Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

שימוש במודל מורין של מתח פסיכו-סוציאלי בהריון כפרדיגמה רלוונטית לתרגום להפרעות פסיכיאטריות אצל אמהות ותינוקות

Published: June 13, 2021 doi: 10.3791/62464
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3
1Molecular Developmental Biology Program, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 2Division of Human Genetics, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 3Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine, 4Division of Veterinary Services, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center

Summary

פרדיגמת הלחץ הפסיכו-סוציאלי הכרוני (CGS) מעסיקה גורמי לחץ רלוונטיים מבחינה קלינית במהלך ההריון בעכברים כדי לדגמן הפרעות פסיכיאטריות של אמהות ותינוקות. כאן, אנו מספקים הליך שלב אחר שלב של החלת פרדיגמת CGS והערכות במורד הזרם כדי לאמת מודל זה.

Abstract

תקופת פריפרטום נחשבת לתקופה רגישה שבה חשיפות אימהיות שליליות יכולות לגרום לתוצאות שליליות ארוכות טווח הן לאם והן לצאצאים, כולל התפתחות של הפרעות נוירופסיכיאטריות. גורמי סיכון הקשורים להופעתה של dysregulation רגשי בדיאדה אימהית-תינוק נחקרו בהרחבה. חשיפה ללחץ פסיכו-סוציאלי במהלך ההריון התגלתה בעקביות כאחד המנבאים החזקים ביותר. מספר דגמי מכרסמים נוצרו כדי לחקור את הקשר הזה; עם זאת, מודלים אלה מסתמכים על שימוש בלחצים פיזיים או מספר מוגבל של גורמי לחץ פסיכו-סוציאליים המוצגים באופן חוזר ונשנה, שאינם לוכדים במדויק את הסוג, העוצמה והתדירות של גורמי לחץ שחוו נשים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, נוצרה פרדיגמת מתח פסיכו-סוציאלי כרוני (CGS) המעסיקה עלבונות פסיכו-סוציאליים שונים בעוצמה שונה המוצגת באופן בלתי צפוי. כתב היד מתאר פרדיגמת CGS חדשנית שבה עכברות בהריון, מיום ההיריון 6.5 עד 17.5, חשופות ללחצים שונים במהלך היום והלילה. גורמי לחץ יומיים, שניים ביום המופרדים על ידי הפסקה של 2 שעות, נעים בין חשיפה לחפצים זרים או ריח טורף לשינויים תכופים במיטות, הסרת מצעים והטיית כלוב. גורמי לחץ למשך הלילה כוללים חשיפה מתמשכת לאור, החלפת בני זוג בכלוב או מצעים להרטבה. הוכחנו בעבר כי חשיפה ל- CGS גורמת להתפתחות של הפרעות נוירואנדוקריניות והתנהגותיות אימהיות, כולל תגובתיות מתח מוגברת, הופעת דפוסי טיפול אימהיים מקוטעים, anhedonia, והתנהגויות הקשורות לחרדה, תכונות הליבה של נשים הסובלות ממצב רוח פרינטלי והפרעות חרדה. מודל CGS זה, אם כן, הופך לכלי ייחודי שניתן להשתמש בו כדי להבהיר פגמים מולקולריים שבבסיס דיסרבציה רגשית אימהית, כמו גם מנגנונים טרנס-שליה המשפיעים על נוירו-פיתוח העובר וכתוצאה מכך השלכות התנהגותיות שליליות לטווח ארוך בצאצאים.

Introduction

המנגנונים שבביד רגישות מוגברת להפרעות נוירופסיכיאטריות אצל אמהות ותינוקות בעקבות חשיפות אימהיות שליליות בתקופת פריפרטום עדיין אינם ידועים ברובם. שינויים פיזיולוגיים אימהיים משמעותיים מתרחשים במהלך ההריון והמעבר לתקופה שלאחר הלידה, כולל מספר התאמות נוירואנדוקריניות המשוערות כקריטיות לא רק לפיתוח עצבי בריא של צאצאים, אלא גם לשמירה על בריאות הנפש האימהית1,2. ברמה של ציר בלוטת יותרת המוח ההיפותלמוסית האימהית (HPA), נצפים התאמות הן ברמות היממה והן ברמות הנגרמות מלחץ של שחרור גלוקוזקורטיקואידים, כולל קצב שטוח יותר של פעילות ציר HPA יומית ותגובת ציר HPA דכאונית ללחצים חריפים3,4,5. בהתחשב בכך פעילות משופרת של ציר HPA מדווחת בתת קבוצה של נשים עם dysregulation רגשי לאחר הלידה, כולל רמות גבוהות של glucocorticoids במחזור משוב שלילי מעוכב6,7,8 ,חשיפהלחצים שגורמים תגובתיות מתח לאחר הלידה ולמנוע התאמות ציר HPA אימהי נחשבים כדי להגביר את הרגישות להפרעות נוירופסיכיאטריות.

כדי לפרט את ההשפעות של מתח על dysregulation רגשי אצל אמהות ותינוקות, כמה מודלים מכרסמים של מתח בתקופת פריפרטום נוצרו. רוב המודלים האלה מאופיינים ביישום של גורמי לחץ פיזיים שגורמים לאתגרים ושינויים הומיאוסטטיים במצב הפיזיולוגי של הסכר9, כגון לחץ ריסון כרוני10 ומתח שחייה במהלךההריון 11, או חשיפה להלם לאחר לידה12. למרות פרדיגמות אלה הוכחו לגרום להופעתם של התנהגויות דיכאוניות לאחר לידה ושינויים בטיפול אימהי10,11,12, הם הוגבלו על ידי חוסר היכולת שלהם ללכוד במדויק את האופי הפסיכו-סוציאלי של גורמי לחץ שבדרך כלל חווים אמהות אנושיות. זה הופך להיות חשוב במיוחד כאשר מנסים לחשוף את ההשלכות הנוירואנדוקריניות של מתח כרוני בתקופת הפריפרטום, בהתחשב בכך עיבוד של סוגים שונים של לחצים נחשב להיות בתיווך על ידי רשתות עצביות שונות מתוזמר הפעלת ציר HPA9.

על מנת להתגבר על מגבלה זו, מספר קבוצות עיצבו פרדיגמות מתח המעסיקות עלבונות פסיכו-סוציאליים או שילוב של גורמי לחץ פיזיים ופסיכו-סוציאליים. מודל ההפרדה האימהית, שבו סכרים מופרדים גוריה במשך כמה שעות ביום במהלך התקופה שלאחר הלידה13,14, ואת מודל הלחץ החברתי הכרוני, שבו הסכרים חשופים פולש זכר בנוכחות המלטה שלהם15,16, הצליחו לשחזר את הופעתה של חריגות בטיפול אימהי פנוטיפים דמויי דיכאון הקשורים פרדיגמות מתח פיזי. פרדיגמת הלחץ האולטרה-מהותית הכרונית, שבה עכברות הרות חשופות למגוון עלבונות פסיכו-סוציאליים, כולל הטיית כלוב ותאורה לילית, כמו גם עלבונות פיזיולוגיים משמעותיים, כגון לחץ איפוק והגבלת מזון, חשפה עוד יותר חשיפה לאופי מעורב של גורמי לחץ גורמת לחריגות בהתנהגות האימהית, כולל ליקויים בתוקפנות אימהית, כמו גם dysregulation בפעילות היממה של ציר HPA17,18. עולה בקנה אחד עם תוצאות אלה, מתח ריסון לסירוגין מודל צפיפות במהלך ההריון תוצאות העלאות ברמות הקורטיקוסטרון האימהי לאחר הלידה, כמו גם שינויים בטיפול האימהי, אם כי אין הבדלים נצפו בפעילות מחדש בציר HPA לאחר חשיפה לאחר הלידה עלבונות חריפים חדשניים1.

הרחבה של עבודה זו, יצירת פרדיגמת מתח הריונית המשתמשת בעלבונות פסיכו-סוציאליים מרובים המוצגים באופן בלתי צפוי וממזערת את השימוש בלחצים פיזיולוגיים. מחקרים הראו בעבר פרדיגמת מתח פסיכו-חברתי כרונית זו (CGS) גורמת להתפתחות תפקוד לקוי של ציר HPA האימהי, כולל תגובתיות מתח משופרת בתקופה המוקדמת שלאחר הלידה19. שינויים אלה קשורים לחריגות בהתנהגות האימהית, כולל שינויים באיכות הטיפול האימהי המתקבלים על ידי גורים, ואת הופעתה של התנהגויות anhedonic וחרדהכמו 19, תכונות בקנה אחד עם מצב הרוח הפרינטלי והפרעות חרדה20,21. יתר על כן, צאצאים במשקל מפחית במהלך התקופה שלאחר ההילה בעקבות חשיפה בתוך הרחם CGS19, דבר המצביע על CGS עשוי להיות השפעות תכנות שלילי מתמשך בדורות הבאים.

המטרה בפיתוח פרדיגמת CGS הייתה בעיקר להשתמש בלחצים רלוונטיים קלינית, אשר לוכדים במדויק את הסוג, העוצמה והתדירות של עלבונות הקשורים לעתים קרובות עם dysregulation נוירואנדוקריני ופיתוח של מצב רוח פרינטלי והפרעות חרדה. כאן, המחקר מספק פרוטוקול מפורט של איך לחשוף עכברים נקבות בהריון CGS, כמו גם הערכות במורד הזרם שניתן להשתמש בהם כדי לבדוק את תוקפו של המודל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ושימוש במרכז הרפואי לילדים בסינסינטי והיו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות. גישה למכרסמים ומים סטנדרטיים סופקה בכל עת לעכברים, כולל במהלך פרדיגמת CGS. עכברים שוכנו במחזור בהיר-כהה של 14 שעות/10 שעות (אורות דולקים בשעה 06:00) אלא אם צוין אחרת (כלומר, חשיפה לאורות במהלך הלילה).

1. הכנה להזדווגויות מתוזמנות

  1. לפחות שבועיים לפני הגדרת הזדווגויות מתוזמנות, שוכנו את העכברים הבוגרים יחד בכלוב עכברים סטנדרטי (18.4 ס"מ x 29.2 ס"מ x 12.7 ס"מ), ארבעה עכברים לכלוב. סמן כל עכבר נשי עם מספר זיהוי ספציפי באמצעות תג אוזניים.
    הערה: עכברות C57BL6 ללא הריון קודם ובין 3 ל 6 חודשים של גיל שימשו לפרוטוקול זה.
  2. לפחות שבוע לפני הגדרת הזדווגויות מתוזמן, בנפרד לשכן את העכברים הזכרים הבוגרים שישמשו להזדווגות.

2. הגדרת הזדווגויות מתוזמנות

  1. הגדר את ההזדווגויות המתוזמנות בשעה 18:00. קח שתי עכברות נקבה והנח אותם בתוך כלוב שמחזיק עכבר זכר שוכן בנפרד. הפרד את ההזדווגות המתוזמנות למחרת בבוקר עד השעה 08:00.

3. בדיקת תקע ההזדווגות, המיועד ליום ההיריון 0.5 (G0.5)

  1. מיד לאחר הפרדת הזדווגויות מתוזמנות, בדוק את נוכחותו של תקע הזדווגות בעכברים הנשיים. נוכחות של תקע מזדווג תסמן G0.5. אפשר לעכבר להחזיק את רשת החוטים בתוך הכלוב ולהרים אותה בעדינות בזנב כדי לדמיין את פתח הנרתיק.
    הערה: נוכחות של תקע מזדווג מצביעה על פעילות מינית התרחשה אך אינה מבטיחה הריון. כאשר מנסים לחשב את מספר העכברים הניסיוניים הדרושים, צפו כי 50% מהעכברים יהיו מחוברים מהזדווגות מתוזמן והריון כדי לחבר שכיחות של 60%-70%.
  2. השתמש בבדיקה חזותית פשוטה כדי לזהות את נוכחותו של תקע הזדווגות (מסה אטומה מקושטת לבנבן בתוך או בולטת מעט מפתיחת הנרתיק). אם תקע ההזדווגות אינו מזוהה בקלות על ידי בדיקה חזותית פשוטה, הכנס בעדינות בדיקה קהה לפתח הנרתיק. לזהות את התקעים הממוקמים עוד יותר בחזרה בנרתיק על ידי ההתנגדות של החדרת בדיקה.
  3. הפרד את העכברים הנשיים עם תקעים מזדווגים ובית קבוצה בכלובי עכבר סטנדרטיים, 3 עד 4 עכברים לכלוב.

4. הכנה לפרדיגמת CGS

  1. הקצאה אקראית של כלובים המאכלסים עכברות עם תקעים מזדווגים לשתי קבוצות ב- G5.5: קבוצת בקרה ו- CGS. נסה ליצור אקראיות כלובים כך שמספר שווה בקירוב של עכברים לקבוצה. העבר את העכברים לניקוי כלובי עכבר סטנדרטיים ותווית עם שלט "נא לא להפריע". ייעדו את הכלובים האלה כ"כלובים ביתיים" לעכברים שימקם אותם בסוף כל מאמץ.
  2. ייעד חדר נפרד במתקן העכבר כדי לבצע את פרדיגמת CGS. עצב משטר מתח של 11 יום, הפועל מ- G6.5 ל- G17.5, כדי לנצל כל אחד מ-7 גורמי הלחץ [חשיפה לחפצים זרים (גולות או לגו), חשיפה לריח טורף (מצעים מלוכלכים), הטיית כלוב ב-30 מעלות, שינויים תכופים של מצעים, הסרת מצעים, תנועה על שייקר] פעמיים ביום, ולנצל כל אחד מ-3 גורמי הלחץ הליליים (אורות לילה דולקים, שינוי בן זוג בכלוב, חשיפה למצעים רטובים) בן לילה באופן אקראי. לקבלת לוח זמנים אפשרי לדגימה וסכימה של ניסויים המתוארים להלן, ראו איור 1.
    הערה: כל יום stressor צריך ליפול בתוך מחזור האור של עכברים (אורות על 06:00 h-20:00 h), האחרון 2 שעות, עם לפחות הפסקה 2 שעות בין גורמי לחץ. כל לילה לחץ צריך להיות מוגדר בתחילת המחזור הכהה (אורות כבויים 20:00 שעות) מופרד בתחילת מחזור האור (אורות על 06:00 שעה).

5. ביצוע פרדיגמת CGS

  1. הגדר גורמי לחץ ספציפיים על כלוב סטטי סטנדרטי עם חלק עליון מסונן ובקבוק מים בחדר המיועד לפרדיגמת CGS. הכן את מספר הכלובים הסטטיים הדרושים לניסוי בהתאם למספר כלובי העכבר המיועדים לעבור CGS במהלך אקראיות. לפני הפעלת כל מאמץ, להעביר את כלובי העכבר של קבוצת CGS מחדר הדיור לחדר CGS.
    הערה: בצע את הטיפול / העברה של עכברים מכלוב הבית לכלוב ניסיוני ובחזרה בברדסים זרימה למינאר.
  2. החל את גורמי הלחץ הבאים על פי המשטר שתוכנן מראש (עיין בשלב 4.2).
    1. חשיפה לחפצים זרים (גולות או לגו): מניחים שש גולות (בקוטר 14 מ"מ) או שש לגו (צורות שונות, שלא יעלה על גובה של 4 ס"מ) המחולקות באופן אקראי לכלוב סטטי נקי עם מצעים לעכבר, מבלי לכלול את קנטי העכברים. מניחים את העכברים יחד עם עמיתיהם בכלוב הביתי בכלוב הסטטי עם חפצים זרים למשך 2 שעות. החזירו את העכברים לכלוב הביתי שלהם עם אותם עמיתים בסיום הלחץ.
      הערה: יש לנקות את האובייקטים הזרים לאחר השימוש.
    2. חשיפה לריח טורף (מצעי חולדה מלוכלכים): מניחים עומק של ס"מ אחד של מצעים של חולדות מלוכלכות טריות מחולדות וכלוב סטטי נקי ללא מצעים לעכבר, מבלי לכלול את קנדלט העכברים. מניחים את העכברים יחד עם עמיתיהם בכלוב הביתי בכלוב הסטטי עם מצעי חולדה מלוכלכים למשך 2 שעות. החזירו את העכברים לכלוב הביתי שלהם עם אותם עמיתים בסיום הלחץ.
    3. הטיית כלוב ב-30°: הנח את העכברים עם עמיתיהם לכלוב הביתי בכלוב סטטי ונקי עם מצעים לעכברים, מבלי לכלול את קנקני העכברים. הטה את הכלוב ב 30° על הקיר במשך 2 שעות. החזירו את העכברים לכלוב הביתי שלהם עם אותם עמיתים בסיום הלחץ.
    4. שינויים תכופים במיטות: הניחו את העכברים עם עמיתיהם בכלוב הביתי בכלוב סטטי ונקי עם מצעים לעכבר, מבלי לכלול את קנקני העכברים. החלף את מצעים העכבר עם מצעים עכבר נקי כל 10 דקות במשך 2 שעות. במהלך שינויים במיטות העכבר, הניחו בעדינות את העכברים בכלוב נקי אחר כדי להימנע ממגע ישיר עם העכברים. החזירו את העכברים לכלוב הביתי שלהם עם אותם עמיתים בסיום הלחץ.
    5. הסרת מצעים: מניחים את העכברים יחד עם עמיתיהם בכלוב הביתי בכלוב סטטי ריק ונקי (ללא מצעים או קננים של עכברים) למשך 2 שעות. החזירו את העכברים לכלוב הביתי שלהם עם אותם עמיתים בסיום הלחץ.
    6. תנועה על שייקר: מניחים את העכברים עם עמיתיהם בכלוב הביתי בכלוב סטטי ונקי עם מצעים לעכבר, מבלי לכלול את קנקני העכברים. מניחים את הכלוב הסטטי על גבי שייקר מעבדה הדדי להגדיר 140 משיכות לדקה במשך 2 שעות. החזירו את העכברים לכלוב הביתי שלהם עם אותם עמיתים בסיום הלחץ.
    7. חשיפה לילית לאורות: הניחו את העכברים עם עמיתיהם בכלוב הביתי בכלוב סטטי ונקי עם מצעים לעכברים, מבלי לכלול את קנקני העכברים. שמור את האורות דולקים למשך הלילה (20:00 h-06:00 h) כדי להפריע למחזור האפל. החזירו את העכברים לכלוב הביתי שלהם עם אותם עמיתים בסיום הלחץ.
    8. שינוי בן זוג בכלוב: העבר את העכבר לכלוב סטטי ונקי עם מצעים לעכבר אשר שוכן על ידי קבוצה אחרת של שתי עכברים נקבות (נקבות שלמות שאינן חלק מהטיפול או קבוצת הביקורת). שמור את העכבר בכלוב הסטטי עם חברים לא מוכרים בכלוב למשך הלילה. החזר את העכבר לכלוב הביתי שלו עם עמיתיו לכלוב הביתי הספציפיים בסיום מאמץ הלחץ.
    9. חשיפה למצעים רטובים: מלאו את הכלוב הסטטי במיטות עכבר במים נקיים שנשמרו ב-24 מעלות צלזיוס עד שהמצעים רוויים במים. מניחים את העכברים יחד עם עמיתיהם בכלוב הביתי בכלוב הסטטי עם מצעים רטובים למשך הלילה. החזירו את העכברים לכלוב הביתי שלהם עם אותם עמיתים בסיום הלחץ.
  3. במהלך פרדיגמת CGS, לשמור על עכברי הבקרה ללא הפרעה בכלובי הבית שלהם בתוך חדר הדיור.
  4. החלף את כלובי הבית המשומשים בכלובי בית חדשים ב- G10.5. ב-G17.5, בסיום הלחץ הלילי, כל העכברים הניסיוניים מתכוננים לפרקטוריישן והערכות תפקודיות במורד הזרם.

6. ניטור העכברים הניסיוניים במהלך פרדיגמת CGS

  1. נטר את העכברים כל שעה במהלך יישום לחץ, למעט במהלך גורמי לחץ לילה.
  2. אל תכלול את העכברים המציגים סימני מצוקה, כולל פצעים, עייפות או כל חריגה פיזית מהניסוי. צרו קשר עם הצוות הווטרינרי לפי הצורך.

7. מדידת אחוז העלייה במשקל הגוף במהלך ההיריון בעכברים הניסיוניים (אופציונלי)

  1. ב- G6.5, שקול את העכברים בנפרד לפני החשיפה ללחצים. ב- G17.5, בסיום הלחץ הלילי, שוקלים את העכברים בנפרד. שקול את עכברי הבקרה בנקודות הזמן ההיריון המקבילות.
  2. למדוד את אחוז עלייה במשקל הגוף במהלך ההריון על ידי הגדרת המשקל של היום הראשון של פרדיגמת CGS (G6.5) כמו 100%.

8. מדידת משקולות בלוטת יותרת הכליה היחסית לאחר הלידה בעכברים ניסיוניים (אופציונלי)

  1. ביום שלאחר הלידה 2 (PP2), לשקול את השליטה ואת CGS סכרים בנפרד. להרדים את הסכרים על ידי שאיפת פחמן דו חמצני ואחריו נקע צוואר הרחם במכסה המנוע אדים.
  2. מניחים את העכברים על צלחת ניתוח, לעקר את אזור הבטן עם 70% אתנול, ולפתוח את חלל הבטן באמצעות מספריים כדי להפוך חתך אנכי. לבודד את בלוטות יותרת הכליה הממוקם בסמוך לקוטב הצפוני של הכליות עם מלקחיים, בילטרלי. לנתח בזהירות את רקמת השומן המקיפה את בלוטות יותרת הכליה מתחת למיקרוסקופ ניתח.
  3. לשקול את בלוטות יותרת הכליה הדו צדדיות בנפרד. חשב את משקולות בלוטת יותרת הכליה היחסית במיליגרם לגרם (המשקל הכולל של בלוטות יותרת הכליה הימנית והשמאלית /משקל הגוף).

9. מדידת פעילות ציר בלוטת יותרת המוח ההיפותלמית לאחר הלידה בעכברים הניסיוניים (אופציונלי)

  1. כהכנה למדידות ציר HPA, המת פסולת להמתה ל 6 גורים לכל המלטה ביום שלאחר הלידה 0 (PP0). השתמש שאיפת פחמן דו חמצני, ואחריו עריפת ראש עם מספריים כירורגיים כשיטה משנית של המתת חסד.
  2. ביום שלאחר הלידה 2 (PP2), לרסן בנפרד את השליטה ואת סכרי CGS בתוך צינור פוליפרופילן חרוטי מאוורר היטב 50 מ"ל במשך 20 דקות. מיד לאחר לחץ איפוק, להסיר את העכבר מן הצינור חרוט ולרסן את העכבר עם היד הלא דומיננטית על ידי החזקת העור הרופף מעל הכתפיים ואחוריים לאוזניים כדי לקבל את העור מעל הלסתן מתוח.
  3. לנקב את הווריד submandibular עם lancet מעט מאחורי הלסת התחתונה אבל קהורי לתעלת האוזן. לאסוף עד 100 μL של דם אימהי בצינור מפריד סרום. לאחר איסוף דגימות, להפעיל לחץ עדין עם גזה לאתר הדקירה כדי לעצור את הדימום. תחזיר את הסכרים לכלוב הביתי ברגע שהה דימום ייפסק.
  4. צנטריפוגות צינור מפריד הסרום ב 21,130 x גרם במשך 6 דקות ולהסיר בזהירות את הסרום. יש לאחסן את הסרום במהירות של -20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. למדוד את ריכוז קורטיקוסטרון בסרום על ידי ערכת ELISA בעקבות פרוטוקול היצרן.

10. מדידת השינויים ההתנהגותיים לאחר הלידה בעכברים הניסיוניים (אופציונלי)

  1. כדי להתכונן לניתוח ההתנהגותי, יש ללכלך על 6 גורים לכל המלטה ב-PP0.
  2. בצע ניתוח של פיצול הטיפול האימהי מ PP2 ל PP5. בכל יום, במהלך מחזור האור, לחשוף את הסכרים לחדר הבדיקות במשך תקופת הרגלה של 5 דקות לפני צילום ההתנהגות האימהית לתקופה של 30 דקות.
    1. להעריך את הפיצול בטיפול אימהי על ידי מדידת האורך הממוצע של התקף ליקוק / טיפוח אישי ואת המספר הכולל של התקפים המבוצעים על ידי סכרים19.
      הערה: התנהגות ליקוק/טיפוח מוגדרת כהתנהגות שבה הסכר יוצר קשר עם גוף הגור עם הלשון שלה, או שהגור מטופל על ידי הסכר עם הפתחים שלה. התקף מוגדר כתקופה רצופה של זמן שבו הסכר עוסק בליקוק / טיפוח של גוריה.
  3. בצע ניתוח של anhedonia באמצעות מבחן העדפת סוכרוז (SPT) מ PP0 ל PP6. לחשוף את הסכרים לבקבוק אחד 100 מ"ל של מים נקיים ובקבוק אחד 100 מ"ל של 4% תמיסת סוכרוז בכלוב הבית שלהם. למדוד את כמות המים סוכרוז נצרך (ב mL) מדי יום. להחליף את מיקום הבקבוק בכלוב הביתי. חשב את העדפת סוכרוז באמצעות הממוצעים מ 4 הימים האחרונים: העדפה % = [(צריכת סוכרוז / סוכרוז + צריכת מים) x 100].
  4. בצע ניתוח של התנהגות דמוית חרדה באמצעות מבוך אפס מוגבה (EZM) על PP8. הניחו את הסכרים בנפרד על מנגנון EZM המורכב משני רבעים סגורים ושני רבעים פתוחים מוגבהים מהרצפה. אפשר לסכרים לחקור את המבוך באין מפריע במשך 5 דקות. לכמת את הזמן שהושקע ברביע הפתוח ואת מספר הכניסות לרבעים הפתוחים.

11. מדידת שינויי משקל הצאצאים לאחר ההולכה (אופציונלי)

  1. כדי להתכונן לניתוח משקל הצאצאים, יש ללכלך עד 6 גורים לכל המלטה ביום הלידה (יום לאחר הלידה 0, PN0).
  2. תעד את משקל הגורים ב- PN0 ובנקודות זמן שונות במהלך התקופה שלאחר ההילה (PN2, 7, 15, 21).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חשיפת העכברים הנשיים ההרים ל-CGS גורמת לשינויים בפרמטרים הכרוניים הרלוונטיים ללחץ, כולל ירידה במשקל הגוף במהלך ההריון (איור 2A) ומשקולות בלוטת יותרת הכליה המוגברות בתקופה המוקדמת שלאחר הלידה (איור 2B)19. חשוב לציין, חשיפה CGS תוצאות לאחר הלידה חריגות בתפקוד הנוירואנדוקריני האימהי. סכרי CGS מציגים ציר HPA היפראקטיבי כפי שמעידים רמות הקורטיקוסטרון בסרום מוגברות בעקבות יישום עלבון חריף חדשני (איור 3)19.

חשיפת העכברים הנשיים ההרים ל- CGS גורמת לחריגות התנהגותיות בתקופה המוקדמת שלאחר הלידה שנראות משקפות את הופעתו של פנוטיפ דמוי דיכאון. סכרי CGS מציגים שינויים בטיפול האימהי כפי שהם משתקפים על ידי עלייה במידת הפיצול של אותות אימהיים שהתקבלו על ידי הגורים. משך הזמן הממוצע של התקפי ליקוק/טיפוח מצטמצם ומזוהה עם עלייה במספר הממוצע של התקפים בעקבות CGS, המציין פרקים קצרים רבים של התנהגות טיפוח (איור 4A,B)19. העדפת סוכרוז מדוכאת גם בסכרי CGS בהשוואה לסכרי בקרה, מה שמרמז על נוכחות של אנהדוניה (איור 4C)19. לבסוף, סכרי CGS מציגים גם התנהגויות מוגברות הקשורות לחרדה כפי שנמדדו על ידי ירידה בזמן שהוקדש לרבעים הפתוחים של EZM בהשוואה לסכרי בקרה(איור 4D)19.

אצל הצאצאים, חשיפה ל- CGS בתוך הרחם גורמת לירידה במשקל במהלך התקופה שלאחר הלידה, מיום לאחר הלידה 7 עד 21, אם כי לא נצפים שינויים בלידה. ירידה זו במשקל הגוף קיימת בצאצאים של שני המינים (איור 5)19. יש לציין שלפרדיגמת CGS לא הייתה השפעה כלשהי על אורך ההיריון, גודל המלטה או יחס המין לכל המלטה (נתונים שאינם מוצגים)19.

Figure 1
איור 1: סכמטי פרדיגמת CGS והערכות פונקציונליות לאימות. נתון זה שונה מזובובסקי, ס.פ. ואח '19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שינויים בפרמטרים הכרוניים הקשורים ללחץ בסכרים בעקבות חשיפה ל- CGS. (A)שינויי משקל הגוף מ- G6.5-G17.5, Control = 17, CGS = 17. (B)משקולות בלוטת יותרת הכליה האימהית יחסית ב PP2, בקרה = 20, CGS = 15. נתונים המוצגים כממוצע + SEM. *p < 0.05, ****p < 0.0001. נתון זה שונה מזובובסקי, ס.פ. ואח '19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מדידות ציר HPA אימהיות בעקבות חשיפת CGS. רמות קורטיקוסטרון בסרום אימהי נמדדות לאחר 20 דקות של לחץ ריסון על PP2, בקרה = 8, CGS = 5. נתונים המוצגים כממוצע + SEM. *p < 0.05. נתון זה שונה מזובובסקי, ס.פ. ואח '19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: שינויים התנהגותיים בתקופה המוקדמת שלאחר הלידה בסכרים לאחר חשיפת CGS. (A) משך ממוצע ו -(B)מספר התקפי ליקוק/טיפוח שנרשמו מ- PP2-PP5, Control = 17, CGS = 17. (C)אחוז העדפת סוכרוז ב- SPT, בקרה = 17, CGS = 19. (D)משך הזמן הכולל שהוקדש לרביע פתוח של EZM במהלך 5 הדקות, בקרה = 17, CGS = 19. נתונים המוצגים כממוצע + SEM *p < 0.05, **p < 0.01. נתון זה שונה מזובובסקי, ס.פ. ואח '19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: שינויים במשקל הגוף של הצאצאים במהלך התפתחות לאחר ההולכה בעקבות חשיפה בתוך הרחם ל-CGS. משקל הגוף הצאצא נמדד מ PN0 ל PN21, בקרה = 17 המלטה, CGS = 17 המלטה. נתונים המוצגים כממוצע + SEM. *p < 0.05, ****p < 0.0001. נתון זה שונה מזובובסקי, ס.פ. ואח '19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חשיפת העכברים ההרים לתפקוד הנוירואנדוקריני האימהי של CGS מטרידה לאחר הלידה, כולל תגובת ציר HPA ללחצים חדשניים, והיא קשורה לחריגות התנהגותיות שונות הרלוונטיות למצב הרוח הפרינטלי והפרעות חרדה. בהתחשב בכך שהמודל משתמש בניצול של גורם סיכון סביבתי, צפוי וריאציה פנוטיפית גבוהה יותר מזו שנצפתה במודלים גנטיים22. עם זאת, תוצאות המתקבלות מיישום פרדיגמת CGS יכולות להיות עקביות במעבדות מחקר אם לוקחים טיפול כדי למזער משתנים שעלולים לבלבל את התוצאות.

צעדים קריטיים בפרוטוקול כוללים צעדים הקשורים לשיטות גידול כלליות, כולל עכברי בקרת דיור נפרדים מעכברי CGS, וצעדי הזדווגות מתוזמן. בקרת דיור משותף ועכברי CGS יכולים כשלעצמם להיות גירוי מלחיץ לקבוצת הביקורת ולכן מבלבלים את התוצאות הנוירואנדוקריניות או ההתנהגותיות23,24. כמו כן, ייזום ניסויים עם עכברים בהריון שנשלחו מהספק אינו מומלץ. כדי למקסם את היעילות של הזדווגויות מתוזמן, מומלץ לשכן עכברים נקבה בוגרת יחד לפחות 2 שבועות לפני הגדרת הזדווגויות מתוזמן כדי לסנכרן את מחזורי estrus שלהם. כמו כן, שימוש בעכברים זכרים בוגרים מנוסים מינית ומניעת גברים להזדווג לפחות שבוע לפני הגדרת הזדווגויות מתוזמן ימקסמו את פוריותם ויגדילו את הפוטנציאל להריונות מוצלחים. יש לעקוב בזהירות גם אחר ציר הזמן של פרדיגמת CGS. החלת גורמי לחץ אלה בעוצמה משתנה מוקדם מדי בהריון עלולה להשפיע על החלטת הרחם ולעכב השתלת עובר25. חשיפה ללחץ במהלך חלונות זמן הריון שונים נמצאה גם לשאת סיכון משתנה למחלות נוירו-פיתוחיות ספציפיות למין לצאצאים, שם צאצאים זכרים פגיעים באופן משמעותי יותר מאשר צאצאים נשיים ללחצים במהלך ההריון המוקדם26,27. לוח הזמנים של CGS חייב להיות מתוכנן באופן כזה שהוא מבטיח בלתי צפוי למנוע התפתחות של מנגנוני הסתגלות והתאקלמות הקשורים לעתים קרובות עם חשיפה חוזרת ונשנית ללחצים צפויים28. לבסוף, המלטה צריכה להיות ליקוט שישה גורים ביום הלידה כדי להבטיח תנאים דומים על פני כל הסכרים ולמנוע שונות גודל המלטה מן הורמון אימהי מבלבל או ניתוח התנהגות. כמו כן, יש להשתמש קבוצות שונות להערכות נוירואנדוקריניות והתנהגותיות כדי למזער את ההשפעות המבלבלות של לחץ איפוק ודימומים תת-קרקעיים על ההתנהגות. קבוצות שונות צריכות לשמש גם להערכה וניתוח טיפול אימהי של פרמטרים התנהגותיים אחרים כדי למזער את ההפרעה של אינטראקציה אימהית עם הגורים.

קיימות מספר מגבלות לפרוטוקול הנוכחי. חוסר היכולת לחזות במדויק את מספר העכברים ההרים לפני תחילת פרדיגמת CGS יכול להוות נטל כלכלי ניכר ושימוש בבעלי חיים. שינויים יכולים להתבצע בפרוטוקול כדי להשיג הצלחה צפויה יותר עם הזדווגות מתוזמנת, כולל הערכת ציטולוגיה וגינלית כדי לזהות עכברים בשלב estrus, שבו הן הזדווגות וביוץ מתרחשים בדרך כלל29. בדיקה אולטרה-סאונדוגרפית של עכברים יכולה להיות משולבת גם בפרדיגמת CGS כניסתה חלופית לא פולשנית לזיהוי מדויק של הריונות משלבים מוקדמים מאוד שלההריון 30. השימוש בצ'או רבייה מיוחד, עם תכולת שומן מוגברת, הועסק גם על ידי קבוצות אחרות כדי לשפר את הצלחת ההזדווגות31. עם זאת, יש לנקוט זהירות בעת הפעלה של שינויים בתזונה, בהתחשב בכך שזה יכול להשפיע על תגובתיות מתח אימהי והתנהגות32. בנוסף, הפרוטוקול הנוכחי הוכח כיעיל בעכברים מסוג C57BL/6 מסוג בר, אך ייתכן שיהיה צורך בשינויים של הפרוטוקול עבור זנים שונים או רקע גנטי כמו גם מינים, שכן ייתכן שיש להם וריאציות גדולות ברגישות ללחץ, טיפול אימהי ורגולציה רגשית.

בהשוואה למודלים הקיימים כיום של לחץ פריפרטום, פרדיגמת CGS מוכיחה שהיא רלוונטית יותר מבחינה תרגומית בהתחשב באנדופנוטיפים הרלוונטיים למחלות שנצפו, כולל תגובתיות מתח אימהית משופרת וחריגות לאחר לידה בטיפול אימהי, אנהדוניה וחרדה. שינויים אלה נראה לשחזר ממצאים קליניים הקשורים מצב הרוח הפרינטלי והפרעות חרדה. יישומים עתידיים של מודל זה כוללים ניצול פרדיגמת CGS כדי לזהות השפעות ספציפיות למין של לחץ פסיכו-סוציאלי אימהי על התפתחות המוח הצאצאים ורגישות למחלות. יש לקחת בחשבון את ההשפעות של CGS על תפקוד השליה, בהתחשב בכך שאין תפקוד לקוי בתפקודי שליה מרכזיים הוכחו כמשפיעים על התפתחות המוח העוברי33. שילוב ניסויים בטיפוח צולב עם פרדיגמת CGS יסייע עוד יותר להבין את התרומות האישיות בחשיפה ל- CGS ברחם ושינויים הורמונליים אימהיים הקשורים לעומת חריגות לאחר הלידה בטיפוח התנהגות לשחק בעיצוב התפתחות רגשית צאצאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להכיר בתמיכה מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית T32 GM063483-14 מענק וקרן סינסינטי לחקר הילדים. עבור נתונים המותאמים מזובובסקי ואח', 2019, ניתן למצוא רישיון משותף יצירתי במיקום הבא: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal lancet Braintree Scientific Inc. GR4MM
Blunt end probe Fine Science Tools 10088-15 Used to check for copulatory plugs
Bottles for SPT Braintree Scientific Inc. WTRBTL S-BL 100 mL glass water bottle with stopper and sipper ball point tube, graduted by 1 mL.
Conical tubes (50 mL) Corning Inc. 352098 Used for restraining mice to measure HPA axis response to acute stress. Make sure conical tube has small opening at the end for ventilation.
Legos Amazon -
Marbles Amazon -
Mouse Corticosterone ELISA kit Biovendor RTC002R
Mouse EZM TSE Systems -
Reciprocal laboratory shaker Labnet international S2030-RC-B
Serum separator tubes Becton Dickinson 365967
Static cage- bottom Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. RC71D-PC
Static cage - filtered ventilated tops Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. FT71H-PC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hillerer, K. M., Reber, S. O., Neumann, I. D., Slaterry, D. A. Exposure to chronic pregnancy stress reverses peripartum-associated adaptations: implications for postpartum anxiety and mood disorders. Endocrinology. 152 (10), 3930-3940 (2011).
  2. Hillerer, K. M., Neumann, I. D., Slaterry, D. A. From stress to postpartum mood and anxiety disorders: how chronic peripartum stress can impair maternal adaptations. Neuroendocrinology. 95 (1), 22-38 (2018).
  3. Altemus, M., Deuster, P. A., Galliven, E., Carter, C. S., Gold, P. W. Suppression of hypothalamic-pituitary-adrenal axis responses to stress in lactating women. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 80 (10), 2954-2959 (1995).
  4. Slattery, D. A., Neumann, I. D. No stress please! Mechanisms of stress hyporesponsiveness of the maternal brain. The Journal of Physiology. 586 (2), 377-385 (2008).
  5. Hasiec, M., Misztal, T. Adaptive modifications of maternal hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity during lactation and salsolinol as a new player in this phenomenon. International Journal of Endocrinology. 10 (2), 1-11 (2018).
  6. Bloch, M., et al. Cortisol response to ovine corticotropin-releasing hormone in a model of pregnancy and parturition in euthymic women with and without a history of postpartum depression. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (2), 695-699 (2005).
  7. Jolley, S. N., Elmore, S., Barnard, K. E., Carr, D. B. Dysregulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in postpartum depression. Biological Research for Nursing. 8 (3), 210-222 (2007).
  8. Nierop, A., Bratsikas, A., Zimmermann, R., Ehlert, U. Are stress-induced cortisol changes during pregnancy associated with postpartum depressive symptoms. Psychosomatic Medicine. 68 (6), 931-937 (2006).
  9. Ulrich-Lai, Y. M., Herman, J. P. Neural regulation of endocrine and autonomic stress responses. Nature Reviews Neuroscience. 10 (6), 397-409 (2009).
  10. Smith, J. W., Seckl, J. R., Evans, A. T., Costall, B., Smythe, J. W. Gestational stress induces post-partum depression-like behavior and alters maternal care in rats. Psychoneuroendocrinology. 29 (2), 227-244 (2004).
  11. Leuner, B., Fredericks, P. J., Nealer, C., Albin-Brooks, C. Chronic gestational stress leads to depressive-like behavior and compromises medial prefrontal cortex structure and function during the postpartum period. PLOS One. 9 (3), 89912 (2014).
  12. Kurata, A., Morinobu, S., Fuchikami, M., Yamamoto, S., Yamawaki, S. Maternal postpartum learned helplessness (LH) affects maternal care by dams and responses to the LH test in adolescent offspring. Hormones and Behavior. 56 (1), 112-120 (2009).
  13. Boccia, M. L., Pedersen, C. A. Brief vs. long maternal separations in infancy: Contrasting relationships with adult maternal behavior and lactation levels of aggression and anxiety. Psychoneuroendocrinology. 26 (7), 657-672 (2001).
  14. Boccia, M. L., et al. Repeated long separations from pups produce depression-like behavior in rat mothers. Psychoneuroendocrinology. 32 (1), 65-71 (2007).
  15. Nephew, B. C., Bridges, R. S. Effects of chronic social stress during lactation on maternal behavior and growth in rats. Stress. 14 (6), 677-684 (2011).
  16. Carini, L. M., Murgatroyd, C. A., Nephew, B. C. Using chronic social stress to model postpartum depression in lactating rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50324 (2013).
  17. Pardon, M., Gérardin, P., Joubert, C., Pérez-Diaz, F., Cohen-Salmon, C. Influence of prepartum chronic ultramild stress on maternal pup care behavior in mice. Biological Psychiatry. 47 (10), 858-863 (2000).
  18. Misdrahi, D., Pardon, M. C., Pérez-Diaz, F., Hanoun, N., Cohen-Salmon, C. Prepartum chronic ultramild stress increases corticosterone and estradiol levels in gestating mice: Implications for postpartum depressive disorders. Psychiatry Research. 137 (12), 123-130 (2005).
  19. Zoubovsky, S. P., et al. Chronic psychosocial stress during pregnancy affects maternal behavior and neuroendocrine function and modulates hypothalamic CRH and nuclear steroid receptor expression. Translational Psychiatry. 10 (6), 1-13 (2020).
  20. Yim, I. S., et al. Biological and psychosocial predictors of postpartum depression: systematic review and call for integration. Annual Review of Clinical Psychology. 11, 99-137 (2015).
  21. Slomian, J., Honvo, G., Emonts, P., Reginster, J. Y., Bruyere, O. Consequences of maternal postpartum depression: a systematic review of maternal and infant outcomes. Women's Health. 15, 1-55 (2019).
  22. Chow, K. H., Yan, Z., Wu, W. L. Induction of maternal immune activation in mice at mid-gestation stage with viral mimic poly(I:C). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53643 (2016).
  23. Zalaquett, C., Thiessen, D. The effects of odors from stressed mice on conspecific behavior. Physiology and Behavior. 50 (1), 221-227 (1991).
  24. Burstein, O., Doron, R. The unpredictable chronic mild stress protocol for inducing anhedonia in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58184 (2018).
  25. Zheng, H. T., et al. The detrimental effects of stress-induced glucocorticoid exposure on mouse uterine receptivity and decidualization. FASEB Journal: Official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (11), 14200-14216 (2020).
  26. Mueller, B. R., Bale, T. L. Sex-specific programming of offspring emotionality after stress early in pregnancy. Journal of Neuroscience. 28 (36), 9055-9065 (2008).
  27. Bale, T. L. The placenta and neurodevelopment: sex differences in prenatal vulnerability. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18 (4), 459-464 (2016).
  28. Herman, J. P., Tasker, J. G. Paraventricular hypothalamic mechanisms of chronic stress adaptation. Frontiers in Endocrinology. 7, Lausanne. 137-147 (2016).
  29. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLOS One. 7 (4), 35538 (2012).
  30. Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. Use of ultrasound imaging for early diagnosis of pregnancy and determination of litter size in the mouse. Laboratory Animals. 43 (1), 91-95 (2009).
  31. Froberg-Fejko, K., Lecker, J. Using environmental enrichment and nutritional supplementation to improve breeding success in rodents. Lab Animal (NY). 45 (1), 406-407 (2016).
  32. Perani, C. V., Neumann, I. D., Reber, S. O., Slattery, D. A. High-fat diet prevents adaptive peripartum-associated adrenal gland plasticity and anxiolysis. Scientific Reports. 5, 14821-14831 (2015).
  33. Nugent, B. M., Bale, T. L. The omniscient placenta: metabolic and epigenetic regulation of fetal programming. Frontiers in Neuroendocrinology. 39, 28-37 (2015).

Tags

התנהגות גיליון 172 מתח פסיכו-סוציאלי כרוני הריון התנהגות תפקוד נוירואנדוקריני מצב רוח פרינטלי והפרעות חרדה
שימוש במודל מורין של מתח פסיכו-סוציאלי בהריון כפרדיגמה רלוונטית לתרגום להפרעות פסיכיאטריות אצל אמהות ותינוקות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zoubovsky, S. P., Wilder, A.,… More

Zoubovsky, S. P., Wilder, A., Muglia, L. Using a Murine Model of Psychosocial Stress in Pregnancy as a Translationally Relevant Paradigm for Psychiatric Disorders in Mothers and Infants. J. Vis. Exp. (172), e62464, doi:10.3791/62464 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter