Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית להקרנה בתגלית עופרת מבוססת שבר

Published: May 16, 2021 doi: 10.3791/62469
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 2, 1, 1
1Oncode Institute and Division of Biochemistry, the Netherlands Cancer Institute, 2Institute for Organic Chemistry and Chemical Biology, Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ), Johann Wolfgang Goethe-University

Summary

ניטור שינויים בטמפרטורת ההיתוך של חלבון יעד (כלומר,בדיקת משמרות תרמית, TSA) היא שיטה יעילה לבדיקת ספריות שברים של כמה מאות תרכובות. אנו מציגים פרוטוקול TSA המיישם פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית בסיוע רובוטיקה (nano-DSF) לניטור פלואורסצנטיות טריפטופן מהותית ופיזור גב אור להקרנת שברים.

Abstract

בדיקות משמרות תרמיות (TSAs) בוחנות כיצד טמפרטורת ההיתוך (Tm)של חלבון יעד משתנה בתגובה לשינויים בסביבתו (למשל. השירות של TSA, ובמיוחד של פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית (nano-DSF), הוקם לאורך השנים, הן למציאת תנאים המסייעים לייצב חלבון מסוים והן להסתכל על כריכת ליגנד על ידי ניטור שינויים ב- Tmלכאורה . מאמר זה מציג הקרנה יעילה של ספריית הקטעים (DSi-Poised) (DSi-Poised) (DSi-Poised) (768 תרכובות) על-ידי שימוש בננו-DSF, תוך ניטור Tm לזיהוי כריכת מקטעים פוטנציאלית. התנאים הקדם לגבי איכות החלבון והריכוז לביצוע ניסויי ננו-DSF מפורטים בקצרה ואחריו פרוטוקול שלב אחר שלב המשתמש במתקן רובוטי ננו-ליטר המשמש בדרך כלל במעבדות ביולוגיה מבנית להכנת הדגימות הנדרשות בלוחות 96-well. הפרוטוקול מתאר כיצד תערובות ריאגנט מועברות נימים הדרושים למדידות ננו-DSF. בנוסף, מאמר זה מספק פרוטוקולים למדידת דנטורציה תרמית (ניטור פלואורסצנטיות טריפטופן מהותית) וצבירה (ניטור פיזור גב אור) ואת השלבים הבאים להעברת נתונים וניתוח. לבסוף, נדונים ניסויי סינון עם שלושה יעדי חלבון שונים כדי להמחיש את השימוש בהליך זה בהקשר של קמפיינים לגילוי עופרת. ניתן להעביר בקלות את העיקרון הכולל של השיטה המתוארת לספריות קטעים אחרות או להתאים אותו לכלים אחרים.

Introduction

תוכניות גילוי סמים לעתים קרובות להתחיל על ידי הקרנת תרכובות כימיות על היכולת שלהם לקיים אינטראקציה עם ו /או לשנות את הפונקציה של מטרות סמים, לרוב חלבונים. מה שמכונה "להיטים" שנמצאים במסכים כאלה, מניחים את הבסיס לגילוי לידים חדשים ומועמדים לפיתוח, ולרוב התרופות החדשות המרישיונות בימים אלה. הזמינות של שיטות תפוקה גבוהה ולכן חיוני לסנן מספר עצום של מטרות זמינות עם מספר עצום של תרכובות שונות כדי לזהות במהירות את הכריכה ההדוקה שלהם או את יכולתם לווסת פונקציה ספציפית של היעד. לאחר זיהוי להיטים, השילובים המבטיחים ביותר של יעדי פגיעה נדחפים לצינור פיתוח תרופות נרחב באמצעות טכנולוגיות אחרות, לעתים קרובות יקרות וגוזלות זמן רב, כדי להבין "יחסי מבנה-פעילות" (SAR).

גישות ביולוגיה מבנית, כגון אלה המוצעות על ידי תוכניות הגישה במימון האיחוד האירופי "תשתית עבור NMR, EM, וצילומי רנטגן למחקר תרגום" (iNEXT) ויורשו הנוכחי iNEXT-Discovery, משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד את האינטראקציות של תרכובות רבות בפירוט רב תוך שיפור הזיקה ואת המאפיינים הפרמקולוגיים של הלהיטים הראשוניים על ידי בדרך כלל כמה סיבובים של כימיה סינתטית1. תרכובות מובילות שיוצאות מקמפיינים אלה של "מפגיעה למוביל" הופכות למועמדות לפיתוח ונכנסות ללימודים פרה-קליניים. מתודולוגיית הסינון המולקולרי המפותחת היטב יכולה להיות מסווגת בערך לשתי גישות, כלומר גילוי עופרת מבוסס ליגנד (LBLD) וגילוי עופרת מבוסס שבר (FBLD). בקמפיינים של LBLD, קולטני חלבון נבדקים עם כמה אלפי ליגנדים שנבחרו בקפידה (בהתבסס על מבנה הליבנדים הטבעיים או מבנה המטרה), או עם עשרות אלפי תרכובות רבות בספריות ליגנד דמויות סמים המכסות חלק גדול מהשטח הכימי.

בדרך כלל, התרכובות נבדקות עבור הפעילות המעכבת שלהם בבדיקת פעילות, בדרך כלל ניטור פונקציה אנזימטית. בקמפיינים FBLD2,3,4,5, עם זאת, כמה מאות תרכובות כי הם בדרך כלל קטנים יותר מאשר סמים (100-200 דלטון) נבדקים על יכולתם לקשור את היעד ישירות, ללא שימוש בבדיקת פעילות. כריכה זו עלולה להפריע לפעילות היעד וניתן למדודה על ידי שיטות ביופיסיות רבות המדווחות ישירות על יכולתם של שברים להיקשר ליעד, או בשיטות מבניות כגון קריסטלוגרפיה של קרנירנטגן 6 וספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית7, ולאחרונה, גם מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית. כאשר שברים נקשרים במקומות שונים הקרובים זה לזה על החלבון, ניתן לשלב את שברי הכריכה השונים, בדרך כלל בעלי זיקה נמוכה, באופן רציונלי כדי ליצור קבוצה קטנה של לידים שניתן ללמוד ביתר פירוט. התוצאה היא לעתים קרובות זיקה גבוהה יותר, תרכובות חזקות יותר, ומתודולוגיה זו החלה להניב מולקולות חשובות עם פוטנציאל קליני. הבחירה בספריית קטעים "אידיאלית" המנצלת קבוצות כימיות ביעילות הייתה תחום מחקר פעיל במשך שנים רבות8,9,10.

בעוד הדגש הראשוני היה על כיסוי שטח כימי מלא, תשומת הלב שלאחר מכן התמקדה על מתן שילוב כימי במורד הזרם של להיטי שבר לייצר תרכובות עופרת. מחקר כזה הוביל לספריות "צפויות". אלה מכילים שברים עם קבוצה פונקציונלית אחת לפחות המאפשרים כימיה סינתטית מעקב מהירה וזולה להתקדמות יעילה בלימוד SAR. אחת הפעילויות שזרזה iNEXT הייתה לעדכן את הספרייה התייצבת שפותחה על ידי חוקרים בקונסורציום מקור אור היהלום וגנומיקה מבנית. מאמץ משולב זה הביא לספריה DSi-Poised11, אשר אומתה גם בתוך iNEXT12. מאוחר יותר, ספריה זו הותאמת עם הזמינות של תרכובות במאגר REAL של Enamine Ltd., ארגון מחקר כימי ויצרן של אוספים גדולים של אבני בניין וספריות מורכבות להקרנה. DSi-Poised זמין כעת לכל אחד לרכישה, אך זמין גם במעבדות שותפות רבות של iNEXT-Discovery עבור פרויקטים נתמכים של סינון שברים.

לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן יוקרתיות וטכנולוגיות ביולוגיה מבנית של NMR יש יתרונות וחסרונות עבור FBLD. שניהם דורשים דגימות יעד מבודדות ומניבים את הפרטים האטומיים ברזולוציה גבוהה הנדרשים עבור FBLD. עם זאת, גבישים נחוצים לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, והרסיסים נקשרים לחללים באזורי החלבון המסודרים היטב שאינם מעורבים בבניית סריג הגביש התלת מימדי. פתרון NMR לעתים קרובות מניב להיטים שונים מקריסטלוגרפיה רנטגן, כפי שהוא אינו מושפע על ידי סביבת הגביש והוא טוב בזיהוי כריכה גם באזורי חלבון מסודרים חלקית. עם זאת, בעוד ניסויי NMR מבוססי ליגנד הם מהירים יחסית, הם עדיין דורשים כמות משמעותית של זמן וחומר וניתן לעשות זאת באופן שגרתי רק למטרות חלבון קטנות יחסית או תחומים. לצורך תעדוף תרכובות לניסויים קריסטלוגרפיים או NMR, נעשה שימוש בגישות ביופיסיות13,14,15.

מכיוון שפרוטוקולי מכשור וחישוב עדכניים מאפשרים הקרנה גבישית יעילה עבור FBLD על ידי קביעת מבנים וניתוח ~ 1,000 שברים ביעילות רבה, סדר עדיפויות זה הפך פחות חיוני במחקר מבוסס קרני רנטגן. עבור NMR עם זאת, רצוי להשתמש בניסויים זולים ומהירים יותר כדי לתעדף את הקרנת הספרייה ולחסוך זמן מכשירים על הציוד הקצה הגבוה ביותר. יחד עם זאת, שימוש בשילוב של טכנולוגיות שונות במהותן יכול לספק אישור עצמאי לאירועים מחייבים, או אפילו להיטים נוספים שאינם נאספים על ידי שימוש רק בקריסטלוגרפיה או בשיטת NMR. טכניקות קריסטלוגרפיות ו- NMR דורשות ציוד יקר מאוד ולעתים קרובות ניתן לעשות זאת רק במתקנים חיצוניים ייעודיים בעזרת מומחים מקומיים ומיומנים מאוד. בנוסף, ניתוח נכון של התוצאות דורש גם מומחיות גבוהה. בעוד תוכניות כגון iNEXT ו- iNEXT-Discovery הן דמוקרטיזציה גישה למתקנים כאלה16, זה כבר מוכר כי זול, מהיר, ותפוקה גבוהה FBLD הקרנה בשיטות אחרות יכול לעודד תוכניות הקרנת סמים במגוון רחב בהרבה של מעבדות. תוצאות כאלה יכולות לשמש כאינדיקציה לבניית שיתופי פעולה עם כימאים רפואיים, ולתעדף את ניסויי ההקרנה היקרים ביותר לתרכובות המבטיחות ביותר אם מתקני NMR וקריסטלוגרפיה מטילים הגבלות על מספר התרכובות שניתן לסנן.

ה- TSA יוצר שיטה ביופיסית מהירה, יעילה וזולה יחסית ונגישה17 שניתן להשתמש בה להקרנת FBLD. זה שימש בהגדרות מרובות, החל בסיוע למצוא תנאי חלבון יציבים לניסויי התגבשות18, למציאת תרכובות שנקשרות ליעדים ספציפיים בתאים19. TSAs שימשו גם למדידת קבועי הניתוק עבור חלבוני יעד מחייבי ליגנד, כמו כריכת ליגנד מוביל לעתים קרובות לשינויים ביציבות תרמית. בכל TSAs, השינוי בטמפרטורת denaturation של חלבון (יציבותו) נמדד כפונקציה של עליית טמפרטורה איטית. דרך יעילה לעקוב אחר denaturation חלבון על חימום היא על ידי DSF או Thermofluor, אשר כימות מרווה פלואורסצנטיות של צבע הידרופובי (בדרך כלל Sypro כתום) על אינטראקציה עם אזורים הידרופוביים חשופים של חלבון המתפתח עקב עליית הטמפרטורה.

Nano-DSF מתייחס בדרך כלל למדידה של היציבות התרמית של חלבון בהיעדר צבעים חיצוניים. אחד המכשירים הראשונים שהציעו אפשרות זו היה OPTIM1000 המודד ספקטרום רחב של עוצמת אור, כמו גם פיזור אור של מדגם. מכונה זו אפשרה מדידה סימולטנית של התפשטות חלבון (בדרך כלל בעקבות פלואורסצנטיות טריפטופן) וצבירת חלבונים (כפי שנוצר חלקיקים לגרום לעלייה של פיזור אור ב ~ 400 ננומטר). מאוחר יותר, הפרומתאוס הציג את השימוש בהשתקפות אחורית למדידת צבירה וזיהוי רגיש של אות הפלואורסצנטיות, המאפשר הקרנה של ריכוזי חלבון נמוכים עם רגישות טובה20. הסעיף הבא מתאר כיצד פרומתאוס שימש להדגמת פרוטוקול סינון שברים לאיתור כניסות למטרות חלבון שונות. מבוא קצר על איכות וכמות החלבון הצפויה מלווה בפרוטוקול שלב אחר שלב להכנת, ביצוע וניתוח ניסויי סינון הקטעים. תוצאות המיון של שלושה חלבונים הוצגו כנתונים לדוגמה שהושגו כחלק משיתוף פעולה של iNEXT-Discovery.

Protocol

הערה: החלבונים המשמשים בניסויים ננו-DSF צריך להיות טהור (>95%) הומוגני כפי שנשפט על ידי נתרן dodecylsulfate-polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה. לפני ביצוע מסך הקטע, יש לקבוע את יציבות החלבונים בתנאי חיץ שונים. חוזק יוני נמוך, חוצץ מלח נמוך שמפריע באופן מינימלי לחלבון צריך לשמש כדי לא להשפיע על האינטראקציה הישירה שלו עם שברים. המאגרים המשמשים בדרך כלל בפרוטוקול זה לבדיקת יציבות מוצגים בטבלה S1 משלימה. הריכוז של החלבון שצריך לשמש לניסוי זה כתמיסת מלאי הוא בדרך כלל 0.2 מ"ג מ"ל-1. להקרנת כל הספרייה DSi-צפוי (768 תרכובות), סך של ~ 12 מ"ל של חלבון של ריכוז זה, בסך הכל ~ 2.5 מ"ג, נדרש. ספריית DSi-Poised המשמשת בניסויים אלה סופקה בפורמט של 96 בארות(איור 1). ריכוז השברים הותאם ל-100 מ"מ ב-20% v/v דימתילסולפוקסיד (DMSO). יש לציין כי פרוטוקול הערבוב המתואר כאן גורם לריכוזים DMSO סופיים נמוכים של 0.4% v/v; למרות שזה מאוד לא סביר להשפיע על היציבות של החלבון, ההשפעה של DMSO צריך להיבדק עבור כל חלבון חדש.

Figure 1
איור 1:סוגי הצלחות המשמשים לניסויים אלה. (B)צלחת 96-באר. (C)מבט מקרוב על צלחת 96 באר המציגה את subwell 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

1. הכנת צלחת

  1. מוציאים צלחת שבר מהמקפיא -20 °C/-80 °C (50°F), ומניחים לה להפשיר בטמפרטורת החדר, עם רעד עדין על שייקר ספסל. צנטריפוגות את הצלחת ב 500 × g עבור 30 s כדי לאסוף כל טיפות דבק בצד של בארות.
    הערה: כמו ספריית קטע זמין מומס DMSO-d6 (נקודת התכה 19 °C (19 °F), זה חיוני כדי לוודא כי כל תרכובת מופשרת לחלוטין solubilized.
  2. קחו צלחת התגבשות MRC 2-well(איור 1A),ופיפטה 14.7 μL של תמיסה מלאי חלבון לתוך כל תת באר. כדי לעשות זאת בצורה יעילה בזמן, שמרו את החלבון במאגר ריאגנט(Table of Materials)והשתמשו בפיפטה רב-ערוצית לחלוקה(איור 2A,B).
    הערה: עבור ספריית DSi-צפוי, בהתאם לפורמט, לא כל בארות של צלחת 96-well מכילים תרכובות. בדרך כלל, שורות A, H ועמודות 1, 12 מלאות ב- DMSO. לפיכך, שורות A, H ועמודות 1, 12 אינן אמורות להתמלא בחלבון, שכן בארות אלה לא יכילו שברים בסוף השלב הבא; רק DMSO יועבר לשם על ידי הרובוט. שים לב שהשורות והעמודות הריקות שונות בחלק מהצלחות.

Figure 2
איור 2: מתאר של הליך סינון השברים. (A) שימוש בצינור רב-ערוצי ומאגר ריאגנט לחלוקת החלבון. (B)חלוקת החלבון בצלחת 96-well. (ג)חלוקת קטע על ידי רובוט המתקן. (D)העמסת החלבון לתוך הנימים. מגירההמציגה את מחזיק הנימים. (ו)מבט מקרוב על מחזיק נימי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: סקירה כללית של הציוד המשמש בניסויים אלה. (A)רובוט Nanodispenser המשמש לחלוקת שברים. מיקומי לוח מצוין. (B)ממשק תוכנית להגדרת לוח חדש. (ג)ממשק של תוכנית חלוקה. (ד)תוכנית חלוקת חלוקה המשמשת לחלוקת השברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. חלוקת ננו-רסיס על ידי רובוט היתושים

  1. בדוק את סוג הצלחת שבה מסופקים השברים(טבלת חומרים).
  2. בדוק הגדרות שבר וצלחת חלבון על היתוש.
    1. הדליקו את הננודיספנסר(איור 3A). ודא שאין מכשולים סביב הרכיבים הנעים.
    2. פתח את ממשק המשתמש הגרפי, לחץ על הכרטיסיה התקנה ותחת תצורת סיפון, בדוק אם סוג הצלחת שבה מסופקות התרכובות והצלחת שבה הועבר החלבון בסעיף 1 כבר נמצאים ברשימת הלוחות הזמינים. אם לא, לחץ על אפשרויות| לוחות ויצירת הגדרת לוחית חדשה על-ידי מילוי הערכים הנכונים עבור סוג המאפיין (איור 3B).
      הערה: ערכים אלה עבור צלחת MRC 2-well ואת צלחת 96-well המשמש בניסוי זה מוצגים טבלה משלימה S2 ו טבלה משלימה S3, בהתאמה.
  3. תוכנית חלוקה
    1. תחת הכרטיסיה התקנה, ציין את מיקומי הלוח תחת תצורת סיפון.
      הערה: היתוש המשמש בניסוי זה יש שתי עמדות צלחת על הסיפון. מיקום 1 מוגדר כצלחת המקור, ומיקום 2 הוא לוח היעד.
    2. באמצעות התפריט הנפתח, בחר צלחת תחתונה Greiner U עבור מיקום 1 ו MRC 2- צלחת טובה עבור מיקום 2 (איור 2C). שמור את הפרוטוקול.
  4. חלוקת קטעים
    1. הנח את צלחת הקטעים במיקום 1 ואת צלחת החלבון במיקום 2 של הסיפון (איור 3A).
    2. בכרטיסיה פרוטוקול (איור 3D), לחץ על קובץ ובחר את הפרוטוקול שנשמר בסעיף 2.3 לחלוקת הקטעים. הגדר את עוצמת הקול של השברים שיש לחלק; השתמש ב- 0.3 μL. עבור לוח טיפוסי, שבו עמודות 1 ו- 12 אינן מכילות קטעים, הגדר את מיקום ההתחלה לעמודה 2 ואת מיקום הסיום לעמודה 11. בלוחות מסוימים, אם עמודות 2 או 11 ריקות, השתמש בעמודות 3 ו- 10 כערכי התחלה וסיום, בהתאמה.
      הערה: עקב הגדרת היתושים, ניתן לדלג על עמודות בלבד, לא על שורות; עבור השורות, היתוש י pipette DMSO. ודא שהאפשרות שינוי עצה נבחרת כתמיד, כדי לא לזהם את ספריית הקטעים.
    3. לחץ על הפעל כדי להפעיל את התוכנית. לאחר חלוקה, אשר לוקח ~ 2 דקות, הושלם, להסיר את החלבון ואת לוחות שבר מהרובוט, ולאטום אותם בחזרה עם סרט איטום דבק. צנטריפוגות קצרות את צלחת החלבון (500 × גרם, 30 s) כדי לאסוף את כל טיפות דבק בצדי הבארות לפני שתמשיך לשלב הבא.

3. מדידה של ננו-DSF

הערה: תיאור מפורט אודות ביצוע TSAs באמצעות Prometheus NT.48 פורסם בעבר20. נקודות חשובות בהקשר של הקרנת קטעים מוזכרות כאן.

  1. בדיקת לוחית לפני המדידה
    1. בדוק חזותית את בארות צלחת החלבון עבור משקעים שאולי התרחשו עקב תוספת של שברים. אם משקעים נצפים בבארות רבות, להפחית את הריכוז של שברים, ולחזור על הניסוי.
      הערה: מומלץ לשמור על צלחת החלבון בטמפרטורת החדר; השברים נוטים להיות מסיסים בטמפרטורות נמוכות יותר.
  2. הכנת הפרומתאוס
    1. תדליק את מכשיר הפרומתאוס. במסך המגע, לחץ על פתח מגירה כדי לגשת למודול הטעינה הנימי של המכשיר. הסר את הפס המגנטי ממודול הטעינה, ונקה את המראה עם אתנול כדי להסיר את כל חלקיקי אבק.
  3. מעבירים מצלחת שברי החלבון לנומים
    הערה: שלב זה כרוך בהעברת דגימת החלבון/שבר המעורבת מכל באר בצלחת החלבון אל הנימים לשימוש עם הפרומתאוס. בשביל זה, למרות סוג נימי סטנדרטי משמש בדרך כלל, ניתן להשתמש נימים רגישות גבוהה עבור ריכוזי חלבון נמוכים מאוד.
    1. מניחים את צלחת החלבון ואת הנימים ליד המכשיר כדי שתהיה להם גישה קלה למודול הטעינה הנימי.
    2. קח נימי אחד, להחזיק אותו בקצה אחד, ולגעת בתמיסה בצלחת החלבון עם הקצה הרחוק של נימי כדי להעביר את המדגם על ידי פעולה נימית. תמיד ללבוש כפפות, ולהקפיד לא לגעת נימי באמצע, כמו זיהומים(למשל.,חלקיקי אבק) מן הכפפות ישפיעו על המדידה.
    3. מניחים את הנימי בעמדה המיועדת של המחזיק, מוודאים שהוא מיושר ומרוכז כראוי.
    4. חזור על שלבים 3.3.2 ו- 3.3.3, ובכך למלא את כל המיקומים במודול הטעינה. טען את כל נימים תצטרך למדידה.
      הערה: עבור ריצה אחת, ניתן לטעון מקסימום של 48 נימים.
    5. בסוף, מניחים את הפס המגנטי על גבי הנימים כדי להחזיק אותם במקומם, ולחץ על סגור מגירה כדי להתחיל את הניסוי.
  4. בצע את ניסוי nano-DSF
    1. סריקת פלואורסצנטיות
      1. פתח את יחסי הציבור של יישום פרומתאוס. ThermControlוצור פרוייקט חדש על-ידי לחיצה על התחל הפעלה חדשה בשם ProteinName_ScreenName_PlateNumber. ראשית, לעשות סריקת דיסקברי כדי לזהות את הפלואורסצנטיות של הדגימות.
        הערה: רמות הפלואורסצנטיות צריכות להיות באופן אידיאלי מעל 3,000 ספירות עבור כל דגימה. דגימות שיש להן פלואורסצנטיות מעל מגבלת הרוויה של המכשיר (20,000 ספירות) לא יימדדו.
      2. שנה את אות הפלואורסצנטיות של הדגימות על-ידי התאמת כוח העירור של הלייזר (איור 4).
    2. דנטורציה תרמית
      1. לחץ על הכרטיסיה סריקת התכה. כדי לבצע את הניסוי, הגדר את טמפרטורת ההתחלה ל -20 °C (55 °F), את טמפרטורת הקצה ל-95 °C (55 °F) ואת שיפוע הטמפרטורה ל-1 °C (55°F)-1° . לחץ על התחל מדידה.
    3. ביאור הניסוי
      1. לאחר תחילת הניסויים, לחץ על הכרטיסיה ביאור ותוצאות. ביאור כל נימי על ידי מתן לו צלחת ייחודית - ומספר טוב.
        הערה: לדוגמה, נימי 1B2 יתאים לוח 1 וגם B2. בכרטיסייה זו, עמודות נוספות ניתן להוסיף עבור הניסוי, למשל .,שם חלבון, חוצץ, ריכוז חלבון. לאחר סיום הניסוי, התוצאות מוצגות גם בכרטיסיה זו. זהו זמן טוב לעצור בסוף היום; הניסויים מתקיימים בן לילה, ניתן לאסוף את התוצאות למחרת.
    4. תצוגה חזותית וייצוא של נתונים
      1. לאחר סיום הניסוי, לחץ על הכרטיסיה סריקת התכה כדי להציג את עקומות ההיתוך והפזור עבור הדגימות. כדי לייצא את התוצאות בגיליון אלקטרוני, לחץ על הכרטיסיה סריקה נמסה, לחץ על ייצואובחר יצא נתונים מעובדים מהתפריט הנפתח.

Figure 4
איור 4: התאמת כוח העירור ואות הפלואורסצנטיות. (A)ב-80% כוח עירור, אות הפלואורסצנטיות עבור רוב הדגימות חורג ממגבלת הרוויה. (B)אות הפלואורסצנטיות מצטמצם לרמות מדידות על ידי הפחתת כוח העירור ל -60%. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

4. איטרציה

  1. חזור על שלבים 1-3 כדי לבצע 16 ריצות בספריית Enamine כולה של 768 תרכובות (16 × 48 = 768).
  2. כאשר המדידה של כל צלחת אורכת ~ 1.5 שעות כדי להשלים, להשלים את הביאורים (3.4.3), ולהכין את צלחת שברי חלבון הבאה על ידי חזרה על שלבים בסעיפים 1 ו -2.
    הערה: ביום עבודה טיפוסי, ניתן למדוד 4-6 צלחות, בהתאם לחוויה. ניתן לסיים את ההקרנה של ספריית DSi כולה תוך 3-4 ימים.

5. ניתוח נתונים

  1. בחינת הנתונים שנוצרו
    1. לאחר השלמת כל ריצה, לחץ על הכרטיסיה ביאורים ותוצאות כדי להציג את התוצאות. עבור כל מדגם, התמקד בשני ערכים מחושבים החשובים ביותר בסקירה זו: 1) טמפרטורת תחילת הפיזור (Onset #1 לפיזור), המציינת את הטמפרטורה בתחילת אירועי פיזור מדגם מוגברים ומאופיינת בצבירה; 2) הערך Tm (נקודת פיתול #1 עבור Ratio) המופק מהיחס בין אירועי פלואורסצנטיות בערכי 330 ו- 350 ננומטר המתאימים בדרך כלל לשינויים המקסימליים של פלואורסצנטיות טריפטופן עם שינויים בסביבתו.
    2. הקפד לבדוק את הפיזור ואת עקומות ההיתוך עבור כל נימי בכרטיסיה סריקת התכה כדי לוודא שערכים אלה אמינים.
  2. ייצוא ובדיקה לגיליון אלקטרוני
    1. יצא את הנתונים מכל הריצות השונות לבדיקה לתוכנת גיליון אלקטרוני, כמתואר ב- 3.4.4, וליצור טבלאות והתווייות מבט כוללות. לחץ על הגליונות השונים בקובץ הגיליון האלקטרוני כדי לציין את המידע בכל גיליון.
      1. בגיליון מבט כולל, שים לב שכל שורה תואמת לניסוי אחד. לאורך סקירה כללית של פרמטרים (לדוגמה,התחלה וסיום), שים לב לערכים המחושבים עבור Tm ואת תחילת הפיזור (ראה 5.1 לעיל לשמות והסברים, וקבצים משלימים 1 ו -2 לדוגמה). כאשר התוכנה מחשבת שני ערכי Tm או יותר (נקודת הטיה #1 ו- #2 עבור Ratio) עבור דגימות מסוימות, עיין בעקומת המעבר הנמסה כדי לקבוע איזה מערכי Tm נכון.
      2. בגיליון Ratio, שים לב שכל עמודה תואמת לדוגמה, וכל שורה לנתונים שנקראו בכל שלב בטמפרטורה. שים לב לערכי ספירת הפלואורסצנטיות המתאימים לכל שלב בטמפרטורה, והשתמש בהם כדי להתוות את עקומות ההיתוך עבור דגימות ספציפיות, התוויית עמודת הטמפרטורה כנגד עמודת ספירת הפלורסצנטיות. שים לב שהנתונים ביחס (נגזרת ראשונה), 330 ננומטר, 330 ננומטר (נגזרת ראשונה), 350 ננומטר, 350 ננומטר (נגזרת ראשונה) משמשים לחישוב היחס והנגזרת הראשונה שלו (שיש לה מקסימום בקצב השינוי המרבי) בתבנית דומה.
      3. שים לב לנתונים דומים לפיזור בגיליון הפיזור. צור את עקומת הפיזור עבור כל מדגם על-ידי התוויית עמודת הטמפרטורה כנגד עמודת הפיזור. חפש את הגיליון עבור הנגזרת הראשונה של הפיזור.
  3. יצירה ואימות של מבט כולל כללי עבור כל הקטעים
    1. לאחר אימות ערכי Tm הנכונים עבור הקטעים, שלב את העמודות מזהה לדוגמה ונקודת פיתול של יחס של 330/350 ננומטר (Tm)מכל הריצות בקובץ תוצאות חדש יחיד, תוך העתקת עמודות אלה מכל הפעלה.
    2. השתמש בערך Tm הממוצע של החלבון המקומי (מחושב בדרך כלל מעל עשר ריצות) ולהחסיר אותו מערכי Tm של כל דגימה, כדי לקבל את ΔTm. מיין את התוצאות מעל ΔTm בסדר יורד כדי לזהות את הדגימות שגורמות לשינוי הגדול ביותר.
    3. חלקו את הקטעים לפחים בהתאם להזזת ΔTm, ויצרו טבלת תדרים עבור הספריה כולה על-ידי התוויית ה- ΔTm עבור כל סל כנגד מספר הקטעים (איור 5). לנוחות, הצג את הציר המייצג את מספר הקטעים בסולם יומן הרישום. סל הדגימה עם ΔTm ±1, ולהתאים את הסלים האחרים לכל ריצה כדי להתאים את מספר החצאים באופן אמפירי.

Representative Results

מסך מלא של ספריית DSi-Poised (768 שברים) בוצע על שלושה חלבונים בעלי עניין רפואי, כלומר, הקינטוצ'ורה החיצונית שבאה לידי ביטוי בחלבון מסוג סרטן 1 (Hec1, או Ndc80), תחום הטטרריקואופפטיד הרגולטורי (TPR) של ציר קינאז מונופולרי 1 (Mps1), ופרוטאז דמוי SARS-CoV-2 3C, Nsp5, אשר מבקע את C-טרמינל של פוליפרוטאין משוכפל ב -11 אתרים. תנאי החיץ שנבחרו עבור כל חלבון, כמו גם ריכוז החלבון ו- Tm של החלבונים, מוצגים בטבלה משלימה S4.

Figure 5
איור 5: התפלגות תדירות השינוי בטמפרטורת ההיתוך (ΔTm)עבור שלושת החלבונים, Hec1, Mps1 ו-Nsp5, המוצגים במחקר זה כתוצאות מייצגות. קיצורים: Hec1 = מתבטא מאוד בחלבון סרטן 1; Mps1 = ציר מונופולרי קינאז 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C דמוי פרוטאז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

התוצאות של שלוש ההקרנות באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, המוצגות כהתפלגות התדירות של השינוי ב- Tm לעומת מספר הקטעים, מוצגות באיור 5. חלקות אלה נוצרו כמתואר בסעיף 5.3 של הפרוטוקול, התוויית תדירות השינוי הנצפה ב- Tm. את משמעות השינוי יש להגדיר באופן סובייקטיבי עבור כל פרויקט אחר, כמתואר בסעיף הדיון להלן. ערכים שליליים מצביעים על ירידה בטמפרטורת ההיתוך בנוכחות קטע, ערך חיובי עלייה ב- Tm. ממזימות כאלה, קל להבחין כי עבור Nsp5, כל השברים יש השפעה מערערת, ואילו עבור Hec1 ו Mps1, הן להיטים מייצבים ומערערים נצפים. זה צפוי וידונו.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטת תפוקה בינונית עד גבוהה להקרנת ספריות מקטעים באמצעות כמה רובוטיקה נפוצה וכלי מדידה. מסכים כמו אלה המתוארים בפרוטוקול זה יכולים להתבצע באופן שגרתי על ידי מתקן החלבון NKI באמסטרדם, למשל כשירות iNEXT-Discovery, לעתים קרובות אפילו בחינם למשתמשים לאחר יישום הצעה וביקורת עמיתים. במקרים כאלה, הספרייה DSi-Poised יכולה להיות מסופקת על ידי המתקן, אך ניתן לדון בשימוש בספריות אחרות גם בהקשר של כל יישום משתמש והסכם שירות שונים. בחירת המכשירים בפרוטוקול זה מייצגת פתרונות מעשיים למעבדות רבות, אך אין לראות בהן תקן זהב. שיטות ללא תוויות מומלצות למדידת היציבות התרמית של חלבון היעד להקרנת שברים, ולא בשיטות המשתמשות בתוויות רגישות לסביבה לאיתור התגלגלות בתרמוציקלופלר תגובת שרשרת פולימראז הפוך.

לשיטות ללא תוויות, כמו זו המוצגת כאן באמצעות מכשיר פרומתאוס, יש כמה יתרונות: הם משתמשים בכמויות נמוכות של חלבון, לעתים קרובות כמה סדרי גודל פחות; הם יכולים לשמש בו זמנית למדוד פיזור של המדגם ובכך צבירה; והתוויות המשמשות לזיהוי התגלות בגישות אחרות יכולות לקיים אינטראקציה שונה עם כל קטע, וכתוצאה מכך חפצים מדידה. פרוטוקול זה תואר בהקשר של רובוט יתוש, המאפשר pipetting של נפח קטן מאוד של מדגם (0.3 μL) כי לא ניתן לעשות באופן ידני. היתוש הוא רובוט פופולרי, נוכח במעבדות רבות עובד על ביולוגיה מבנית ופרויקטים גילוי סמים; עם זאת, הפרוטוקול יכול בבירור להשתמש בגישות חלופיות עבור pipetting בנפח נמוך.

ספריות קטעים מכילות תרכובות המומסות ב- DMSO. אחד האתגרים הראשוניים הוא למצוא את ריכוז DMSO האופטימלי שבו החלבון נשאר יציב, ואת התרכובות להישאר מסיס. זה כרוך בביצוע המדידות בריכוזים שונים של DMSO כדי לקבוע את התנאים האופטימליים להקרנה. החלבון כדי לפצל דילול בשימוש כאן תוצאות ריכוזי DMSO של 0.2%; רוב החלבונים יציבים למדי בתנאים אלה. כמות החלבון הנדרשת לביצוע ההקרנה לספרייה 768-מתחם הוא ~ 2-3 מ"ג בסך הכל, כמו המדידות מתבצעות בדרך כלל בריכוזים חלבון נמוך (0.2 מ"ג מ"ל-1). עבודה עם ריכוזי חלבון נמוכים יחסית לא רק מפחיתה את עלויות ייצור החלבון, אלא גם מפחיתה את הסיכויים למשפכי חלבון. ריכוז החלבון הנמוך אינו משפיע על זיהוי כריכת שברים, שכן ריכוז השברים בניסוי הוא ~ 2 mM, ומאפשר גם קלסרים חלשים להיות מזוהים.

מכיוון שגילוי המעבר הנמס בניסויים אלה מבוסס על עוצמת פלואורסצנטיות, היבט קריטי הוא לקבוע את כוח העירור של הלייזר שבו ניתן לבצע את המדידות. האינטראקציה של התרכובות עם החלבון יכול (i) אין השפעה על הפלואורסצנטיות המהותית שלה, (ii) לגרום מרווה, או (iii) להגדיל את הפלואורסצנטיות המהותית שלה. בנוסף לכך, עבודה עם ריכוזי חלבון נמוכים פירושה שספירת הפלואורסצנטיות של החלבון המקומי תהיה נמוכה. לכן יש להתאים את כוח העירור באופן כזה שניתן למדוד את רוב הדגימות. פרופיל הפיזור של כל ריצה מספק מידע חשוב אודות אפקטי הצבירה שעשויים להיות מופעלים על-ידי הוספת מקטע כלשהו. בנוסף, ההשפעה של טמפרטורה על מסיסות מתחם ניתן לראות גם על פרופיל הפיזור.

באופן בלתי צפוי, עבור תרכובות רבות נצפתה כי הפיזור דווקא ירד עם טמפרטורה עולה(איור 6). לכן חשוב להסתכל הן על עקומת המעבר ההיתוך והן על פרופיל הפיזור הנלווה כדי להחליט על האמינות של כל ניסוי, במיוחד עבור אותם שברים הנחשבים מועמדים למדידות תובעניות יותר על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או ספקטרוסקופיית NMR, או אפילו נחשבים ללהיטים לכימיה של מעקב. מגבלה ספציפית אחת של השיטה למטרות סינון קטעים היא שלשברים רבים בספרייה DSi-Poised יש פלואורסצנטיות מהותית משמעותית, לפעמים אפילו מעבר למגבלת הרוויה של הגלאי, ולכן לא ניתן לסנן אותם כראוי עבור איגוד היעד גם בכוח עירור נמוך. נקודה נוספת שיש לציין לשיטה זו היא כי זה יכול לשמש רק עם חלבונים המכילים שאריות טריפטופן.

Figure 6
איור 6: השפעת הטמפרטורה על מסיסות מורכבת. עקומת מעבר נמסה ופרופיל פיזור של Hec1 עם שתי תרכובות שונות. (A)פרופיל הפיזור מראה כי עבור מדגם זה, המסיסות אינה מושפעת מהטמפרטורה. (B)פרופיל הפיזור מראה כי המסיסות של מדגם זה עולה עם טמפרטורה עולה. עקומת המעבר הנמסה במקרה זה אינה אמינה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שאלה פתוחה היא מה צריך להיחשב כשינוי משמעותי ב- Tm, לא מנקודת מבט מתמטית, אלא מנקודת המבט המעשית: איזה שינוי ב- Tm חשוב לשקול כמעיד על כריכה של ליגנד לחלבון? בדוגמאות אלה, משמרות של פחות מ 1 °C (74% של שברים עבור מחייב Hec1, 66% עבור Mps1, ו 53% עבור Nsp5. בהתחשב 1 °C כמו "שינוי משמעותי" בקושי יספק להיטים כי הם ראויים להמשיך על ידי כימיה מעקב. בגרפים הסקירה הכללית (איור 5), נחשבו פחים של 1, 2, 5 או יותר מ- 5 מעלות של משמרת Tm, חיובית או שלילית. זה דורש שינוי על פי כל מקרה ספציפי כדי לתת סקירה טובה ולאפשר קבלת החלטות מושכלת, קביעת השלב הבא. ראוי לציין, עבור חלבונים מסוימים, הן ייצוב דה ייצוב של היעד נצפו בהתאם שברים נחשב. שני האירועים מעניינים, שכן שניהם יכולים להיות תוצאה של כריכת שבר, ושניהם יכולים להוביל למולקולת מעקב טובה כדי לתפעל התנהגות חלבון.

נותרה שאלה אחרונה, כלומר, "מה מגדיר להיט שימושי?". למעשה, התשובה תלויה במצב הספציפי. לדוגמה, עבור Hec1, כל השברים המייצבים את החלבון ביותר מ-2 מעלות או מערערים אותו ביותר מ-5 הועברו למשתפי הפעולה הכימיים שלנו, שעיצבו מולקולות חדשות המבוססות על להיטים אלה. עבור Nsp5, עם זאת, הלהיטים המדכאים ביותר הועברו למשתפי הפעולה שלנו ב- NMR כדי לאשר את הלהיטים שמקורם ב- nanoDSF בניסויי NMR. במילים אחרות, יש לנתח את תוצאות הסינון המתקבלות מפרוטוקול זה בזהירות ובאופן תלוי הקשר, קבלת החלטות מושכלות המבוססות על השאלה הספציפית והמתודולוגיה הסובבת. בכל מקרה, השיטה המתוארת כאן היא גישה משלימה למתודולוגיות קיימות כגון רנטגן והקרנה מבוססת NMR, אשר יכולה לשאוף לאשר, לתעדף או לתת רעיונות חדשים לקמפיינים בכימיה.

טבלה משלימה S1: רשימת מאגרים המשמשים להקרנת חלבונים. קיצורים: HEPES = 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזינתאנסולניק; DTT = dithiothreitol; MOBS = 4-(N-מורפולינו)חומצה בוטאנסולפונית. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה S2: מאפיינים עבור MRC 2-צלחת טובה לשימוש עם רובוט nanodispenser. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה S3: מאפיינים עבור צלחת V-תחתון 96-well לשימוש עם רובוט nanodispenser. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה S4: המאגר, ריכוז החלבון וה- Tm של החלבונים שנדונו בתוצאות מייצגות. קיצורים: DTT = dithiothreitol; Hec1 = מתבטא מאוד בסרטן 1 חלבון; Mps1 = ציר מונופולרי קינאז 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C דמוי פרוטאז. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

קובץ משלים 1: כללית כללית-נתונים לדוגמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: ערכי Tm ו- ΔTm עבור 406 מקטעים לדוגמה. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Disclosures

אין גילויים.

Acknowledgments

"עבודה זו נהנתה מגישה למתקן החלבון NKI, מרכז Instruct-ERIC. תמיכה כספית ניתנה על ידי iNEXT, מספר הפרויקט 653706, ו- iNEXT-Discovery, מספר הפרויקט 871037, במימון תוכנית Horizon 2020 של הנציבות האירופית".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ClearVue Sheets Molecular Dimensions adhesive sealing film for protein plate
CORNING 6570 Aluminium Sealing Tape CORNING adhesive sealing film for fragment plate
DSi poised library Enamine Fragment library containing 768 compounds used in this study
Elisa Reagent Reservior ThermoFisher Scientific 15075 Reagent reservior used for pipetting the protein
Greiner round (U) bottom plates Cat. No. 650201 Fragments supplied in these plates
Mosquito type X1 sptlabtech Part nr- 3019-0003 Nanolitre dispenser
MRC 2-well crystallization plate MRC96T-PS
Pierce ELISA Reagent Reservoirs Pierce
Prometheus High Sensitivity capillaries Catalog PR-C006
Prometheus NT.48 nanoDSF Nanotemper Catalog nr PR001 (+ Aggregation Detection Optics, catalog nr PR-AGO) nanoDSF and light back scattering
Prometheus Standard capillary type Catalog PR-C002
TX-1000 Thermoscientific Centrifuge for plates

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffer, L., Muller, C., Roche, P., Morelli, X. Chemistry-driven hit-to-lead optimization guided by structure-based approaches. Molecular Informatics. 37 (9-10), 1800059 (2018).
  2. Lamoree, B., Hubbard, R. E. Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD). Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).
  3. Ress, D. C., Congreve, M., Murray, C. W., Carr, R. Fragment-based lead discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 660-672 (2004).
  4. Carr, R. A. E., Congreve, M., Murray, C. W., Rees, D. C. Fragment-based lead discovery: Leads by design. Drug Discovery Today. 10 (14), 987-992 (2005).
  5. Bradley, A. R., et al. The SGC beyond structural genomics: Redefining the role of 3D structures by coupling genomic stratification with fragment-based discovery. Essays in Biochemistry. 61 (5), 495-503 (2017).
  6. Davies, T. G., Tickle, I. J. Fragment screening using X-ray crystallography. Topics in Current Chemistry. 317, 33-59 (2012).
  7. Ma, R., Wang, P., Wu, J., Ruan, K. Process of fragment-based lead discovery - A perspective from NMR. Molecules. 21 (7), 854 (2016).
  8. Troelsen, N. S., Clausen, M. H. Library design strategies to accelerate fragment-based drug discovery. Chemistry. 26 (50), 11391-11403 (2020).
  9. Shi, Y., von Itzstein, M. How size matters: Diversity for fragment library design. Molecules. 24 (15), 2838 (2019).
  10. Taylor, A., Doak, B. C., Scanlon, M. J. Design of a fragment-screening library. Methods in Enzymology. 610, 97-115 (2018).
  11. Cox, O. B., et al. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).
  12. Sreeramulu, S., et al. NMR quality control of fragment libraries for screening. Journal of Biomolecular NMR. 74 (10-11), 555-563 (2020).
  13. Pfaff, S. J., Chimenti, M. S., Kelly, M. J. S., Arkin, M. R. Biophysical methods for identifying fragment-based inhibitors of protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1278, 587-613 (2015).
  14. Fattori, D., Squarcia, A., Bartoli, S. Fragment-based approach to drug lead discovery: Overview and advances in various techniques. Drugs in R & D. 9 (4), 217-227 (2008).
  15. Winter, A., et al. Biophysical and computational fragment-based approaches to targeting protein-protein interactions: Applications in structure-guided drug discovery. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (4), 383-426 (2012).
  16. Boelens, R., et al. iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
  17. Zhang, R., Monsma, F. Fluorescence-based thermal shift assays. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 13 (4), 389-402 (2010).
  18. Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).
  19. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  20. Bruce, D., Cardew, E., Freitag-Pohl, S., Pohl, E. How to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the Virus-X Project. Journal of Visualized Experiments JoVE. (144), e58666 (2019).

Tags

ביוכימיה גיליון 171 בדיקת משמרות תרמיות הקרנת שברים עיצוב סמים SARS-CoV-2 Nsp5 Hec1 Mps1
פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית להקרנה בתגלית עופרת מבוססת שבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmad, M. U. D., Fish, A., Molenaar, … More

Ahmad, M. U. D., Fish, A., Molenaar, J., Sreeramulu, S., Richter, C., Altincekic, N., Schwalbe, H., Wienk, H., Perrakis, A. Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery. J. Vis. Exp. (171), e62469, doi:10.3791/62469 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter