Nano-differensialskanning fluorimetri for screening i fragmentbasert blyoppdagelse

Summary

Overvåking av endringer i smeltetemperaturen til et målprotein (dvs.termisk skiftanalyse, TSA) er en effektiv metode for screening av fragmentbiblioteker av noen få hundre forbindelser. Vi presenterer en TSA-protokoll som implementerer robotisert nano-differensialskanning Fluorimetry (nano-DSF) for overvåking av iboende tryptofan fluorescens og lys back-scattering for fragmentscreening.

Abstract

Termiske skiftanalyser (TSAer) undersøker hvordan smeltetemperaturen (T_m) til et målprotein endres som følge av endringer i miljøet (f.eks.buffersammensetning). Nytten av TSA, og spesielt av nano-Differensialskanning Fluorimetry (nano-DSF), har blitt etablert gjennom årene, både for å finne forhold som bidrar til å stabilisere et bestemt protein og for å se på ligandbinding ved å overvåke endringer i den tilsynelatende T_m. Dette dokumentet presenterer en effektiv screening av Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) fragmentbibliotek (768 forbindelser) ved bruk av nano-DSF, overvåking T_m for å identifisere potensiell fragmentbinding. Forutsetningene for proteinkvalitet og konsentrasjon for å utføre nano-DSF-eksperimenter er kort skissert etterfulgt av en trinnvis protokoll som bruker en nano-liters robotdispenser som vanligvis brukes i strukturelle biologilaboratorier for å forberede de nødvendige prøvene i 96-brønnsplater. Protokollen beskriver hvordan reagensblandingene overføres til kapillærene som trengs for nano-DSF-målinger. I tillegg gir dette dokumentet protokoller for å måle termisk denaturering (overvåking av innebygd tryptofan fluorescens) og aggregering (overvåking av lys back-scattering) og de påfølgende trinnene for dataoverføring og analyse. Til slutt diskuteres screeningeksperimenter med tre forskjellige proteinmål for å illustrere bruken av denne prosedyren i sammenheng med blyoppdagelseskampanjer. Det overordnede prinsippet for metoden som er beskrevet, kan enkelt overføres til andre fragmentbiblioteker eller tilpasses andre instrumenter.

Introduction

Narkotikaoppdagelsesprogrammer starter ofte med å screene kjemiske forbindelser for deres evne til å samhandle med og / eller endre funksjonen til narkotikamål, oftest proteiner. De såkalte "hits" som finnes i slike skjermer, legger grunnlaget for oppdagelsen av nye potensielle kunder og utviklingskandidater, og for de fleste av de nye stoffene som blir lisensiert i disse dager. Tilgjengeligheten av høygjennomstrømningsmetoder er derfor uunnværlig for å screene et enormt antall tilgjengelige mål med et stort antall forskjellige forbindelser for raskt å identifisere deres tette binding eller deres evne til å modulere en bestemt funksjon av målet. Etter at treff er identifisert, skyves de mest lovende hitmålkombinasjonene inn i en omfattende rørledning for narkotikautvikling ved hjelp av andre, ofte dyre og tidkrevende teknologier, for å forstå "strukturaktivitetsrelasjoner" (SAR).

Strukturelle biologi tilnærminger, for eksempel de som tilbys av EU-finansierte tilgangsprogrammer "Infrastruktur for NMR, EM og røntgenstråler for translasjonell forskning" (iNEXT) og dens nåværende etterfølger iNEXT-Discovery, brukes ofte til å studere interaksjonene mellom mange forbindelser i ekstrem detalj samtidig som de affinitets- og farmakologiske egenskapene til de første treffene forbedres av vanligvis flere runder med syntetisk kjemi¹. Blyforbindelser som kommer ut av disse "fra hit til lead" -kampanjer blir utviklingskandidater og går inn i prekliniske studier. Den velutviklede molekylære screeningmetoden kan grovt kategoriseres i to tilnærminger, nemlig det ligandbaserte blyfunnet (LBLD) og fragmentbasert blyfunn (FBLD). I LBLD-kampanjer blir proteinreseptorer screenet med enten noen få tusen håndplukkede ligander (basert på strukturen av naturlige ligander eller strukturen til målet), eller med mange titusenvis av forbindelser i narkotikalignende ligandbiblioteker som dekker en stor del av kjemisk rom.

Vanligvis testes forbindelsene for deres hemmende aktivitet i en aktivitetsanalyse, som vanligvis overvåker en enzymatisk funksjon. I FBLD-kampanjer^2,3,4,5, er imidlertid noen hundre forbindelser som vanligvis er mindre enn narkotika (100-200 Dalton) testet for deres evne til å binde målet direkte, uten bruk av en aktivitetsanalyse. Denne bindingen kan forstyrre målaktiviteten og kan måles ved hjelp av mange biofysiske metoder som rapporterer direkte om fragmenters evne til å binde seg til målet, eller ved strukturelle metoder som røntgenkrystallografi⁶ og kjernemagnetisk resonansspektroskopi⁷, og mer nylig også kryo-elektronmikroskopi. Når fragmenter binder seg på forskjellige steder som er nær hverandre på proteinet, kan de forskjellige, vanligvis lavaffinitetsbindende fragmentene kombineres rasjonelt kjemisk for å skape et lite sett med ledninger som kan studeres mer detaljert. Dette resulterer ofte i høyere affinitet, mer potente forbindelser, og denne metoden har begynt å gi viktige molekyler med klinisk potensial. Valget av et "ideelt" fragmentbibliotek som utnytter kjemiske grupper effektivt, har vært et aktivt forskningsområde i mange år^8,9,10.

Mens den første vektleggingen var på å dekke fullt kjemisk rom, var etterfølgende oppmerksomhet fokusert på å muliggjøre nedstrøms kjemisk kombinasjon av fragmenttreff for å produsere blyforbindelser. Slik forskning har ført til de såkalte "poised" bibliotekene. Disse inneholder fragmenter med minst én funksjonsgruppe som tillater rask, billig oppfølging av syntetisk kjemi for effektiv fremgang i studier av SAR. En av aktivitetene katalysert av iNEXT var å oppdatere biblioteket utviklet av forskere i Diamond Light Source og Structural Genomics Consortium. Denne kombinerte innsatsen resulterte i DSi-Poised-biblioteket¹¹, som også er validert i iNEXT¹². Senere ble dette biblioteket justert med tilgjengeligheten av forbindelser i REAL Database of Enamine Ltd., en kjemisk forskningsorganisasjon og produsent av store samlinger av byggeklosser og sammensatte biblioteker for screening. DSi-Poised er nå tilgjengelig for alle for kjøp, men også tilgjengelig i mange iNEXT-Discovery-partnerlaboratorier for støttede fragmentscreeningsprosjekter.

Den avanserte røntgenkrystallografien og NMR-strukturelle biologiteknologien har begge sine fordeler og ulemper for FBLD. Begge krever isolerte målprøver og gir de høyoppløselige atomdetaljene som kreves for FBLD. Krystaller er imidlertid nødvendige for røntgenkrystallografi, og fragmentene binder seg til hulrom i de velordnede proteinområdene som ikke er involvert i å bygge det tredimensjonale krystallgitteret. Løsning NMR gir ofte forskjellige treff fra røntgenkrystallografi, da den ikke påvirkes av krystallmiljøet og er god til å oppdage binding også i delvis bestilte proteinregioner. Men selv om ligandbaserte NMR-eksperimenter er relativt raske, krever de fortsatt en betydelig mengde tid og materiale og kan rutinemessig bare gjøres for relativt små proteinmål eller domener. Med det formål å prioritere forbindelser for krystallografiske eller NMR-eksperimenter, har biofysiske tilnærminger blitt brukt^13,14,15.

Ettersom nyere instrumenterings- og beregningsprotokoller tillater effektiv krystallografisk screening for FBLD ved å bestemme strukturer og analysere ~ 1000 fragmenter veldig effektivt, har denne prioriteringen blitt mindre viktig i røntgenbasert forskning. For NMR er det imidlertid fortsatt ønskelig å bruke billigere og raskere eksperimenter for å prioritere bibliotekscreening og spare instrumenttid på avansert utstyr. Samtidig kan bruk av en kombinasjon av i hovedsak forskjellige teknologier gi uavhengig bekreftelse av bindende hendelser, eller til og med flere treff som ikke plukkes opp ved å bruke bare krystallografien eller NMR-metoden. Krystallografiske og NMR-teknikker krever begge svært dyrt utstyr og kan ofte bare gjøres i dedikerte eksterne anlegg med hjelp fra lokale, dyktige eksperter. I tillegg krever riktig analyse av resultatene også høy kompetanse. Mens programmer som iNEXT og iNEXT-Discovery demokratiserer tilgang til slike anlegg¹⁶, har det blitt anerkjent at billig, rask og høy gjennomstrømning FBLD screening ved andre metoder kan oppmuntre til narkotikascreeningsprogrammer i et mye bredere spekter av laboratorier. Slike resultater kan deretter brukes som en indikasjon på å bygge samarbeid med medisinske kjemikere, og for å prioritere de dyreste screeningforsøkene til de mest lovende forbindelsene hvis NMR og krystallografianlegg pålegger restriksjoner på antall forbindelser som kan screenes.

TSA danner en rask, effektiv og relativt billig og tilgjengelig biofysisk metode¹⁷ som kan brukes til FBLD-screening. Den har blitt brukt i flere innstillinger, fra å hjelpe til med å finne stabile proteinforhold for krystalliseringsforsøk¹⁸, til å finne forbindelser som binder seg til spesifikke mål i celle¹⁹. TSAer har også blitt brukt til å måle dissosiasjonskonstantene for ligander som binder målproteiner, da ligandbinding ofte fører til endringer i termisk stabilitet. I alle TSA-er måles endringen i denatureringstemperaturen til et protein (stabiliteten) som en funksjon av en langsom temperaturøkning. En effektiv måte å følge protein denaturering ved oppvarming er av DSF eller Thermofluor, som kvantifiserer fluorescens slukking av en hydrofob fargestoff (vanligvis Sypro Orange) ved interaksjon med eksponerte hydrofobe områder av protein som utfolder seg på grunn av temperaturøkning.

Nano-DSF refererer vanligvis til måling av termisk stabilitet av protein i fravær av eksterne fargestoffer. Et av de første instrumentene som tilbød denne muligheten var OPTIM1000 som måler et bredt spekter av lysintensitet samt lysspredning av en prøve. Denne maskinen tillot samtidig måling av protein utfoldelse (vanligvis etter tryptofan fluorescens) og protein aggregering (som dannet nanopartikler resulterer i en økning av lysspredning på ~ 400 nm). Senere introduserte Prometheus bruk av ryggrefleksjon for måling av aggregering og sensitiv deteksjon av fluorescenssignalet, slik at screening av lave proteinkonsentrasjoner med god følsomhet²⁰. Følgende avsnitt beskriver hvordan Prometheus ble brukt til å demonstrere en fragmentscreeningsprotokoll for å oppdage treff for forskjellige proteinmål. En kort innføring i forventet proteinkvalitet og kvantitet etterfølges av en trinnvis protokoll for å forberede, utføre og analysere fragmentscreeningseksperimentene. Screeningresultater for tre proteiner har blitt vist som eksempeldata innhentet som en del av iNEXT-Discovery-samarbeid.

Protocol

MERK: Proteinene som brukes i nano-DSF-eksperimenter bør være rene (>95%) og homogene som dømt av natriumdedylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese. Før du utfører fragmentskjermen, bør stabiliteten til proteinene bestemmes under ulike bufferforhold. En lav ionisk styrke, lav saltbuffer som forstyrrer minimalt med proteinet, bør brukes for ikke å påvirke den direkte samspillet med fragmentene. Bufferne som vanligvis brukes i denne protokollen for kontroll av stabilitet, vises i Supplerende tabell S1. Konsentrasjonen av proteinet som må brukes til dette eksperimentet som en lagerløsning er vanligvis 0,2 mg ml^-1. For screening av hele DSi-Poised biblioteket (768 forbindelser), er det nødvendig med totalt ~ 12 ml protein av den konsentrasjonen, totalt ~ 2,5 mg. DSi-Poised-biblioteket som ble brukt i disse eksperimentene, ble levert i 96-brønnsformat (figur 1). Konsentrasjonen av fragmentene ble justert til 100 mM i 20% v / v dimetylsulfoksid (DMSO). Det skal bemerkes at blandeprotokollen som er beskrevet her resulterer i lave endelige DMSO-konsentrasjoner på 0,4% v / v; Selv om dette er svært usannsynlig å påvirke stabiliteten til proteinet, bør effekten av DMSO kontrolleres for hvert nytt protein.

Figur 1: Platetypene som brukes til disse eksperimentene. (A) U-bunnplate. (B) 96-brønnsplate. (C) Et nærbilde av 96-brønnsplate som viser subwell 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

1. Plateforberedelse

1. Ta ut en fragmentplate fra fryseren -20 °C/-80 °C, og la den tine ved romtemperatur, med skånsom risting på en benkeplate shaker. Sentrifuger platen ved 500 × g i 30 s for å samle dråper som stikker til siden av brønnene.
   MERK: Siden fragmentbiblioteket er tilgjengelig oppløst i DMSO-d₆ (smeltepunkt 19 °C), er det viktig å sørge for at hver forbindelse er helt tint og oppløselig.
2. Ta en MRC 2-brønns krystalliseringsplate (figur 1A) og pipette 14,7 μL proteinbestandsoppløsning i hver underbrønn. For å gjøre dette på en tidseffektiv måte, hold proteinet i et reagensreservoar (Materialtabell), og bruk en flerkanals pipette for dispensering (Figur 2A, B).
   MERK: For DSi-Poised-biblioteket, avhengig av formatet, inneholder ikke alle brønnene på 96-brønnsplaten forbindelser. Vanligvis er rad A, H og kolonne 1, 12 fylt med DMSO. Dermed skal rad A, H og kolonne 1, 12 ikke fylles med protein, da disse brønnene ikke vil inneholde noen fragmenter på slutten av neste trinn; bare DMSO vil bli overført dit av roboten. Vær oppmerksom på at de tomme radene og kolonnene varierer i noen plater.

Figur 2: Omriss av fragmentscreeningsprosedyren. (A) Bruke en flerkanals pipette og reagensreservoar til å dispensere proteinet. (B) Dispensering av proteinet i 96-brønnsplaten. (C) Fragmentdispensering av dispenserroboten. (D) Lasting av proteinet i kapillærene. (E) Skuff som viser kapillærholderen. (F) Nærbilde av kapillærholderen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Oversikt over utstyret som brukes i disse eksperimentene. (A) Nanodispenserrobot som brukes til fragmentdispensering. Plateposisjoner er indikert. (B) Programgrensesnitt for å definere en ny plate. (C) Grensesnittet til dispenseringsprogrammet. (D) Dispenseringsprogrammet som brukes til å dispensere fragmentene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Fragment nano-dispensering av myggroboten

1. Kontroller platetypen som fragmentene leveres i (Materialbord).
2. Kontroller fragment- og proteinplatedefinisjoner på Mosquito.
   1. Slå på nanodispenseren (Figur 3A). Pass på at det ikke er noen hindringer rundt de bevegelige komponentene.
   2. Åpne det grafiske brukergrensesnittet, klikk kategorien Oppsett , og kontroller under Dekkkonfigurasjonom platetypen som forbindelsene leveres i, og den der proteinet er overført i avsnitt 1, allerede finnes i listen over tilgjengelige plater. Hvis ikke, klikker du Alternativer| Plater og opprett en ny platedefinisjon ved å fylle ut de riktige verdiene for egenskapstypen (Figur 3B).
      MERK: Disse verdiene for MRC 2-brønnsplaten og 96-brønnsplaten som brukes i dette eksperimentet er vist i henholdsvis Supplerende tabell S2 og supplerende tabell S3.
3. Dispenseringsprogrammet
   1. I kategorien Oppsett angir du plateposisjonene under Dekkkonfigurasjon.
      MERK: Mygggen som brukes i dette eksperimentet har to plateposisjoner på dekk. Posisjon 1 er definert som Kildeplate, og Posisjon 2 er Målplaten.
   2. Bruk rullegardinmenyen til å velge Greiner U bunnplate for posisjon 1 og MRC 2-brønnplate for posisjon 2 (figur 2C). Lagre protokollen.
4. Fragmentdispensering
   1. Plasser fragmentplaten i posisjon 1 og proteinplaten i posisjon 2 på aggregatet (Figur 3A).
   2. I kategorien Protokoll (Figur 3D) klikker du fil og velger protokollen som er lagret i avsnitt 2.3 for utlevering av fragmentene. Definer volumet på fragmentene som skal dispenseres. bruk 0,3 μL. For en vanlig plate, der kolonne 1 og 12 ikke inneholder fragmenter, definerer du startplasseringen til kolonne 2 og sluttplasseringen til kolonne 11. Hvis kolonne 2 eller 11 er tomme i noen plater, bruker du henholdsvis kolonne 3 og 10 som start- og sluttverdier.
      MERK: På grunn av Myggoppsettet kan bare kolonner hoppes over, ikke rader; For radene vil mygga pipette DMSO. Kontroller at alternativet Tipsendring er valgt som Alltidfor ikke å krysskontaminer fragmentbiblioteket.
   3. Klikk Kjør for å starte programmet. Etter dispensering, som tar ~ 2 min, er fullført, fjern proteinet og fragmentplatene fra roboten, og forsegle dem tilbake med en selvklebende tetningsfilm. Sentrifuger proteinplaten (500 × g, 30 s) for å samle eventuelle dråper som stikker til sidene av brønnene før du går videre til neste trinn.

3. Måling av nano-DSF

MERK: En detaljert beskrivelse av å utføre TSAer ved hjelp av Prometheus NT.48 har blitt publisert tidligere²⁰. Viktige punkter i sammenheng med fragmentscreening er nevnt her.

1. Plateinspeksjon før målingen
   1. Inspiser visuelt brønnene på proteinplaten for nedbør som kan ha skjedd på grunn av tilsetning av fragmentene. Hvis nedbør observeres i mange brønner, reduser konsentrasjonen av fragmentene, og gjenta eksperimentet.
      MERK: Det anbefales å holde proteinplaten ved romtemperatur; fragmentene har en tendens til å bli uoppløselige ved lavere temperaturer.
2. Forbereder Prometheus
   1. Slå på Prometheus-instrumentet. Trykk på Open Drawer på berøringsskjermen for å få tilgang til instrumentets kapillære lastemodul. Fjern magnetstripen fra lastemodulen, og rengjør speilet med etanol for å fjerne støvpartikler.
3. Overfør fra proteinfragmentplaten til kapillærene
   MERK: Dette trinnet innebærer overføring av blandet protein/fragmentprøve fra hver brønn i proteinplaten til kapillærene for bruk med Prometheus. For dette, selv om standard kapillærtype vanligvis brukes, er det mulig å bruke høysensitivitets kapillærene for svært lave proteinkonsentrasjoner.
   1. Plasser proteinplaten og kapillærene ved siden av instrumentet for å få enkel tilgang til kapillærlastingsmodulen.
   2. Ta en kapillær, hold den i den ene enden, og berør løsningen i proteinplaten med den andre enden av kapillæren for å overføre prøven ved kapillær virkning. Bruk alltid hansker, og pass på at du ikke berører kapillæren i midten, da urenheter(f.eks.støvpartikler) fra hanskene vil påvirke målingen.
   3. Plasser kapillæren i den angitte posisjonen til holderen, og sørg for at den er riktig justert og sentrert.
   4. Gjenta trinn 3.3.2 og 3.3.3, og fyll dermed opp alle posisjonene i lastemodulen. Last inn alle kapillærene du trenger for måling.
      MERK: For en enkelt løpetur kan maksimalt 48 kapillærer lastes.
   5. På slutten plasserer du magnetstripen på toppen av kapillærene for å holde dem på plass, og trykker Lukk skuff for å starte eksperimentet.
4. Utfør nano-DSF-eksperimentet
   1. Fluorescensskanning
      1. Åpne Prometheus-programmets PR. ThermControl, og opprett et nytt prosjekt ved å klikke Start ny økt ved hjelp av navnet ProteinName_ScreenName_PlateNumber. Først må du utføre en oppdagelsesskanning for å oppdage fluorescensen til prøvene.
         MERK: Fluorescensnivåene bør ideelt sett være over 3000 tellinger for hver prøve. Prøver som har fluorescens over instrumentets metningsgrense (20 000 tellinger) måles ikke.
      2. Endre fluorescenssignalet til prøvene ved å justere eksitasjonskraften til laseren (figur 4).
   2. Termisk denaturering
      1. Klikk på smelteskanningsfanen. For å utføre eksperimentet, sett starttemperaturen til 20 °C, slutttemperaturen til 95 °C og temperaturhellingen til 1 °C min^-1. Klikk Start måling.
   3. Sette inn merknader i eksperimentet
      1. Når eksperimentene har startet, klikker du kategorien Merknad og resultater . Kommenter hver kapillær ved å gi den et unikt plate- og brønnnummer.
         MERK: Kapillær 1B2 vil for eksempel tilsvare plate 1 og brønn B2. I denne kategorien kan ekstra kolonner legges til eksperimentet, for eksempelproteinnavn, buffer, proteinkonsentrasjon. Når eksperimentet er fullført, vises også resultatene i denne kategorien. Dette er et godt tidspunkt å pause på slutten av dagen; eksperimentene finner sted over natten, resultatene kan samles neste dag.
   4. Datavisualisering og eksport
      1. Når eksperimentet er fullført, klikker du kategorien Smelteskanning for å vise smelte- og spredningskurvene for prøvene. Hvis du vil eksportere resultatene i et regneark, klikker du kategorien Smelteskanning , klikker Eksporterog velger Eksporter behandlede data på rullegardinmenyen.

Figur 4: Justering av eksitasjonskraft og fluorescenssignal. (A) Ved 80 % eksitasjonskraft er fluorescenssignalet for de fleste prøvene utenfor metningsgrensen. (B) Fluorescenssignalet reduseres til målbare nivåer ved å redusere eksitasjonseffekten til 60%. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Gjentakelse

1. Gjenta trinn 1-3 for å utføre 16 kjøringer på hele Enamine-biblioteket med 768 forbindelser (16 × 48 = 768).
2. Ettersom målingen av hver plate tar ~ 1,5 timer å fullføre, fullfører du merknaden (3.4.3), og forbereder neste proteinfragmentplate ved å gjenta trinn i avsnitt 1 og 2.
   MERK: I en typisk arbeidsdag kan 4-6 plater måles, avhengig av erfaring. Visningen av hele DSi-biblioteket kan fullføres på totalt 3-4 dager.

5. Dataanalyse

1. Undersøke de genererte dataene
   1. Når hver kjøring er fullført, klikker du kategorien Merknader og resultater for å vise resultatene. For hvert utvalg fokuserer du på to beregnede verdier som er viktigst i denne oversikten: 1) Spredningstemperaturen (Innsett #1 for spredning), som angir temperaturen ved starten av økte prøvespredningshendelser og er karakteristisk for aggregering; 2) verdien T_m (Bøyningspunkt #1 for forhold) ekstrahert fra forholdet mellom fluorescenshendelser ved 330 og 350 nm-verdier som vanligvis tilsvarer de maksimale endringene i tryptofan fluorescens ved endringer i miljøet.
   2. Pass på at du kontrollerer spredningen og smeltekurvene for hver kapillær i kategorien Smelteskanning for å sikre at disse verdiene er pålitelige.
2. Eksportere og inspisere til et regneark
   1. Eksporter dataene fra alle forskjellige kjøringer for inspeksjon til en regnearkprogramvare, som beskrevet i 3.4.4, og for å lage oversiktstabeller og plott. Klikk de ulike arkene i regnearkfilen for å notere informasjonen i hvert ark.
      1. Legg merke til at hver rad tilsvarer ett eksperiment, i oversiktsarket. Følg de beregnede verdiene for T m og spredningsstart (f.eks. start- og slutttemperatur) langs en oversikt over parametere(f.eks.start- og slutttemperatur), følg de beregnede verdiene for T_m og spredningsstart (se 5.1 ovenfor for navn og forklaring, og Tilleggsfiler 1 og 2 for eksempel). Når programvaren beregner to eller flere T_m-verdier (Inflection Point #1 og #2 for Ratio) for noen prøver, kan du se på smelteovergangskurven for å finne ut hvilke av T_m-verdiene som er riktige.
      2. Legg merke til at hver kolonne tilsvarer et utvalg i Ratio-arket, og hver rad med dataene som leses ved hvert temperaturtrinn. Vær oppmerksom på fluorescenstellingsverdiene som tilsvarer hvert temperaturtrinn, og bruk dem til å plotte smeltekurvene for spesifikke prøver, plotte temperaturkolonnen mot fluorescenstellingskolonnen. Merk at dataene i Forholdet (første derivat), 330 nm, 330 nm (første derivat), 350 nm, 350 nm (første derivat) brukes til å beregne forholdet og det første derivatet (som har maksimalt endringshastighet) i et lignende format.
      3. Vær oppmerksom på lignende data for spredning i spredningsarket. Generer spredningskurven for hvert utvalg ved å tegne temperaturkolonnen mot spredningskolonnen. Se etter arket for spredning av første derivat.
3. Opprette og validere en global oversikt for alle fragmenter
   1. Når du har kontrollert de riktige T_m-verdiene for fragmentene, kombinerer du kolonnene Eksempel-ID og Bøyningspunkt på 330/350 nm ratio (T_m) fra alle kjøringene i en enkelt ny resultatfil, og kopierer disse kolonnene fra hver kjøring.
   2. Bruk den gjennomsnittlige T_{m -verdien} for det opprinnelige proteinet (vanligvis beregnet over ti kjøringer) og trekk det fra T_{m -verdiene} i hver prøve for å få ΔT_m. Sorter resultatene over ΔT_m i synkende rekkefølge for å identifisere prøvene som resulterer i det største skiftet.
   3. Del fragmentene i beholdere avhengig av ΔT_m-skiftet, og generer en frekvenstabell for hele biblioteket ved å tegne inn ΔT_m for hver skuff mot antall fragmenter ( Figur5). For enkelhets skyld, vis aksen som representerer antall fragmenter i loggskalaen. Bin prøven med ΔT_m ±1, og tilpass de andre hyllene til hver kjøring for å justere antall outliers empirisk.

Representative Results

En fullskjerm av DSi-Poised-biblioteket (768 fragmenter) ble utført på tre proteiner av medisinsk interesse, nemlig det ytre kinetochore svært uttrykt i kreft 1 protein (Hec1, eller Ndc80), regulatorisk tetraricopeptide repetisjon (TPR) domene av monopolar spindel kinase 1 (Mps1), og SARS-CoV-2 3C-lignende protease, Nsp5, som cleaves av C-terminus av kopiene polyprotein på 11 steder. Bufferforholdene som er valgt for hvert protein, samt proteinkonsentrasjonen og T_m av proteinene, er vist i Supplerende tabell S4.

Figur 5: Frekvensfordeling av skiftet i smeltetemperatur (ΔT_m) for de tre proteinene, Hec1, Mps1 og Nsp5, presentert i denne studien som representative resultater. Forkortelser: Hec1 = Svært uttrykt i kreft 1 protein; Mps1 = monopolar spindel kinase 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C-lignende protease. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Resultatene av de tre visningene ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor, vist som frekvensfordelingen av endringen i T_m i forhold til antall fragmenter, vises i figur 5. Disse plottene er generert som beskrevet i punkt 5.3 i protokollen, og plotter frekvensen av den observerte endringen i T_m. Betydningen av skiftet må defineres subjektivt for hvert enkelt prosjekt, som beskrevet i diskusjonsdelen nedenfor. Negative verdier indikerer en reduksjon i smeltetemperaturen i nærvær av et fragment, en positiv verdi en økning i T_m. Fra slike tomter er det lett å observere at for Nsp5 har alle fragmentene en destabiliserende effekt, mens for Hec1 og Mps1 observeres både stabiliserende og destabiliserende treff. Dette kan forventes og vil bli diskutert.

Discussion

Denne protokollen beskriver en middels til høy gjennomstrømningsmetode for screening av fragmentbiblioteker ved hjelp av noen vanlige robotikk- og måleinstrumenter. Skjermer som de som er beskrevet i denne protokollen kan rutinemessig utføres av NKI Protein Facility i Amsterdam, for eksempel som en iNEXT-Discovery-tjeneste, ofte til og med gratis for brukere etter forslagsprogram og fagfellevurdering. I slike tilfeller kan DSi-Poised-biblioteket leveres av anlegget, men bruken av andre biblioteker kan også diskuteres i sammenheng med hver enkelt brukerapplikasjon og tjenesteavtale. Valg av instrumenter i denne protokollen representerer praktiske løsninger for mange laboratorier, men bør ikke betraktes som en gullstandard. Etikettfrie metoder anbefales for å måle den termiske stabiliteten til målproteinet for fragmentscreening, i stedet for metoder som bruker miljøfølsomme etiketter for å oppdage utfolde seg i en omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjonstermosykler.

Etikettfrie metoder, som den som presenteres her ved hjelp av Prometheus-instrumentet, har noen fordeler: de bruker lave mengder protein, ofte et par størrelsesordener mindre; de kan brukes til samtidig å måle spredning av prøven og dermed aggregasjon; og etikettene som brukes til å oppdage utfoldelse i andre tilnærminger, kan samhandle forskjellig med hvert fragment, noe som resulterer i måleartefakter. Denne protokollen er beskrevet i sammenheng med Myggroboten, som tillater pipettering av et svært lite volum prøve (0,3 μL) som ikke kan gjøres manuelt. Mosquito er en populær robot, til stede i mange laboratorier som arbeider med strukturell biologi og narkotikaoppdagelsesprosjekter; Protokollen kan imidlertid tydelig bruke alternative tilnærminger for pipettering med lavt volum.

Fragmentbiblioteker inneholder forbindelser oppløst i DMSO. En av de første utfordringene er å finne den optimale DMSO-konsentrasjonen der proteinet forblir stabilt, og forbindelsene forblir oppløselige. Dette innebærer å utføre målingene ved ulike DMSO-konsentrasjoner for å bestemme de optimale forholdene for screening. Proteinet til fragmentfortynning som brukes her resulterer i DMSO-konsentrasjoner på 0,2%; de fleste proteiner er ganske stabile under disse forholdene. Mengden protein som kreves for å utføre screeningen for det 768-sammensatte biblioteket er ~ 2-3 mg totalt, da målingene vanligvis utføres ved lave proteinkonsentrasjoner (0,2 mg ml^-1). Å jobbe med slike relativt lave proteinkonsentrasjoner reduserer ikke bare proteinproduksjonskostnadene, men reduserer også sjansene for proteinnedbør. Den lave proteinkonsentrasjonen påvirker ikke påvisning av fragmentbinding, da konsentrasjonen av fragmentene i eksperimentet er ~ 2 mM, slik at også svake bindemidler kan identifiseres.

Ettersom smelteovergangsdeteksjonen i disse eksperimentene er basert på fluorescensintensitet, er et kritisk aspekt å bestemme eksitasjonskraften til laseren som laseren skal utføre målingene på. Samspillet mellom forbindelsene med proteinet kan (i) ikke ha noen effekt på dens indre fluorescens, (ii) resulterer i slukking, eller (iii) øke sin indre fluorescens. I tillegg til dette betyr arbeid med lave proteinkonsentrasjoner at fluorescenstallet for det opprinnelige proteinet vil være lavt. Eksitasjonskraften må derfor justeres slik at de fleste prøvene kan måles. Spredningsprofilen for hver kjøring gir viktig informasjon om aggregasjonseffektene som kan utløses ved at eventuelle fragmenter legges til. I tillegg kan effekten av temperatur på sammensatt løselighet også ses på spredningsprofilen.

Uventet ble det for mange forbindelser observert at spredningen faktisk ble redusert med økende temperatur (Figur 6). Det er derfor viktig å se på både smeltende overgangskurve og tilhørende spredningsprofil for å bestemme påliteligheten til hvert eksperiment, spesielt for de fragmentene som regnes som kandidater for mer krevende målinger av røntgenkrystallografi eller NMR-spektroskopi, eller til og med betraktet som treff for oppfølgingskjemi. En spesifikk begrensning av metoden for fragmentscreening er at mange fragmenter i DSi-Poised-biblioteket har betydelig iboende fluorescens, noen ganger til og med utenfor detektorens metningsgrense, og derfor kan disse ikke screenes riktig for målbinding selv ved lav eksitasjonskraft. Et annet poeng å merke seg for denne metoden er at den bare kan brukes med proteiner som inneholder tryptofan rester.

Figur 6: Effekt av temperatur på sammensatt løselighet. Smeltende overgangskurve og spredningsprofil av Hec1 med to forskjellige forbindelser. (A) Spredningsprofilen viser at for denne prøven påvirkes ikke løseligheten av temperatur. (B) Spredningsprofilen viser at løseligheten til denne prøven øker med økende temperatur. Smelteovergangskurven i dette tilfellet er derfor ikke pålitelig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Et åpent spørsmål er hva som bør betraktes som en betydelig endring i T_m, ikke fra et matematisk perspektiv, men fra det praktiske synspunktet: Hvilken endring i T_m er viktig å vurdere som en indikasjon på binding av en ligand til et protein? I disse eksemplene ses skift på mindre enn 1 °C for 74 % av fragmentene for binding av Hec1, 66 % for Mps1 og 53 % for Nsp5. Med tanke på 1 °C som «betydelig endring» vil det neppe gi treff som er verdige å forfølge ved oppfølgingskjemi. I oversiktsgrafene (figur 5) ble det vurdert hyller på 1, 2, 5 eller mer enn 5 grader T_m skift, enten positive eller negative. Dette krever endring i henhold til hvert enkelt tilfelle for å gi en god oversikt og for å tillate informert beslutningstaking, og bestemme neste trinn. Spesielt for noen proteiner ble både stabilisering og destabilisering av målet observert avhengig av fragmentene som vurderes. Begge hendelsene er interessante, da begge kan være et resultat av fragmentbinding, og begge kan føre til et godt oppfølgingsmolekyl for å manipulere proteinadferd.

Et siste spørsmål gjenstår, nemlig "hva definerer et nyttig treff?". Faktisk avhenger svaret av den spesifikke situasjonen. For eksempel, for Hec1, ble alle fragmenter som stabiliserer proteinet med mer enn 2 grader eller destabiliserer det med mer enn 5 kommunisert til våre kjemipartnere, som designet nye molekyler basert på disse treffene. For Nsp5 ble imidlertid de mest destabiliserende treffene kommunisert til våre NMR-samarbeidspartnere for å bekrefte de nanoDSF-avledede treffene med NMR-eksperimenter. Med andre ord bør screeningresultatene fra denne protokollen analyseres med forsiktighet og på en kontekstavhengig måte, og ta informerte beslutninger basert på det spesifikke spørsmålet og den omkringliggende metodikken. I alle fall er metoden beskrevet her en komplementær tilnærming til eksisterende metoder som røntgen- og NMR-basert screening, som kan ta sikte på å bekrefte, prioritere eller gi nye ideer til kjemikampanjer.

Supplerende tabell S1: Liste over buffere som brukes til screening av proteiner. Forkortelser: HEPES = 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyre; DTT = dithiothreitol; MOBS = 4-(N-morpholino)butansulfonsyre. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell S2: Egenskaper for MRC 2-brønnsplate for bruk med nanodispenserrobot. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende bord S3: Egenskaper for 96-brønns V-bunnplate for bruk med nanodispenserrobot. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell S4: Bufferen, proteinkonsentrasjonen og T_m av proteinene som er diskutert i representative resultater. Forkortelser: DTT = dithiothreitol; Hec1 = Svært uttrykt i kreft 1 protein; Mps1 = monopolar spindel kinase 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C-lignende protease. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsfil 1: Oversiktsparametere-eksempeldata. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: Verdiene T_m og ΔT_m for data med 406 fragmenter. Klikk her for å laste ned denne filen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ClearVue Sheets	Molecular Dimensions		adhesive sealing film for protein plate
CORNING 6570 Aluminium Sealing Tape	CORNING		adhesive sealing film for fragment plate
DSi poised library	Enamine		Fragment library containing 768 compounds used in this study
Elisa Reagent Reservior	ThermoFisher Scientific	15075	Reagent reservior used for pipetting the protein
Greiner round (U) bottom plates		Cat. No. 650201	Fragments supplied in these plates
Mosquito type X1	sptlabtech	Part nr- 3019-0003	Nanolitre dispenser
MRC 2-well crystallization plate		MRC96T-PS
Pierce ELISA Reagent Reservoirs	Pierce
Prometheus High Sensitivity capillaries	Catalog PR-C006
Prometheus NT.48 nanoDSF	Nanotemper	Catalog nr PR001 (+ Aggregation Detection Optics, catalog nr PR-AGO)	nanoDSF and light back scattering
Prometheus Standard capillary type	Catalog PR-C002
TX-1000	Thermoscientific	Centrifuge for plates