.3٪، n = 8، t7 = 2.8، p = 0.025؛ عينة واحدة t-اختبارمقابل مستوى فرصة). لم يكن هناك فرق كبير بين ذاكرة 1 ساعة و 24 ساعة (ع = 0.056؛ غير مدفوعة ويلش تياختبار).
أثناء تجارب الترميز الضعيفة (ترميز 20 دقيقة؛ تجميع النتائج من أربعة سياقات؛ الشكل 4B)، لم يكن هناك تفضيل كبير لأي من الكائنين (51.1 ± 1.0٪، n = 66، t65 = 1.2، p = 0.24؛ عينة واحدة t-testمقابل مستوى الفرصة). هذا البروتوكول ترميز ضعيفة أنتجت زيادة كبيرة في تفضيل الكائن في موقع الرواية مقارنة مع مستوى فرصة في الاختبارات مع تأخير 1 ساعة، ولكن ليس تأخير 24 ساعة (البيانات المجمعة من جميع السياقات الأربعة؛ ذاكرة 1 ساعة، 66.7 ± 2.0٪، n = 32، t31 = 8.2، p < 0.001؛ ذاكرة 24 ساعة، 49.6 ± 2.6٪، n = 34، t33 = 0.16، p = 0.87؛ عينة واحدة t-اختبارمقابل مستوى فرصة). كان هناك فرق كبير بين الأداء في الاختبارات مع تأخير 1 ساعة و 24 ساعة (ذاكرة 1 ساعة: n = 32، ذاكرة 24 ساعة: n = 34، t61.5 = 5.2، p < 0.001؛ غير مدفوعة اختبار ويلش t).
لم يتم ملاحظة الذاكرة على مستوى المجموعة في اختبار التأخير 24 ساعة كما فهرستها من قبل الأداء على مستوى الفرصة، ولكن أظهرت اختلافات فردية. لوحظ هذا الاختلاف الأعلى لظروف ضعيفة إلى عدم وجود ذاكرة(على سبيل المثال، اختبار 24 ساعة) عادة بسبب استكشاف أكثر عشوائية للكائنات. ومن ثم، من المهم عدم تفسير أداء الفئران بشكل فردي. بدلا من ذلك، يمكن استخدام توزيع نقاط البيانات الفردية جنبا إلى جنب مع متوسط المجموعة كنتيجة موثوق بها للاختبار. وكلما كان الترميز أقوى، كلما أصبح سلوك الفئران أكثر اتساقا، وقل عدد الفئران اللازمة للوصول إلى الأهمية الإحصائية، كما يمكن ملاحظته في الشكل 4A لبروتوكول الترميز القوي. وعلى النقيض من ذلك، هناك حاجة إلى مجموعات أكبر للحصول على نتائج موثوقة لظروف ضعيفة(الشكل 4B).
الشكل 4: أداء الذاكرة بعد ترميز قوي وضعيف. (أ) تجربة الترميز القوية (3 × 5 دقائق ترميز) تليها إما 1 ساعة أو 24 ساعة اختبار التجارب. لم يكن هناك تفضيل كبير لأي من الكائنين أثناء ترميز التجارب (n = 16). الترميز القوي أنتج تفضيلا متزايدا للكائن في الموقع الجديد في الاختبارات مع تأخيرات 1-h و 24-h مقارنة بمستوى الفرصة (ذاكرة 1-h و 24-h: n = 8 في كل مجموعة). ولم يكن هناك فرق كبير بين المجموعات. (ب)تجربة الترميز الضعيفة (ترميز 20 دقيقة) تليها إما تجارب اختبار 1-h أو 24-h. لم يكن هناك تفضيل كبير لأي من الكائنين كمجموعة أثناء ترميز التجارب (n = 66). أدى الترميز الضعيف إلى زيادة تفضيل الكائن بشكل كبير في الموقع الجديد في الاختبار مع تأخير 1-h ، ولكن ليس تأخير 24 ساعة ، مقارنة بمستوى الفرصة (ذاكرة 1-h: n = 32 ؛ ذاكرة 24 ساعة: n = 34). كان هناك فرق كبير بين الأداء في الاختبارات مع تأخير 1 ساعة و 24 ساعة. وقد جمعت النتائج من أربعة سياقات. يتم تقديم نقاط البيانات الفردية كنقاط. جميع الحانات تظهر النسبة المئوية لاستكشاف الكائن في موقع الرواية كما يعني ± SEM. * ص < 0.05، *** ع < 0.001؛ عينة واحدة t-testمقابل مستوى الفرصة (50٪، خط متقطع). ###p < 0.001; ns، ليست كبيرة؛ غير مدفوعة ويلش تياختبار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ومن المزايا الهامة لهذا البروتوكول المنشأ أنه يمكن تنفيذه أربع مرات باستخدام أربعة سياقات متميزة(الشكل 1C)مع نفس الفوج من الفئران. وتبين النتائج المبينة في الشكل 5 إحدى الطرق الممكنة لاستخدام التوازن مع مجموعتين تجريبيتين (مجموعتا ذاكرة 1-h و24-h). وقد تمت موازنة المجموعتين على سياقين (السياقان 1 و2)، وتكرر ذلك في سياقين إضافيين (السياقان 3 و4؛ وسياقان 2 و2؛ وسياقان 2 و2؛ وسياقان 2 و2؛ وسياقان 2 و2 و2 و2000؛ وسياقان 2 و2 و2 و2000). الشكل 5A). يتم عرض نتائج السياقات الأربعة بشكل فردي في الشكل 5B, D, حيث تم تقييم الذاكرة لكل مجموعة تجريبية من خلال مقارنة الأفضلية بمستوى الفرصة في كل سياق (ذاكرة 1 ساعة: السياق 1، 69.9 ± 3.6٪، n = 9، t8 = 5.5، p < 0.001؛ السياق 2، 65.6 ± 3.9٪، n = 9، t8 = 4.0، p = 0.004؛ السياق 3، 65.2 ± 3.8٪، n = 7، t6 = 4.0، p = 0.007؛ السياق 4، 65.3 ± 5.6٪، n = 7، t6 = 2.7، p = 0.035؛ ذاكرة 24 ساعة: السياق 1، 45.1 ± 6.4٪، n = 9، t8 = 0.77، p = 0.46؛ السياق 2، 49.1 ± 4.9٪، n = 9، t8 = 0.18، p = 0.86؛ السياق 3، 57.2 ± 4.1٪، n = 8، t7 = 1.7، p = 0.12؛ السياق 4، 47.6 ± 4.7٪، n = 8، t7 = 0.52، p = 0.62؛ عينة واحدة t-اختبارمقابل مستوى فرصة).
في السياقات 1 و 2 و 4، كشفت المقارنة بين الموضوعات للمجموعات عن اختلافات كبيرة بين الذاكرة 1-h و 24-h (ذاكرة 1-h مقابل ذاكرة 24 ساعة: السياق 1، t12.7 = 3.4، p = 0.005؛ السياق 2، t15.2 = 2.6، p = 0.019؛ السياق 3، t13.0 = 1.4، p = 0.17؛ السياق 4، t12.2 = 2.4، p = 0.032؛ غير مدفوع ويلش راختبار). من أجل تمثيل أفضل ومقارنة داخل الموضوع للبيانات ، تم الجمع بين النتائج من سياقين متوازنين(الشكل 5C، E). تمت مقارنة المجموعات التجريبية المشتركة بمستوى الصدفة بشكل فردي مرة أخرى (السياقان 1 و 2 مجتمعين: ذاكرة 1-h، 67.8 ± 2.6٪، n = 18، t17 = 6.7، p < 0.001؛ ذاكرة 24 ساعة، 47.1 ± 3.9٪، n = 18، t17 = 0.74، p = 0.47؛ السياقات 3 و 4 مجتمعة: ذاكرة 1 ساعة، 65.3 ± 3.3٪، ن = 14، ر13 = 4.7، ص < 0.001؛ ذاكرة 24 ساعة، 52.4 ± 3.2٪، n = 16، t15 = 0.73، p = 0.48؛ عينة واحدة t-اختبارمقابل مستوى فرصة). ثم تمت مقارنة المجموعات التجريبية ببعضها البعض.
في كلا أزواج السياق، كانت هناك اختلافات كبيرة بين المجموعات كما كشفت عنها المقارنات داخل الموضوع (ذاكرة 1-h مقابل ذاكرة 24 ساعة: السياقان 1 و 2 مجتمعين، t16 = 3.5، p = 0.003؛ السياقات 3 و 4 مجتمعة، ر13 = 2.4، ص = 0.032؛ يقترن تياختبار). تم الحصول على نتائج مماثلة مع الفئران المقنعة ليستر البرية من النوع ، أيضا ، في بروتوكول الترميز الضعيف باستخدام السياقين 1 و 4 للدورتين الموازنتين (البيانات غير المعروضة). تم التحقق من قابلية النسخ المتماثل وثوقية النتائج بمقارنة كل مجموعة بيانات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه. لم يتم الكشف عن أي اختلاف كبير بين السياقات الأربعة (ذاكرة 1 ساعة: F3,28 = 0.31، p = 0.81؛ ذاكرة 24 ساعة: F3,30 = 0.99، p = 0.41). لذلك، يمكن تكرار اختبار موقع الكائن بشكل موثوق مع الحد الأدنى من تأثير التكرار، نظرا لاتباع التعليمات الواردة في هذا البروتوكول.
الشكل 5: طرق مختلفة لعرض وتحليل نتائج بروتوكول الترميز الضعيف مع مجموعتين تجريبيتين متوازنتين على مدى جلستين. (أ) التصميم التجريبي للموازنة مع مجموعتين تجريبيتين (مجموعات ذاكرة 1-h و 24-h) على مدى جلستين (السياقان 1 و 2). وتكررت موازنة الظروف في جلستين إضافيتين (السياقان 3 و4). (ب و د) تمت مقارنة النتائج من كل سياق والمجموعات التجريبية بشكل فردي بمستوى الصدفة وبكل منها الآخر. في جميع السياقات الأربعة، تم زيادة تفضيل الكائن في الموقع الجديد في الاختبارات مع تأخير 1-h بشكل كبير مقارنة بمستوى الفرصة [السياق 1 و 2: n = 9 لكل مجموعة (B)؛ السياق 3 و4: n = 7 لكل مجموعة(D)]. في اختبارات التأخير 24 ساعة، لم يختلف تفضيل الكائن في الموقع الجديد عن الصدفة (السياق 1 و2: n = 9 لكل مجموعة؛ السياق 3 و 4: n = 8 لكل مجموعة). وكان هناك فرق كبير بين تفضيلات المجموعات التجريبية في السياقات 1 و2 و4، ولكن ليس السياق 3، كما كشفت المقارنة بين الموضوعين. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; عينة واحدة t-testمقابل مستوى الفرصة (50٪، خط متقطع). #ع < 0.05 ؛ ##ص < 0.01; ns، ليست كبيرة؛ غير مدفوعة ويلش تياختبار. (ج و ه) يتم عرض النتائج بعد الجمع بين المجموعات التجريبية من السياقين الموازنين [السياقان 1 و 2 مجتمعان، n = 17 لكل مجموعة (C)؛ السياقان 3 و4 مجتمعان، n = 14 لكل مجموعة(E)]. تم زيادة تفضيل الكائن في الموقع الجديد بشكل كبير مقارنة بمستوى الفرصة في الاختبارات مع تأخير 1-h ، ولكن ليس 24 ساعة ، في كلا أزواج السياق. وكشفت المقارنة داخل الموضوع للمجموعات التجريبية عن اختلافات كبيرة بين تفضيلات الجسم في الموقع الجديد في الاختبارات مع تأخير 1 ساعة و 24 ساعة في كلا الزوجين السياق. ص < 0.001; عينة واحدة t-testمقابل مستوى الفرصة (50٪، خط متقطع). #ع < 0.05 ، # #ف < 0.01 ؛ يقترن تي-اختبار. يتم تقديم نقاط البيانات الفردية كنقاط. تظهر جميع الأشرطة النسبة المئوية لاستكشاف الكائن في الموقع الجديد على أنها متوسط ± SEM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يمكن استخدام مهمة موقع الكائن في مجموعة متنوعة من الدراسات للتحقيق في الذاكرة المكانية كما هو موضح سابقا. مرونة الإعداد تمكن من نمذجة الذاكرة على المدى القصير والطويل من نقاط القوة المختلفة، ويمكن تنفيذها بسهولة بتكلفة منخفضة. ومع ذلك، كما أن هناك العديد من المعلمات في البروتوكول التي يمكن أن تؤثر على النتائج، ودراسات مختلفة تختلف قليلا في هذه المعلمات6،يمكن للمرء أن يواجه صعوبات في تنفيذ المهمة بنجاح للمرة الأولى. يهدف البروتوكول أعلاه إلى توجيه القراء خلال هذه العملية بسلاسة. ونوقشت أدناه خطوات حاسمة أخرى قد تكون هامة في التنفيذ الناجح للمهمة ذات قابلية عالية للتكرار.
على الرغم من أن جلسة الترميز / الاختبار غالبا ما تكون التركيز عند تشغيل تجارب موقع الكائن ، فإن بروتوكولات المناولة والتعود لها تأثير عميق على نتيجة هذا النوع من الاختبارات السلوكية حيث تعتمد النتيجة على سلوك الفئران الطبيعية غيرالمضطربة 14،15. على هذا النحو، يجب أن تصمم الخطوات السابقة لجلسة الترميز/الاختبار بحذر، لأنها يمكن أن تؤثر على سلوك الفئران والذاكرة وبالتالي، تؤثر على النتائج النهائية. وهناك مستوى جيد من التعامل والتعود بحيث الفئران تصبح مألوفة مع المجرب والمهمة سوف تقلل من تأثير عوامل الإجهاد مع زيادة احتمال عرض السلوك الطبيعي8. كما ذكر في البروتوكول ، يمكن أن يبدأ المناولة في وقت مبكر من فطام الجراء إذا تم الحفاظ على سلالة الفئران في المرفق المنزلي. استنادا إلى الخبرة السابقة (البيانات غير مبين) ومن عدة دراساتسابقة 16,17, هذا التعامل المبكر النتائج في انخفاض القلق وتعزيز الفضول في الأشهر التالية.
كما مهمة موقع الكائن يعتمد فقط على محرك الأقراص الاستكشافية الجوهرية للفئران، يمكن أن يعوق بسهولة السلوك المتوقع إذا الفئران ليست حريصة على استكشاف أو مترددة في الاقتراب من الجدة، والتي يشار إليها باسم "السلوك النيوفوبيكي"1. وعلى هذا النحو، يوصى بشدة بتضمين بروتوكول شامل للتعامل والتعود وفقا للاحتياجات المحددة للدراسة. يمكن استخدام هذا البروتوكول كدليل الحد الأدنى من المتطلبات، ويمكن تنفيذ المزيد من الخطوات(على سبيل المثال،إذا كان للدراسة أن تشمل الحقن في مرحلة لاحقة، والتعود على إجراءات الحقن ووضع عقد محددة مطلوبة). السلالة وعمر الفئران التجريبية هما عاملان مؤثران آخران وينبغي النظر فيهما قبل التخطيط لتجربة لتجنب النتائج دون المستوى الأمثل. سلالات الفئران المختلفة يمكن أن يكون لها سلوكيات مختلفة ومستويات القلق خط الأساس18،19،20 ، وبالتالي ، قد تكون هناك حاجة إلى تعديل محدد للبروتوكول اعتمادا على سلالة المستخدمة.
وأكد هذا البروتوكول للعمل بشكل جيد مع الفئران المعدلة وراثيا Th-Cre مع سلالة لونغ ايفانز backcrossed أربع مرات لسلالة ليستر مقنعين والجرذان البرية من نوع ليستر مقنعين. سن البدء المثالي منطقيا للفئران في التجارب السلوكية حوالي 12 أسبوعا20، ولكن يجب حساب التباين بين السلالات والمتطلبات المحددة للمهمة. كما يمكن استخدام الفئران النامية إذا كان ذلك مهما للدراسة، على الرغم من أنه قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات على البروتوكول وغير مشمولة هنا. ومع ذلك، من المهم النظر فيما إذا كان الجرذ في سن معينة قد طور الوظائف المعرفية المطلوبة لأداء هذه المهمة بنجاح. وقد أفادت دراسة21 التحقيق في هذا أن الفئران المراهقين فقط في يوم ما بعد الولادة 38 وليس قبل ذلك، أظهرت الذاكرة المكانية allocentric ينعكس في تفضيل الكائن في موقع الرواية، كما لوحظ في الفئران الكبار. البروتوكول المعروض هنا كان ناجحا باستخدام الفئران التي كانت 15-16 أسابيع من العمر في بداية الدورة الترميز / الاختبار الأول. في السابق ، كان نفس بروتوكول الترميز القوي ينتج نتائج دون المستوى الأمثل إلى النتائج السلبية عند استخدام الفئران البالغة من العمر 23 أسبوعا التي لم تصل إلى المستوى الأمثل من التعود بسبب نقص المناولة والتعود في سن مبكرة بما فيه الكفاية. هذه الفئران إما فشلت في أداء مختلف عن مستوى فرصة أو في الواقع، أظهرت نفورا نحو الجدة كما لوحظ من حيث تفضيل الكائنات مستقرة بدلا من الكائنات المشردة (البيانات غير مبين). تقدم هذه النتائج أدلة على أن عمر وتوقيت التعامل مع التعود يمكن أن يكون له تأثير على فعالية التعود ونتيجة لذلك ، يساهم في مراقبة السلوك القلق والنيوفوبيكي في الاختبارات.
هنا، يتم تحديد بروتوكولين مختلفين، مما يضمن ترميز قوي أو ضعيف في مهمة موقع الكائن. وأثناء وضع هذه البروتوكولات، لوحظ أن الاهتمام بالأجسام انخفض بعد 5-10 دقائق من الاستكشاف خلال تجارب طويلة واحدة(على سبيل المثال، ترميز 20 دقيقة)، وتوقفت الفئران في نهاية المطاف عن الاستكشاف. يؤدي هذا إلى ذاكرة أضعف من مواقع الكائن. بروتوكول الترميز الذي ترميز التجارب interleaves مع فترات راحة قصيرة(على سبيل المثال، 3 × 5 دقيقة ترميز) يتغلب على هذا ويؤدي إلى استكشاف عالية في جميع أنحاء التجارب. وهكذا، فإن وقت الاستكشاف النشط والتخطيط المختلف لهذين البروتوكولين الترميز يؤثر على قوة الذاكرة، التي هي أقوى بعد ترميز 3 × 5 دقائق مما كانت عليه بعد بروتوكولات الترميز 20 دقيقة. ويمكن أيضا تحقيق نتائج مماثلة باستخدام فترات مختلفة قليلا مع بروتوكولات تجريبية واحدة مقابل بروتوكولات تجريبية متداخلة، ويمكن إجراء تعديلات لتناسب احتياجات الدراسة وسلالة الفئران.
بدلا من البروتوكولات التي تستخدم حقلا أبيضا مفتوحا عاديا مع إشارات خارجية فقط في الغرفة ، يستخدم البروتوكول المعروض هنا ساحة ذات سياقات متميزة وإشارات داخل المتاهة تتطلب على الأرجح المزيد من الوقت للتعلم. ومن ثم، يوصى بإضافة خطوة اتقاء السياق في البروتوكول قبل تجربة الترميز. وسيسمح ذلك للفئران بتشكيل خريطة مكانية لكل سياق أثناء التعود وتقليل مدة تجربة الترميز التالية، حيث ستحتاج الفئران فقط إلى ترميز مواقع الأجسام فيما يتعلق بهذه الخريطة. وعلاوة على ذلك، فإن تعود السياق سيسمح للفئران بالتعود على أي مشتت محتمل في كل سياق، مثل الإشارات المكانية ثلاثية الأبعاد، وتقليل السلوكيات بخلاف استكشاف الأجسام في جلسة الترميز/الاختبار التي ستتبعها. مع تنفيذ طريقة شاملة التوازن تتكون من عدة مستويات(أي مجموعة واسعة من تركيبات موقع الكائن (عدادات) واتجاه الإزاحة الكائن)، يتم تقليل التفضيلات غير المرغوب فيها التي قد ترتفع بسبب الاختلافات في كثافة الضوء وألوان الجدار / أنماط في زوايا الساحة.
وينبغي النظر في عدة عوامل عند تكرار المهمة لزيادة قابلية النسخ المتماثل بين جلسات الترميز / الاختبار وتقليل تأثير التكرار. أولا، يجب تصميم سياقات متميزة (مثل عدد تكرار جلسات الترميز/الاختبار) لتجنب تراكم الذاكرة المكانية التي قد تكون ناتجة عن إجراء جلسات العمل المتكررة باستخدام نفس السياق. ولتحقيق ذلك، تم استخدام جهاز مزود بجدران قابلة للاستبدال بألوان وأنماط مختلفة (الشكل 1B، C). الجدران المتميزة والكائنات ثلاثية الأبعاد (مثل اللعب أو العناصر اليومية الصغيرة ذات الألوان والأشكال المتميزة ، انظر البروتوكول والشكل 1C)معلقة على الجدران هي الإشارات والمعالم المكانية التي يحتمل أن تستخدمها الفئران لتعلم مواقع الكائنات فيما يتعلق بسياقها. في حالة فشل اختبار لإنتاج تفضيل للكائن المنقول، تغيير هذه المعلمات من السياق (تصميم الجدار والإشارات المكانية) يمكن النظر فيها. بدلا من ذلك، يمكن استخدام arena مستطيلة أو دائرية الشكل لمهام موقع الكائن بدلا من ساحة مربعة كما هو الحال في هذا البروتوكول. يتم الإبلاغ عن الساحات الدائرية للقضاء على تفضيلات الزاوية22 التي غالبا ما لوحظ في الساحات مع زوايا، وبالتالي، يمكن أن يكون مفيدا عند التعامل مع الفئران عالية القلق بشكل خاص أو سلالة الماوس. في حين أن متطلبات إنشاء أربعة سياقات متميزة في هذا البروتوكول تعمل على النحو الأمثل مع شكل رباعي ، يمكن أيضا جعل الساحة الدائرية وظيفية بعد بعض التعديلات.
ثانيا، ينبغي تحديد الفترات الفاصلة بين كل جلسة ترميز/اختبار بحيث تحتفظ الفئران بنفس المستوى من الاهتمام في كل مرة، مع تجنب خطر التعلم التراكمي الناتج عن جدول زمني كثيف من التكرار. عادة ما تكون فترة زمنية لا تقل عن ضعف طول مدة التأخير بين الترميز والتجارب الاختبارية كافية ، مع فترات أطول تكون أكثر ملاءمة لأكثر من تكرارين. وهذا يعني، في حين أن فاصلا لا يقل عن 48 ساعة بعد اختبار 24 ساعة يكفي لتكرار واحد أو اثنين، يوصى باستخدام فاصل زمني لمدة أسبوع واحد لأربع مرات تكرار. كما تظهر النتائج في الشكل 5 والمقارنة باستخدام ANOVA، يمكن تكرار المهمة بنجاح أربع مرات. وبناء على ذلك، يمكن استخدام البروتوكول المعمول به لموازنة ما يصل إلى أربعة شروط تجريبية. يحدد عدد المجموعات التجريبية عدد تكرار جلسات الترميز/التجربة في سياقات مختلفة. وتمثل النتائج الواردة في الشكل 5 إحدى الطرق الممكنة لاستخدام البروتوكول مع مجموعتين تجريبيتين. وجرى موازنة المجموعات في جلستين، وتكررت نفس الشروط في جلستين إضافيتين (لأغراض التحقق من الصحة). ويمكن أيضا استخدام المجموعة الثانية من الدورات الموازنة لموازنة الظروف الجديدة. وبالمثل، يمكن مقارنة ثلاثة أو أربعة شروط تجريبية باستخدام ثلاث أو أربع جلسات متوازنة، على التوالي.
وفي هذه الحالات، ينبغي تصميم السياقات بحيث تستوعب الخصائص المتناقضة الموصوفة في البروتوكول. ومن الجدير بالذكر أن التصميم الموازن قد لا يكون مناسبا للتجارب التي تستخدم فيها عمليات تلاعب إضافية، مثل التدخل الدوائي الذي قد يترك أثرا أو ضررا طويل الأمد. وللحفاظ على فعالية الاختبارات وتكرارها، ينبغي تصميم التجربة وفقا لذلك. يمكن عرض البيانات من الاختبارات المتكررة وتحليلها بعدة طرق، كما هو موضح في الشكل 5. لتحليل أولي، يمكن مقارنة المجموعات التجريبية في كل سياق على حدة إلى مستوى فرصة باستخدام عينة واحدة ر-اختبارلتحديد أي تفضيل كبير(الشكل 5B،D). قد يكون ذلك مفيدا في الحصول على فهم سريع للبيانات، ولكنه يضمن مقارنة غير مباشرة للمجموعات فقط. لذلك، لمقارنة مجموعتين أو أكثر، يجب تحليل البيانات باستخدام اختبارينt-tests (مقترن أو غير مدفوع) أو ANOVA، على التوالي. يمكن أن يكون هذا في شكل مقارنة بين الموضوعات للمجموعات ضمن جلسة ترميز /اختبار واحدة (الشكل 4A والشكل 5B، D) أو مقارنة داخل الموضوع للمجموعات من سياقين (أو أكثر) متوازنين ( الشكل5C، E). ويوصى بشدة الأسلوب الأخير، وخاصة عند التعامل مع ظروف الذاكرة الضعيفة، والتي، كما هو موضح سابقا، يؤدي إلى تباين كبير بسبب العشوائية في السلوك.
الجمع بين السياقات متوازن يؤدي إلى مجموعات أكبر المطلوبة لتصور موثوق سلوك المجموعة مع الحد الأدنى من الاختلاف. باستخدام بروتوكول مع التكرار في جلسات متوازنة، يمكن للمرء أن يتوقع انخفاضا في عدد الفئران إلى حوالي ثلث العدد المطلوب باستخدام اختبار واحد بنفس القوة الإحصائية. عادة، أحجام العينة في مجموعة من 7 إلى 15 الفئران (المجموع) لجلسات متوازنة وفي مجموعة من 20 إلى 50 الفئران (10 إلى 25 لكل مجموعة) لدورة واحدة مع حجم تأثير والطاقة على حد سواء أكبر من 0.8 كافية. إن انخفاض عدد الحيوانات اللازمة وزيادة المعلومات التي نحصل عليها من كل باستخدام هذا البروتوكول يصقل الدراسة ويخدم مبادئ 3R للاستخدامات الأخلاقية للحيوانات في البحث. من المهم في هذه الخطوة أن نضع في اعتبارنا أن سلوك الفئران العشوائية، والتي لا تصاحبها ذاكرة قوية، قد يؤدي إلى تفضيلات قوية الفردية على حد سواء تحت وفوق فرصة، ولكن متوسط المجموعة ينبغي أن تسفر عن تفضيل لا يختلف كثيرا عن فرصة. وينبغي تفسير البيانات الفردية بعناية. كما يمكن أن يكون توزيع نقاط البيانات الفردية داخل المجموعة مفيدا لتفسير النتائج. كما رأينا في الشكل 4 والشكل 5، يتغير التوزيع اعتمادا على قوة الذاكرة. عموما، يمكن اتباع البروتوكول المعروض هنا بسهولة لتنفيذ مهمة موقع الكائن مع التكرار لنموذج الذاكرة المكانية على المدى القصير و / أو طويلة الأجل. بروتوكول التدريب بسيط ومرن وإمكانية تنفيذ المزيد من التلاعب جعل هذه المهمة خيارا شعبيا. تمكن هذه التعديلات على البروتوكول التحقيق في خطوات معينة مثل اكتساب الذاكرة والدمج والتذكر.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
ونود أن نشكر أنطونيوس أسميناس ودوروثي تسي وكيتشي أوهارا وديفيد بيت على تعليقاتهم واقتراحاتهم الثاقبة. وقد دعمت هذه الدراسة من قبل Erasmus + (إلى G.B وL.N.); كلية الدراسات العليا للصحة، جامعة آرهوس (إلى درجة البكالوريوس)؛ جائزة المحقق الشاب لمؤسسة نوفو نورديسك لعام 2017 (NNF17OC0026774)، لوندبيكفوندن (DANDRITE-R248-2016-2518) وPROMO - مركز البروتينات في الذاكرة، وهو مركز امتياز تموله المؤسسة الوطنية الدنماركية للبحوث (DNRF133) (إلى T.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Open-field/experimental box | O'Hara & Co (Japan) | OF-3001 | Open-field box for the object location task |
| Object 1: cones | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RR | |
| Object 2: footballs | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RB | |
| Object 3: rectangular blocks | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RC | Rectangular blocks were modified after purchase |
| Object location task apparatus | O'Hara & Co (Japan) | SPP-4501 | Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task |
| Tracking software | O'Hara & Co (Japan) | TimeSSI | For movement tracking and automated camera functions |
| Wild-type Lister Hooded rats | Charles River | 603 |
References
- Hughes, R. N. Neotic preferences in laboratory rodents: issues, assessment and substrates. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (3), 441-464 (2007).
- Blaser, R., Heyser, C. Spontaneous object recognition: a promising approach to the comparative study of memory. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 183 (2015).
- Dix, S. L., Aggleton, J. P. Extending the spontaneous preference test of recognition: evidence of object-location and object-context recognition. Behavioral Brain Research. 99 (2), 191-200 (1999).
- Barker, G. R., Warburton, E. C. When is the hippocampus involved in recognition memory. Journal of Neuroscience. 31 (29), 10721-10731 (2011).
- Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9 (2), 49-57 (2002).
- Gulinello, M., et al. Rigor and reproducibility in rodent behavioral research. Neurobiology of Learning and Memory. 165, 106780 (2019).
- Rudeck, J., Vogl, S., Banneke, S., Schonfelder, G., Lewejohann, L. Repeatability analysis improves the reliability of behavioral data. PLoS One. 15 (4), 0230900 (2020).
- Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999 (2017).
- Migues, P. V., et al. Blocking synaptic removal of GluA2-containing AMPA receptors prevents the natural forgetting of long-term memories. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3481-3494 (2016).
- Maingret, N., Girardeau, G., Todorova, R., Goutierre, M., Zugaro, M. Hippocampo-cortical coupling mediates memory consolidation during sleep. Nature Neuroscience. 19 (7), 959-964 (2016).
- Chao, O. Y., de Souza Silva, M. A., Yang, Y. M., Huston, J. P. The medial prefrontal cortex - hippocampus circuit that integrates information of object, place and time to construct episodic memory in rodents: Behavioral, anatomical and neurochemical properties. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 113, 373-407 (2020).
- Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).
- Witten, I. B., et al. Recombinase-driver rat lines: tools, techniques, and optogenetic application to dopamine-mediated reinforcement. Neuron. 72 (5), 721-733 (2011).
- Costa, R., Tamascia, M. L., Nogueira, M. D., Casarini, D. E., Marcondes, F. K. Handling of adolescent rats improves learning and memory and decreases anxiety. Journal of the American Association for Labaratory Animal Science. 51 (5), 548-553 (2012).
- Schmitt, U., Hiemke, C. Strain differences in open-field and elevated plus-maze behavior of rats without and with pretest handling. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 59 (4), 807-811 (1998).
- Kosten, T. A., Kim, J. J., Lee, H. J. Early life manipulations alter learning and memory in rats. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (9), 1985-2006 (2012).
- Denenberg, V. H., Grota, L. J. Social-seeking and novelty-seeking behavior as a function of differential rearing histories. Journal of Abnormal and Social Psychology. 69 (4), 453-456 (1964).
- Clemens, L. E., Jansson, E. K., Portal, E., Riess, O., Nguyen, H. P. A behavioral comparison of the common laboratory rat strains Lister Hooded, Lewis, Fischer 344 and Wistar in an automated homecage system. Genes, Brain, and Behavior. 13 (3), 305-321 (2014).
- Ennaceur, A., Michalikova, S., Bradford, A., Ahmed, S. Detailed analysis of the behavior of Lister and Wistar rats in anxiety, object recognition and object location tasks. Behavioral Brain Research. 159 (2), 247-266 (2005).
- Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936-946 (2006).
- Contreras, M. P., Born, J., Inostroza, M. The expression of allocentric object-place recognition memory during development. Behavioral Brain Research. 372, 112013 (2019).
- Yaski, O., Eilam, D. How do global and local geometries shape exploratory behavior in rats. Behavioral Brain Research. 187 (2), 334-342 (2008).
