Summary
Il paradigma dello stress psicosociale cronico (CGS) impiega fattori di stress clinicamente rilevanti durante la gravidanza nei topi per modellare i disturbi psichiatrici di madri e neonati. Qui, forniamo una procedura passo-passo per applicare il paradigma CGS e le valutazioni a valle per convalidare questo modello.
Abstract
Il periodo peripartum è considerato un periodo sensibile in cui le esposizioni materne avverse possono comportare conseguenze negative a lungo termine sia per la madre che per la prole, incluso lo sviluppo di disturbi neuropsichiatrici. I fattori di rischio legati all'emergere della disregolazione affettiva nella diade materno-infantile sono stati ampiamente studiati. L'esposizione allo stress psicosociale durante la gravidanza è costantemente emersa come uno dei predittori più forti. Diversi modelli di roditori sono stati creati per esplorare questa associazione; tuttavia, questi modelli si basano sull'uso di fattori di stress fisici o di un numero limitato di fattori di stress psicosociali presentati in modo ripetitivo, che non catturano con precisione il tipo, l'intensità e la frequenza dei fattori di stress sperimentati dalle donne. Per superare queste limitazioni, è stato generato un paradigma di stress psicosociale cronico (CGS) che impiega vari insulti psicosociali di diversa intensità presentati in modo imprevedibile. Il manoscritto descrive questo nuovo paradigma CGS in cui le topi femmine gravide, dal giorno gestazionale 6,5 al 17,5, sono esposte a vari fattori di stress durante il giorno e durante la notte. I fattori di stress diurni, due al giorno separati da una pausa di 2 ore, vanno dall'esposizione a oggetti estranei o odore di predatore a frequenti cambiamenti nella biancheria da letto, rimozione della biancheria da letto e inclinazione della gabbia. I fattori di stress durante la notte includono l'esposizione continua alla luce, il cambio dei compagni di gabbia o la lettiera bagnata. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'esposizione alla CGS provoca lo sviluppo di anomalie neuroendocrine e comportamentali materne, tra cui una maggiore reattività allo stress, l'emergere di modelli di assistenza materna frammentati, anedonia e comportamenti correlati all'ansia, caratteristiche fondamentali delle donne che soffrono di umore perinatale e disturbi d'ansia. Questo modello CGS, quindi, diventa uno strumento unico che può essere utilizzato per chiarire i difetti molecolari alla base della disregolazione affettiva materna, nonché i meccanismi trans-placentati che influenzano il neurosviluppo fetale e provocano conseguenze comportamentali negative a lungo termine nella prole.
Introduction
I meccanismi alla base di una maggiore suscettibilità ai disturbi neuropsichiatrici nelle madri e nei neonati a seguito di esposizioni materne avverse nel periodo peripartum rimangono in gran parte sconosciuti. Sostanziali alterazioni fisiologiche materne si verificano durante la gravidanza e il passaggio al periodo postpartum, compresi diversi adattamenti neuroendocrini che si ipotizza siano critici non solo per il neurosviluppo della prole sana ma anche per preservare la salute mentale materna1,2. A livello dell'asse ipotalamico ipotalamico surrenale materno (HPA), si osservano adattamenti sia nei livelli circadiani che indotti dallo stress del rilascio di glucocorticoidi, tra cui un ritmo più appiattito dell'attività dell'asse HPA diurno e una risposta smorzata dell'asse HPA ai fattori di stress acuti3,4,5. Dato che una maggiore attività dell'asse HPA è riportata in un sottogruppo di donne con disregolazione affettiva postpartum, tra cui un aumento dei livelli di glucocorticoidi circolanti e feedback negativo inibito6,7,8, l'esposizione a fattori di stress che provocano un aumento della reattività allo stress postpartum e prevengono gli adattamenti dell'asse HPA materno sono pensati per aumentare la suscettibilità ai disturbi neuropsichiatrici.
Per chiarire gli effetti dello stress sulla disregolazione affettiva nelle madri e nei neonati, sono stati generati diversi modelli di stress da roditori nel periodo peripartum. La maggior parte di questi modelli sono caratterizzati dall'applicazione di fattori di stress fisici che si traducono in sfide omeostatiche e alterazioni nello stato fisiologico della diga9, come lo stress cronico di contenimento10 e lo stress del nuoto durante lagestazione 11o l'esposizione allo shock postpartum12. Sebbene questi paradigmi abbiano dimostrato di provocare l'emergere di comportamenti depressivi postpartum e alterazioni nell'assistenza materna10,11,12,sono stati limitati dalla loro incapacità di catturare con precisione la natura psicosociale dei fattori di stress comunemente sperimentati dalle madri umane. Ciò diventa particolarmente importante quando si tenta di rivelare le conseguenze neuroendocrine dello stress cronico nel periodo peripartum, dato che si ritiene che l'elaborazione di diversi tipi di fattori di stress sia mediata da reti neurali variabili che orchestrano l'attivazione dell'asse HPA9.
Per superare questa limitazione, diversi gruppi hanno progettato paradigmi di stress che impiegano insulti psicosociali o una combinazione di fattori di stress fisici e psicosociali. Il modello di separazione materna, in cui le dighe sono separate dai suoi cuccioli per diverse ore al giorno durante il periodo postpartum13,14,e il modello di stress sociale cronico, in cui le dighe sono esposte a un intruso maschio in presenza delle loro cucciolate15,16,sono stati in grado di riprodurre l'emergere di anomalie nella cura materna e fenotipi depressivi associati a paradigmi di stress fisico. Il paradigma dello stress ultramild cronico, in cui le topi femmine gravide sono esposte a una varietà di insulti psicosociali, tra cui l'inclinazione della gabbia e l'illuminazione notturna, nonché insulti fisiologici sostanziali, come lo stress da contenimento e la restrizione alimentare, ha ulteriormente rivelato che l'esposizione a una natura mista di fattori di stress provoca anomalie nel comportamento materno, comprese le menomazioni nell'aggressività materna, così come la disregolazione nell'attività circadiana dell'asse HPA17,18. Coerentemente con questi risultati, un modello alternato di stress di contenimento e sovraffollamento durante la gestazione provoca aumenti dei livelli di corticosterone circadiano materno postpartum e alterazioni nell'assistenza materna, sebbene non si osservino differenze nella riattivazione dell'asse HPA dopo l'esposizione postpartum a nuovi insulti acuti1.
Un'espansione di questo lavoro, generando un paradigma di stress gestazionale che impiega molteplici insulti psicosociali presentati in modo imprevedibile e riduce al minimo l'uso di fattori di stress fisiologici. Gli studi hanno precedentemente dimostrato che questo paradigma di stress psicosociale cronico (CGS) provoca lo sviluppo della disfunzione dell'asse HPA materno, compresa una maggiore reattività allo stress nel primo periodo postpartum19. Questi cambiamenti sono associati ad anomalie nel comportamento materno, comprese alterazioni nella qualità delle cure materne ricevute dai cuccioli e l'emergere di comportamenti anedonici e ansiosi19, caratteristiche coerenti con l'umore perinatale e disturbi d'ansia20,21. Inoltre, l'aumento di peso della prole si riduce durante il periodo postnatale dopo l'esposizione in utero a CGS19,suggerendo che la CGS potrebbe avere persistenti effetti di programmazione negativi nelle generazioni future.
L'obiettivo nello sviluppo del paradigma CGS è stato quello di utilizzare principalmente fattori di stress clinicamente rilevanti, che catturano accuratamente il tipo, l'intensità e la frequenza degli insulti spesso associati alla disregolazione neuroendocrina e allo sviluppo dell'umore perinatale e dei disturbi d'ansia. Qui, lo studio fornisce un protocollo dettagliato su come sottoporre topi femmina gravidi a CGS, nonché valutazioni a valle che possono essere utilizzate per testare la validità del modello.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dall'Animal Care and Use Committee presso il Cincinnati Children's Medical Center ed erano in conformità con le linee guida del National Institutes of Health. L'accesso ad libitum al chow e all'acqua standard dei roditori è stato fornito in ogni momento ai topi, anche durante il paradigma CGS. I topi sono stati alloggiati su un ciclo luce-buio di 14 ore / 10 ore (luci su 06:00 h) se non diversamente specificato (cioè esposizione alle luci durante la notte).
1. Preparazione per gli accoppiamenti a tempo
- Almeno 2 settimane prima di allestire gli accoppiamenti a tempo, ospitare i topi femmina adulti insieme in una gabbia per topi standard (18,4 cm x 29,2 cm x 12,7 cm), quattro topi per gabbia. Etichetta ogni mouse femminile con un numero ID specifico tramite un marchio auricolare.
NOTA: per questo protocollo sono stati utilizzati topi femmina C57BL6 senza gravidanza precedente e tra i 3 ei 6 mesi di età. - Almeno 1 settimana prima di impostare gli accoppiamenti a tempo, ospitare individualmente i topi maschi adulti da utilizzare per l'accoppiamento.
2. Impostazione degli accoppiamenti a tempo
- Imposta gli accoppiamenti a tempo alle 18:00 h. Prendi due topi femmina e mettili all'interno di una gabbia che contiene un topo maschio alloggiato individualmente. Separare gli accoppiamenti cronos temporizzando la mattina seguente entro le ore 08:00.
3. Controllo della spina copulatoria, designata come giorno gestazionale 0,5 (G0,5)
- Immediatamente dopo aver separato gli accoppiamenti a tempo, verificare la presenza di un tappo copulatorio nei topi femmina. La presenza di una spina copulatoria segnerà G0.5. Lasciare che il mouse tenga la griglia metallica all'interno della gabbia e sollevarla delicatamente per la coda per visualizzare l'apertura vaginale.
NOTA: La presenza di un tappo copulatorio indica che si è verificata un'attività sessuale ma non garantisce una gravidanza. Quando si tenta di calcolare il numero di topi sperimentali necessari, aspettarsi che il 50% dei topi sia collegato da accoppiamenti a tempo e una gravidanza per tappare l'incidenza del 60% -70%. - Utilizzare un semplice esame visivo per identificare la presenza di un tappo copulatorio (una massa indurita biancastra opaca all'interno o leggermente sporgente dall'apertura vaginale). Se il tappo copulatorio non è facilmente identificabile da un semplice esame visivo, inserire delicatamente una sonda smussata nell'apertura vaginale. Identificare i tappi situati più indietro nella vagina dalla resistenza dell'inserimento della sonda.
- Separare i topi femmina con tappi copulatori e la casa del gruppo in gabbie standard per topi, da 3 a 4 topi per gabbia.
4. Prepararsi per il paradigma CGS
- Assegna in modo casuale gabbie che ospitano topi femmina con tappi copulatori in due gruppi su G5.5: controllo e gruppo CGS. Tentare di randomizzare le gabbie per avere un numero approssimativamente uguale di topi per gruppo. Trasferire i mouse per pulire le gabbie standard del mouse ed etichettare con un segno "non disturbare". Designare queste gabbie come "gabbie domestiche" per i topi per posizionarle alla fine di ciascun fattore di stress.
- Designare una stanza separata nella struttura del mouse per eseguire il paradigma CGS. Progettare un regime di stress di 11 giorni, che va da G6.5 a G17.5, per utilizzare ciascuno dei fattori di stress di 7 giorni [esposizione a oggetti estranei (biglie o lego), esposizione agli odori dei predatori (biancheria da letto sporca per topi), inclinazione della gabbia di 30 °, frequenti cambi di biancheria da letto, rimozione della biancheria da letto, movimento sullo shaker] due volte al giorno e per utilizzare ciascuno dei 3 fattori di stress notturni (luci notturne accese, cambio del compagno di gabbia, esposizione alla biancheria da letto bagnata) durante la notte in modo casuale. Per un possibile schema di esempio e uno schema degli esperimenti descritti di seguito, vedere la Figura 1.
NOTA: Ogni giorno il fattore di stress dovrebbe rientrare nel ciclo di luce dei topi (luci accese 06:00 h-20:00 h), e durare 2 h, con almeno una pausa di 2 ore tra i fattori di stress. Ogni fattore di stress notturno deve essere impostato all'inizio del ciclo buio (luci spente 20:00 h) e separato all'inizio del ciclo di luce (luci accese 06:00 h).
5. Esecuzione del paradigma CGS
- Impostare fattori di stress specifici su una gabbia statica standard con piano filtrato e bottiglia d'acqua nella stanza designata per il paradigma CGS. Preparare il numero di gabbie statiche necessarie per l'esperimento in base al numero di gabbie di topo designate per essere sottoposte a CGS durante la randomizzazione. Prima di avviare ogni fattore di stress, trasferire le gabbie per topi del gruppo CGS dalla stanza di alloggiamento alla stanza CGS.
NOTA: Eseguire la manipolazione / trasferimento dei topi dalla gabbia domestica alla gabbia sperimentale e di nuovo in cappe a flusso laminare. - Applicare i seguenti fattori di stress secondo il regime pre-progettato (fare riferimento al punto 4.2).
- Esposizione a oggetti estranei (biglie o lego): Posizionare sei biglie (14 mm di diametro) o sei lego (forme diverse, per non superare i 4 cm di altezza) distribuiti casualmente in una gabbia statica pulita con biancheria da letto per topi, senza includere i nidiacei del topo. Posizionare i topi insieme alle loro controparti della gabbia domestica nella gabbia statica con oggetti estranei per 2 ore. Riportare i topi nella loro gabbia di casa con le stesse controparti alla conclusione del fattore di stress.
NOTA: Pulire gli oggetti estranei dopo l'uso. - Esposizione agli odori dei predatori (lettiera sporca per topi): posizionare 1 cm di profondità della lettiera di ratto sporca fresca dei ratti femmine in una gabbia statica pulita senza lettiera per topi, senza includere i nidiacei del topo. Metti i topi insieme alle loro controparti della gabbia domestica nella gabbia statica con lettiera sporca per topi per 2 ore. Riportare i topi nella loro gabbia di casa con le stesse controparti alla conclusione del fattore di stress.
- Inclinazione della gabbia di 30 °: posizionare i topi con le loro controparti della gabbia domestica in una gabbia statica pulita con lettiera per topi, senza includere i nidiacei del topo. Inclinare la gabbia a 30° contro il muro per 2 ore. Riportare i topi nella loro gabbia di casa con le stesse controparti alla conclusione del fattore di stress.
- Frequenti cambi di biancheria da letto: posiziona i topi con le loro controparti della gabbia domestica in una gabbia statica pulita con lettiera per topi, senza includere i nidiacei del topo. Sostituire la biancheria da letto del mouse con una biancheria da letto pulita per mouse ogni 10 minuti per 2 ore. Durante i cambi di biancheria da letto del topo, posizionare delicatamente i topi in una gabbia pulita diversa per evitare il contatto diretto con i topi. Riportare i topi nella loro gabbia di casa con le stesse controparti alla conclusione del fattore di stress.
- Rimozione della lettiera: posizionare i topi insieme alle loro controparti della gabbia domestica in una gabbia statica pulita vuota (senza lettiera o nidiacei) per 2 ore. Riportare i topi nella loro gabbia di casa con le stesse controparti alla conclusione del fattore di stress.
- Movimento sullo shaker: posiziona i topi con le loro controparti della gabbia domestica in una gabbia statica pulita con biancheria da letto per topi, senza includere i nidiacei del topo. Posizionare la gabbia statica in cima a uno shaker da laboratorio reciproco impostato su 140 colpi al minuto per 2 ore. Riportare i topi nella loro gabbia di casa con le stesse controparti alla conclusione del fattore di stress.
- Esposizione notturna alle luci: posiziona i topi con le loro controparti della gabbia domestica in una gabbia statica pulita con lettiera per topi, senza includere i nidiacei del topo. Tenere le luci accese durante la notte (20:00 h-06:00 h) per interferire con il ciclo buio. Riportare i topi nella loro gabbia di casa con le stesse controparti alla conclusione del fattore di stress.
- Cambio del compagno di gabbia: trasferire il topo in una gabbia statica pulita con lettiera per topi che viene ospitata da un gruppo diverso di due topi femmina (femmine intatte non parte del trattamento o del gruppo di controllo). Tieni il mouse nella gabbia statica con compagni di gabbia sconosciuti durante la notte. Riportare il topo nella sua gabbia domestica con le sue controparti specifiche della gabbia domestica alla conclusione del fattore di stress.
- Esposizione alla lettiera bagnata: riempire la gabbia statica con lettiera per topi con acqua pulita mantenuta a 24 °C fino a quando la lettiera non è satura di acqua. Metti i topi insieme alle loro controparti della gabbia domestica nella gabbia statica con lettiera bagnata durante la notte. Riportare i topi nella loro gabbia di casa con le stesse controparti alla conclusione del fattore di stress.
- Esposizione a oggetti estranei (biglie o lego): Posizionare sei biglie (14 mm di diametro) o sei lego (forme diverse, per non superare i 4 cm di altezza) distribuiti casualmente in una gabbia statica pulita con biancheria da letto per topi, senza includere i nidiacei del topo. Posizionare i topi insieme alle loro controparti della gabbia domestica nella gabbia statica con oggetti estranei per 2 ore. Riportare i topi nella loro gabbia di casa con le stesse controparti alla conclusione del fattore di stress.
- Durante il paradigma CGS, mantieni i topi di controllo indisturbati nelle loro gabbie domestiche all'interno della stanza abitativa.
- Sostituire le gabbie domestiche usate con nuove gabbie domestiche su G10.5. Su G17.5, a conclusione del fattore di stress notturno, ha fatto da solo tutti i topi sperimentali per prepararsi al parto e alle valutazioni funzionali a valle.
6. Monitoraggio dei topi sperimentali durante il paradigma CGS
- Monitorare i topi ogni 1 ora durante l'applicazione del fattore di stress, tranne durante i fattori di stress notturni.
- Escludere dall'esperimento i topi che mostrano segni di angoscia, tra cui ferite, letargia o qualsiasi anomalia fisica. Contattare il personale veterinario se necessario.
7. Misurazione della percentuale di aumento di peso corporeo durante la gestazione nei topi sperimentali (opzionale)
- Su G6.5, pesare i topi individualmente prima dell'esposizione a fattori di stress. Su G17.5, al termine del fattore di stress notturno, pesare i topi individualmente. Pesare i topi di controllo nei punti temporali gestazionali equivalenti.
- Misurare la percentuale di aumento di peso corporeo durante la gestazione impostando il peso del primo giorno del paradigma CGS (G6.5) al 100%.
8. Misurazione del peso relativo della ghiandola surrenale postpartum nei topi sperimentali (opzionale)
- Il giorno 2 postpartum (PP2), pesare il controllo e le dighe CGS individualmente. Eutanasia delle dighe per inalazione di anidride carbonica seguita da lussazione cervicale in una cappa aspirante.
- Posizionare i topi su una piastra di dissezione, sterilizzare la zona addominale con il 70% di etanolo e aprire la cavità addominale usando le forbici per effettuare un taglio verticale. Isolare le ghiandole surrenali situate adiacenti al polo anteriore dei reni con una pinna, bilateralmente. Sezionare attentamente il tessuto adiposo che circonda le ghiandole surrenali sotto un microscopio di dissezione.
- Pesare le ghiandole surrenali bilaterali individualmente. Calcola i pesi relativi della ghiandola surrenale in milligrammi per grammo (peso totale delle ghiandole surrenali destra e sinistra / peso corporeo).
9. Misurazione dell'attività dell'asse surrenale ipotalamico postpartum (HPA) nei topi sperimentali (opzionale)
- In preparazione per le misurazioni dell'asse HPA, eutanasizzare le cucciolate a 6 cuccioli per cucciolata il giorno 0 postpartum (PP0). Utilizzare l'inalazione di anidride carbonica, seguita dalla decapitazione con forbici chirurgiche come metodo secondario di eutanasia.
- Il giorno 2 postpartum (PP2), frenare individualmente il controllo e le dighe CGS all'interno di un tubo conico in polipropilene da 50 mL ben ventilato per 20 minuti. Immediatamente dopo lo stress di contenimento, rimuovere il mouse dal tubo conico e trattenere il mouse con la mano non dominante tenendo la pelle sciolta sopra le spalle e posteriore alle orecchie per avere la pelle sopra la mandibola tesa.
- Perforare la vena sottomandibolare con una lancetta leggermente dietro la mandibola ma anteriore al condotto uditivo. Raccogliere fino a 100 μL di sangue materno in un tubo separatore sierico. Dopo la raccolta del campione, applicare una leggera pressione con una garza al sito di puntura per fermare l'emorragia. Riportare le dighe nella gabbia di casa una volta che l'emorragia si ferma.
- Centrifugare il tubo separatore di siero a 21.130 x g per 6 minuti e rimuovere con cura il siero. Conservare il siero a -20 °C per un uso successivo. Misurare la concentrazione sierica di corticosterone con un kit ELISA seguendo il protocollo del produttore.
10. Misurazione dei cambiamenti comportamentali postpartum nei topi sperimentali (opzionale)
- Per prepararsi all'analisi comportamentale, abbattere le cucciolate a 6 cuccioli per cucciolata su PP0.
- Eseguire analisi della frammentazione dell'assistenza materna da PP2 a PP5. Ogni giorno, durante il ciclo di luce, esporre le dighe alla sala prove per un periodo di assuefazione di 5 minuti prima di filmare il comportamento materno per un periodo di 30 minuti.
- Valutare la frammentazione dell'assistenza materna misurando la lunghezza media di un singolo incontro di leccatura / toelettatura e il numero totale di attacchi eseguiti dalle dighe19.
NOTA: Il comportamento di leccatura / toelettatura è definito come un comportamento in cui la diga sta prendendo contatto con il corpo del cucciolo con la lingua, o il cucciolo viene maneggiato dalla diga con le zampe. Un incontro è definito come un periodo di tempo ininterrotto in cui la diga è impegnata a leccare / governare i suoi cuccioli.
- Valutare la frammentazione dell'assistenza materna misurando la lunghezza media di un singolo incontro di leccatura / toelettatura e il numero totale di attacchi eseguiti dalle dighe19.
- Eseguire l'analisi dell'anedonia tramite test di preferenza del saccarosio (SPT) da PP0 a PP6. Esporre le dighe a una bottiglia da 100 ml di acqua pulita e una bottiglia da 100 ml di soluzione di saccarosio al 4% nella loro gabbia domestica. Misurare la quantità di acqua e saccarosio consumati (in ml) al giorno. Intercambiare il posizionamento della bottiglia nella gabbia di casa. Calcola la preferenza del saccarosio utilizzando le medie degli ultimi 4 giorni: preferenza % = [(consumo di saccarosio / saccarosio + consumo di acqua) x 100].
- Esegui l'analisi del comportamento ansioso tramite un labirinto zero elevato (EZM) su PP8. Posizionare le dighe individualmente sull'apparato EZM costituito da due quadranti chiusi e due quadranti aperti sollevati dal pavimento. Lascia che le dighe esplorino il labirinto indisturbato per 5 minuti. Quantificare il tempo trascorso nel quadrante aperto e il numero di voci nei quadranti aperti.
11. Misurazione delle variazioni di peso postnatale della prole (opzionale)
- Per prepararsi all'analisi del peso della prole, abbattere le cucciolate a 6 cuccioli per cucciolata il giorno della nascita (giorno postnatale 0, PN0).
- Registrare il peso dei cuccioli su PN0 e in diversi punti temporali durante il periodo postnatale (PN2, 7, 15, 21).
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Representative Results
L'esposizione delle tope femmine gravide alla CGS provoca cambiamenti nei parametri cronici rilevanti per lo stress, tra cui una riduzione dell'aumento di peso corporeo durante la gravidanza (Figura 2A) e un aumento del peso delle ghiandole surrenali nel primo periodo postpartum (Figura 2B)19. È importante sottolineare che l'esposizione alla CGS provoca anomalie postpartum nella funzione neuroendocrina materna. Le dighe CGS mostrano un asse HPA iperattivo, come evidenziato dall'aumento dei livelli sierici di corticosterone a seguito dell'applicazione di un nuovo insulto acuto (Figura 3)19.
L'esposizione delle topi femmine gravide alla CGS provoca ulteriori anomalie comportamentali nel primo periodo postpartum che sembrano riflettere l'emergere di un fenotipo depressivo. Le dighe CGS mostrano alterazioni nell'assistenza materna come riflesso da un aumento del grado di frammentazione dei segnali materni ricevuti dai cuccioli. La durata media degli attacchi di leccatura/toelettatura è ridotta e associata ad un aumento del numero medio di attacchi successivi a CGS, indicando numerosi brevi episodi di comportamento nutritivo (Figura 4A,B)19. La preferenza per il saccarosio è anche depressa nelle dighe CGS rispetto alle dighe di controllo, suggerendo la presenza di anedonia (Figura 4C)19. Infine, le dighe CGS mostrano anche un aumento dei comportamenti legati all'ansia misurato da una riduzione del tempo trascorso nei quadranti aperti dell'EZM rispetto alle dighe di controllo (Figura 4D)19.
Nella prole, l'esposizione alla CGS in utero provoca una diminuzione dell'aumento di peso durante il periodo postnatale, dal giorno 7 al 21 postnatale, sebbene non si osservino cambiamenti alla nascita. Questa riduzione dell'aumento di peso corporeo è presente nella prole di entrambi i sessi (Figura 5)19. Da notare, il paradigma CGS non ha avuto alcun effetto sulla lunghezza gestazionale, sulle dimensioni della cucciolata o sul rapporto tra i sessi per cucciolata (dati non mostrati)19.
Figura 1: Schema del paradigma CGS e valutazioni funzionali per la validazione. Questa cifra è stata modificata da Zoubovsky, S.P. et al.19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Cambiamenti nei parametri cronici legati allo stress nelle dighe in seguito all'esposizione a CGS. (A) Variazioni del peso corporeo da G6.5-G17.5, Controllo = 17, CGS = 17. (B) Pesi relativi della ghiandola surrenale materna a PP2, Controllo = 20, CGS = 15. Dati presentati come media + SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Questa cifra è stata modificata da Zoubovsky, S.P. et al.19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Misurazioni dell'asse HPA materno dopo l'esposizione al CGS. Livelli sierici di corticosterone materno misurati dopo 20 minuti di stress di contenimento su PP2, Controllo = 8, CGS = 5. Dati presentati come media + SEM. *p < 0,05. Questa cifra è stata modificata da Zoubovsky, S.P. et al.19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Cambiamenti comportamentali nel primo periodo postpartum nelle dighe a seguito dell'esposizione a CGS. (A) Durata media e (B) numero di attacchi di leccatura /toelettatura registrati da PP2-PP5, Controllo = 17, CGS = 17. (C) Percentuale di preferenza saccarosio in SPT, Controllo = 17, CGS = 19. (D) Quantità totale di tempo trascorso nel quadrante aperto di EZM durante il periodo di 5 minuti, Controllo = 17, CGS = 19. Dati presentati come media + SEM *p < 0,05, **p < 0,01. Questa cifra è stata modificata da Zoubovsky, S.P. et al.19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Variazioni del peso corporeo della prole durante lo sviluppo postnatale a seguito dell'esposizione in utero alla CGS. Il peso corporeo della prole misurato da PN0 a PN21, Controllo = 17 cucciolate, CGS = 17 cucciolate. Dati presentati come media + SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Questa cifra è stata modificata da Zoubovsky, S.P. et al.19. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'esposizione delle topi gravide alla CGS perturba la funzione neuroendocrina materna postpartum, compresa la risposta dell'asse HPA a nuovi fattori di stress, ed è associata a varie anomalie comportamentali rilevanti per l'umore perinatale e i disturbi d'ansia. Dato che il modello impiega l'utilizzo di un fattore di rischio ambientale, si prevede una variazione fenotipica più elevata di quella altrimenti osservata nei modelli genetici22. Tuttavia, i risultati ottenuti dall'applicazione del paradigma CGS possono essere coerenti tra i laboratori di ricerca se si presta attenzione a ridurre al minimo le variabili che possono confondere i risultati.
I passaggi critici nel protocollo includono passaggi relativi alle pratiche di allevamento generali, tra cui topi di controllo dell'alloggiamento separati dai topi CGS e fasi di accoppiamento a tempo. Il controllo co-housing e i topi CGS potrebbero di per sé essere uno stimolo stressante per il gruppo di controllo e quindi confondere i risultati neuroendocrini o comportamentali23,24. Allo stesso modo, l'avvio di esperimenti con topi gravidi spediti dal fornitore non è raccomandato. Per massimizzare l'efficienza degli accoppiamenti a tempo, si consiglia di ospitare topi femmina adulti insieme almeno 2 settimane prima di impostare accoppiamenti temporizzati per sincronizzare i loro cicli di estro. Allo stesso modo, l'uso di topi maschi adulti sessualmente esperti e la prevenzione dei maschi dall'accoppiamento almeno 1 settimana prima di impostare accoppiamenti a tempo massimizzeranno la loro fertilità e aumenteranno il potenziale per gravidanze di successo. Anche la linea temporale del paradigma CGS deve essere seguita attentamente. L'applicazione di questi fattori di stress di varia intensità troppo presto nella gestazione potrebbe influenzare la decidualizzazione uterina e inibire l'impianto dell'embrione25. L'esposizione allo stress durante diverse finestre temporali gestazionali è stata anche trovata per portare un rischio di malattia dello sviluppo neurologico specifico per sesso variabile per la prole, in cui la prole maschile è significativamente più vulnerabile della prole femminile ai fattori di stress durante la gestazione precoce26,27. Il programma CGS deve essere progettato in modo tale da garantire l'imprevedibilità per prevenire lo sviluppo di meccanismi di adattamento e acclimatazione spesso associati a ripetute esposizioni a fattori di stress prevedibili28. Infine, le cucciolate dovrebbero essere ridotte a sei cuccioli il giorno della nascita per garantire condizioni comparabili in tutte le dighe e impedire che le variabilità delle dimensioni della cucciolata confondano l'ormone materno o l'analisi del comportamento. Allo stesso modo, diverse coorti dovrebbero essere impiegate per valutazioni neuroendocrine e comportamentali per ridurre al minimo gli effetti confondenti dello stress di contenimento e delle emorragie sottomandibolari sul comportamento. Diverse coorti dovrebbero anche essere utilizzate per la valutazione dell'assistenza materna e l'analisi di altri parametri comportamentali per ridurre al minimo l'interruzione dell'interazione materna con i cuccioli.
Esistono diverse limitazioni al protocollo corrente. L'incapacità di prevedere con precisione il numero di topi gravidi prima dell'inizio del paradigma CGS può rappresentare un notevole onere finanziario e di uso animale. Potrebbero essere apportate modifiche al protocollo per ottenere un successo più prevedibile con accoppiamenti a tempo, compresa la valutazione della citologia vaginale per identificare i topi nella fase dell'estro, dove sia l'accoppiamento che l'ovulazione si verificano in genere29. L'esame ecografico dei topi potrebbe anche essere incorporato nel paradigma CGS come tecnica alternativa non invasiva per identificare con precisione le gravidanze fin dalle primissime fasi dellagestazione 30. L'uso di chow da riproduzione speciale, con un maggiore contenuto di grassi, è stato impiegato anche da altri gruppi per migliorare il successo dell'accoppiamento31. Tuttavia, è necessario prestare attenzione quando si istituono cambiamenti nella dieta, dato che ciò potrebbe influenzare la reattività e il comportamento dello stress materno32. Inoltre, l'attuale protocollo ha dimostrato di essere efficace nei topi C57BL/6 wild-type, ma potrebbero essere necessarie modifiche del protocollo per diversi ceppi o background genetici e specie, poiché potrebbero avere grandi variazioni nella sensibilità allo stress, nella cura materna e nella regolazione emotiva.
Rispetto ai modelli di stress peripartum attualmente esistenti, il paradigma CGS si rivela più rilevante dal punto di vista traslazionale dati i conseguenti endofenotipi rilevanti per la malattia osservati, tra cui una maggiore reattività allo stress materno e anomalie postpartum nell'assistenza materna, nell'anedonia e nell'ansia. Queste alterazioni sembrano ricapitolare i risultati clinici associati all'umore perinatale e ai disturbi d'ansia. Le applicazioni future di questo modello includono l'utilizzo del paradigma CGS per identificare gli effetti specifici del sesso dello stress psicosociale materno sullo sviluppo del cervello della prole e sulla suscettibilità alle malattie. Lo studio degli effetti della CGS sulla funzione placentare dovrebbe essere considerato, dato che la disfunzione nelle funzioni placentari chiave ha dimostrato di avere un impatto sullo sviluppo del cervello fetale33. Incorporare esperimenti di cross-fostering con il paradigma CGS aiuterebbe ulteriormente a comprendere i contributi individuali nell'esposizione alla CGS in utero e i cambiamenti ormonali ormonali materni associati rispetto alle anomalie postpartum nel comportamento nutritivo nel plasmare lo sviluppo emotivo della prole.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano riconoscere il sostegno del National Institute of General Medical Sciences T32 GM063483-14 grant e della Cincinnati Children's Research Foundation. Per i dati adattati da Zoubovsky et al., 2019, Creative Common License può essere trovato nella seguente posizione: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal lancet | Braintree Scientific Inc. | GR4MM | |
| Blunt end probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Used to check for copulatory plugs |
| Bottles for SPT | Braintree Scientific Inc. | WTRBTL S-BL | 100 mL glass water bottle with stopper and sipper ball point tube, graduted by 1 mL. |
| Conical tubes (50 mL) | Corning Inc. | 352098 | Used for restraining mice to measure HPA axis response to acute stress. Make sure conical tube has small opening at the end for ventilation. |
| Legos | Amazon | - | |
| Marbles | Amazon | - | |
| Mouse Corticosterone ELISA kit | Biovendor | RTC002R | |
| Mouse EZM | TSE Systems | - | |
| Reciprocal laboratory shaker | Labnet international | S2030-RC-B | |
| Serum separator tubes | Becton Dickinson | 365967 | |
| Static cage- bottom | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | RC71D-PC | |
| Static cage - filtered ventilated tops | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | FT71H-PC |
References
- Hillerer, K. M., Reber, S. O., Neumann, I. D., Slaterry, D. A. Exposure to chronic pregnancy stress reverses peripartum-associated adaptations: implications for postpartum anxiety and mood disorders. Endocrinology. 152 (10), 3930-3940 (2011).
- Hillerer, K. M., Neumann, I. D., Slaterry, D. A. From stress to postpartum mood and anxiety disorders: how chronic peripartum stress can impair maternal adaptations. Neuroendocrinology. 95 (1), 22-38 (2018).
- Altemus, M., Deuster, P. A., Galliven, E., Carter, C. S., Gold, P. W. Suppression of hypothalamic-pituitary-adrenal axis responses to stress in lactating women. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 80 (10), 2954-2959 (1995).
- Slattery, D. A., Neumann, I. D. No stress please! Mechanisms of stress hyporesponsiveness of the maternal brain. The Journal of Physiology. 586 (2), 377-385 (2008).
- Hasiec, M., Misztal, T. Adaptive modifications of maternal hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity during lactation and salsolinol as a new player in this phenomenon. International Journal of Endocrinology. 10 (2), 1-11 (2018).
- Bloch, M., et al. Cortisol response to ovine corticotropin-releasing hormone in a model of pregnancy and parturition in euthymic women with and without a history of postpartum depression. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (2), 695-699 (2005).
- Jolley, S. N., Elmore, S., Barnard, K. E., Carr, D. B. Dysregulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in postpartum depression. Biological Research for Nursing. 8 (3), 210-222 (2007).
- Nierop, A., Bratsikas, A., Zimmermann, R., Ehlert, U. Are stress-induced cortisol changes during pregnancy associated with postpartum depressive symptoms. Psychosomatic Medicine. 68 (6), 931-937 (2006).
- Ulrich-Lai, Y. M., Herman, J. P. Neural regulation of endocrine and autonomic stress responses. Nature Reviews Neuroscience. 10 (6), 397-409 (2009).
- Smith, J. W., Seckl, J. R., Evans, A. T., Costall, B., Smythe, J. W. Gestational stress induces post-partum depression-like behavior and alters maternal care in rats. Psychoneuroendocrinology. 29 (2), 227-244 (2004).
- Leuner, B., Fredericks, P. J., Nealer, C., Albin-Brooks, C. Chronic gestational stress leads to depressive-like behavior and compromises medial prefrontal cortex structure and function during the postpartum period. PLOS One. 9 (3), 89912 (2014).
- Kurata, A., Morinobu, S., Fuchikami, M., Yamamoto, S., Yamawaki, S. Maternal postpartum learned helplessness (LH) affects maternal care by dams and responses to the LH test in adolescent offspring. Hormones and Behavior. 56 (1), 112-120 (2009).
- Boccia, M. L., Pedersen, C. A. Brief vs. long maternal separations in infancy: Contrasting relationships with adult maternal behavior and lactation levels of aggression and anxiety. Psychoneuroendocrinology. 26 (7), 657-672 (2001).
- Boccia, M. L., et al. Repeated long separations from pups produce depression-like behavior in rat mothers. Psychoneuroendocrinology. 32 (1), 65-71 (2007).
- Nephew, B. C., Bridges, R. S. Effects of chronic social stress during lactation on maternal behavior and growth in rats. Stress. 14 (6), 677-684 (2011).
- Carini, L. M., Murgatroyd, C. A., Nephew, B. C. Using chronic social stress to model postpartum depression in lactating rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50324 (2013).
- Pardon, M., Gérardin, P., Joubert, C., Pérez-Diaz, F., Cohen-Salmon, C. Influence of prepartum chronic ultramild stress on maternal pup care behavior in mice. Biological Psychiatry. 47 (10), 858-863 (2000).
- Misdrahi, D., Pardon, M. C., Pérez-Diaz, F., Hanoun, N., Cohen-Salmon, C. Prepartum chronic ultramild stress increases corticosterone and estradiol levels in gestating mice: Implications for postpartum depressive disorders. Psychiatry Research. 137 (12), 123-130 (2005).
- Zoubovsky, S. P., et al. Chronic psychosocial stress during pregnancy affects maternal behavior and neuroendocrine function and modulates hypothalamic CRH and nuclear steroid receptor expression. Translational Psychiatry. 10 (6), 1-13 (2020).
- Yim, I. S., et al. Biological and psychosocial predictors of postpartum depression: systematic review and call for integration. Annual Review of Clinical Psychology. 11, 99-137 (2015).
- Slomian, J., Honvo, G., Emonts, P., Reginster, J. Y., Bruyere, O. Consequences of maternal postpartum depression: a systematic review of maternal and infant outcomes. Women's Health. 15, 1-55 (2019).
- Chow, K. H., Yan, Z., Wu, W. L. Induction of maternal immune activation in mice at mid-gestation stage with viral mimic poly(I:C). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53643 (2016).
- Zalaquett, C., Thiessen, D. The effects of odors from stressed mice on conspecific behavior. Physiology and Behavior. 50 (1), 221-227 (1991).
- Burstein, O., Doron, R. The unpredictable chronic mild stress protocol for inducing anhedonia in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58184 (2018).
- Zheng, H. T., et al. The detrimental effects of stress-induced glucocorticoid exposure on mouse uterine receptivity and decidualization. FASEB Journal: Official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (11), 14200-14216 (2020).
- Mueller, B. R., Bale, T. L. Sex-specific programming of offspring emotionality after stress early in pregnancy. Journal of Neuroscience. 28 (36), 9055-9065 (2008).
- Bale, T. L. The placenta and neurodevelopment: sex differences in prenatal vulnerability. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18 (4), 459-464 (2016).
- Herman, J. P., Tasker, J. G. Paraventricular hypothalamic mechanisms of chronic stress adaptation. Frontiers in Endocrinology. 7, Lausanne. 137-147 (2016).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLOS One. 7 (4), 35538 (2012).
- Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. Use of ultrasound imaging for early diagnosis of pregnancy and determination of litter size in the mouse. Laboratory Animals. 43 (1), 91-95 (2009).
- Froberg-Fejko, K., Lecker, J. Using environmental enrichment and nutritional supplementation to improve breeding success in rodents. Lab Animal (NY). 45 (1), 406-407 (2016).
- Perani, C. V., Neumann, I. D., Reber, S. O., Slattery, D. A. High-fat diet prevents adaptive peripartum-associated adrenal gland plasticity and anxiolysis. Scientific Reports. 5, 14821-14831 (2015).
- Nugent, B. M., Bale, T. L. The omniscient placenta: metabolic and epigenetic regulation of fetal programming. Frontiers in Neuroendocrinology. 39, 28-37 (2015).
