Summary
Fenolsyrer er viktige fytokjemikalier som er tilstede i fullkorn. De har bioaktive egenskaper som antioksidantbeskyttende funksjoner. Dette arbeidet tar sikte på å rapportere om en generalisert metode for HPLC-identifisering, total fenolisk innholdsestimering og bestemmelse av antioksidantkapasiteten til fenolsyrer i korn og belgfrukter.
Abstract
Fenolsyrer er en klasse organiske forbindelser som bærer både en fenolgruppe og en karboksylgruppe. De finnes i korn og konsentrerer seg i kli av frokostblandinger eller frøbelegg av belgfrukter. De har antioksidantegenskaper som har generert mye forskningsinteresse de siste årene, om deres potensielle antioksidantbeskyttende helsefunksjoner. Dette arbeidet presenterer en generalisert metode for utvinning av frie oppløselige fenolsyrer fra fullkorn og analyse av deres antioksidantkapasitet. Fem fullkornsprøver bestående av to kornblandinger (hvete og gul mais) og tre belgfrukter (cowpea bønne, nyrebønner og soyabønner), ble brukt. Kornene ble malt i mel og deres frie oppløselige fenolsyrer ekstrahert ved hjelp av vandig metanol. Forbindelsene ble deretter identifisert ved hjelp av en høytrykks væskekromatografi (HPLC). Folin-Ciocalteu-metoden ble brukt til å bestemme deres totale fenoliske innhold mens deres antioksidantkapasitet ble bestemt ved hjelp av DPPH radikal scavenging kapasitet, Trolox tilsvarende antioksidant kapasitet (TEAC) og oksygen radikal absorbans kapasitet (ORAC) analyser. Fenolsyrene som ble identifisert inkluderte vanillsyre, koffeinsyre, p-coumarinsyrer og ferulinsyrer. Vanillsyre ble identifisert bare i cowpea mens koffeinsyre ble identifisert bare i nyrebønner. p-coumarinsyre ble identifisert i gul mais, cowpea og soyabønne, mens ferulinsyre ble identifisert i alle prøvene. Ferulinsyre var den dominerende fenolsyren identifisert. Den totale konsentrasjonen av fenolsyrer i prøvene ble redusert i følgende rekkefølge: soyabønne > cowpea bønne > gul mais = nyrebønner > hvete. Den totale antioksidantkapasiteten (summen av verdier av DPPH, TEAC og ORAC analyser) redusert som følger: soyabønne > nyrebønne > gul mais = cowpea bønne > hvete. Denne studien konkluderte med at HPLC-analyse samt DPPH-, TEAC- og ORAC-analyser gir nyttig informasjon om fenolsyresammensetningen og antioksidantegenskapene til fullkorn.
Introduction
Fenolsyrer er blant de viktigste fytokjemikaliene som studeres i planter på grunn av den vitale rollen de spiller i planteforsvar mot plantelevende og soppinfeksjon, samt opprettholde strukturell støtte og integritet i plantevev 1,2. De er rikelig i kli av frokostblandinger og frøbelegg av belgfrukter3. Strukturelt er de delt inn i to grupper: hydroksybenzosyrene (figur 1) og hydroksycinnamic syrer (figur 2). De vanlige hydroksybenzosyrene i korn og belgfrukter inkluderer gallisk, p-hydroksybenzosyre, 2,4-dihydroksybenzosyre, protocatechuic, vanillic og syringssyrer, mens de vanlige hydroksycinnamic syrer inkluderer koffeinsyre, p-coumaric, ferulic og sinapic syrer3. Fenolsyrer har også antioksidantegenskaper siden de er i stand til å scavenge frie radikaler, noe som forårsaker oksidativ rancidity i fett, og initiere og forplante radikalt indusert oksidativt stress i fysiologiske systemer 4,5. På grunn av denne vitale fysiologiske rollen som antioksidanter, er de gjenstand for nyere forskning. Dette skyldes at når de forbrukes som komponenter av plantefôr, kan de utøve antioksidantbeskyttelse.
Korn og frokostblandinger er store karbohydratmatkilder for mennesker og dyr over hele verden6. Korn inkluderer hvete, ris, mais (mais), bygg, triticale, hirse og sorghum. Blant dem er mais mest utnyttet, med en estimert global utnyttelse på 1.135,7 millioner tonn i 2019/2020, etterfulgt av hvete med en estimert global utnyttelse på 757,5 millioner tonn i samme periode7. Kornmat er gode energikilder for forbrukerne siden de er rike kilder til karbohydrater. De gir også noe protein, fett, fiber, vitaminer og mineraler6. I tillegg til næringsverdien er korn gode kilder til fytokjemiske antioksidanter, spesielt fenolsyrer, som har potensial til å beskytte det fysiologiske systemet mot radikalindusert oksidativ skade3. Belgfrukter er også gode kilder til næringsstoffer og er generelt høyere i protein enn frokostblandinger. De inneholder også vitaminer og mineraler og brukes til fremstilling av ulike matvarer8. I tillegg er belgfrukter gode kilder til en rekke fytokjemiske antioksidanter, inkludert fenolsyrer, flavonoider, antocyaniner og proanthocyanidiner 9,10. Ulike varianter av frokostblandinger og belgfrukter kan ha en annen fenolsyresammensetning. Det er derfor behov for å studere fenolsyresammensetningen av korn og belgfrukter og deres varianter, for å vite deres potensielle helsemessige fordeler med hensyn til fenoliske antioksidanter.
En rekke analyser er rapportert for å måle mengden fenolsyrer i korn- og belgfruktkorn, og bestemme deres antioksidantaktiviteter. De vanligste analysemetodene for fullkorns fenolsyrer er spektrofotometri og flytende kromatografi11. Målet med dette arbeidet var å demonstrere en generalisert høytrykks væskekromatografisk metode for å bestemme fri løselig fenolsyresammensetning, og spektrofotometriske metoder for å bestemme totalt fenolinnhold og antioksidantkapasitet av noen fullkornskorn og belgfrukter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Type prøver
- Bruk fem fullkornsprøver, som består av to kornblandinger (f.eks. durum hvete og gul mais) og tre belgfrukter (f.eks. Blackeye cowpea bønne, soyabønne og rød nyrebønne) for denne studien.
- Fres 50 g av hvert korn i triplikater i mel, ved hjelp av en kaffekvern, og send dem gjennom en 500 μm sikt.
- Oppbevar dem ved -20 °C.
2. Prøvepreparering
-
Bestemmelse av tørrstoffinnhold og uttrykk for tørrvektsgrunnlag
MERK: Bestem tørrstoffinnholdet i hver pulverisert prøve i henhold til metoden for AOAC (2000)12.- Slå på en tvungen konveksjonsovn og sett temperaturen til 130 °C.
- Tørr tørkemiddel (silikagel) i ovnen i 30 min til 1 t og overfør den tørkede silikagelen til en tørkedesiccator.
- Vei nøyaktig 2 g av hver prøve inn i en ren, fortørket og veid aluminiumskanne.
- Tørk de veide prøvene ved 130 °C i 1 time i en tvungen konveksjonsovn.
- Overfør den tørkede prøven til tørkedesiccatoren og la den avkjøles til omgivelsestemperatur.
- Vei den tørkede, avkjølte prøven og registrer vekten.
- Beregn tørrstoffinnholdet i hver prøve på følgende måte:
- Uttrykk hver parameter målt i tørrvektsbasis ved hjelp av følgende formel:
-
Fenolsyre ekstraksjon
MERK: Trekk ut de løselige frie fenolforbindelser i kornprøvene ved hjelp av en modifikasjon av metoden til Y. Qiu et al.5 som muliggjør fenolisk ekstraksjon fra milligram mengder fullkorn.- Vei nøyaktig 100 mg av fullkornsmelprøven direkte inn i et gulfarget mikrosenterrør med 2 ml kapasitet. Den mørke fargen på røret bidrar til å forhindre eksponering av blandingen for lys.
- Tilsett 1 ml 80 % vandig HPLC-metanol i hvert av rørene som inneholder prøvene.
- Virvel kort for å blande metanoloppløsningen og prøvene.
- Soniker prøvene i 60 min for å trekke ut de frie løselige fenolforbindelser. Sett et deksel over prøvene så lenge sonikeringen varer for ekstra beskyttelse mot lys.
- Etter sonikering, sentrifuger blandingen på 20.000 × g i 5 min for å sedimentere de faste rester som etterlater supernatanten på toppen. Frie fenolforbindelser vil være til stede i supernatanten etter sentrifugering.
- Overfør supernatanten til et rent mikrosenterrør.
MERK: Supernatanten må filtreres før den injiseres i HPLC-instrumentet. For å filtrere supernatanten, fjern stempelet på en 3 ml sprøyte og fest et sprøytefilter. Filteret skal ha en porestørrelse på ikke større enn 0,22 μm. - Pipette ca. 0,4 ml av supernatanten inn i toppen av sprøyten. Sett stempelet inn igjen og skyv væsken gjennom filteret inn i et HPLC-hetteglass som inneholder en hetteglassinnsats.
- Når instrumentet er satt opp til å kjøre metoden som er skissert i manuskriptet for HPLC-analyse, laster du hetteglassene inn i karusellen slik at de samsvarer med prøvelisten.
- Få HPLC-kromatogrammer ved 320 nm og 280 nm som viser distinkte topper som representerer forskjellige fenolforbindelser.
- Ved hjelp av passende standardkurver kvantifiserer hydroksycinnamic syrer ved 320 nm siden de har maksimal absorbans ved denne bølgelengden. Ved samme prinsipp kvantifisere hydroksybenzosyrer ved 280 nm.
- Oppbevar de resterende ekstraktene ved -20 °C for andre analyser.
3. Fenolisk sammensetning
- Bruk en høytrykks væskekromatografi (Materialliste) for å identifisere og kvantifisere de ekstraherte fenolforbindelser i prøvene, basert på metoden til J. Xiang, F.B. Apea-Bah, V. U. Ndolo, M.C. Katundu og T. Beta 4.
- Forbered fenolsyrestandarder (vanillsyre, koffeinsyre, p-coumarinsyre, ferulsyre og sinapisk syre) for å identifisere og kvantifisere bestanddeler fenolforbindelser i ekstraktene.
- For å gjøre dette, veie 1 mg av hver standard og oppløses i 1 ml 50% vandig metanol for å produsere 1000 μg / ml av hver standard.
- Bland like store mengder av alle fem standardene i et 2 ml gult sentrifugerør for å produsere en cocktail av standarder, som hver har en konsentrasjon på 200 μg / ml.
- Forbered serielle fortynninger av standardcocktailen ved å ta et volum inn i et nytt rør og fortynne med like mye av det vandige metanolløsningsmidlet.
- Gjenta de serielle fortynningene ned til en konsentrasjon på 3,125 μg/ml.
- Fortynn også hver standard 40 ganger med løsningsmidlet for å oppnå 25 μg / ml konsentrasjon av hver standard.
- Sett kolonnetemperaturen til 35 °C og prøveovnstemperaturen til 15 °C.
- For å forberede mobil fase A (0,1% vandig maursyre), overfør 1 ml maursyre til en 1 L kapasitet volumetrisk kolbe og tilsett HPLC-grade vann til 1 L-merket. Rist godt for å blande.
- For å forberede mobil fase B (0,1% maursyre i metanol), overfør 1 ml maursyre til en 1 L kapasitet volumetrisk kolbe og tilsett HPLC-klasse metanol til 1 L-merket. Rist godt for å blande.
- Juster volumene til 1 L-merket om nødvendig.
- Filtrer begge de mobile fasene gjennom et hydrofilt filterpapir på 0,45 μm.
- For analysen, injiser 10 μL av hvert ekstrakt eller standard (25 μg / ml standarder og standard cocktailer) på omvendt fase kolonne.
- Elute med de mobile fasene i henhold til det lineære gradientprogrammet for en 25 minutters kjøring som følger: 0-3,81 min, 9% -14% B; 3.81-4.85 min, 14%-15% B; 4.85-5.89 min, 15%-15% B, 5.89-8.32 min, 15%-17% B; 8.32-9.71 min, 17%-19% B; 9.71-10.40 min, 19%-19% B; 10.40-12.48 min, 19%-26% B; 12.48-13.17 min, 16%-28% B; 13.17-14.21 min, 28%-35% B; 14.21-15.95 min, 35%-40% B; 15.95-16.64 min, 40%-48% B; 16.64-18.37 min, 48%-53% B; 18.37-22.53 min, 53%-70% B; 22.53-22.88 min, 70%-90% B; 22.88-25.00 min, 90% B.
- Sammenlign oppbevaringstidene for kromatografiske topper oppnådd for de autentiske standardene for konsentrasjoner 25 μg / ml, ved 280 nm og 320 nm, med ekstraktene, for å identifisere de bestanddelene fenolforbindelser i prøvene.
- Plottkalibreringskurver for fenolsyrestandardcocktails, med konsentrasjon av standardene på den horisontale aksen, og toppområdet på den vertikale aksen
- Bruk kalibreringskurvene til å estimere konsentrasjonene av de identifiserte fenolforbindelser, ved å sammenligne toppområdene på tomten med de identifiserte forbindelsene ved 280 nm og 320 nm som nevnt i den tidligere delen.
4. Totalt fenolisk innhold
MERK: Bestem det totale fenolinnholdet i ekstraktene ved hjelp av Folin-Ciocalteu-metoden beskrevet av F.B. Apea-Bah et al.13.
- Forbered ferulinsyre- og gallsyrestandarder innenfor konsentrasjonsområdet 0,025 til 0,150 mg / ml for å plotte kalibreringskurver i sammenligning, for estimering av totalt fenolinnhold.
- For å gjøre dette, vei nøyaktig 1 mg hver av ferulinsyre- og gallsyrestandarder i sentrifugerør med 2 ml kapasitet.
- Tilsett 1 ml 50 % vandig metanol i hver standard og virvel som skal oppløses, og produserer 1 mg/ml lager av hver standard.
- Forbered en rekke fortynninger fra hver lagerløsning i totalt 500 μL.
- Pipette 18,2 μL av hvert ekstrakt eller standard i en separat brønn på en 96-brønns mikroplate.
- Tilsett 36,4 μL 10 % (v/v) vandig Folin-Ciocalteu-reagens i hvert ekstrakt eller hver standard.
- Tilsett deretter 145,4 μL 700 mM natriumkarbonat til hver reaksjonsblanding.
- Inkuber reaksjonsblandingene i mørket ved romtemperatur (20-25 °C) i 2 timer.
- Les absorbansen på en mikroplateleser på 750 nm.
- Plottkalibreringskurver for endring i absorbans mot konsentrasjonen av fenolsyrestandardene og bruk dem til å estimere det totale fenolinnholdet.
- Uttrykk resultatene som milligram ferulinsyreekvivalenter per gram freset prøve (mg FAE/g) og milligram gallsyreekvivalenter per gram malt prøve (mg GAE/g) på tørrvektsbasis.
5. Antioksidantanalyser
MERK: Bestem antioksidantkapasiteten til kornekstraktene ved hjelp av følgende tre analyser: 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radikal scavenging kapasitet; 2,2'-azino-bis(3-etylbenzothiazoline-6-sulfonsyre (ABTS) radikal scavenging kapasitet, som også kalles Trolox tilsvarende antioksidant kapasitet (TEAC); og oksygen radikal absorbans kapasitet (ORAC).
- Utarbeidelse av Trolox-standarder for standardkurver
- Bruk Trolox, en vannløselig analog av vitamin E, som standard for å estimere in vitro antioksidantkapasiteten til hele kornekstraktene.
- Vei nøyaktig 1 mg Trolox inn i et 15 ml rør. Oppløs i 4 ml 50% vandig metanol. Virvel å oppløse for å forberede en lagerløsning på 1 mM (1000 μM).
- Forbered seks konsentrasjoner av Trolox, det vil: 50, 100, 200, 400, 600 og 800 μM for å plotte standardkurver for estimering av DPPH radikal scavenging kapasitet og Trolox tilsvarende antioksidantkapasitet (TEAC). På samme måte forbereder du 6,25, 12,5, 25 og 50 μM konsentrasjoner av Trolox for å estimere oksygenradikale absorbanskapasitet (ORAC). Utgjør det totale volumet av hver konsentrasjon til 500 μL som vist i tabell 1.
- Fortynning av prøveekstrakter
- Fortynn prøveekstraktene med metanol før analyse. Her ble gul mais og cowpea ekstrakter fortynnet to ganger, hvete og nyrebønner ble fortynnet fem ganger mens soyabønneekstraktet ble fortynnet 10 ganger med metanol.
- Trolox tilsvarende antioksidantkapasitet (TEAC) analyse
- Mål trolox tilsvarende antioksidantkapasitet (TEAC) av prøvene ved hjelp av metoden beskrevet tidligere av F.B. Apea-Bah et al.14.
- Vei 8,23 mg ABTS inn i et rent 2 ml gult sentrifugerør.
- Deretter veier du 1,62 mg kaliumpersulfat i et annet rent 2 ml kapasitets gult sentrifugerør.
- Tilsett 1 ml destillert vann til hver av dem og virvel for å oppløse dem.
MERK: Dette resulterer i 16 mM ABTS lagerløsning med 6 mM vandig kaliumpersulfatoppløsning. - Forbered ABTS-lagerløsningen ved å blande ABTS- og kaliumpersulfatløsningene i like store volumer. Løsningen vil umiddelbart endres til en mørk farge.
- Inkuber reagensblandingen i mørket i 12-16 timer.
- Fortynn ABTS-lagerløsningen 30 ganger med 200 mM fosfatbufret saltvann (PBS), for å danne ABTS-arbeidsløsningen. For å gjøre dette, tilsett 58 ml 200 mM PBS til 2 ml ABTS-lagerløsning. Arbeidsløsningen vil inneholde 0,27 mM ABTS og 0,1 mM kaliumpersulfat.
- For analysen, plasser 10 μL av hvert fortynnet ekstrakt eller Trolox i en 96-brønns mikroplate.
- Tilsett 190 μL ABTS arbeidsløsning til hver brønn og inkuber reaksjonsblandingene i 60 min.
- Mål absorbansen av reaksjonsblandingene ved 750 nm i en mikroplateleser.
- Bruk Trolox-standardene i en konsentrasjon fra 100 til 800 μmol/l for å plotte en kalibreringskurve.
- Beregn ABTS radikal scavenging kapasitet fra kalibreringskurven.
- Uttrykk resultatene som mikromole Trolox-ekvivalenter per gram (μmol TE/g) prøve på tørrvektsbasis.
- DPPH-analyse
MERK: Bestem DPPH radikal scavenging kapasitet av prøvene ved hjelp av metoden beskrevet tidligere av F.B. Apea-Bah et al.13. DPPH-antioksidantanalysen krever en radikal-genererende forbindelse, DPPH (2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl).- Vei nøyaktig 1,2 mg DPPH inn i et tomt sentrifugerør med 50 ml kapasitet. Løs opp DPPH i 30 ml metanol for å forberede en 60 μmol / l metadonisk løsning.
MERK: DPPH-analysen tester prøveekstraktenes evne til å samle frie radikaler produsert av DPPH. - For analysen, tilsett 5 μL av prøveekstraktene eller Trolox-løsningen i mikroplatebrønnene.
- Deretter legger du til 195 μL av 60 μmol / L DPPH methanolic-løsningen og inkuberer i 60 min.
- Mål absorbansen av reaksjonsblandingen ved 515 nm.
- Bruk Trolox-standardene (50-800 μmol/L) til å tegne inn en kalibreringskurve, med endringen i absorbans på den vertikale aksen og Trolox-konsentrasjonene på den horisontale aksen.
- Beregn DPPH-kapasiteten fra kalibreringskurven.
- Uttrykk resultatene som mikromole Trolox-ekvivalenter per gram (μmol TE/g) prøve på tørrvektsbasis.
- Vei nøyaktig 1,2 mg DPPH inn i et tomt sentrifugerør med 50 ml kapasitet. Løs opp DPPH i 30 ml metanol for å forberede en 60 μmol / l metadonisk løsning.
- Oksygen radikal absorbans kapasitet
- Bestem den oksygenradikale absorbanskapasiteten (ORAC) til prøvene basert på metoden F.B. Apea-Bah et al.13.
- For å begynne med, forberede Trolox standarder for konsentrasjoner 6.25, 12.5, 25 og 50 μM fra en 1,000 μM Trolox standard lagerløsning i 75 mM kaliumfosfat (K2HPO4/KH2PO4) buffer.
- For å gjøre dette, vei 1 mg Trolox pulver og oppløses i 4 ml bufferoppløsning under sonikering for å forberede en 1000 μM lagerløsning.
- Ta deretter 50 μL av lagerløsningen inn i et sentrifugerør med 2 ml kapasitet og fortynn med 950 μL bufferløsning for å oppnå 1000 μL 50 μM Trolox-løsning.
- Pipette 500 μL av 50 μM-oppløsningen i et nytt rør og fortynn med like mye buffer for å oppnå en 25 μM Trolox-løsning.
- Gjenta den serielle fortynning av 25 μM for å oppnå 12,5 μM, og gjenta deretter fortynning av 12,5 μM for å oppnå 6,25 μM.
- Forbered passende fortynning av prøveekstraktene.
- Fortynn den gule maisen og cowpea ekstrakter 20 ganger, hvete og nyrebønner trekker ut 50 ganger, og soyabønneekstraktet 100 ganger med bufferløsningen.
- Overfør 200 μL av hver prøve eller Trolox-standard til brønnene på en svart 96-brønns mikroplate for automatisk pipettering.
- Fyll deretter de tre reagenstankene som følger med ORAC-utstyret, med følgende: (1) bufferløsningen; (2) 0,816 nM fluorescein i bufferen; og (3) 153 mM 2,2′-azobis(2-amidinopropan) dihydroklorid (AAPH) i buffer.
- Plasser dem i beholderne for automatisk pipettering.
- Sett opp ORAC-maskinen og det automatiske pipetteringssystemet for analyse, basert på standard driftsprosedyre.
- For analysen, sett opp det automatiserte pipetteringssystemet for å overføre 25 μL av hvert fortynnet ekstrakt eller standard til brønnene til en klar bunnsvart 96-brønns mikroplate.
- Deretter tilsettes automatisk 150 μL 0,816 nM fluorescein i buffer.
- Inkuber reaksjonsblandingen ved 37 °C i 15 minutter i ORAC-maskinen.
- Deretter tilsetter du automatisk 25 μL av AAPH til hver reaksjonsblanding.
- Inkuber dem ved 37 °C i 50 minutter i ORAC-maskinen.
- Sett opp ORAC-maskinen for å måle fluorescensforfallet, over inkubasjonsperioden, ved eksitasjons- og utslippsbølgelengder på henholdsvis 485 nm og 520 nm.
- Etter målingene, plott en Trolox standardkurve, med Trolox (6,25-50 μM) på den horisontale aksen og fluorescens forfall på den vertikale aksen.
- Beregn oksygenradikal absorbanskapasiteten til ekstraktene fra Trolox standardkurve.
- Uttrykk resultatene som μmol TE/g-prøve på tørrvektsbasis.
- Statistisk analyse
- Presentere alle resultatene som betyr ± standardavvik på minst triplikater.
- Utfør variansanalyse (ANOVA) for å bestemme effekten av korntype på responsvariablene.
- Der det er signifikante forskjeller ved p < 0,05, bruker du minst signifikant forskjell (LSD) for å sammenligne midlene.
- Utfør Pearson korrelasjonsanalyse for å estimere forholdet mellom fenolinnhold og antioksidantkapasitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabell 2 viser fenolsyrene som ble identifisert i korn- og belgfruktkornene. Basert på tilgjengelige autentiske standarder ble fire fenolsyrer identifisert i prøvene, og de er: vanilliske, koffeinfrie, p-coumarinsyrer og ferulinsyrer. Vanillsyre er en hydroksybenzosyre, mens de tre andre er hydroksycinnamic syrer. Vanillsyre ble identifisert bare i Blackeye cowpea bønne mens koffeinsyre ble identifisert bare i nyrebønner. p-coumarinsyre ble identifisert i gul mais, cowpea bønne og soyabønne. Konsentrasjonen varierte mellom 7,57 og 12,48 μg/g mel på tørrvektsbasis, med gult mais som hadde lavest verdi mens soyabønner hadde den høyeste verdien. Ferulinsyre var den eneste fenolsyren som ble identifisert i alle prøvene. Konsentrasjonen varierte mellom 5,69 og 41,76 μg/g mel på tørrvektsbasis. Blant prøvene var ferulsyrekonsentrasjonen høyest i soyabønner etterfulgt av cowpeabønner, mens hvete, gul mais og nyrebønner hadde sammenlignbare verdier (tabell 2). Når alle fenolsyrekonsentrasjonene ble oppsummert for hver prøve, ble deres verdier redusert i følgende rekkefølge: soyabønne > cowpea bønne > gul mais = nyrebønner > hvete.
Tabell 3 viste det totale fenolinnholdet (TPC) og antioksidantkapasiteten til korn- og belgfruktkornene. Antioksidantkapasiteten besto av DPPH radikal scavenging kapasitet, TEAC, og ORAC. Summen av disse tre verdiene ga derfor den totale antioksidantkapasiteten til prøvene. TPC ble målt både i ferulinsyreekvivalent og gallsyreekvivalent med det formål å sammenligne. TPC varierte mellom 1,16 og 2,78 mg FAE/g mel og 0,63 til 1,48 mg GAE/g mel, på tørrvektsbasis. Uavhengig av tilsvarende enhet, TPC av prøvene redusert i følgende rekkefølge: soyabønner > hvete = gul mais = nyrebønner > cowpea bønne.
DPPH radikal scavenging kapasitet av prøvene varierte mellom 4.48 og 14.87 μmol TE / g mel på tørrvekt basis. Soyabønner hadde den høyeste DPPH-scavenging kapasiteten, etterfulgt av nyrebønner, mens gul mais og cowpea bønne hadde sammenlignbare verdier. Hvete hadde den laveste evnen til å samle DPPH-radikaleren. Trolox tilsvarende antioksidantkapasitet (TEAC) av prøvene varierte mellom 12,82 og 57,24 μmol TE/g mel på tørrvektsbasis. Igjen hadde Soyabønne den høyeste TEAC-verdien, etterfulgt av nyrebønner, og deretter hvete, mens gul mais og cowpea bønne hadde relativt lave TEAC-verdier. Oksygenradikal absorbanskapasiteten til prøvene var mellom 0,35 og 1,67 μmol TE/g mel på tørrvektsbasis, der kornkornene hadde lavest verdi mens soyabønner hadde høyest verdi. Når alle antioksidantkapasitetene ble oppsummert, ble verdiene i prøvene redusert i følgende rekkefølge: soyabønne > nyrebønne > gul mais = cowpea bønne > hvete.
Det var en sterk positiv sammenheng mellom de to TPC-verdiene, og verdiene for TEAC, ORAC og total antioksidantkapasitet (TAC) (tabell 4). Det var imidlertid svak sammenheng mellom TPC-verdiene og DPPH.
Figur 1: Hydroksybenzosyrer identifisert i korn og belgfrukter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Hydroksycinnamic syrer identifisert i korn og belgfrukter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Utarbeidelse av Trolox-konsentrasjoner for standardkurver for DPPH og ABTS. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Fenolsyreinnhold i noen fullkornskorn og belgfrukter. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 3: Totalt fenolinnhold (TPC) og antioksidantkapasitet av noen fullkornskorn og belgfrukter. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 4: Pearson korrelasjonsmatrise for totalt fenolinnhold og antioksidantkapasitet av noen korn- og belgfruktkorn. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hele korn ble valgt som representative kornkorn og belgfrukter som finner brede matapplikasjoner over hele verden. Mens variasjoner kan eksistere blant kultivarer av hvert korn, var fokuset i denne studien å demonstrere en generalisert metode for fri fenolsyreutvinning og analyse for fullkorn. Utvinningsmetoden ble modifisert ved å redusere mengdene prøver og løsningsmidler betydelig, for å redusere mengden kjemikalier som ville bli frigjort i miljøet når slike eksperimenter utføres. Modifikasjonen muliggjør også fenolisk ekstraksjon fra milligram mengder fullkorn.
HPLC-analyse produserer et kromatogram av de bestanddelene fenolsyrer i prøven. Hver kromatografiske topp som representerer en fenolsyre, kan identifiseres ved å sammenligne oppbevaringstiden, ved en forhåndsdefinert bølgelengde, med de autentiske fenolsyrestandardene. Ultrafiolette (UV) detektorer brukes vanligvis til å identifisere fenolsyrer innenfor UV-bølgelengdeområdet. Hydroksybenzosyrer identifiseres vanligvis mellom 254-280 nm, mens hydroksycinnamic syrer vanligvis identifiseres mellom 300-330 nm15. Fotodiode array detektorer kan brukes til å skanne hele UV-synlig bølgelengde området, og er spesielt nyttig for å bestemme UV-synlig spektra av forbindelser tilstede i prøver som aldri har blitt studert. R. J. Robbins og S. R. Bean15 rapporterte følgende bølgelengder for maksimal absorpsjon, for henholdsvis vanillsyre, koffeinsyre, p-coumarinsyre og ferulinsyre: 260 nm; 325 nm; 310 nm; 325 nm. HPLC-identifiseringsmetoden er normalt akseptabel for prøver av kjent fenolsyresammensetning, hvis oppbevaringstider og UV-spektraldata tidligere er etablert. Dette er viktig fordi noen forbindelser kan ko-elute når god separasjon ikke oppnås på kolonnen. For prøver av ukjent fenolsyresammensetning brukes et massespektrometer i tillegg til de autentiske standardene for identifikasjon. Publisert litteratur gir nyttig informasjon om fenolforbindelser som tidligere er identifisert i utvalget som studeres eller i lignende utvalg 3,9,14. Det er verdt å merke seg at under HPLC-analyse er fenolsyretopper i kromatogrammet bare identifiserbare når autentiske standarder er tilgjengelige for sammenligning. Det kan derfor være andre topper som ikke kan identifiseres uten tilsvarende standarder. Dette er en begrensning med HPLC-analyse som kan overvinnes når HPLC er koblet til et massespektrometer. Derfor vil den totale konsentrasjonen av kvantifiserte fenolsyrer avhenge av antall fenolsyrer identifisert.
Folin-Ciocalteu-metoden, som først ble publisert av V. L. Singleton og J. A. Rossi (1965)16 er en elektronoverføringsbasert analyse som brukes til å estimere TPC av en analytt17. Den er basert på analyttens evne til å redusere fosfomolybdate-fosfotungstate i et alkalisk medium, og dermed konvertere den fra gul til en mørk blå løsning18. Absorbansen av den resulterende løsningen kan deretter måles ved 765 nm19. Reagenset er ikke spesifikt for fenolforbindelser alene, men kan reagere med flere andre forbindelser med å redusere egenskaper som tioler, redusere sukker og noen aminosyrer (f.eks. tyrosin). Derfor foreslås det at TPC kan brukes til å estimere reduksjonsegenskapen til en prøve eller analytt17. Under fenolutvinningen er de fleste forstyrrende forbindelser utelukket, og siden fenolforbindelser er de mest allestedsnærværende fytokjemikaliene, er Folin-Ciocalteu-analysen fortsatt en nyttig metode for å estimere TPC for en prøve. I de fleste prøver hvis fenolsammensetning ikke er kjent, brukes gallsyre som standard for å tegne en kalibreringskurve for å estimere TPC. Imidlertid vil ikke alle prøver inneholde gallsyre. I den nåværende studien brukte vi ferulinsyre for å sammenligne resultatene med gallsyre. En to-prøve T-test viste at TPC bestemt som ferulinsyreekvivalent hadde betydelig høyere verdier enn TPC uttrykt som en gallsyreekvivalent. Siden vi bekreftet at ferulinsyre var til stede i alle prøvene basert på VÅR HPLC-analyse og andre rapporterte resultater, ville vi lene oss mer mot å uttrykke TPC-resultatene som en ferulinsyreekvivalent. Det er nyttig å uttrykke TPC i forhold til en dominerende bestanddel fenolforbindelse i prøven.
Ved hjelp av tre forskjellige antioksidantanalyser ble det observert at de forskjellige kornene reagerte annerledes i sine evner til å samle frie radikaler. DPPH radikal scavenging kapasitet og TEAC analyse er basert på elektron overføring (ET) mekanisme mens ORAC analysen er basert på hydrogen atom overføring (HAT) mekanisme20. Derfor gir kombinasjon av de tre analysene en bedre indikasjon på antioksidantkapasiteten til en prøve. Det er verdt å merke seg at ORAC-analysen måler en prøves evne til å scavenge den fysiologisk relevante peroksylradikale, som i et fysiologisk system kan forårsake lipidperoksidasjon som er relatert til skumcelledannelse og aterogenese21,22. På den annen side bruker DPPH- og TEAC-analyser radikaler som ikke er av fysiologisk relevans. Imidlertid gjør deres brukervennlighet dem nyttige som raske metoder for å estimere den radikale scavenging kapasiteten til en prøve. ORAC-analysen sammenligner seg også godt med andre in vitro- eller ex vivo-antioksidantanalyser som bruker celler og DNA som biomarkører23.
Alle metodene beskrevet ovenfor for utvinning og identifisering av frie fenolsyrer, estimering av totalt fenolinnhold og bestemmelse av antioksidantegenskaper, er ikke standardisert. Ulike produsenter av flytende kromatografiske kolonner anbefaler forskjellige gradient elutionsystemer av løsningsmidler for å skille fenolsyrer for identifikasjon. Selv om Folin-Ciocalteu-metoden er den vanligste for å estimere totalt fenolisk innhold av prøver, utfører forskjellige laboratorier denne analysen annerledes. Det samme kan sies om antioksidantmetodene. Det er derfor behov for harmonisering av disse metodene for å fremme sammenligning av resultater mellom laboratorier. Det er også behov for utvikling av robuste prediktive modeller som kan relatere fenolsyresammensetning til antioksidantegenskapene målt ved disse viktige analysemetodene.
Det konkluderes fra denne studien at løsningsmiddelutvinningsmetoden som brukes, er effektiv for å trekke ut frie oppløselige fenolsyrer fra melet av fullkornskorn og belgfrukter, og dermed lette deres identifikasjon og kvantifisering. HPLC-metoden muliggjør identifisering og kvantifisering av frie oppløselige fenolsyrer i fullkornsekstrakter, forutsatt at det er autentiske standarder for sammenligning. Ved hjelp av de tre forskjellige antioksidantmetodene: DPPH, TEAC og ORAC, kan antioksidantkapasiteten til frie oppløselige fenolekstrakter fra fullkorn effektivt bestemmes basert på hydrogenatomoverføring og elektronoverføringsmekanismer. Denne studien bekrefter videre at hele korn varierer i deres fenolsyresammensetning og antioksidantkapasitet. Korrelasjonsanalysen viser at antioksidantkapasiteten som måles er relatert til de bestanddelene fenolsyrer i hele kornfrie løselige ekstrakter. Selv om både TEAC og DPPH scavenge frie radikaler ved elektronoverføringsmekanisme, korrelerte de annerledes med TPC. Forskjellen i atferd av forskjellige antioksidantanalyser nødvendiggjør behovet for å bestemme antioksidantkapasiteten til prøver ved hjelp av en rekke analyser. Blant de fem hele kornene som studeres, har soyabønner den høyeste fenolsyrekonsentrasjonen og tilsvarende høyeste antioksidantkapasitet. Studien viser også at fullkornsfrie oppløselige fenolsyrer kan ekstraheres og deres antioksidantkapasiteter studeres i så lite som 1 ml vandig methanolic løsning, og dermed redusere mengden laboratoriekjemikalier som slippes ut i miljøet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner takknemlig den tekniske støtten til Ms. Alison Ser og Ms. Hannah Oduro-Obeng, samt videoredigeringsstøtten av Ms. Janice Fajardo og Mr. Miguel del Rosario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
References
- Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478 (2014).
- Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation. Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).
- Dykes, L., Rooney, L. W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits. Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).
- Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties. Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).
- Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids. Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).
- Beverly, R. L. Encyclopedia of Food Safety. Motarjemi, Y. 3, Academic Press. 309-314 (2014).
- FAO. Food Outlook - Biannual report on global food markets. Food and Agriculture Organization. , Rome, Italy. (2020).
- Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses. Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).
- Dueñas, M., Hernández, T., Estrella, I. Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents. Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).
- Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes. Foods. 5 (2), 27 (2016).
- Hefni, M. E., Amann, L. S., Witthöft, C. M. A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals. Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).
- AOAC. Official Methods of Analysis. 17th edn. , Association of Official Analytical Chemists. Gaithersburg, MD, USA. (2000).
- Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems. Heliyon. 6 (10), 05158 (2020).
- Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion. Food Chemistry. 197, Pt A 307-315 (2016).
- Robbins, R. J., Bean, S. R. Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids. Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).
- Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).
- Waterhouse, A. L. Determination of total phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 1, 1-8 (2002).
- Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).
- Esterbauer, H., Wäg, G., Puhl, H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).
- Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., Jürgens, G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).
- Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake. Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).
