Et eksperimentelt design inden for emnet ved hjælp af en objektplaceringsopgave i rotter

Summary

Denne protokol indeholder detaljerede trin til en objektplaceringsopgave med fire gentagelser ved hjælp af den samme kohorte rotter. Svag og stærk kodning kan give kort- og langsigtede minder. Fleksibiliteten i protokollen med gentagelse kan være gavnlig for undersøgelser, der involverer kirurgiske operationer ved at spare tid og arbejdskraft.

Abstract

Objekt stedgenkendelse er en fremtrædende metode, der bruges til at undersøge rumlig hukommelse hos gnavere. Dette objektstedsgenkendelseshukommelse danner grundlaget for objektplaceringsopgaven. Dette papir giver en omfattende protokol til at guide etableringen af et objekt placering opgave med mulighed for op til fire gentagelser ved hjælp af den samme kohorte af rotter. Både svage og stærke kodningsprotokoller kan bruges til at studere kort- og langsigtede rumlige erindringer af varierende styrke og til at muliggøre implementering af relevante hukommelseshæmmende eller -styrkende manipulationer. Derudover giver gentagelse af testen med den modvægt, der præsenteres her, mulighed for kombinationen af resultater fra to eller flere tests til sammenligning inden for emnet for at reducere variationen mellem rotter. Denne metode hjælper med at øge den statistiske effekt og anbefales stærkt, især når du kører eksperimenter, der producerer stor variation i individuel adfærd. Dette forfiner direkte undersøgelsen ved at øge de data, der er indhentet fra hvert dyr, og reducere det samlede antal dyr, der er behov for. Endelig øger gennemførelsen af opgaven med gentagen objektplacering effektiviteten af undersøgelser, der involverer kirurgiske procedurer ved at spare tid og arbejdskraft.

Introduction

Spontane anerkendelsesopgaver(f.eks. objektgenkendelse, objektpladsgenkendelse) er i høj grad blevet udnyttet i forbindelse med undersøgelsen af hukommelse hos gnavere. Disse tests er i modsætning til de mange forskellige tests, der anvendes til vurdering af hukommelse, der er baseret på enten frygt konditionering eller belønning motivation, i, at spontan anerkendelse opgaver er udelukkende baseret på spontan sonderende adfærd mod nye stimuli. Denne adfærd, benævnt 'neotisk præference'¹, er iboende i gnavere såvel som i andre pattedyrarter og nogle ikke-pattedyr som fugle og fisk². Objektplaceringsgenkendelse, som afhænger af rumlig hukommelse, kan observeres ved hjælp af objektplaceringsopgaven (også kaldet opgave til genkendelse af rumlige objekter)³. Læsion undersøgelser har vist, at objekt sted anerkendelse kræver en intakt hippocampus^4,5. På grund af den relativt enkle træningsprotokol og fraværet af nogen forstærkning er denne opgave at foretrække i mange undersøgelser. Fraværet af både positiv og negativ forstærkning minimerer de ekstra parametre og hjerneområder, der kan drive adfærden. Derfor er adfærd her neutral og er baseret på nysgerrighed og rumlig hukommelse, hvilket gør det muligt at undersøge mekanismer, der er involveret i kodning, konsolidering og hentning af den rumlige hukommelse.

Protokollen for objektplaceringsopgaven består typisk af habituationssessioner efterfulgt af en enkelt session med kodnings- og testforsøg adskilt af en forsinkelsesperiode, som varierer fra flere minutter til timer. Det anbefales kraftigt, at rotter håndteres på forhånd for at minimere dyrenes stressniveau og dermed adfærd, der kan påvirke anerkendelseshukommelsen, såsom modvilje mod nyhed. På samme måde spiller en veldesignet habituationsprotokol en væsentlig rolle i forebyggelsen af stress, der kan hindre rottens naturlige adfærd under opgaven. Omfanget af håndtering og tilvænning varierer dog i høj grad mellem laboratorier og forsøgslaboratorier, hvilket kan bidrage til lav replikabilitet^6,7,8. I kodningsforsøget får rotten tid til at udforske en arena med to identiske genstande placeret i to udpegede hjørner. I testforsøget, der er forsinket med en periode, får rotten tid til at udforske arenaen med det samme par genstande, men denne gang er en af dem blevet flyttet til et nyt sted. Den spontane præference, som rotterne udviser, og den deraf følgende stigning i den tid, der bruges på at udforske objektet på det nye sted, er tegn på rumlig anerkendelse og mindet om objektplaceringerne³. Ændring af kodningsforsøget (varighed og antal gentagelser) påvirker hukommelsens styrke.

Afhængigt af formålet med undersøgelsen kan længden af forsinkelsen mellem kodnings- og testforsøg ændres til modelproteinsyntese-uafhængig korttidshukommelse eller proteinsynteseafhængig langtidshukommelse. Derfor kan objektplaceringsopgaven bruges til en lang række undersøgelser ved at tilpasse protokollen efter behov. Endvidere er gennemførelse af eksperimentelle manipulationer, såsom farmakologiske og optogenetiske interventioner, også mulige mellem disse forsøg, ligesom in vivo imaging. Der er flere undersøgelser^9,10, der rapporterer gentagne gentagelser af objektet placering opgave inden for samme rotte kohorte. Dette kontrasterer den traditionelle anvendelse, hvor et dyr har en session uden gentagelser. Men effektiviteten af disse paradigmer er ikke blevet grundigt undersøgt, og der er heller ingen metode papirer, der beskriver disse. Så vidt vi ved, er dette den første rapporterede beskrivelse af en protokol, der beskriver i detaljer en objektplaceringsopgave med op til fire gentagelser ved hjælp af den samme rottekohorte, som også systematisk sammenligner resultaterne fra hver gentagelse. Gentagelser kan bruges til at opveje eksperimentelle betingelser for at muliggøre sammenligning inden for emnet med reduceret variation mellem test. Den pålidelige gentagelse af opgaven gør det muligt at samle data, hvilket betyder, at der kan genereres tilstrækkeligt stor mængde data ved hjælp af et relativt lille antal rotter. Endelig kan gentagelser ved hjælp af den samme rotte være gavnlige i forsøg med kirurgiske operationer og implantationer ved at sænke antallet af rotter, der kræves, hvilket derfor sparer tid og lønomkostninger.

Denne undersøgelse præsenterer en omfattende protokol, der beskriver, hvordan man udfører en objektplaceringsopgave hos voksne rotter ved hjælp af stærke og svage kodningsforsøg efterfulgt af testforsøg med 1-h og 24-timers forsinkelser. Den stærke kodning protokol producerer statistisk signifikant anerkendelse hukommelse, når testet med 1-h og 24-timers forsinkelser og kan derfor bruges til at studere både kortsigtede og langsigtede erindringer ved gennemførelsen af manipulationer til at hæmme disse erindringer¹¹. I modsætning hertil producerer den svage kodningsprotokol kun betydelig korttidshukommelse, når den testes med en 1-timers forsinkelse. Fraværet af langtidshukommelse kan bruges til at studere manipulationer for at forbedre opbevaringen af hukommelse^11,12. Denne protokol indeholder også detaljerede håndterings- og habituationssessioner, som har til formål at øge replikabiliteten af objektplaceringsopgaven. Dette papir viser også gentagelse af opgaven i fire forskellige sammenhænge med den samme kohorte af rotter ved hjælp af den svage kodning protokol, som er bekræftet at producere replikerbar og konsekvente resultater hver gang.

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet her, er godkendt af De Nationale Myndigheder (Licensnummer: 2018-15-0201-01405) i overensstemmelse med dansk og EU's dyrevelfærdslovgivning.

1. Eksperimentel opsætning og forberedelse af forskellige sammenhænge

1. Arena for objektplacering med kontekst
   BEMÆRK: Opsætningen nedenfor er demonstreret i en lukket lydisoleret boks (Figur 1B) med lyskilden placeret langs loftets kanter og kameraet placeret i midten af kassens loft. Arenaen, 60 cm x 60 cm med vægge, der er 100 cm høje (Figur 1B), er placeret inde i kassen og er fuldt isoleret fra det omgivende rum. Alle rumlige signaler er inde i arenaen. Dette forenkler processen med at skabe forskellige sammenhænge. Et lignende niveau af isolation fra det omkringliggende rum kan opnås ved at omslutte en normal åben arena med et ensartet gardin omkring væggene.
   1. Få en firkantet arena lavet af uigennemsigtig, ikke-porøs hård plast med en bredde på mindst 60 cm og mindst 50 cm højde. Vælg en farve til gulvet i kontrast til farven på rotten for en vellykket registrering af rottebevægelser af den automatiserede software (hvis det er relevant). Placer arenaen enten inde i en kasse (Figur 1B) eller på en platform, der er omgivet af et gardin.
   2. Hvis du vil oprette en kontekst, skal du anskaffe et andet lag af vægge, der kan indsættes(f.eks. vægbeklædning af samme materiale som arenaen eller plasttapet, der nemt kan rengøres) i forskellige farver og/eller mønstre(f.eks. sort, hvid, striber eller prikker). Indsæt det andet lag af vægge i arenaen, så de adskiller sig fra hinanden.
   3. Opnå tredimensionelle (3D) rumlige signaler (1-2 pr. kontekst) med dimensioner, der varierer mellem 10 cm x 10 cm x 5 cm og 20 cm x 15 cm x 15 cm (bredde x længde x højde) og har (i) forskellige geometriske former og (ii) farver, der kontrasterer vægfarven. Hæng dem på væggene højt nok, så rotter ikke kan nå disse signaler.
   4. Få forskellige par objekter (så mange som kontekstnummeret), der ikke er porøse, ikke-tyggelige og nemme at rengøre. Til formål at have forskellige geometriske former og teksturer for hvert nyt objekt. Vælg objekter, der er mellem 5 og 15 cm i bredde og højde (undgå højere objekter). Se figur 1D for eksempler på fire forskellige objekter (kegler, fodbolde, rektangulære prismer og trekantede prismer).
      BEMÆRK: Hvert objekt skal være af samme interesse som rotter, således at de samlede efterforskningstider for alle objekter er sammenlignelige.
   5. Find den bedste løsning til fastgørelse af genstandene på gulvet i arenaen(f.eks. ved hjælp af klæbemåtter, dobbeltsidet tape, fastgørelse af en metalplade under objektet og en parringsmagnet under arenaen osv.).
   6. Når du opretter en anden kontekst, skal du genskabe væggene, så de kontrasterer fordelingen af væggenes farve og mønster fra den eller de tidligere kontekster. Brug nye 3D rumlige signaler, der er forskellige fra og i kontrast til alle tidligere signaler. Se figur 1C for eksempler på fire forskellige sammenhænge.
   7. Få en lyskilde, der sikrer en diffus og lige belysning i arenaen, og som har en lysdæmper mulighed. Juster lysintensiteten til ca. 100-120 lux i hjørnerne af arenaen efter at have skabt hver kontekst. Få et kamera og placere det i midten af loftet i kassen.
      BEMÆRK: Lysintensiteten kan justeres til et lavere niveau, hvis der ikke anvendes automatiseret scoringssoftware.
2. Objektspand
   1. Få en spand (>50 cm i diameter). Vælg ikke en firkantet form for at undgå nogen lighed med den eksperimentelle arena. Fyld det med sengetøj.
   2. Få 5-10 objekter i forskellige former og størrelser (forskellig fra de objekter, der skal bruges i eksperimentet), og placer tilfældigt dem alle i spanden (Figur 1A).

Figur 1: Forsøgsopsætningen, herunder fire forskellige sammenhænge og objekter. (A) Objektspand til objektbefrugtning. (B) Forsøgsapparatet (til venstre), der omslutter objektplaceringsarenaen, kameraet og lyskilden. Den eksperimenterende boks og arena før kontekstopsætning (midt) og arena med kontekstopsætning (højre). (C) Fire sammenhænge (1-4) med forskellige vægfarver og mønstre samt tredimensionelle rumlige signaler. (D) Fire objekter, der bruges i henholdsvis konteksterne 1-4. Klik her for at se en større version af dette tal.

3. Kamera- og sporingssoftware (valgfrit)
   1. Få software, der kan bruges til at fjernstyre kameraoptageren, og som kan spore rottenæser. Foretag softwarejusteringer for hver specifik kontekst og rottestamme før hvert eksperiment.
4. Modvægt af objektplaceringer og eksperimentelle grupper
   1. Forbered mulige kombinationer af objektplaceringer til kodnings- og testforsøg, og navngiv dem som tællere. Opret kombinationerne, så de dækker alle hjørner som objektplaceringer, og objektbevægelse fra tilstødende til diagonale hjørner og omvendt (Figur 2A).
   2. Forbered en tidsplan for det specifikke eksperiment, der matcher hver rotte i en eksperimentel gruppe med en tæller. Brug hvert par af de to parrede tællere (Figur 2A) inden for en gruppe, hvis der er nok rotter. Brug det samme sæt tællere til begge forsøgsgrupper i en enkelt kodnings-/testsession (Figur 2B). Gentildele tællere til følgende sessioner(dvs. hver ny kontekst).
      BEMÆRK: Kør rotterne i blandet rækkefølge under kodning/testsessioner (f.eks.skal du ikke køre alle rotter i det ene bur efter det andet; drej i stedet bure for at sikre et roligt miljø i et bur på mere end en rotte).
   3. Når du bruger to eller flere sammenhænge til at opveje forsøgsgrupperne (f.eks. 1-timers hukommelse i forhold til 24-timers hukommelsesgrupper), skal du tildele rotter til hver gruppe og ændre grupperne i følgende sammenhænge (Figur 2B).

Figur 2: Repræsentative modvægtsmetoder. (A) Mulige retninger af objekter i arenaen ved kodnings- og testforsøg kaldes tællere. Objekt 1 er altid det bevægelige objekt. Hver to tællere opvejes, så placeringen af det bevægelige objekt ændres. Hvert hjørne er optaget to gange, og objekt 1 flyttes fra diagonal til tilstødende og omvendt for et tilsvarende antal gange. (B) Eksempel på kodnings-/testplan for to modvægtssessioner (f.eks. kontekst 1 og 2). Rotter tildeles eksperimentelle tilstande i kontekst 1 (session X, til venstre). Et sæt tællerpar (dvs. 1-2, 3-4, 5-6 og 7-8) vælges og tildeles hver rotte i en eksperimentel gruppe. Det samme sæt tællere tildeles rotter i begge forsøgsgrupper. I den følgende session i kontekst 2 (session X+1; højre) ændres rotterne i forsøgsgrupperne til modvægt, og der tildeles et nyt sæt modpar. Tidspunktet i begyndelsen af kodnings- og testforsøg skal bemærkes. Klik her for at se en større version af dette tal.

BEMÆRK: Alle håndterings-, habituations- og kodnings-/testsessioner i denne protokol blev optimeret i lysfasen af en 12-timers lys/mørk cyklus, og det anbefales derfor, at eksperimenter udføres i lysfasen.

2. Håndtering og tilvænning

1. Begynd at håndtere rotter, der begynder enten fra fravænning (hvis rotterne opdrættes i hjemmefaciliteten) eller 2-3 uger før begyndelsen af eksperimenter (i tilfælde af at rotterne bestilles fra en ekstern facilitet, efter at have givet dem mulighed for at akklimatificerer i en uge efter ankomsten).
2. Tilbring mindst 10-15 min på hvert bur på 4 rotter i 2 eller 3 dage om ugen, indtil rotterne er behagelige at blive rørt og afhentet af eksperimentatoren. Juster den tildelte tid pr. bur afhængigt af antallet af rotter i et bur.
   BEMÆRK: Det er vigtigt, at alle forsøgspersoner, der forventer at arbejde med rotterne, er til stede under håndteringen.
3. I tilfælde, hvor håndteringen begynder ved fravænning, reducere håndteringen til et minimum (valgfrit), når dette niveau er nået. Hvis du begynder 2-3 uger før forsøgene, skal du fortsætte med at håndtere indtil begyndelsen af habituationssessioner.
4. Bring rotterne i deres bure til forsøgsrummet for at vænne rotterne til transporten såvel som til forsøgsrummet. Lad rotter sidde i mindst 30 minutter for at give dem tid til at falde til ro og habituate. Efter denne tid skal rotterne / burene returneres til boligrummet.
   BEMÆRK: Trin 2.4 kan kombineres med håndtering og gentages så mange gange som nødvendigt. Yderligere tilvænning kan implementeres på dette trin, hvis protokollen omfatter yderligere manipulationer (f.eks. håndtering af injektionsproceduren osv.).
5. Udfør objektbefrugtning for at vænne rotter til at interagere med objekter og for at reducere generelle stressniveauer, der stammer fra oplevelsen af nye miljøer.
   1. Til session 1 skal du bringe alle hjemmebure til forsøgsrummet og lade rotterne habituate til rummet og nøjes i mindst 30 minutter. Sæt rotter (2-4 rotter) fra samme bur sammen i spanden i 20 minutter. Rengør spanden ved at fjerne fækalt stof mellem hver gruppe rotter. Gentag proceduren for alle bure. Sæt alle rotter i deres hjemmebure og vend tilbage til boligrummet.
   2. For session 2, på en separat dag bringe alle bure til eksperimentet værelse og lad i mindst 30 min. Sæt hver rotte individuelt i spanden i 10 minutter. Placer rotten tilbage i hjemmet bur og rense spanden efter hver rotte. Returner alle bure til boligrummet.
   3. For session 3 gentages trin 2.5.2 på en separat dag.
6. Hvis forsøgsapparatet er en lukket boks (Figur 1B), skal du vælge at udføre tom kassebefrugtning for at vænne rotterne til det nye forsøgsapparat. I session 4 skal du medbringe alle bure til forsøgsrummet og forlade i mindst 30 minutter. Placer rotter fra samme bur sammen (2-4 rotter) i den tomme arena uden kontekst eller rumlige signaler(Figur 1B, midten) i 20 min. Placer alle rotter tilbage i hjemmet bur, og tørre arenaen med 70% ethanol efter hver gruppe af rotter.
   BEMÆRK: Trin 2.5 og 2.6 skal udføres på en enkelt uge forud for kontekstbeboelsesugen (trin 2.7, se figur 3). En pause i et par dage under disse trin er acceptabelt. Efter start trin 2.7 skal hvert trin dog udføres på sammenhængende dage som angivet indtil afslutningen af testforsøget (trin 2.9).
7. Udfør kontekstbefrugtning for at vænne rotter til konteksten og 3D-signaler, for at reducere det generelle stressniveau og for at støtte den rumlige læring af miljøet.
   1. Rediger den tomme arena for at oprette den første kontekst som beskrevet i afsnit 1.1, men sæt ikke objekterne i arenaen. Klargør kontrolapparatet.
   2. For session 1 skal du medbringe alle bure til forsøgsrummet og forlade i mindst 30 minutter. Start optageren, hvis du gør dette manuelt. Placer den første rotte i midten af arenaen, og lad rotten udforske arenaen i 10 minutter. Stop derefter optageren (hvis manuel) og læg rotten tilbage i hjemmeburet. Tør arenaen grundigt af med 70% ethanol efter hver rotte, og returner alle bure til boligrummet, når de er færdige.
   3. For sessioner 2 og 3 gentages trin 2.7.2 for hver rotte over to på hinanden følgende dage, således at der er 3 sessioner af kontekstbefrugtning pr. Rotte i alt.
      BEMÆRK: Overvej at blande den rækkefølge, rotter går ind i arenaen, især når der beskæftiger sig med en stor gruppe. Dette undgår at køre specifikke rotter gentagne gange på samme tid af dagen.

Figur 3: Udformningen af det adfærdsmæssige eksperiment, herunder opgaveprotokoller til håndtering, habituation og objektplacering. Rotter skal håndteres regelmæssigt fra få uger før beboelsesugen. I uge 0 udføres objekt- og eksperimentelle boksovervædringer over 4 sessioner med mindst 24-timers intervaller imellem. I uge 1 udføres kontekst habituation over 3 på hinanden følgende sessioner med 24-timers intervaller imellem, efterfulgt af kodning og testforsøg. Der bør være mindst 48 timer og op til 1 uges interval, før du fortsætter med den følgende session(f.eks. begynder habituation til den næste kontekst i uge 2 eller 3). Forkortelse: Hab., habituation. Klik her for at se en større version af dette tal.

8. Kodningsforsøg (session 4)
   BEMÆRK: I tilfælde af farmakologiske manipulationer kan et rimeligt tidspunkt til at administrere et middel være enten før eller umiddelbart efter kodningsforsøget og/eller før forsøgsforsøget afhængigt af arten af det farmakologiske middel.
   1. Bring alle bure til eksperimentet værelse og lad i mindst 30 min. Ved hjælp af den tidsplan, der er udarbejdet på forhånd (figur 2B), skal du placere det første identiske par genstande på de udpegede steder (i 2 hjørner og en afstand på >10 cm fra hver respektive væg; et L-formet stykke pap kan bruges til at opretholde den samme afstand hver gang) ved hjælp af klæbemåtter eller dobbeltsidet tape.
   2. Start optageren (hvis manuel). Placer den første rotte i arenaen mod en væg eller et hjørne, der ikke er besat af noget objekt (lige stor afstand til hvert objekt).
      BEMÆRK: Følg nedenstående trin for enten svag eller stærk kodning.
   3. For svag kodning (1 forsøg), lad rotten udforske arenaen og objekter i 20 minutter. Stop derefter optageren (hvis manualen) og læg rotten tilbage i hjemmeburet. Fjern objekterne, og tør både objekterne og arenaen grundigt med 70% ethanol.
   4. Gentag trin 2.8.3 for alle rotter, så hver rotte modtager 1 kodningsforsøg på 20 min.
   5. For stærk kodning (3 forsøg), lad rotten udforske arenaen og objekter i 5 minutter. Stop derefter optageren (hvis manualen) og læg rotten tilbage i hjemmeburet. Fjern ikke objekterne. Tør arenaen og genstande med 70% ethanol.
   6. Gentag trin 2.8.5 to gange mere med den samme rotte, så der er 3 forsøg i alt. Placer rotten tilbage i hjemmeburet, når tiden er inde. Fjern genstandene til grundig rengøring, og tør genstandene og arenaen af med 70% ethanol.
      BEMÆRK: Inter-prøveintervallet for en rotte skal være ca. 1-2 min.
   7. Gentag trin 2.8.5-2.8.6 for hver rotte.
   8. Hvis forsinkelsestiden er kortere end 24 timer, skal burene opbevares i forsøgslokalet indtil prøveforsøget. Hvis ikke, skal du returnere alle bure til boligrummet, når de er færdige.
9. Testforsøg (session 4)
   BEMÆRK: Forsinkelsesperioden skal tælles fra begyndelsen af kodningsforsøget.
   1. I tilfælde af en forsinkelse på 24 timer (eller forsinkelse, der kræver, at testforsøget udføres den følgende dag), skal du bringe alle bure til forsøgslokalet, hvilket giver tilstrækkelig tid forud for den første test, så rotterne kan efterlades i mindst 30 minutter. I henhold til tidsplanen skal objekterne placeres på de angivne placeringer (et af objekterne på en ny placering).
   2. Når det er tid, skal du starte optageren (hvis manuel). Placer den første rotte i arenaen mod en væg eller et hjørne, der ikke er besat af noget objekt (lige stor afstand til hvert objekt).
   3. Lad rotten udforske arenaen og genstande i 5 minutter. Stop derefter optageren (hvis manuel). Læg rotten tilbage i buret. Fjern objekterne, og tør både objekterne og arenaen grundigt med 70% ethanol.
   4. Trinnene 2.9.2-2.9.3 for hver rotte gentages. Returner alle bure tilbage til boligrummet.
      BEMÆRK: I hver efterfølgende kodnings-/testsession skal du starte habituationsprotokollen fra trin 2.7 (kontekstbefrugtning) efter et interval på mindst 48 timer og op til 1 uge.

3. Dataanalyse

1. For hver rotte skal du score udforskningstiden for hvert objekt i både kodnings- og testforsøg ved hjælp af software, der er designet til dette formål eller ved hjælp af en manuel opsætning. Score kodning forsøg for hele varigheden. Score test forsøg i 2 min for bedste diskrimination ydeevne³. Hvis du bruger automatiseret online software scoring, eksportere scoring data fra softwaren.
2. Tæl efterforskningstid, når rotten er i kontakt med objektet, snuser objektet eller vender mod objektet i en afstand på mindre end 2 cm. Medtag klatring og siddende på objektet som udforskning, medmindre rottens opmærksomhed ser ud til at være et andet sted end objektet(f.eks. kigger væk fra objektet).
3. Beregn den samlede efterforskningstid for begge objekter for hver rotte. Overvej at udelukke enhver rotte, der har en samlet efterforskningstid på mindre end 10 s i testforsøget (i 2 min scoring) fra denne test, da det kan afspejle upålidelig udforskning.
4. Beregn procentdelen af udforskning for hvert objekt (ligning 1) eller forskelsbehandlingsindekset (DI) for hver rotte (ligning 2), og beregn gennemsnitsværdier for grupperne.
   (1)
   
   BEMÆRK: Hvis % udforskning er 50% eller DI er 0, betyder det, at ydeevnen er på chanceniveau, og rotten har ingen præference for nogen af objekterne. Den gennemsnitlige procentdel efterforskning og DI under kodning forsøg bør ~ 50% eller 0, henholdsvis. Enhver rotte, der foretrækker højere end [middel ± (2 × SD)] for begge objekter i kodningsforsøget, bør udelukkes fra analysen af den respektive test. Dette giver mulighed for pålidelig fortolkning af præference i testforsøget som hukommelsen af den stabile objektplacering. Denne værdi kan beregnes for en individuel test eller for kombinerede kodningsdata fra flere test.
5. Analyser dataene efter den metode, der passer bedst til eksperimentelle opsætning. Brug en t-testmed én prøve til at registrere en væsentlig præference over chanceniveauet.
6. Mens du bruger mere end én sammenhæng med modvægt, kombinere resultaterne af den samme eksperimentelle tilstand på tværs af sammenhænge.
   BEMÆRK: Dette vil resultere i grupper, der består af de samme rotter, hvilket muliggør sammenligning inden for emnet ved hjælp af en parret t-testfor to grupper og ved hjælp af gentagne målinger analyse af varians (ANOVA) for mere end to grupper.

Representative Results

Vist her er de repræsentative resultater for både de stærke og svage kodning protokoller beskrevet ved hjælp af mandlige tyrosin hydroxylase (Th)-Cre transgene rotter¹³ med Long-Evans stamme backcrossed fire gange til Lister Hooded stamme og vilde-type Lister Hooded rotter. Th-Cre transgene rotter blev brugt, da denne rottelinje vil blive anvendt i fremtidige undersøgelser, der involverer optogenetik. Ved hjælp af hver protokol blev hukommelsen testet med forsinkelser på 1 og 24 timer. Tests ved 1 time viser korttidshukommelse, mens 24-timers tests viser langtidshukommelse. Eksklusionsværdien for kodningspræference blev beregnet som beskrevet i protokollen ved hjælp af de kombinerede data fra fem tests (stærke og svage kodningsprotokoller) som [50,8 % ± (2×10,8 %)]. Rotter, der havde en kodningspræference over og under disse værdier, blev udelukket fra analyserne af de respektive tests.

Til stærke kodningsforsøg blev der anvendt 16 rotter, og til svage kodningsforsøg blev der anvendt 19 rotter. Under de stærke kodningsforsøg (3 × 5 min kodning; Figur 4A), var der ingen signifikant præference for nogen af objekterne (52,0 ± 1,9 %, n = 16, t₁₅ = 1,1, p = 0,29; en stikprøve t-test versus tilfældighedsniveau). Denne stærke kodningsprotokol førte til præference for objektet på det nye sted, som det fremgår af gennemsnitlig procentdel udforskning, som var betydeligt højere end chanceniveauet (50%) i test med både 1-h og 24-timers forsinkelser (1-timers hukommelse, 77,9 ± 2,4%, n = 8, t₇ = 11,8, p < 0,001; 24-timers hukommelse, 65,2 ± 5,3%, n = 8, t₇ = 2,8, p = 0,025; en-prøve t-test versus chance niveau). Der var ingen signifikant forskel mellem 1-h og 24-timers hukommelse (p = 0,056; uparret Welch's t-test).

Under de svage kodningsforsøg (20 min kodning; resultater samlet ud fra fire sammenhænge; Figur 4B), var der ingen signifikant præference for nogen af objekterne (51,1 ± 1,0 %, n = 66, t₆₅ = 1,2, p = 0,24; en stikprøve t-testversus tilfældighedsniveau). Denne svage kodningsprotokol medførte en betydelig stigning i præferencen for objektet på det nye sted sammenlignet med tilfældighedsniveau i test med en 1-timers forsinkelse, men ikke 24-timers forsinkelse (kombinerede data fra alle fire sammenhænge, 1-timers hukommelse, 66,7 ± 2,0%, n = 32, t₃₁ = 8,2, p < 0,001; 24-timers hukommelse, 49,6 ± 2,6%, n = 34, t₃₃ = 0,16, p = 0,87; en-prøve t-test versus chance niveau). Der var en signifikant forskel mellem ydeevnen i test med 1-h og 24-timers forsinkelser (1-timers hukommelse: n = 32, 24-timers hukommelse: n = 34, t_61,5 = 5,2, p < 0,001; uparret Welch's t-test).

Hukommelse på gruppeniveau blev ikke observeret i 24-timers forsinkelsestesten som indekseret af ydeevne på tilfældighedsniveau, men viste individuelle variationer. Denne højere variation for svage til no-memory betingelser (f.eks,24-timers test) blev almindeligt observeret på grund af mere tilfældig udforskning af objekterne. Derfor er det vigtigt ikke at fortolke rotternes ydeevne individuelt. I stedet kan fordelingen af individuelle datapunkter bruges sammen med gruppegennemsnittet som det pålidelige resultat af testen. Jo stærkere kodningen er, jo mere ensartet bliver rotternes adfærd, og jo færre er antallet af rotter, der er nødvendige for at opnå statistisk signifikans, som det kan observeres i figur 4A for den stærke kodningsprotokol. I modsætning hertil er der behov for større grupper for at opnå pålidelige resultater for svage forhold (figur 4B).

Figur 4: Hukommelsesydelse efter stærk og svag kodning. (A) Det stærke kodningsforsøg (3 × 5 min kodning) efterfulgt af enten 1-h eller 24-timers testforsøg. Der var ingen signifikant præference for nogen af objekterne under kodningsforsøg (n = 16). Den stærke kodning gav signifikant øget præference for objektet på det nye sted i testene med både 1-h og 24-timers forsinkelser sammenlignet med tilfældighedsniveau (1-h og 24-timers hukommelse: n = 8 i hver gruppe). Der var ingen signifikant forskel mellem grupperne. (B) Det svage kodningsforsøg (20 min kodning) efterfulgt af enten 1-timers eller 24-timers testforsøg. Der var ingen signifikant præference for nogen af objekterne som en gruppe under kodningsforsøg (n = 66). Den svage kodning gav signifikant øget præference for objektet på det nye sted i testen med en 1-h, men ikke 24-timers forsinkelse sammenlignet med tilfældighedsniveau (1-timers hukommelse: n = 32; 24-timers hukommelse: n = 34). Der var en betydelig forskel mellem præstationen i test med 1-h og 24-timers forsinkelser. Resultaterne blev samlet ud fra fire sammenhænge. Individuelle datapunkter præsenteres som prikker. Alle søjler viser procentdelen af udforskning af objektet på roman placering som middel ± SEM. * p < 0,05, *** p < 0,001; en-prøve t-test versus chance niveau (50%, stiplet linje). ^###p < 0,001; ns, ikke signifikant; umalet Welchs t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.

En væsentlig fordel ved denne etablerede protokol er, at den kan udføres fire gange ved hjælp af fire forskellige sammenhænge (Figur 1C) med den samme kohorte af rotter. Resultaterne i figur 5 viser en mulig måde at anvende modvægt til to forsøgsgrupper (1-h og 24-timers hukommelsesgrupper). De to grupper blev opvejet i to sammenhænge (kontekst 1 og 2), og dette blev gentaget i to yderligere sammenhænge (kontekst 3 og 4; Figur 5A. Resultaterne fra de fire sammenhænge præsenteres individuelt i figur 5B,D, hvor hukommelsen for hver eksperimentel gruppe blev vurderet ved at sammenligne præferencen til tilfældighedsniveau i hver sammenhæng (1-timers hukommelse: Kontekst 1, 69,9 ± 3,6%, n = 9, t₈ = 5,5, p < 0,001; Kontekst 2, 65,6 ± 3,9%, n = 9, t₈ = 4,0, p = 0,004; Kontekst 3, 65,2 ± 3,8%, n = 7, t₆ = 4,0, p = 0,007; Kontekst 4, 65,3 ± 5,6%, n = 7, t₆ = 2,7, p = 0,035; 24-timers hukommelse: Kontekst 1, 45,1 ± 6,4%, n = 9, t₈ = 0,77, p = 0,46; Kontekst 2, 49,1 ± 4,9%, n = 9, t₈ = 0,18, p = 0,86; Kontekst 3, 57,2 ± 4,1%, n = 8, t₇ = 1,7, p = 0,12; Kontekst 4, 47,6 ± 4,7%, n = 8, t₇ = 0,52, p = 0,62; en-prøve t-test versus chance niveau).

I kontekst 1, 2 og 4 afslørede sammenligningen mellem grupperne betydelige forskelle mellem 1-h og 24-timers hukommelse (1-timers hukommelse versus 24-timers hukommelse: Kontekst 1, t_12,7 = 3,4, p = 0,005; Kontekst 2, t_15,2 = 2,6, p = 0,019; Kontekst 3, t_13,0 = 1,4, p = 0,17; Kontekst 4, t_12,2 = 2,4, p = 0,032; umalet Welch's t-test). For at opnå en bedre repræsentation og en sammenligning af dataene inden for motivet blev resultaterne fra to modvægtskontekster kombineret (figur 5C, E). De kombinerede forsøgsgrupper blev sammenlignet med tilfældighedsniveau individuelt igen (Kontekst 1 og 2 kombineret: 1-timers hukommelse, 67,8 ± 2,6%, n = 18, t₁₇ = 6,7, p < 0,001; 24-timers hukommelse, 47,1 ± 3,9%, n = 18, t₁₇ = 0,74, p = 0,47; Kontekst 3 og 4 kombineret: 1-timers hukommelse, 65,3 ± 3,3%, n = 14, t₁₃ = 4,7, p < 0,001; 24-timers hukommelse, 52,4 ± 3,2%, n = 16, t₁₅ = 0,73, p = 0,48; en-prøve t-test versus chance niveau). Derefter blev de eksperimentelle grupper sammenlignet med hinanden.

I begge kontekstpar var der betydelige forskelle mellem grupper som afsløret af sammenligninger inden for motivet (1-timers hukommelse versus 24-timers hukommelse: Kontekst 1 og 2 kombineret, t₁₆ = 3,5, p = 0,003; Kontekst 3 og 4 kombineret, t₁₃ = 2,4, p = 0,032; pareret t-test). Sammenlignelige resultater blev opnået med vilde lister hætteklædte rotter, også i den svage kodning protokol ved hjælp af kontekst 1 og 4 for de to modvægt sessioner (data ikke vist). Replikabiliteten og pålideligheden af resultaterne blev valideret ved at sammenligne hvert datasæt ved hjælp af envejs ANOVA. Der blev ikke fundet nogen signifikant forskel mellem de fire sammenhænge (1-timers hukommelse: F_3,28 = 0,31, p = 0,81; 24-timers hukommelse: F_3,30 = 0,99, p = 0,41). Derfor kan objektplaceringstesten gentages pålideligt med minimal indflydelse af gentagelser, da instruktionerne i denne protokol følges.

Figur 5: Forskellige måder at præsentere og analysere resultaterne af den svage kodningsprotokol med to eksperimentelle grupper opvejet over to sessioner. (A) Det eksperimentelle design til modvægt med to eksperimentelle grupper (1-h og 24-timers hukommelsesgrupper) over to sessioner (kontekst 1 og 2). Modvægten blev gentaget i to yderligere sessioner (kontekst 3 og 4). (B og D) Resultaterne fra hver kontekst og de eksperimentelle grupper blev individuelt sammenlignet med tilfældighedsniveau og med hinanden. I alle fire sammenhænge blev præferencen for objektet på det nye sted i test med en forsinkelse på 1 time øget betydeligt i forhold til tilfældighedsniveau [Kontekst 1 og 2: n = 9 pr. gruppe (B); Kontekst 3 og 4: n = 7 pr. gruppe (D)]. I 24-timers forsinkelsestest adskilte præferencen for objektet på det nye sted sig ikke fra tilfældigheder (kontekst 1 og 2: n = 9 pr. gruppe; Kontekst 3 og 4: n = 8 pr. gruppe). Der var en betydelig forskel mellem forsøgsgruppernes præferencer i kontekst 1, 2 og 4, men ikke kontekst 3, som det fremgår af sammenligning mellem emnet. *p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; en-prøve t-test versus chance niveau (50%, stiplet linje). ^#p < 0,05; ^##p < 0,01; ns, ikke signifikant; umalet Welchs t-test. (C og E) Resultaterne præsenteres efter at have kombineret forsøgsgrupperne fra de to modvægtsammenhænge [Kontekst 1 og 2 kombineret, n = 17 pr. gruppe (C); Kontekst 3 og 4 tilsammen, n = 14 pr. gruppe (E)]. Præferencen for objektet på den nye placering blev signifikant øget i forhold til tilfældighedsniveau i test med en 1-h, men ikke 24-timers forsinkelse, i begge kontekstpar. Sammenligningen af forsøgsgrupperne i faget afslørede betydelige forskelle mellem objektets præferencer på det nye sted i test med 1-h og 24-timers forsinkelser i begge kontekstpar. p < 0,001; en-prøve t-test versus chance niveau (50%, stiplet linje). ^#p < 0,05, ^{# #}p < 0,01; parret t-test. Individuelle datapunkter præsenteres som prikker. Alle søjler viser procentdelen af udforskning af objektet på den nye placering som middel ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Objektplaceringsopgaven kan bruges i en række undersøgelser til at undersøge rumlig hukommelse som beskrevet tidligere. Fleksibiliteten i opsætningen muliggør modellering af kortsigtet og langsigtet hukommelse af forskellige styrker, og det kan nemt implementeres til en lav pris. Da der imidlertid er mange parametre i protokollen, der kan påvirke resultaterne, og forskellige undersøgelser varierer lidt i disse parametre⁶, kan man få problemer med at gennemføre opgaven for første gang. Ovenstående protokol er beregnet til at guide læserne gennem denne proces problemfrit. Yderligere afgørende skridt, der kan være vigtige for en vellykket gennemførelse af opgaven med høj replikabilitet, vil blive diskuteret nedenfor.

Selvom kodnings-/testsessionen ofte er i fokus, når du kører objektplaceringseksperimenter, har håndterings- og habituationsprotokoller en dybtgående effekt på resultatet af denne form for adfærdstest, hvor resultatet afhænger af uforstyrret naturlig rotteadfærd^14,15. Som sådan skal trinene forud for kodnings-/testsessionen udformes med forsigtighed, da de kan påvirke rotteadfærd og -hukommelse og dermed påvirke slutresultaterne. Et godt niveau af håndtering og habituation, således at rotter bliver fortrolige med eksperimentatoren, og opgaven vil minimere effekten af stressfaktorer og samtidig øge sandsynligheden for at udvise naturlig adfærd⁸. Som nævnt i protokollen kan håndteringen begynde så tidligt som fravænning af hvalpe, hvis rottestammen opretholdes i hjemmet. Baseret på tidligere erfaringer (data ikke vist) og fra flere tidligere undersøgelser^16,17, denne tidlige håndtering resulterer i lav angst og øget nysgerrighed i de følgende måneder.

Da objektplaceringsopgaven udelukkende afhænger af rotternes iboende sonderende drev, kan forventet adfærd let hindres, hvis rotter ikke er ivrige efter at udforske eller tilbageholdende med at nærme sig nyhed, som kaldes 'neofobisk adfærd'¹. Som sådan anbefales det stærkt at inkludere en grundig håndterings- og habituationsprotokol i henhold til undersøgelsens specifikke behov. Denne protokol kan bruges som en minimumskravsvejledning, og der kan implementeres yderligere trin (f.eks.er der behov for injektioner på et senere tidspunkt, tilvænning af injektionsprocedurer og specifik holdeposition). Stammen og alderen af de eksperimentelle rotter er to andre indflydelsesrige faktorer og bør overvejes, før du planlægger et eksperiment for at undgå suboptimale resultater. Forskellige rottestammer kan have forskellige adfærdsmønstre og baseline angstniveauer^18,19,20 og derfor kan specifik justering af protokollen være påkrævet afhængigt af den anvendte stamme.

Denne protokol er bekræftet at fungere godt med Th-Cre transgene rotter med Long-Evans stamme backcrossed fire gange til Lister Hooded stamme og vilde-type Lister Hooded rotter. En logisk ideel startalder for rotter i adfærdsmæssige eksperimenter er omkring 12 uger²⁰, men inter-stamme variabilitet og de specifikke krav til opgaven bør tages i betragtning. Det kan også være muligt at bruge udviklende rotter, hvis det er af interesse for undersøgelsen, selv om justeringer af protokollen kan være påkrævet og ikke er omfattet her. Det er dog vigtigt at overveje, om rotten i en given alder har udviklet de kognitive funktioner, der kræves for at udføre denne opgave med succes. En undersøgelse^21, der undersøgte dette, har rapporteret, at kun de unge rotter på postnatal dag 38 og ikke før viste allocentrisk rumlig hukommelse afspejlet i præference for objekt på det nye sted, som observeret hos voksne rotter. Protokollen præsenteret her var vellykket ved hjælp af rotter, der var 15-16 uger gamle i begyndelsen af den første kodning / test session. Tidligere producerede den samme stærke kodningsprotokol suboptimale til negative resultater, når man brugte 23 uger gamle rotter, der ikke havde nået det optimale niveau af beboelse på grund af manglende håndtering og habituating i en ung nok alder. Disse rotter enten undladt at udføre anderledes end tilfældigheder niveau eller i virkeligheden, udvist aversion mod nyhed som observeret med hensyn til præference for de stabile objekter i stedet for de fordrevne objekter (data ikke vist). Disse resultater giver bevis for, at alderen og tidspunktet for håndteringsbeboelse kan have indflydelse på effektiviteten af tilvænning og som følge heraf bidrage til observation af ængstelig og neofobisk adfærd i testene.

Her er to forskellige protokoller skitseret, hvilket sikrer stærk eller svag kodning i objektplaceringsopgaven. Under etableringen af disse protokoller blev det observeret, at interessen for objekterne faldt efter 5-10 minutters udforskning under enkelte lange forsøg (f.eks. 20 minutters kodning), og rotter stoppede til sidst med at udforske. Dette resulterer i svagere hukommelse af objektplaceringerne. En kodningsprotokol, der blander kodningsforsøg med korte hvileperioder (f.eks. 3 x 5 minutters kodning) overvinder dette og fører til høj udforskning under hele forsøgene. Således påvirker den aktive udforskningstid og det forskellige layout af disse to kodningsprotokoller hukommelsens styrke, som er stærkere efter 3 x 5 minutters kodning end efter 20-minutters kodningsprotokoller. Lignende resultater kan også opnås ved hjælp af lidt forskellige varigheder med enkelt forsøg versus interleaved forsøg protokoller, og justeringer kan foretages for at passe til behovene i undersøgelsen og rottestammen.

I modsætning til protokoller ved hjælp af en almindelig hvid åben felt med kun eksterne signaler i rummet, den protokol, der præsenteres her bruger en arena med forskellige sammenhænge og intra-labyrint stikord, der sandsynligvis kræver mere tid til at lære. Derfor anbefales tilføjelsen af et konteksttilstæfende trin i protokollen forud for kodningsforsøget. Dette vil gøre det muligt for rotter at danne et rumligt kort over hver kontekst under habituation og reducere varigheden af det følgende kodningsforsøg, da rotterne kun behøver at kode objekternes placering i forhold til dette kort. Desuden vil kontekst habituation tillade rotter at habituate til enhver mulig distraktor i hver sammenhæng, såsom 3D rumlige signaler, minimere adfærd andre end objekt udforskning i kodning / test session til at følge. Med gennemførelsen af en grundig modvægtsmetode bestående af flere niveauer (dvs. en bred vifte af objektplaceringskombinationer (tællere) og retningen af objektforskydningen), minimeres uønskede præferencer, der kan stige på grund af variationer i lysintensitet og vægfarver / mønstre i hjørnerne af arenaen.

Flere faktorer bør overvejes, når opgaven gentages for at øge replikabiliteten mellem kodnings-/testsessioner og minimere gentagelsens indflydelse. For det første skal der udformes særskilte sammenhænge (så mange som antallet af gentagelser af kodnings-/testsessioner) for at undgå ophobning af rumlig hukommelse, der kan skyldes, at de gentagne sessioner udføres ved hjælp af samme kontekst. For at opnå dette blev der anvendt et apparat med udskiftelige vægge i forskellige farver og mønstre (Figur 1B, C). De forskellige vægge og 3D-objekter (såsom legetøj eller små dagligdags genstande af forskellige farver og former, se protokol og Figur 1C)hang på væggene er de rumlige signaler og vartegn, at rotterne potentielt bruger til at lære objekt steder i forhold til deres sammenhænge. I tilfælde af, at en test ikke giver fortrinsret til det flyttede objekt, kan det overvejes at ændre disse parametre i konteksten (vægdesign og rumlige signaler). Alternativt kan en rektangulær- eller cirkulær-formet arena bruges til objektplaceringsopgaver i stedet for en firkantet arena som i denne protokol. Cirkulære arenaer er rapporteret til at fjerne hjørne præferencer^22, der ofte observeres i arenaer med hjørner, og dermed kan det være gavnligt, når der beskæftiger sig med en særlig høj-angst rotte eller mus stamme. Mens kravene til at skabe fire forskellige sammenhænge i denne protokol fungerer mest optimalt med en firkantet form, kan en cirkulær arena også gøres funktionel efter nogle justeringer.

For det andet bør intervallerne mellem hver kodnings-/testsession bestemmes således, at rotter bevarer det samme interesseniveau hver gang, samtidig med at risikoen for kumulativ læring som følge af en tæt tidsplan for gentagelser undgås. Normalt er et interval på mindst det dobbelte af forsinkelsestiden mellem kodning og testforsøg tilstrækkeligt, med længere intervaller, der er mere gunstige for mere end to gentagelser. Det betyder, at mens mindst 48-timers interval efter en 24-timers test er tilstrækkelig til en eller to gentagelser, anbefales det at bruge et interval på 1 uge til fire gentagelser. Som resultaterne i figur 5 og sammenligningen ved hjælp af ANOVA viser, kan opgaven gentages med succes fire gange. På denne baggrund kan den etablerede protokol bruges til at opveje op til fire forsøgsbetingelser. Antallet af eksperimentelle grupper bestemmer antallet af gentagelser af kodnings-/forsøgssessioner i forskellige sammenhænge. Resultaterne i figur 5 repræsenterer en mulig måde at anvende protokollen på med to forsøgsgrupper. Grupperne blev opvejet i to sessioner, og de samme betingelser blev gentaget i yderligere to sessioner (til valideringsformål). Det andet sæt af modvægt sessioner kunne også bruges til at opveje nye betingelser. På samme måde kan tre eller fire forsøgsbetingelser sammenlignes ved hjælp af henholdsvis tre eller fire modvægtssessioner.

I disse tilfælde bør konteksterne udformes således, at de passer til kontrasterende egenskaber, der er beskrevet i protokollen. Det er bemærkelsesværdigt, at det opvejede design muligvis ikke er egnet til forsøg, hvor der skal anvendes yderligere manipulationer, såsom en farmakologisk intervention, der kan efterlade en langvarig virkning eller skade. For at opretholde testenes effektivitet og replikabilitet bør forsøget udformes i overensstemmelse hermed. Dataene fra gentagne test kan præsenteres og analyseres på flere måder, som det fremgår af figur 5. I forbindelse med en indledende analyse kan forsøgsgrupperne i hver sammenhæng sammenlignes individuelt med tilfældighedsniveau ved hjælp af en stikprøve t-test for at bestemme en signifikant præference (Figur 5B, D). Dette kan være nyttigt at få en hurtig forståelse af dataene, men det sikrer kun en indirekte sammenligning af grupperne. Så for at sammenligne to eller flere grupper skal dataene analyseres ved hjælp af to-prøve t-tests(parret eller uparret) eller ANOVA, henholdsvis. Dette kan være i form af sammenligning mellem faget af grupperne inden for en enkelt kodnings-/testsession (figur 4A og figur 5B, D) eller en sammenligning af grupperne fra to (eller flere) modvægtskontekster ( Figur5C, E). Sidstnævnte metode anbefales stærkt, især når der beskæftiger sig med svage hukommelsesforhold, hvilket som tidligere forklaret resulterer i høj varians på grund af tilfældighed i adfærd.

Kombinationen af de modvægtige sammenhænge fører til større grupper, der er nødvendige for pålideligt at visualisere gruppens funktionsmåde med minimal variation. Ved hjælp af en protokol med gentagelser i modvægt sessioner, kan man forvente et fald i antallet af rotter til omkring en tredjedel af det antal, der ville være påkrævet ved hjælp af en enkelt test med samme statistiske effekt. Normalt er prøvestørrelser i et interval på 7 til 15 rotter (i alt) for modvægt sessioner og i et interval på 20 til 50 rotter (10 til 25 pr. Gruppe) for en enkelt session med en effektstørrelse og effekt, der begge er større end 0,8, tilstrækkelige. Faldet i antallet af dyr, der er behov for, og stigningen i de oplysninger, vi får fra hvert dyr ved hjælp af denne protokol, forfiner både undersøgelsen og tjener 3R-principperne om etisk anvendelse af dyr i forskning. Det er vigtigt på dette trin at huske på, at tilfældig rotteadfærd, som ikke ledsages af en stærk hukommelse, kan resultere i individuelle stærke præferencer både under og over chance, men gruppegennemsnittet bør give en præference, der ikke er væsentligt forskellig fra tilfældighed. Individuelle data skal fortolkes omhyggeligt. Fordelingen af individuelle datapunkter i en gruppe kan også være informativ til fortolkning af resultater. Som det ses i figur 4 og figur 5, ændres fordelingen afhængigt af hukommelsens styrke. Samlet set kan den protokol, der præsenteres her, nemt følges for at gennemføre objektplaceringsopgaven med gentagelser for at modellere kortsigtet og / eller langsigtet rumlig hukommelse. Den enkle og fleksible træningsprotokol og muligheden for at implementere yderligere manipulationer gør denne opgave til et populært valg. Disse ændringer af protokollen gør det muligt at undersøge bestemte trin, f.eks.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Open-field/experimental box	O'Hara & Co (Japan)	OF-3001	Open-field box for the object location task
Object 1: cones	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RR
Object 2: footballs	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RB
Object 3: rectangular blocks	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RC	Rectangular blocks were modified after purchase
Object location task apparatus	O'Hara & Co (Japan)	SPP-4501	Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task
Tracking software	O'Hara & Co (Japan)	TimeSSI	For movement tracking and automated camera functions
Wild-type Lister Hooded rats	Charles River	603