Summary
Fenolsyror är viktiga fytokemikalier som finns i fullkorn. De har bioaktiva egenskaper som antioxidantskyddande funktioner. Detta arbete syftade till att rapportera om en generaliserad metod för HPLC-identifiering, uppskattning av totalt fenolinnehåll och bestämning av antioxidantkapaciteten hos fenolsyror i spannmål och baljväxter.
Abstract
Fenolsyror är en klass av organiska föreningar som bär både en fenolgrupp och en karboxylgrupp. De finns i korn och koncentreras i kli av spannmål eller fröbeläggning av baljväxter. De har antioxidantegenskaper som har genererat mycket forskningsintresse de senaste åren, om deras potentiella antioxidantskyddande hälsofunktioner. Detta arbete presenterar en generaliserad metod för extraktion av fria lösliga fenolsyror från fullkorn och analys av deras antioxidantkapacitet. Fem fullkornsprover bestående av två spannmål (vete och gul majs) och tre baljväxter (cowpeaböna, njurböna och sojabönor) användes. Kornen maldes till mjöl och deras fria lösliga fenolsyror extraherades med vattenhaltig metanol. Föreningarna identifierades sedan med hjälp av en högtrycksvätskekromatograf (HPLC). Folin-Ciocalteu-metoden användes för att bestämma deras totala fenolinnehåll medan deras antioxidantkapacitet bestämdes med hjälp av DPPH-radikalrensningskapaciteten, Trolox-ekvivalent antioxidantkapacitet (TEAC) och syreradikalabsorberingskapacitet (ORAC) -analyser. De fenolsyror som identifierades inkluderade vanillinsyra, koffeinsyra, p-kumarinsyra och ferulinsyror. Vanillinsyra identifierades endast i cowpea medan koffeinsyra endast identifierades i njurböna. p-kumarinsyra identifierades i gul majs, cowpea och sojabönor, medan ferulinsyra identifierades i alla prover. Ferulinsyra var den dominerande fenolsyran som identifierades. Den totala koncentrationen av fenolsyror i proverna minskade i följande ordning: sojabönor > cowpeaböna > gul majs = njurböna > vete. Den totala antioxidantkapaciteten (summan av värdena för DPPH-, TEAC- och ORAC-analyser) minskade enligt följande: sojabönor > njurbönor > gul majs = cowpeaböna > vete. Denna studie drog slutsatsen att HPLC-analys samt DPPH-, TEAC- och ORAC-analyser ger användbar information om fenolsyrasammansättningen och antioxidantegenskaperna hos fullkorn.
Introduction
Fenolsyror är bland de viktigaste fytokemikalierna som studeras i växter på grund av den viktiga roll de spelar i växtförsvaret mot växtätande och svampinfektion, samt upprätthåller strukturellt stöd och integritet i växtvävnader 1,2. De är rikliga i kli av spannmål och fröbeläggning av baljväxter3. Strukturellt är de indelade i två grupper: hydroxibensoesyra (figur 1) och hydroxikinnaminsyror (figur 2). De vanliga hydroxibensoesyrorna i spannmål och baljväxter innefattar gallinsyra, p-hydroxibensoesyra, 2,4-dihydroxibensoesyra, protokatechuic, vanillinsyra och sprutsyror, medan de vanliga hydroxikinnaminsyrorna innefattar koffeinsyra, p-kumarsyra, ferulinsyra och sinapinsyror3. Fenolsyror har också antioxidantegenskaper eftersom de kan rensa fria radikaler, vilket orsakar oxidativ härskning i fetter och initierar och sprider radikalinducerad oxidativ stress i fysiologiska system 4,5. På grund av denna viktiga fysiologiska roll som antioxidanter är de föremål för ny forskning. Detta beror på att när de konsumeras som komponenter i vegetabiliska livsmedel kan de utöva antioxidantskydd.
Spannmål och spannmålsprodukter är viktiga kolhydratmatkällor för människor och djur över hela världen6. Spannmål inkluderar vete, ris, majs (majs), korn, triticale, hirs och sorghum. Bland dem är majs den mest utnyttjade, med ett uppskattat globalt utnyttjande på 1 135,7 miljoner ton 2019/2020, följt av vete med ett uppskattat globalt utnyttjande på 757,5 miljoner ton under samma period7. Spannmålsprodukter är bra energikällor för konsumenterna eftersom de är rika källor till kolhydrater. De ger också lite protein, fett, fiber, vitaminer och mineraler6. Förutom deras näringsvärde är spannmål goda källor till fytokemiska antioxidanter, särskilt fenolsyror, som har potential att skydda det fysiologiska systemet från radikalinducerad oxidativ skada3. Baljväxter är också bra källor till näringsämnen och är i allmänhet högre i protein än spannmål. De innehåller också vitaminer och mineraler och används vid framställning av olika livsmedel8. Dessutom är baljväxter bra källor till en mängd olika fytokemiska antioxidanter, inklusive fenolsyror, flavonoider, antocyaniner och proantocyanidiner 9,10. Olika sorter av spannmål och baljväxter kan ha en annan fenolsyrasammansättning. Det finns därför ett behov av att studera fenolsyrasammansättningen hos spannmål och baljväxter och deras sorter för att känna till deras potentiella hälsofördelar med avseende på fenolantioxidanter.
Ett antal analyser har rapporterats för att mäta mängden fenolsyror i spannmål och baljväxter och bestämma deras antioxidantaktiviteter. De vanligaste analysmetoderna för fullkornsfenolsyror är spektrofotometri och vätskekromatografi11. Syftet med detta arbete var att demonstrera en generaliserad vätskekromatografisk högtrycksmetod för bestämning av fritt löslig fenolsyrasammansättning och spektrofotometriska metoder för att bestämma totalt fenolinnehåll och antioxidantkapacitet hos vissa fullkornsspannmål och baljväxter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Typ av prover
- Använd fem fullkornsprover, bestående av två spannmål (t.ex. durumvete och gul majs) och tre baljväxter (t.ex. Blackeye cowpea bean, sojabönor och röd njurböna) för denna studie.
- Fräs 50 g av varje korn i tre exemplar till mjöl, med en kaffekvarn, och passera dem genom en 500 μm sil.
- Förvara dem vid -20 °C.
2. Provberedning
-
Bestämning av torrsubstanshalt och uttryck av torrviktsbas
OBS: Bestäm torrsubstanshalten i varje pulveriserat prov enligt metoden för AOAC (2000)12.- Slå på en tvångskonvektionsugn och ställ in temperaturen på 130 ° C.
- Torka torkmedel (kiselgel) i ugnen i 30 minuter till 1 timme och överför den torkade kiselgelen till en torkskurator.
- Väg noggrant 2 g av varje prov i en ren, förtorkad och vägd aluminiumburk.
- Torka de vägda proverna vid 130 °C i 1 timme i en tvingad konvektionsugn.
- Överför det torkade provet till tonkindikatorn och låt svalna till omgivningstemperatur.
- Väg det torkade, kylda provet och registrera dess vikt.
- Beräkna torrsubstanshalten i varje prov enligt följande:
- Uttryck varje parameter mätt i torrviktsbasis med hjälp av följande formel:
-
Fenolsyra extraktion
OBS: Extrahera de lösliga fria fenolföreningarna i kornproverna med hjälp av en modifiering av metoden för Y. Qiu et al.5 som möjliggör fenolextraktion från milligrammängder fullkorn.- Väg noggrant 100 mg av fullkornsmjölprovet direkt i ett bärnstensfärgat mikrocentrifugrör med 2 ml kapacitet. Rörets mörka färg hjälper till att förhindra exponering av blandningen för ljus.
- Tillsätt 1 ml 80 % vattenhaltig metanol av HPLC-kvalitet till vart och ett av rören som innehåller proverna.
- Vortex kort för att blanda metanollösningen och proverna.
- Sonicate proverna i 60 min för att extrahera de fria lösliga fenolföreningarna. Sätt ett lock över proverna under ultraljudsbehandlingens varaktighet för extra skydd mot ljus.
- Efter ultraljudsbehandling, centrifugera blandningen vid 20,000 × g för 5 min för att sedimentera de fasta resterna lämnar supernatanten på toppen. Fria fenolföreningar kommer att vara närvarande i supernatanten efter centrifugering.
- Överför supernatanten till ett rent mikrocentrifugrör.
OBS: Supernatanten måste filtreras innan den injiceras i HPLC-instrumentet. För att filtrera supernatanten, ta bort kolven på en 3 ml spruta och fäst ett sprutfilter. Filtret ska ha en porstorlek på högst 0,22 μm. - Pipettera cirka 0,4 ml av supernatanten i toppen av sprutan. Sätt tillbaka kolven och tryck vätskan genom filtret i en HPLC-injektionsflaska som innehåller en injektionsflaska.
- När instrumentet har ställts in för att köra den metod som beskrivs i manuskriptet för HPLC-analys, ladda flaskorna i karusellen för att motsvara provlistan.
- Få HPLC-kromatogram vid 320 nm och 280 nm som visar distinkta toppar som representerar olika fenolföreningar.
- Använd lämpliga standardkurvor, kvantifiera hydroxikinnaminsyror vid 320 nm eftersom de har maximal absorbans vid denna våglängd. Med samma princip kvantifiera hydroxibensoesyra vid 280 nm.
- Förvara de återstående extrakten vid -20 °C för andra analyser.
3. Fenolisk komposition
- Använd en vätskekromatograf med högt tryck (materialtabell) för att identifiera och kvantifiera de extraherade fenolföreningarna i proverna, baserat på metoden för J. Xiang, F.B. Apea-Bah, V. U. Ndolo, M.C. Katundu och T. Beta 4.
- Förbered fenolsyrastandarder (vanillinsyra, koffeinsyra, p-kumarinsyra, ferulinsyra och sinapinsyra) för att identifiera och kvantifiera beståndsdelar fenolföreningar i extrakten.
- För att göra detta, väg 1 mg av varje standard och lös upp i 1 ml 50% vattenhaltig metanol för att producera 1000 μg / ml av varje standard.
- Blanda lika stora volymer av alla fem standarderna i ett 2 ml gult centrifugrör för att producera en cocktail av standarder, var och en med en koncentration på 200 μg / ml.
- Förbered seriella utspädningar av standardcocktailen genom att ta en volym i ett nytt rör och späda med samma volym av det vattenhaltiga metanollösningsmedlet.
- Upprepa de seriella utspädningarna ner till en koncentration av 3,125 μg/ml.
- Späd också separat varje standard 40 gånger med lösningsmedlet för att erhålla 25 μg / ml koncentration av varje standard.
- Ställ in kolonntemperaturen på 35 °C och provugnstemperaturen på 15 °C.
- För att förbereda mobil fas A (0,1% vattenhaltig myrsyra), överför 1 ml myrsyra till en 1 L kapacitet volymetrisk kolv och tillsätt HPLC-grade vatten till 1 L-märket. Skaka väl för att blanda.
- För att förbereda mobil fas B (0,1% myrsyra i metanol), överför 1 ml myrsyra till en 1 L kapacitet volymetrisk kolv och tillsätt HPLC-kvalitet metanol till 1 L-märket. Skaka väl för att blanda.
- Justera volymerna till 1 L-märket om det behövs.
- Filtrera båda mobilfaserna genom ett hydrofilt filterpapper på 0,45 μm.
- För analysen, injicera 10 μL av varje extrakt eller standard (25 μg / ml standarder och standardcocktails) på omvänd faskolonn.
- Elute med de mobila faserna enligt det linjära gradientprogrammet för en 25 minuters körning enligt följande: 0-3,81 min, 9% -14% B; 3,81-4,85 min, 14%-15% B; 4,85-5,89 min, 15%-15% B, 5,89-8,32 min, 15%-17% B; 8,32-9,71 min, 17%-19% B; 9,71-10,40 min, 19%-19% B; 10,40-12,48 min, 19%-26% B; 12,48-13,17 min, 16%-28% B; 13,17-14,21 min, 28%-35% B; 14,21-15,95 min, 35%-40% B; 15,95-16,64 min, 40%-48% B; 16,64-18,37 min, 48%-53% B; 18,37-22,53 min, 53%-70% B; 22,53-22,88 min, 70%-90% B; 22.88-25.00 min, 90% B.
- Jämför retentionstiderna för kromatografiska toppar som erhållits för de autentiska standarderna för koncentrationer 25 μg/ml, vid 280 nm och 320 nm, med extraktens, för att identifiera de ingående fenolföreningarna i proverna.
- Plotta kalibreringskurvor för fenolsyra standardcocktails, med koncentration av standarderna på den horisontella axeln och toppområdet på den vertikala axeln
- Använd kalibreringskurvorna för att uppskatta koncentrationerna av de identifierade fenolföreningarna genom att jämföra toppområdena på tomten med de identifierade föreningarna vid 280 nm och 320 nm som nämnts i det tidigare avsnittet.
4. Totalt fenolinnehåll
OBS: Bestäm det totala fenolinnehållet i extrakten med hjälp av Folin-Ciocalteu-metoden som beskrivs av F.B. Apea-Bah et al.13.
- Förbered ferulinsyra- och gallinsyrastandarder inom koncentrationsområdet 0,025 till 0,150 mg/ml för att plotta kalibreringskurvor i jämförelse, för uppskattning av den totala fenolhalten.
- För att göra detta, väg noggrant 1 mg vardera av ferulinsyra och gallinsyrastandarder i centrifugrör med 2 ml kapacitet.
- Tillsätt 1 ml 50% vattenhaltig metanol till varje standard och virvel för att lösa upp, vilket ger 1 mg / ml lager av varje standard.
- Förbered en serie utspädningar från varje stamlösning i totalt 500 μL.
- Pipett 18,2 μL av varje extrakt eller standard i en separat brunn på en 96-brunns mikroplatta.
- Tillsätt 36,4 μL 10 % (v/v) vattenhaltigt Folin-Ciocalteu-reagens till varje extrakt eller standard.
- Tillsätt sedan 145,4 μL 700 mM natriumkarbonat till varje reaktionsblandning.
- Inkubera reaktionsblandningarna i mörkret vid rumstemperatur (20-25 °C) i 2 timmar.
- Läs absorbansen på en mikroplattläsare vid 750 nm.
- Plotta kalibreringskurvor för förändring i absorbans mot koncentration av fenolsyrastandarderna och använd dem för att uppskatta det totala fenolinnehållet.
- Uttryck resultaten som milligram ferulinsyraekvivalenter per gram malet prov (mg FAE/g) och milligram gallinsyraekvivalenter per gram malet prov (mg GAE/g) på torrviktsbasis.
5. Antioxidantanalyser
OBS: Bestäm antioxidantkapaciteten hos kornextrakten med hjälp av följande tre analyser: 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radikal rensningskapacitet; 2,2'-azino-bis (3-etylbensotiazolin-6-sulfonsyra (ABTS) radikal rensningskapacitet, som också kallas Trolox ekvivalent antioxidantkapacitet (TEAC); och syreradikalabsorberingskapacitet (ORAC).
- Förberedelse av Trolox-standarder för standardkurvor
- Använd Trolox, en vattenlöslig analog av vitamin E, som standard för att uppskatta fullkornsextraktens in vitro-antioxidantkapacitet .
- Väg noggrant 1 mg Trolox i ett 15 ml rör. Lös upp i 4 ml 50% vattenhaltig metanol. Virvel att lösa upp för att bereda en stamlösning av 1 mM (1000 μM).
- Förbered sex koncentrationer av Trolox, det vill säga 50, 100, 200, 400, 600 och 800 μM för att plotta standardkurvor för uppskattning av DPPH-radikalrensningskapacitet och Trolox-ekvivalent antioxidantkapacitet (TEAC). På samma sätt bereda 6,25, 12,5, 25 och 50 μM koncentrationer av Trolox för uppskattning av syreradikalabsorberingskapacitet (ORAC). Gör upp den totala volymen av varje koncentration till 500 μL enligt tabell 1.
- Utspädning av provextrakt
- Späd provextrakten med metanol före analys. Här späddes gula majs- och cowpea-extrakt två gånger, vete- och njurbönan späddes fem gånger medan sojabönextraktet späddes 10 gånger med metanol.
- Trolox ekvivalent antioxidantkapacitet (TEAC) analys
- Mät Trolox ekvivalent antioxidantkapacitet (TEAC) hos proverna med den metod som tidigare beskrivits av F.B. Apea-Bah et al.14.
- Väg 8,23 mg ABTS i ett rent 2 ml bärnstensfärgad centrifugrör.
- Väg sedan 1,62 mg kaliumpersulfat i ett annat rent 2 ml kapacitet bärnstensfärgad centrifugrör.
- Tillsätt 1 ml destillerat vatten till var och en av dem och virvel för att lösa upp dem.
OBS: Detta resulterar i 16 mM ABTS-stamlösning med 6 mM vattenhaltig kaliumpersulfatlösning. - Förbered ABTS-stamlösningen genom att blanda ABTS- och kaliumpersulfatlösningarna i lika stora volymer. Lösningen ändras omedelbart till en mörk färg.
- Inkubera reagensblandningen i mörkret i 12-16 timmar.
- Späd ABTS-stamlösningen 30 gånger med 200 mM fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att bilda ABTS-arbetslösningen. För att göra detta, tillsätt 58 ml 200 mM PBS till 2 ml av ABTS-stamlösningen. Arbetslösningen kommer att innehålla 0,27 mM ABTS och 0,1 mM kaliumpersulfat.
- För analysen, placera 10 μL av varje utspätt extrakt eller Trolox i en 96-brunns mikroplatta.
- Tillsätt 190 μL ABTS-arbetslösning till varje brunn och inkubera reaktionsblandningarna i 60 minuter.
- Mät absorbansen hos reaktionsblandningarna vid 750 nm i en mikroplattläsare.
- Använd Trolox-standarderna i en koncentration från 100 till 800 μmol / L för att rita en kalibreringskurva.
- Uppskatta ABTS radikala rensningskapacitet från kalibreringskurvan.
- Uttryck resultaten som mikromolekyl troloxekvivalenter per gram (μmol TE/g) prov på torrviktsbasis.
- DPPH-analys
OBS: Bestäm DPPH-radikalrensningskapaciteten hos proverna med hjälp av den metod som beskrivits tidigare av F.B. Apea-Bah et al.13. DPPH-antioxidantanalysen kräver en radikalgenererande förening, DPPH (2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl).- Väg exakt 1,2 mg DPPH i ett tomt centrifugrör med 50 ml kapacitet. Lös upp DPPH i 30 ml metanol för att bereda en 60 μmol / L metanollösning.
OBS: DPPH-analysen testar förmågan hos provextrakten att rensa fria radikaler som produceras av DPPH. - För analysen, tillsätt 5 μL av provextrakten eller Trolox-lösningen i mikroplattbrunnarna.
- Tillsätt sedan 195 μL av 60 μmol / L DPPH metanollösning och inkubera i 60 min.
- Mät reaktionsblandningens absorbans vid 515 nm.
- Använd Trolox-standarderna (50-800 μmol / L) för att rita en kalibreringskurva, med förändringen i absorbans på den vertikala axeln och Trolox-koncentrationerna på den horisontella axeln.
- Uppskatta DPPH-rensningskapaciteten från kalibreringskurvan.
- Uttryck resultaten som mikromolekyl troloxekvivalenter per gram (μmol TE/g) prov på torrviktsbasis.
- Väg exakt 1,2 mg DPPH i ett tomt centrifugrör med 50 ml kapacitet. Lös upp DPPH i 30 ml metanol för att bereda en 60 μmol / L metanollösning.
- Syreradikal absorbans kapacitet
- Bestäm syreradikalabsorberingskapaciteten (ORAC) hos proverna baserat på metoden för F.B. Apea-Bah et al.13.
- Börja med att förbereda Trolox-standarder för koncentrationerna 6,25, 12,5, 25 och 50 μM från en 1 000 μM Trolox-standardlösning i 75 mM kaliumfosfatbuffert (K2HPO4/KH2PO4).
- För att göra detta, väga 1 mg Trolox pulver och lösa upp i 4 ml av buffertlösningen under ultraljudsbehandling för att förbereda en 1,000 μM stamlösning.
- Ta sedan 50 μL av stamlösningen i ett centrifugrör med 2 ml kapacitet och späd med 950 μL buffertlösning för att erhålla 1 000 μL 50 μM Trolox-lösning.
- Pipettera 500 μL av 50 μM-lösningen i ett nytt rör och späd med samma volym buffert för att erhålla en 25 μM Trolox-lösning.
- Upprepa den seriella utspädningen av 25 μM för att erhålla 12,5 μM och upprepa sedan på samma sätt utspädningen av 12,5 μM för att erhålla 6,25 μM.
- Förbered lämpliga utspädningar av provextrakten.
- Späd de gula majs- och cowpea-extrakten 20 gånger, vete- och njurbönextrakten 50 gånger och sojabönextraktet 100 gånger med buffertlösningen.
- Överför 200 μL av varje prov eller Trolox-standard till brunnarna på en svart 96-brunns mikroplatta för automatisk pipettering.
- Fyll sedan de tre reagenstankarna som medföljer ORAC-utrustningen med följande: (1) buffertlösningen; (2) 0,816 nM fluorescein i bufferten. och (3) 153 mM 2,2′-azobis(2-amidinopropan)dihydroklorid (AAPH) i buffert.
- Placera dem i sina behållare för automatisk pipettering.
- Ställ in ORAC-maskinen och det automatiska pipetteringssystemet för analys, baserat på standardproceduren.
- För analysen, ställ in det automatiska pipetteringssystemet för att överföra 25 μL av varje utspätt extrakt eller standard till brunnarna i en klar botten svart 96-brunns mikroplatta.
- Tillsätt sedan automatiskt 150 μL 0,816 nM fluorescein i bufferten.
- Inkubera reaktionsblandningen vid 37 °C i 15 minuter i ORAC-maskinen.
- Därefter tillsätt automatiskt 25 μL av AAPH till varje reaktionsblandning.
- Ruva dem vid 37 °C i 50 minuter i ORAC-maskinen.
- Ställ in ORAC-maskinen för att mäta fluorescenssönderfall, under inkubationsperioden, vid excitations- och emissionsvåglängder på 485 nm respektive 520 nm.
- Efter mätningarna ritar du en Trolox-standardkurva, med Trolox (6,25-50 μM) på den horisontella axeln och fluorescensförfall på den vertikala axeln.
- Uppskatta syreradikalabsorberingskapaciteten hos extrakten från Trolox-standardkurvan.
- Uttryck resultaten som μmol TE/g-prov på torrviktsbasis.
- Statistisk analys
- Presentera alla resultat som medel ± standardavvikelse på minst tre exemplar.
- Utför variansanalys (ANOVA) för att bestämma effekten av korntyp på svarsvariablerna.
- Om det finns signifikanta skillnader vid p < 0,05, använd minst signifikant skillnad (LSD) för att jämföra medlen.
- Utför Pearson korrelationsanalys för att uppskatta förhållandet mellan fenolinnehållet och antioxidantkapaciteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabell 2 visar fenolsyrorna som identifierades i spannmåls- och baljväxtkornen. Baserat på tillgängliga autentiska standarder identifierades fyra fenolsyror i proverna och de är: vanillinsyra, koffeinsyra, p-kumarinsyra och ferulinsyror. Vanillinsyra är en hydroxibensoesyra medan de andra tre är hydroxikinnaminsyror. Vanillinsyra identifierades endast i Blackeye cowpea bean medan koffeinsyra endast identifierades i njurböna. p-Kumarinsyra identifierades i gul majs, cowpeaböna och sojabönor. Dess koncentration varierade mellan 7,57 och 12,48 μg /g mjöl på torrviktsbasis, där gul majs hade det lägsta värdet medan sojabönor hade det högsta värdet. Ferulinsyra var den enda fenolsyran som identifierades i alla prover. Dess koncentration varierade mellan 5,69 och 41,76 μg/g mjöl på torrviktsbasis. Bland proverna var ferulinsyrakoncentrationen högst i sojabönor följt av cowpeaböna medan vete, gul majs och njurböna hade jämförbara värden (tabell 2). När alla fenolsyrakoncentrationer summerades för varje prov minskade deras värden i följande ordning: sojabönor > cowpeaböna > gul majs = njurböna > vete.
Tabell 3 visade det totala fenolinnehållet (TPC) och antioxidantkapaciteten hos spannmåls- och baljväxtkornen. Antioxidantkapaciteten omfattade DPPH radikal rensningskapacitet, TEAC och ORAC. Summeringen av dessa tre värden gav därför provernas totala antioxidantkapacitet. TPC mättes både i ferulinsyraekvivalenter och gallinsyraekvivalenter för jämförelseändamål. TPC varierade mellan 1,16 och 2,78 mg FAE/g mjöl och 0,63 till 1,48 mg GAE/g mjöl, på torrviktsbasis. Oavsett motsvarande enhet minskade TPC för proverna i följande ordning: sojabönor > vete = gul majs = njurböna > cowpea bean.
DPPH:s radikalrensningskapacitet för proverna varierade mellan 4,48 och 14,87 μmol TE/g mjöl på torrviktsbasis. Sojabönor hade den högsta DPPH-rensningskapaciteten, följt av njurböna, medan gul majs och cowpeaböna hade jämförbara värden. Vete hade den lägsta förmågan att rensa DPPH-radikalen. Provernas troloxekvivalenta antioxidantkapacitet (TEAC) varierade mellan 12,82 och 57,24 μmol TE/g mjöl på torrviktsbasis. Återigen hade sojabönor det högsta TEAC-värdet, följt av njurböna och sedan vete, medan gul majs och cowpeaböna hade jämförbart låga TEAC-värden. Syreradikalabsorberingsförmågan hos proverna var mellan 0,35 och 1,67 μmol TE/g mjöl på torrviktsbasis, där spannmålskornen hade det lägsta värdet medan sojabönor hade det högsta värdet. När alla antioxidantkapaciteter summerades minskade deras värden i proverna i följande ordning: sojabönor > njurbönor > gul majs = cowpeaböna > vete.
Det fanns en stark positiv korrelation mellan de två TPC-värdena och värdena för TEAC, ORAC och total antioxidantkapacitet (TAC) (tabell 4). Det fanns dock svag korrelation mellan TPC-värdena och DPPH.
Figur 1: Hydroxibensoesyror identifierade i spannmål och baljväxter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Hydroxikinnaminsyror identifierade i spannmål och baljväxter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Beredning av Troloxkoncentrationer för DPPH- och ABTS-standardkurvor. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Fenolsyrahalten i vissa fullkornsspannmål och baljväxter. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: Total fenolhalt (TPC) och antioxidantkapacitet hos vissa fullkornsspannmål och baljväxter. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 4: Pearson korrelationsmatris för totalt fenolinnehåll och antioxidantkapacitet hos vissa spannmåls- och baljväxtkorn. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fullkornen valdes ut som representativa spannmålsprodukter och baljväxter som hittar breda livsmedelsapplikationer över hela världen. Medan variationer kan existera bland sorter av varje korn, var fokus för denna studie att visa en generaliserad metod för fri fenolsyraextraktion och analys för fullkorn. Extraktionsmetoden modifierades genom att avsevärt minska mängden prover och lösningsmedel för att minska mängden kemikalier som skulle släppas ut i miljön när sådana experiment utförs. Modifieringen möjliggör också fenolextraktion från milligrammängder fullkorn.
HPLC-analys producerar ett kromatogram av de ingående fenolsyrorna i provet. Varje kromatografisk topp som representerar en fenolsyra kan identifieras genom att jämföra dess retentionstid, vid en fördefinierad våglängd, med den för autentiska fenolsyrastandarder. Ultravioletta (UV) detektorer används normalt för att identifiera fenolsyror inom UV-våglängdsområdet. Hydroxibensoe syror identifieras vanligtvis mellan 254-280 nm medan hydroxikinnaminsyror vanligtvis identifieras mellan 300-330 nm15. Fotodiodmatrisdetektorer kan användas för att skanna hela UV-synliga våglängdsområdet och är särskilt användbara för att bestämma UV-synliga spektra av föreningar som finns i prover som aldrig har studerats. R. J. Robbins och S. R. Bean15 rapporterade följande våglängder för maximal absorption, för vanillinsyra, koffeinsyra, p-kumarinsyra respektive ferulinsyra: 260 nm; 325 nm; 310 nm; 325 nm. HPLC-identifieringsmetoden är normalt godtagbar för prover med känd fenolsyrasammansättning, vars retentionstider och UV-spektraldata tidigare har fastställts. Detta är viktigt eftersom vissa föreningar kan sameluera när god separation inte uppnås på kolonnen. För prover av okänd fenolsyrasammansättning används en masspektrometer utöver de autentiska standarderna för identifiering. Publicerad litteratur ger användbar information om fenolföreningar som tidigare har identifierats i provet som studeras eller i liknande prover 3,9,14. Det är värt att notera att under HPLC-analys är fenolsyratoppar i kromatogrammet identifierbara endast när autentiska standarder är tillgängliga för jämförelse. Det kan därför finnas andra toppar som inte kommer att kunna identifieras utan motsvarande standarder. Detta är en begränsning med HPLC-analys som kan övervinnas när HPLC kopplas till en masspektrometer. Därför kommer den totala koncentrationen av kvantifierade fenolsyror att bero på antalet fenolsyror som identifieras.
Folin-Ciocalteu-metoden, som först publicerades av V. L. Singleton och J. A. Rossi (1965)16 är en elektronöverföringsbaserad analys som används för att uppskatta TPC för en analyt17. Det är baserat på analytens förmåga att reducera fosfolybdat-fosfotungstat i ett alkaliskt medium och därigenom omvandla det från gult till en mörkblå lösning18. Absorbansen hos den resulterande lösningen kan sedan mätas vid 765 nm19. Reagenset är inte specifikt för fenolföreningar ensamma men kan reagera med flera andra föreningar med reducerande egenskaper såsom tioler, reducerande sockerarter och vissa aminosyror (t.ex. tyrosin). Därför föreslås att TPC kan användas för att uppskatta den reducerande egenskapen hos ett prov eller analyt17. Under fenolextraktionen utesluts de flesta interfererande föreningarna och eftersom fenolföreningar är de mest allestädes närvarande fytokemikalierna förblir Folin-Ciocalteu-analysen en användbar metod för att uppskatta TPC för ett prov. I de flesta prover vars fenolsammansättning inte är känd används gallinsyra som standard för att rita en kalibreringskurva för uppskattning av TPC. Men inte alla prover kommer att innehålla gallinsyra. I den aktuella studien använde vi ferulinsyra för att jämföra dess resultat med gallsyrans. Ett T-test med två prover visade att TPC bestämd som ferulinsyraekvivalent hade signifikant högre värden än TPC uttryckt som en gallinsyraekvivalent. Eftersom vi bekräftade att ferulinsyra var närvarande i alla prover baserat på vår HPLC-analys och andra rapporterade resultat, skulle vi luta oss mer mot att uttrycka TPC-resultaten som en ferulinsyraekvivalent. Det är användbart att uttrycka TPC i förhållande till en dominerande beståndsdel fenolförening i provet.
Med hjälp av tre olika antioxidantanalyser observerades att de olika kornen svarade olika i sina förmågor att rensa fria radikaler. DPPH radikal rensningskapacitet och TEAC-analys baseras på elektronöverföringsmekanism (ET) medan ORAC-analysen är baserad på väteatomöverföringsmekanism (HAT)20. Därför ger kombinationen av de tre analyserna en bättre indikation på antioxidantkapaciteten hos ett prov. Det är värt att notera att ORAC-analysen mäter ett provs förmåga att rensa den fysiologiskt relevanta peroxylradikalen, som i ett fysiologiskt system kan orsaka lipidperoxidation som är relaterad till skumcellsbildning och aterogenes21,22. Å andra sidan använder DPPH- och TEAC-analyser radikaler som inte är av fysiologisk relevans. Men deras användarvänlighet gör dem användbara som snabba metoder för att uppskatta ett provs radikala rensningskapacitet. ORAC-analys jämför också bra med andra in vitro- eller ex vivo-antioxidantanalyser som använder celler och DNA som biomarkörer23.
Alla metoder som beskrivs ovan för extraktion och identifiering av fria fenolsyror, uppskattning av totalt fenolinnehåll och bestämning av antioxidantegenskaper är inte standardiserade. Olika tillverkare av flytande kromatografiska kolonner rekommenderar olika gradientelueringssystem av lösningsmedel för att separera fenolsyror för deras identifiering. Även om Folin-Ciocalteu-metoden är den vanligaste för att uppskatta det totala fenolinnehållet i prover, utför olika laboratorier denna analys annorlunda. Detsamma kan sägas om antioxidantmetoderna. Det finns därför ett behov av harmonisering av dessa metoder för att främja jämförelse av resultat mellan laboratorier. Det finns också behov av att utveckla robusta prediktiva modeller som kan relatera fenolsyrasammansättningen till de antioxidantegenskaper som mäts med dessa viktiga analysmetoder.
Av denna studie dras slutsatsen att den lösningsmedelsextraktionsmetod som används är effektiv för att extrahera fria lösliga fenolsyror från mjölet av fullkornsspannmål och baljväxter, vilket underlättar deras identifiering och kvantifiering. HPLC-metoden möjliggör identifiering och kvantifiering av fritt lösliga fenolsyror i fullkornsextrakt, förutsatt att det finns autentiska standarder för jämförelse. Med hjälp av de tre olika antioxidantmetoderna: DPPH, TEAC och ORAC kan antioxidantkapaciteten hos fria lösliga fenolextrakt från fullkorn bestämmas effektivt baserat på väteatomöverförings- och elektronöverföringsmekanismerna. Denna studie bekräftar vidare att fullkorn skiljer sig åt i deras fenolsyrasammansättning och antioxidantkapacitet. Korrelationsanalysen visar att de uppmätta antioxidantkapaciteterna är relaterade till de ingående fenolsyrorna i de fullkornsfria lösliga extrakten. Även om både TEAC och DPPH rensar fria radikaler genom elektronöverföringsmekanism, korrelerade de annorlunda med TPC. Skillnaden i beteenden hos olika antioxidantanalyser kräver behovet av att bestämma antioxidantkapaciteten hos prover med hjälp av en mängd olika analyser. Bland de fem fullkorn som studerats har sojabönor den högsta fenolsyrakoncentrationen och motsvarande högsta antioxidantkapacitet. Studien visar också att fullkornsfria lösliga fenolsyror kan extraheras och deras antioxidantkapacitet studeras i så lite som 1 ml vattenhaltig metanollösning, vilket minskar mängden laboratoriekemikalier som släpps ut i miljön.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt det tekniska stödet från Alison Ser och Hannah Oduro-Obeng, liksom videoredigeringsstödet från Janice Fajardo och Miguel del Rosario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
References
- Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478 (2014).
- Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation. Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).
- Dykes, L., Rooney, L. W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits. Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).
- Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties. Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).
- Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids. Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).
- Beverly, R. L. Encyclopedia of Food Safety. Motarjemi, Y. 3, Academic Press. 309-314 (2014).
- FAO. Food Outlook - Biannual report on global food markets. Food and Agriculture Organization. , Rome, Italy. (2020).
- Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses. Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).
- Dueñas, M., Hernández, T., Estrella, I. Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents. Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).
- Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes. Foods. 5 (2), 27 (2016).
- Hefni, M. E., Amann, L. S., Witthöft, C. M. A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals. Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).
- AOAC. Official Methods of Analysis. 17th edn. , Association of Official Analytical Chemists. Gaithersburg, MD, USA. (2000).
- Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems. Heliyon. 6 (10), 05158 (2020).
- Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion. Food Chemistry. 197, Pt A 307-315 (2016).
- Robbins, R. J., Bean, S. R. Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids. Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).
- Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).
- Waterhouse, A. L. Determination of total phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 1, 1-8 (2002).
- Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).
- Esterbauer, H., Wäg, G., Puhl, H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).
- Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., Jürgens, G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).
- Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake. Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).
