Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

قياس فلوري المسح الضوئي النانوي للفحص في اكتشاف الرصاص القائم على الشظايا

Published: May 16, 2021 doi: 10.3791/62469
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 2, 1, 1
1Oncode Institute and Division of Biochemistry, the Netherlands Cancer Institute, 2Institute for Organic Chemistry and Chemical Biology, Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ), Johann Wolfgang Goethe-University

Summary

رصد التغيرات في درجة حرارة ذوبان البروتين المستهدف(أي،المقايسة التحول الحراري، TSA) هو وسيلة فعالة لفحص مكتبات جزء من بضع مئات من المركبات. نحن نقدم بروتوكول TSA تنفيذ الروبوتات بمساعدة نانو التفاضلية المسح الفلوري (نانو DSF) لرصد التربتوفان المفلورة الجوهرية والضوء التشتت الخلفي لفحص جزء.

Abstract

تفحص مقايسات التحول الحراري (TSAs) كيفية تغير درجة حرارة ذوبان البروتين المستهدف (Tm)استجابة للتغيرات في بيئته(على سبيل المثال،تكوين العازلة). وقد أنشئت فائدة TSA، وتحديدا من نانو التفاضلية المسح الفلوري (نانو DSF)، على مر السنين، سواء لإيجاد الظروف التي تساعد على استقرار بروتين معين والنظر في الربط ليغاند من خلال رصد التغيرات في Tمواضح . تقدم هذه الورقة فحصا فعالا لمكتبة شظايا Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) (768 مركبا) باستخدام نانو-DSF، ورصد Tm لتحديد الربط المحتمل للشظايا. وترد المتطلبات الأساسية فيما يتعلق بجودة البروتين وتركيزه لإجراء تجارب نانو-DSF بإيجاز متبوعا ببروتوكول خطوة بخطوة يستخدم موزع روبوتي سعة نانو لتر يستخدم عادة في مختبرات البيولوجيا الهيكلية لإعداد العينات المطلوبة في لوحات 96 بئرا. يصف البروتوكول كيفية نقل الخلائط الكاشفة إلى الشعيرات الدموية اللازمة لقياسات نانو DSF. وبالإضافة إلى ذلك، توفر هذه الورقة بروتوكولات لقياس التشبع الحراري (رصد تفلور التربتوفان الجوهري) والتجميع (رصد تشتت الضوء الخلفي) والخطوات اللاحقة لنقل البيانات وتحليلها. وأخيرا، تناقش تجارب الفحص مع ثلاثة أهداف بروتين مختلفة لتوضيح استخدام هذا الإجراء في سياق حملات اكتشاف الرصاص. ويمكن نقل المبدأ العام للطريقة الموصوفة بسهولة إلى مكتبات أجزاء أخرى أو تكييفه مع صكوك أخرى.

Introduction

غالبا ما تبدأ برامج اكتشاف الأدوية بفحص المركبات الكيميائية لقدرتها على التفاعل مع و / أو تعديل وظيفة أهداف الأدوية ، في معظم الأحيان البروتينات. ما يسمى "الزيارات" الموجودة في مثل هذه الشاشات ، تضع الأساس لاكتشاف خيوط جديدة والمرشحين للتنمية ، وبالنسبة لمعظم الأدوية الجديدة التي يتم ترخيصها في هذه الأيام. ولذلك، فإن توافر أساليب عالية الإنتاجية أمر لا غنى عنه لفحص عدد هائل من الأهداف المتاحة بعدد كبير من المركبات المختلفة لتحديد ربطها الضيق بسرعة أو قدرتها على تعديل وظيفة محددة للهدف. وبعد تحديد الزيارات، تدفع المجموعات الواعدة من الأهداف المستهدفة إلى خط أنابيب واسع النطاق لتطوير العقاقير باستخدام تكنولوجيات أخرى، غالبا ما تكون مكلفة وتستغرق وقتا طويلا، لفهم "العلاقات بين الهيكل والنشاط".

غالبا ما تستخدم نهج البيولوجيا الهيكلية ، مثل تلك التي تقدمها برامج الوصول الممولة من الاتحاد الأوروبي "البنية التحتية ل NMR و EM والأشعة السينية للأبحاث التحويلية" (iNEXT) وخليفتها الحالي iNEXT-Discovery ، لدراسة تفاعلات العديد من المركبات بالتفصيل الشديد مع تحسين التقارب والخصائص الدوائية للزيارات الأولية من خلال عدة جولات من الكيمياء الاصطناعية1. وتصبح مركبات الرصاص التي تنشأ عن هذه الحملات "من الضرب إلى القيادة" مرشحة للتنمية وتدخل في دراسات ما قبل السريرية. ويمكن تصنيف منهجية الفحص الجزيئي المتطورة إلى نهجين تقريبا، هما اكتشاف الرصاص القائم على الليغند (LBLD) واكتشاف الرصاص القائم على الشظايا (FBLD). في حملات LBLD ، يتم فحص مستقبلات البروتين إما ببضعة آلاف من الليغندات الملقاة يدويا (استنادا إلى بنية الليغند الطبيعي أو بنية الهدف) ، أو مع عشرات الآلاف من المركبات في مكتبات ligand الشبيهة بالمخدرات التي تغطي جزءا كبيرا من المساحة الكيميائية.

عادة، يتم اختبار المركبات لنشاطها المثبطة في مقايسة النشاط، ورصد عادة وظيفة الأنزيمية. في حملات FBLD2،3،4،5، ومع ذلك ، يتم اختبار بعض مئات المركبات التي عادة ما تكون أصغر من المخدرات (100-200 دالتون) لقدرتها على ربط الهدف مباشرة ، دون استخدام فحص النشاط. يمكن أن تتداخل هذه الربطة مع النشاط المستهدف ويمكن قياسها بالعديد من الأساليب الفيزيائية الحيوية التي تقدم تقارير مباشرة عن قدرة الشظايا على الارتباط بالهدف ، أو بالطرق الهيكلية مثل التصوير البلوري بالأشعة السينية6 ومطياف الرنين المغناطيسي النووي7، ومؤخرا ، أيضا المجهر الإلكتروني المبرد. عندما ترتبط الشظايا في مواقع مختلفة قريبة من بعضها البعض على البروتين ، يمكن الجمع بين الأجزاء المختلفة ، وعادة ما تكون منخفضة التقارب ملزمة كيميائيا لإنشاء مجموعة صغيرة من الخيوط التي يمكن دراستها بمزيد من التفصيل. وهذا يؤدي في كثير من الأحيان إلى مركبات أعلى تقاربا وأكثر فعالية ، وقد بدأت هذه المنهجية في إنتاج جزيئات مهمة ذات إمكانات سريرية. اختيار "مثالية" مكتبة جزء يستغل المجموعات الكيميائية بكفاءة كان مجالا نشطا للبحث لسنوات عديدة8،9،10.

وفي حين كان التركيز الأولي على تغطية الحيز الكيميائي الكامل، تركز الاهتمام اللاحق على تمكين التركيبة الكيميائية في المصب من ضربات الشظايا من إنتاج مركبات الرصاص. وقد أدت هذه البحوث إلى ما يسمى بالمكتبات "المتأهبة". تحتوي هذه الشظايا على أجزاء مع مجموعة وظيفية واحدة على الأقل تسمح بالمتابعة السريعة ورخيصة للكيمياء الاصطناعية لتحقيق تقدم فعال في دراسة البحث والإنقاذ. وكان أحد الأنشطة التي حفزتها iNEXT هو تحديث المكتبة التي يستعد لها الباحثون في مصدر الضوء الماسي واتحاد الجينوم الهيكلي. هذا الجهد المشترك أدى إلى مكتبة DSi-Poised11، والتي تم التحقق من صحتها أيضا داخل iNEXT12. وفي وقت لاحق، تمت مواءمة هذه المكتبة مع توافر المركبات في قاعدة بيانات REAL من Enamine Ltd.، وهي منظمة أبحاث كيميائية ومنتجة لمجموعات كبيرة من لبنات البناء والمكتبات المركبة للفحص. DSi-Poised متاح الآن لأي شخص للشراء ، ولكنه متاح أيضا في العديد من مختبرات شريك iNEXT-Discovery لمشاريع فحص الأجزاء المدعومة.

إن تقنيات علم البلورات بالأشعة السينية المتطورة وتقنيات البيولوجيا الهيكلية NMR لها مزاياها وعيوبها بالنسبة ل FBLD. وكلاهما يتطلب عينات هدف معزولة ويسفر عن التفاصيل الذرية عالية الدقة المطلوبة ل FBLD. ومع ذلك ، فإن البلورات ضرورية لتصوير البلورات بالأشعة السينية ، وترتبط الشظايا بتجاويف في مناطق البروتين مرتبة جيدا والتي لا تشارك في بناء شعرية الكريستال ثلاثية الأبعاد. الحل NMR غالبا ما تسفر عن ضربات مختلفة من التصوير البلوري بالأشعة السينية، كما أنها لا تتأثر بالبيئة البلورية وجيدة في الكشف عن ملزمة أيضا في مناطق البروتين أمرت جزئيا. ومع ذلك ، في حين أن تجارب NMR المستندة إلى ligand سريعة نسبيا ، إلا أنها لا تزال تتطلب قدرا كبيرا من الوقت والمواد ويمكن القيام بها بشكل روتيني فقط لأهداف أو مجالات البروتين الصغيرة نسبيا. لغرض إعطاء الأولوية للمركبات لتجارب كريستالية أو NMR ، تم استخدام النهج الفيزيائية الحيوية13،14،15.

وبما أن الأجهزة الحديثة والبروتوكولات الحسابية تسمح بالفحص البلوري الفعال ل FBLD من خلال تحديد الهياكل وتحليل ~ 1000 جزء بكفاءة عالية ، فقد أصبح ترتيب الأولويات هذا أقل أهمية في الأبحاث القائمة على الأشعة السينية. غير أنه بالنسبة ل NMR، لا يزال من المستصوب استخدام تجارب أرخص وأسرع لتحديد أولويات فحص المكتبات وتوفير وقت الأجهزة على المعدات الراقية. وفي الوقت نفسه، يمكن أن يوفر استخدام مزيج من التكنولوجيات المختلفة أساسا تأكيدا مستقلا للأحداث الملزمة، أو حتى ضربات إضافية لا يتم التقاطها باستخدام طريقة علم البلورات أو NMR فقط. تتطلب تقنيات كريستالوغرافية وNMR معدات باهظة الثمن ولا يمكن القيام بها في كثير من الأحيان إلا في مرافق خارجية مخصصة بمساعدة خبراء محليين ذوي مهارات عالية. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب التحليل السليم للنتائج أيضا خبرة عالية. في حين أن برامج مثل iNEXT و iNEXT-Discovery تعمل على إضفاء الطابع الديمقراطي على الوصول إلى مثل هذه المرافق16، فقد تم الاعتراف بأن فحص FBLD الرخيص والسريع وعالي الإنتاجية بطرق أخرى يمكن أن يشجع برامج فحص الأدوية في مجموعة أوسع بكثير من المختبرات. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه النتائج كمؤشر لبناء تعاون مع الكيميائيين الطبيين، وإعطاء الأولوية لتجارب الفحص الأكثر تكلفة للمركبات الواعدة إذا فرضت مرافق الرنين المغناطيسي والبلورات قيودا على عدد المركبات التي يمكن فحصها.

تشكل TSA طريقة17 الحيوية سريعة وفعالة ورخيصة نسبيا ويمكن الوصول إليها ويمكن استخدامها لفحص FBLD. وقد تم استخدامه في إعدادات متعددة, من المساعدة على إيجاد ظروف البروتين مستقرة لتجاربتبلور 18, إلى العثور على المركبات التي تربط إلى أهداف محددة في الخلايا19. كما تم استخدام TSAs لقياس ثوابت الانفصال عن البروتينات المستهدفة الملزمة ليغاندس ، حيث أن الربط الرابط غالبا ما يؤدي إلى تغييرات في الاستقرار الحراري. في جميع TSAs ، يتم قياس التغير في درجة حرارة التشبع للبروتين (استقراره) كدالة لزيادة درجة الحرارة البطيئة. وهناك طريقة فعالة لمتابعة تشبع البروتين عند التدفئة عن طريق DSF أو Thermofluor، الذي يحدد كميا إخماد الفلورية من صبغة مسعورة (عادة سيبرو أورانج) عند التفاعل مع المناطق المعرضة للماء من البروتين الذي يتكشف بسبب زيادة درجة الحرارة.

يشير Nano-DSF عادة إلى قياس الاستقرار الحراري للبروتين في غياب الأصباغ الخارجية. وكان من أولى الأدوات التي عرضت هذا الاحتمال OPTIM1000 الذي يقيس طيفا واسعا من كثافة الضوء وكذلك تشتت الضوء لعينة. سمحت هذه الآلة للقياس المتزامن للبروتين تتكشف (عادة بعد التربتوفان مضان) وتجميع البروتين (كما شكلت الجسيمات النانوية يؤدي إلى زيادة في ضوء التناثر في ~ 400 نانومتر). في وقت لاحق، أدخلت بروميثيوس استخدام انعكاس الظهر لقياس التجميع والكشف الحساس عن إشارة مضان، مما يسمح بفحص تركيزات البروتين منخفضة مع حساسية جيدة20. يصف القسم التالي كيفية استخدام بروميثيوس لإظهار بروتوكول فحص جزء للكشف عن الزيارات لأهداف البروتين المختلفة. ويتبع مقدمة موجزة عن نوعية البروتين المتوقعة وكميتها بروتوكول خطوة بخطوة لإعداد وأداء وتحليل تجارب فحص الأجزاء. وقد تم عرض نتائج الفحص لثلاثة بروتينات على سبيل المثال البيانات التي تم الحصول عليها كجزء من التعاون بين iNEXT و Discovery.

Protocol

ملاحظة: يجب أن تكون البروتينات المستخدمة في تجارب nano-DSF نقية (>95٪) ومتجانسة كما يحكم عليها دودلسلكبريتات الصوديوم-البولي أكريلاميد هلام electrophoresis. قبل إجراء الشاشة جزء، وينبغي تحديد استقرار البروتينات في ظروف عازلة مختلفة. وينبغي استخدام قوة أيونية منخفضة، وانخفاض الملح العازلة التي تتداخل الحد الأدنى مع البروتين حتى لا تؤثر على تفاعلها المباشر مع شظايا. يتم عرض المخازن المؤقتة المستخدمة عادة في هذا البروتوكول للتحقق من الاستقرار في الجدول التكميلي S1. تركيز البروتين الذي يحتاج إلى استخدامها لهذه التجربة كحل الأسهم عادة 0.2 ملجم-1. لفحص كامل مكتبة DSi-Poised (768 مركبا)، هناك حاجة إلى ما مجموعه ~ 12 مل من البروتين من هذا التركيز، ما مجموعه ~ 2.5 ملغ. تم توفير مكتبة DSi-Poised المستخدمة في هذه التجارب بتنسيق 96 بئرا(الشكل 1). تم تعديل تركيز الشظايا إلى 100 مليون في 20٪ v/v ثنائي ميثيل سلف أكسيد (DMSO). وتجدر الإشارة إلى أن بروتوكول الخلط الموصوف هنا يؤدي إلى تركيزات DMSO النهائية المنخفضة بنسبة 0.4٪ v/v؛ على الرغم من أن هذا من غير المرجح جدا أن تؤثر على استقرار البروتين, وينبغي التحقق من تأثير DMSO لكل بروتين جديد.

Figure 1
الشكل 1: أنواع لوحات المستخدمة لهذه التجارب. (أ) لوحة U-bottom. (ب) 96-لوحة جيدا. (ج) منظر عن قرب من لوحة 96 جيدا تظهر subwell 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. إعداد لوحة

  1. أخرج لوحة شظية من الفريزر -20 درجة مئوية/-80 درجة مئوية، ودعه يذوب في درجة حرارة الغرفة، مع اهتزاز لطيف على شاكر على قمة المقعد. الطرد المركزي لوحة في 500 × غرام لمدة 30 ق لجمع أي قطرات التمسك جانب الآبار.
    ملاحظة: بما أن مكتبة الأجزاء متوفرة في DMSO-d6 (نقطة انصهار 19 درجة مئوية)، فمن الضروري التأكد من أن كل مركب يتم إذابته وتليينه بالكامل.
  2. اتخاذ MRC 2-جيدا بلورة لوحة (الشكل 1A), وماصة 14.7 ميكرولتر من محلول مخزون البروتين في كل شبه جيدا. للقيام بذلك بطريقة فعالة من حيث الوقت، والحفاظ على البروتين في خزان كاشف(جدول المواد)،واستخدام ماصة متعددة القنوات للاستغناء (الشكل 2A،B).
    ملاحظة: بالنسبة لمكتبة DSi-Poised، اعتمادا على التنسيق، لا تحتوي جميع آبار اللوحة ذات 96 بئرا على مركبات. عادة، يتم تعبئة الصفوف A و H والأعمدة 1 و 12 مع DMSO. وبالتالي، لا يجب ملء الصفوف A و H والأعمدة 1 و 12 بالبروتين، لأن هذه الآبار لن تحتوي على أي شظايا في نهاية الخطوة التالية. فقط DMSO سيتم نقلها هناك بواسطة الروبوت. يرجى ملاحظة أن الصفوف والأعمدة الفارغة تختلف في بعض اللوحات.

Figure 2
الشكل 2: مخطط تفصيلي لإجراء فحص الشظايا. (أ) باستخدام ماصة متعددة القنوات وخزان كاشف للاستغناء عن البروتين. (ب) الاستغناء عن البروتين في لوحة 96 جيدا. (ج) جزء الاستغناء عن موزع الروبوت. (د)تحميل البروتين في الشعيرات الدموية. (ه) درج يظهر حامل الشعرية. (F) عرض عن قرب لحامل الشعرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: نظرة عامة على المعدات المستخدمة في هذه التجارب. (أ) الروبوت Nanodispenser المستخدمة في الاستغناء عن جزء. يشار إلى مواقف لوحة. (ب) واجهة البرنامج لتعريف لوحة جديدة. (ج) واجهة برنامج الاستغناء. (د)برنامج الاستغناء المستخدمة للاستغناء عن شظايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. جزء نانو الاستغناء عن الروبوت البعوض

  1. تحقق من نوع اللوحة التي يتم فيها توفير الشظايا(جدول المواد).
  2. تحقق من تعريفات الشظايا والبروتينات على البعوض.
    1. قم بتشغيل جهاز النانوديسبينسر(الشكل 3A). تأكد من عدم وجود عقبات حول المكونات المتحركة.
    2. افتح واجهة المستخدم الرسومية، وانقر على علامة التبويب الإعداد، وتحت تكوين سطح السفينة،تحقق مما إذا كان نوع اللوحة التي يتم توفير المركبات فيها وتلك التي تم نقل البروتين فيها في القسم 1 موجودة بالفعل في قائمة اللوحات المتوفرة. إذا لم يكن كذلك، انقر فوق خيارات| لوحات وإنشاء تعريف لوحة جديدة عن طريق ملء القيم الصحيحة لنوع الخاصية (الشكل 3B).
      ملاحظة: هذه القيم للوحة MRC 2-well و 96-well لوحة المستخدمة في هذه التجربة تظهر في الجدول التكميلي S2 والجدول التكميلي S3, على التوالي.
  3. برنامج الاستغناء
    1. ضمن علامة التبويب إعداد، حدد موضع اللوحة ضمن تكوين سطح السفينة.
      ملاحظة: البعوض المستخدمة في هذه التجربة اثنين من مواقف لوحة على سطح السفينة. يتم تعريف الموضع 1 على أنه لوحة المصدر، والموضع 2 هو لوحة الوجهة.
    2. باستخدام القائمة المنسدلة، اختر Greiner U لوحة أسفل لموقف 1 وMRC 2-لوحة جيدا لموقف 2 (الشكل 2C). حفظ البروتوكول.
  4. توزيع الأجزاء
    1. ضع لوحة الشظايا في الموضع 1 ولوحة البروتين في الموضع 2 من سطحالسفينة (الشكل 3A).
    2. في علامة التبويب بروتوكول (الشكل 3D)، انقر على ملف واختر البروتوكول المحفوظة في القسم 2.3 للاستغناء عن الأجزاء. تحديد حجم الأجزاء التي سيتم توزيعها؛ استخدام 0.3 ميكرولتر. بالنسبة إلى لوحة نموذجية، حيث لا يحتوي العمودان 1 و12 على أجزاء، حدد موقع البدء إلى العمود 2 وموقع النهاية إلى العمود 11. في بعض اللوحات، إذا كانت الأعمدة 2 أو 11 فارغة، استخدم العمودين 3 و10 كقيم بداية ونهاية، على التوالي.
      ملاحظة: بسبب إعداد Mosquito يمكن تخطي الأعمدة فقط، وليس الصفوف; للصفوف، فإن البعوض ماصة DMSO. تأكد من تحديد الخيار تغيير تلميح ك دوما، حتى لا تتقاطع تلويث مكتبة الأجزاء.
    3. انقر على تشغيل لبدء البرنامج. بعد الاستغناء، الذي يستغرق ~ 2 دقيقة، وتكتملت، وإزالة البروتين ولوحات جزء من الروبوت، وختم لهم مرة أخرى مع فيلم ختم لاصقة. طرد مركزي لفترة وجيزة لوحة البروتين (500 × غرام، 30 ثانية) لجمع أي قطرات التمسك الجانبين من الآبار قبل الشروع في الخطوة التالية.

3. قياس نانو DSF

ملاحظة: تم نشر وصف مفصل حول تنفيذ TSAs باستخدام Prometheus NT.48 سابقا20. 10- ترد هنا نقاط هامة في سياق فحص الشظايا.

  1. فحص اللوحة قبل القياس
    1. فحص بصريا آبار لوحة البروتين لهطول الأمطار التي قد تكون حدثت بسبب إضافة شظايا. إذا لوحظ هطول الأمطار في العديد من الآبار، والحد من تركيز شظايا، وتكرار التجربة.
      ملاحظة: من المستحسن الحفاظ على لوحة البروتين في درجة حرارة الغرفة. شظايا تميل إلى أن تصبح غير قابلة للذوبان في درجات حرارة أقل.
  2. إعداد بروميثيوس
    1. قم بتشغيل أداة بروميثيوس. على شاشة اللمس، اضغط على فتح درج للوصول إلى وحدة تحميل الشعرية للجهاز. إزالة الشريط المغناطيسي من وحدة التحميل، وتنظيف المرآة مع الإيثانول لإزالة أي جزيئات الغبار.
  3. نقل من لوحة شظايا البروتين إلى الشعيرات الدموية
    ملاحظة: تتضمن هذه الخطوة نقل عينة البروتين/الشظايا المختلطة من كل بئر في صفيحة البروتين إلى الشعيرات الدموية لاستخدامها مع بروميثيوس. لهذا، على الرغم من أن نوع الشعيرات الدموية القياسية يستخدم عادة، فمن الممكن استخدام الشعيرات الدموية عالية الحساسية لتركيزات البروتين منخفضة جدا.
    1. ضع لوحة البروتين والشعيرات الدموية بجانب الجهاز لسهولة الوصول إلى وحدة التحميل الشعرية.
    2. تأخذ واحدة الشعرية، عقد في نهاية واحدة، ولمس الحل في لوحة البروتين مع نهاية بعيدة من الشعرية لنقل العينة عن طريق العمل الشعرية. دائما ارتداء قفازات، وتأكد من عدم لمس الشعرية في الوسط، والشوائب(مثل.،جزيئات الغبار) من القفازات من شأنه أن يؤثر على القياس.
    3. ضع الشعرية في الموضع المعين لحاملها، وتأكد من محاذاتها بشكل صحيح وتركزها.
    4. كرر الخطوتين 3.3.2 و3.3.3، وبالتالي ملء جميع المناصب في وحدة التحميل. تحميل جميع الشعيرات الدموية سوف تحتاج للقياس.
      ملاحظة: يمكن تحميل الحد الأقصى من الشعيرات الدموية 48 لتشغيل واحد.
    5. في النهاية، ضع الشريط المغناطيسي فوق الشعيرات الدموية لعقدها في مكانها، واضغط على إغلاق درج لبدء التجربة.
  4. إجراء تجربة نانو-DSF
    1. فحص الفلورسينس
      1. فتح تطبيق بروميثيوس العلاقات العامة. وrmControl، وإنشاء مشروع جديد عن طريق النقر على بدء جلسة عمل جديدة باستخدام اسم ProteinName_ScreenName_PlateNumber. أولا، قم بمسح ديسكفري للكشف عن مضان العينات.
        ملاحظة: يجب أن تكون مستويات الفلورسينس أعلى من 3000 عدد لكل عينة. ولن تقاس العينات التي تتجاوز فترة التشبع بالآلة (000 20 تهمة).
      2. تغيير إشارة مضان من العينات عن طريق ضبط قوة الإثارة من الليزر (الشكل 4).
    2. التسخين الحراري
      1. انقر على علامة التبويب مسح ذوبان. لإجراء التجربة، قم بتعيين درجة حرارة البدء إلى 20 درجة مئوية، ودرجة الحرارة النهائية إلى 95 درجة مئوية، ومنحدر درجة الحرارة إلى 1 درجة مئوية فيالدقيقة -1. انقر على قياس البدء.
    3. تعليق توضيحي للتجربة
      1. بعد بدء التجارب، انقر على علامة التبويب التعليقات التوضيحية والنتائج. الشرح كل الشعرية من خلال إعطائها لوحة فريدة من نوعها، وعدد جيد.
        ملاحظة: على سبيل المثال، 1B2 الشعرية تتوافق مع لوحة 1 و B2 جيدا. في علامة التبويب هذه، يمكن إضافة أعمدة إضافية للتجربة، على سبيل المثال،اسم البروتين، المخزن المؤقت، تركيز البروتين. بعد انتهاء التجربة، يتم عرض النتائج أيضا في علامة التبويب هذه. هذا هو الوقت المناسب للتوقف في نهاية اليوم. التجارب تجري بين عشية وضحاها، ويمكن جمع النتائج في اليوم التالي.
    4. تصور البيانات وتصديرها
      1. بعد الانتهاء من التجربة، انقر على علامة التبويب "مسح الذوبان" لعرض منحنيات الذوبان والتشتت للعينات. لتصدير النتائج في جدول بيانات، انقر على علامة التبويب Melting Scan، وانقر على تصدير،واختر تصدير البيانات المعالجة من القائمة المنسدلة.

Figure 4
الشكل 4: ضبط قوة الإثارة وإشارة الفلورسينس. (أ) في قوة الإثارة 80٪، إشارة الفلورسينس لمعظم العينات هو خارج حدود التشبع. (ب)يتم تقليل إشارة الفلورسينس إلى مستويات قابلة للقياس عن طريق تقليل قوة الإثارة إلى 60٪. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. التكرار

  1. كرر الخطوات 1-3 لتنفيذ 16 أشواط على مكتبة إينامين بأكملها من 768 مركبا (16 × 48 = 768).
  2. كما قياس كل لوحة يستغرق ~ 1.5 ساعة لإكمال، واستكمال التعليق التوضيحي (3.4.3)، وإعداد لوحة شظايا البروتين المقبل عن طريق تكرار الخطوات في القسمين 1 و 2.
    ملاحظة: في يوم عمل نموذجي، يمكن قياس 4-6 لوحات، اعتمادا على الخبرة. يمكن الانتهاء من فحص مكتبة DSi بأكملها في ما مجموعه 3-4 أيام.

5. تحليل البيانات

  1. فحص البيانات التي تم إنشاؤها
    1. بمجرد الانتهاء من كل تشغيل، انقر فوق علامة التبويب التعليقات التوضيحية والنتائج لعرض النتائج. لكل عينة، ركز على قيمتين محسوبتين هما الأكثر أهمية في هذه النظرة العامة: 1) درجة حرارة بداية التشتت(بداية #1 للتشتت)،والتي تشير إلى درجة الحرارة في بداية أحداث تشتت العينة المتزايدة وهي سمة من سمات التجميع؛ 2) Tm (نقطة انقلاب # 1 بالنسبة للنسبة) القيمة المستخرجة من النسبة بين أحداث الفلورسينس في 330 و 350 نانومتر القيم التي تتوافق عادة مع التغيرات القصوى من تفلور التربتوفان عند التغيرات في بيئتها.
    2. تأكد من التحقق من التشتت ومنحنيات الذوبان لكل الشعرية في علامة التبويب "مسح ذوبان" للتأكد من أن هذه القيم موثوق بها.
  2. التصدير والتفتيش إلى جدول بيانات
    1. تصدير البيانات من كافة أشواط مختلفة للتفتيش على برنامج جدول البيانات، كما هو موضح في 3.4.4، وإنشاء جداول نظرة عامة والمؤامرات. انقر فوق أوراق مختلفة في ملف جدول البيانات لملاحظة المعلومات في كل ورقة.
      1. في ورقة نظرة عامة، لاحظ أن كل صف يتوافق مع تجربة واحدة. على طول نظرة عامة على المعلمات(على سبيل المثال،درجة حرارة البدء والنهاية)، لاحظ القيم المحسوبة ل Tm وبداية التشتت (انظر 5.1 أعلاه للأسماء والشرح، والملفات التكميلية 1 و 2 كمثال). كما يحسب البرنامج اثنين أو أكثر من القيم Tم (نقطة انقلاب # 1 و # 2 للنسبة) لبعض العينات، والنظر في منحنى الانتقال ذوبان لتحديد أي من القيم TM هو الصحيح.
      2. في ورقة النسبة، لاحظ أن كل عمود يتوافق مع عينة، وكل صف إلى البيانات التي تقرأ في كل خطوة درجة حرارة. لاحظ قيم العد الفلورية المقابلة لكل خطوة درجة حرارة ، واستخدمها لرسم منحنيات الذوبان لعينات محددة ، ورسم عمود درجة الحرارة مقابل عمود العد الفلوري. لاحظ أن البيانات في النسبة (المشتقة الأولى) ، 330 نانومتر ، 330 نانومتر (المشتقة الأولى) ، 350 نانومتر ، 350 نانومتر (المشتقة الأولى) تستخدم لحساب النسبة ومشتقها الأول (الذي يحتوي على الحد الأقصى عند الحد الأقصى لمعدل التغيير) في تنسيق مماثل.
      3. لاحظ بيانات مشابهة للتشتت في ورقة التشتت. إنشاء منحنى التشتت لكل عينة عن طريق رسم عمود درجة الحرارة مقابل عمود التشتت. ابحث عن ورقة للشتق الأول التشتت.
  3. إنشاء نظرة عامة عامة لكافة الأجزاء والتحقق من صحتها
    1. بعد التحقق من قيم Tm الصحيحة للأجزاء، اجمع بين العمودين Sample ID ونقطة انقلاب نسبة 330/350 نانومتر (Tm)من كافة الأشواط في ملف نتيجة جديد واحد، ونسخ هذه الأعمدة من كل تشغيل.
    2. استخدم متوسط قيمة Tm للبروتين الأصلي (المحسوب عادة على مدى عشرة أشواط) وطرحه من قيم Tm لكل عينة ، للحصول على ΔTm. فرز النتائج عبر ΔTm بترتيب تنازلي لتحديد العينات التي تؤدي إلى أكبر تحول.
    3. تقسيم الأجزاء إلى صناديق اعتمادا على التحولM ΔT، وتوليد جدول تردد للمكتبة بأكملها عن طريق رسمم ΔT لكل سلة ضد عدد من شظايا (الشكل 5). للراحة، قم بإظهار المحور الذي يمثل عدد الأجزاء في مقياس السجل. قم بملء العينة باستخدام ΔTm ±1، وعدل الصناديق الأخرى مع كل شوط لضبط عدد القيم المتطرفة تجريبيا.

Representative Results

تم إجراء ملء شاشة مكتبة DSi-Poised (768 جزء) على ثلاثة بروتينات ذات أهمية طبية ، وهي ، وkinetochore الخارجي أعرب للغاية في بروتين السرطان 1 (Hec1، أو Ndc80)، وتكرار tetraricopeptide التنظيمية (TPR) المجال من كيناز المغزل الاحتكاري 1 (Mps1)، والسارس-CoV-2 3C مثل بروتياز، Nsp5، الذي يشق قبالة C-terminus من البوليبروتين متماثلة في 11 موقعا. وتظهر الظروف العازلة التي تم اختيارها لكل بروتين، فضلا عن تركيز البروتين و Tm من البروتينات، في الجدول التكميلي S4.

Figure 5
الشكل 5: توزيع التردد للتحول في درجة حرارة ذوبان (ΔTم)للبروتينات الثلاثة، Hec1، Mps1، و Nsp5، المقدمة في هذه الدراسة كنتائج تمثيلية. المختصرات: Hec1 = أعرب عنه للغاية في بروتين السرطان 1; Mps1 = الاحتكار المغزل كيناز 1؛ Nsp5 = السارس-CoV-2 3C مثل بروتياز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تظهر نتائج الفحوصات الثلاثة باستخدام البروتوكول الموضح أعلاه، والمبينة على أنها توزيع تردد التغيير في Tm مقابل عدد الأجزاء، في الشكل 5. وقد تم إنشاء هذه المؤامرات كما هو موضح في القسم 5.3 من البروتوكول، ورسم وتيرة التغيير الملحوظ في Tm. وينبغي تحديد أهمية التحول بطريقة ذاتية لكل مشروع مختلف، على النحو المبين في قسم المناقشة أدناه. تشير القيم السالبة إلى انخفاض في درجة حرارة الذوبان في وجود جزء ، وهي قيمة إيجابية زيادة في Tm. من هذه المؤامرات ، فمن السهل أن نلاحظ أن لNSP5 ، كل شظايا لها تأثير مزعزع للاستقرار ، في حين أن ل Hec1 و Mps1 ، على حد سواء استقرار وزعزعة الاستقرار ويلاحظ الضربات. ويمكن توقع ذلك ومناقشته.

Discussion

يصف هذا البروتوكول طريقة متوسطة إلى عالية الإنتاجية لفحص مكتبات الأجزاء باستخدام بعض الروبوتات الشائعة وأدوات القياس. شاشات مثل تلك الموصوفة في هذا البروتوكول يمكن أن يؤديها بشكل روتيني مرفق البروتين NKI في أمستردام، على سبيل المثال كخدمة iNEXT-ديسكفري، في كثير من الأحيان حتى مجانا للمستخدمين بعد تطبيق الاقتراح ومراجعة الأقران. وفي مثل هذه الحالات، يمكن للمرفق توفير مكتبة DSi-Poised، ولكن يمكن أيضا مناقشة استخدام المكتبات الأخرى في سياق كل تطبيق مستخدم مختلف واتفاق خدمة مختلف. ويمثل اختيار الصكوك في هذا البروتوكول حلولا عملية للعديد من المختبرات، ولكن لا ينبغي اعتباره معيارا ذهبيا. يوصى باستخدام طرق خالية من الملصقات لقياس الاستقرار الحراري للبروتين المستهدف لفحص الشظايا ، بدلا من الطرق التي تستخدم الملصقات الحساسة بيئيا للكشف عن التكشف في تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي.

أساليب خالية من التسمية، مثل تلك المعروضة هنا باستخدام أداة بروميثيوس، لها بعض المزايا: أنها تستخدم كميات منخفضة من البروتين، وغالبا ما بضعة أوامر من حجم أقل؛ ويمكن استخدامها لقياس تشتت العينة في وقت واحد وبالتالي التجميع؛ والتسميات المستخدمة للكشف تتكشف في نهج أخرى يمكن أن تتفاعل بشكل مختلف مع كل جزء، مما أدى إلى قياس القطع الأثرية. وقد وصف هذا البروتوكول في سياق الروبوت البعوض، والذي يسمح الأنابيب من حجم صغير جدا من العينة (0.3 ميكرولتر) التي لا يمكن القيام به يدويا. البعوض هو الروبوت شعبية، موجودة في العديد من المختبرات التي تعمل على البيولوجيا الهيكلية ومشاريع اكتشاف المخدرات. ومع ذلك، يمكن استخدام البروتوكول بوضوح نهج بديلة ل pipetting وحدة تخزين منخفضة.

تحتوي مكتبات الأجزاء على مركبات مذابة في DMSO. أحد التحديات الأولية هو العثور على تركيز DMSO الأمثل الذي يبقى فيه البروتين مستقرا ، وتظل المركبات قابلة للذوبان. وهذا ينطوي على إجراء القياسات بتركيزات DMSO المختلفة لتحديد الظروف المثلى للفحص. البروتين لتجزئة التخفيف المستخدمة هنا يؤدي إلى تركيزات DMSO من 0.2٪؛ معظم البروتينات مستقرة إلى حد ما في هذه الظروف. كمية البروتين المطلوبة لإجراء الفحص للمكتبة 768 مركب ~ 2-3 ملغ في المجموع، كما يتم إجراء القياسات عادة بتركيزات البروتين منخفضة (0.2 مل ملغ-1). العمل مع مثل هذه التركيزات البروتين منخفضة نسبيا ليس فقط يقلل من تكاليف إنتاج البروتين، ولكن أيضا يقلل من فرص هطول الأمطار البروتين. لا يؤثر تركيز البروتين المنخفض على اكتشاف ربط الشظايا ، حيث أن تركيز الشظايا في التجربة هو ~ 2 mM ، مما يسمح أيضا بتحديد الموثقات الضعيفة.

وبما أن الكشف عن انتقال الذوبان في هذه التجارب يستند إلى كثافة الفلورسينس، فإن الجانب الحاسم هو تحديد قوة الإثارة لليزر الذي يمكن من خلاله إجراء القياسات. التفاعل بين المركبات مع البروتين يمكن أن (1) ليس لها أي تأثير على مضانها الجوهري، (2) يؤدي إلى إخماد، أو (3) زيادة مضانها الجوهري. بالإضافة إلى ذلك، فإن العمل مع تركيزات البروتين المنخفض يعني أن عدد الفلورية للبروتين الأصلي سيكون منخفضا. وبالتالي يجب تعديل قوة الإثارة بطريقة يمكن قياس معظم العينات. يوفر ملف تعريف التشتت لكل تشغيل معلومات هامة حول تأثيرات التجميع التي قد يتم تشغيلها بواسطة إضافة أي جزء. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا رؤية تأثير درجة الحرارة على قابلية الذوبان المركبة على ملف التشتت.

بشكل غير متوقع ، بالنسبة للعديد من المركبات لوحظ أن التشتت انخفض بالفعل مع ارتفاع درجة الحرارة(الشكل 6). ولذلك من المهم النظر في كل من منحنى الانتقال الذائب وملف التشتت المصاحب لاتخاذ قرار بشأن موثوقية كل تجربة ، خاصة بالنسبة لتلك الشظايا التي تعتبر مرشحة لقياسات أكثر تطلبا عن طريق التصوير البلوري بالأشعة السينية أو التحليل الطيفي NMR ، أو حتى تعتبر بمثابة ضربات لكيمياء المتابعة. أحد القيود المحددة للطريقة لأغراض فحص الشظايا هو أن العديد من الشظايا في مكتبة DSi-Poised لها مضان جوهري كبير ، في بعض الأحيان حتى خارج حد التشبع للكاشف ، وبالتالي لا يمكن فحصها بشكل صحيح لربط الهدف حتى في قوة الإثارة المنخفضة. نقطة أخرى أن نلاحظ لهذه الطريقة هو أنه لا يمكن إلا أن تستخدم مع البروتينات التي تحتوي على بقايا التربتوفان.

Figure 6
الشكل 6: تأثير درجة الحرارة على قابلية الذوبان المركب. ذوبان منحنى الانتقال وتشتت الملف الشخصي من Hec1 مع اثنين من مركبات مختلفة. (أ)يظهر ملف تعريف التشتت أنه بالنسبة لهذه العينة ، لا تتأثر الذوبان بدرجة الحرارة. (ب)يظهر ملف التشتت أن قابلية الذوبان في هذه العينة تزداد مع ارتفاع درجة الحرارة. وبالتالي فإن منحنى الانتقال الذائب في هذه الحالة غير موثوق به. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

والسؤال المفتوح هو ما الذي ينبغي اعتباره تغييرا كبيرا في Tm، ليس من منظور رياضي ، ولكن من وجهة النظر العملية: ما هو التغيير في Tm المهم اعتباره مؤشرا على ربط الليغند بالبروتين؟ في هذه الأمثلة ، وينظر إلى التحولات أقل من 1 درجة مئوية ل74 ٪ من شظايا ملزمة Hec1 ، 66 ٪ لMps1 ، و 53 ٪ لNsp5. النظر في 1 درجة مئوية باعتبارها "تغيير كبير" من شأنه أن يوفر بالكاد الزيارات التي تستحق متابعة الكيمياء المتابعة. في الرسوم البيانية نظرة عامة (الشكل 5)، صناديق من 1، 2، 5، أو أكثر من 5 درجات من التحول Tم، إما إيجابية أو سلبية، والنظر فيها. وهذا يتطلب تعديلا وفقا لكل حالة محددة لإعطاء نظرة عامة جيدة والسماح بصنع القرار المستنير، وتحديد الخطوة التالية. وتجدر الإشارة إلى أنه بالنسبة لبعض البروتينات، لوحظ استقرار الهدف وإزالة استقراره على حد سواء تبعا للشظايا التي تم النظر فيها. كلا الحدثين مثيرة للاهتمام، كما يمكن أن يكون كل من نتيجة لربط جزء، وكلاهما يمكن أن يؤدي إلى جزيء متابعة جيدة للتلاعب سلوك البروتين.

ويبقى السؤال الأخير، وهو "ما الذي يعرف الضربة المفيدة؟". في الواقع، الجواب يعتمد على الوضع المحدد. على سبيل المثال ، بالنسبة ل Hec1 ، تم إبلاغ جميع الشظايا التي تعمل على استقرار البروتين بأكثر من درجتين أو تزعزع استقراره بأكثر من 5 إلى المتعاونين مع الكيمياء لدينا ، الذين صمموا جزيئات جديدة استنادا إلى هذه الزيارات. بالنسبة ل Nsp5 ، ومع ذلك ، تم إبلاغ معظم الزيارات التي تعمل على إزالة الاستقرار إلى المتعاونين مع NMR لدينا لتأكيد الضربات المشتقة من nanoDSF مع تجارب NMR. وبعبارة أخرى، ينبغي تحليل نتائج الفرز التي تم الحصول عليها من هذا البروتوكول بحذر وبطريقة تعتمد على السياق، واتخاذ قرارات مستنيرة على أساس المسألة المحددة والمنهجية المحيطة بها. على أي حال، فإن الطريقة الموصوفة هنا هي نهج تكميلي للمنهجيات القائمة مثل الأشعة السينية والفحص القائم على NMR، والتي يمكن أن تهدف إلى تأكيد أو إعطاء الأولوية أو إعطاء أفكار جديدة لحملات الكيمياء.

الجدول التكميلي S1: قائمة المخازن المؤقتة المستخدمة لفحص البروتينات. الاختصارات: HEPES = 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-حمض بيبرازينيثانسولفونيك; DTT = ديثيوثيريتول; MOBS = 4-(N-مورفولينو)حمض البوتانسولفونيك. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول التكميلي S2: خصائص لوحة MRC 2-well للاستخدام مع الروبوت nanodispenser. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول التكميلي S3: خصائص لوحة V-bottom 96-well للاستخدام مع الروبوت nanodispenser. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول التكميلي S4: العازلة, تركيز البروتين, و Tم من البروتينات التي نوقشت في النتائج التمثيلية. الاختصارات: DTT = ديثيوثيريتول; Hec1 = أعرب للغاية في بروتين السرطان 1; Mps1 = الاحتكار المغزل كيناز 1؛ Nsp5 = السارس-CoV-2 3C مثل بروتياز. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الملف التكميلي 1: معلمات نظرة عامة-بيانات المثال. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: قيم Tm و ΔTm ل 406 بيانات على سبيل المثال الأجزاء. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Disclosures

لا توجد أي إفصاحات.

Acknowledgments

"استفاد هذا العمل من الوصول إلى مرفق البروتين NKI، وهو مركز Instruct-ERIC. وقد تم تقديم الدعم المالي من قبل iNEXT، رقم المشروع 653706، و iNEXT-Discovery، رقم المشروع 871037، بتمويل من برنامج أفق 2020 للمفوضية الأوروبية".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ClearVue Sheets Molecular Dimensions adhesive sealing film for protein plate
CORNING 6570 Aluminium Sealing Tape CORNING adhesive sealing film for fragment plate
DSi poised library Enamine Fragment library containing 768 compounds used in this study
Elisa Reagent Reservior ThermoFisher Scientific 15075 Reagent reservior used for pipetting the protein
Greiner round (U) bottom plates Cat. No. 650201 Fragments supplied in these plates
Mosquito type X1 sptlabtech Part nr- 3019-0003 Nanolitre dispenser
MRC 2-well crystallization plate MRC96T-PS
Pierce ELISA Reagent Reservoirs Pierce
Prometheus High Sensitivity capillaries Catalog PR-C006
Prometheus NT.48 nanoDSF Nanotemper Catalog nr PR001 (+ Aggregation Detection Optics, catalog nr PR-AGO) nanoDSF and light back scattering
Prometheus Standard capillary type Catalog PR-C002
TX-1000 Thermoscientific Centrifuge for plates

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffer, L., Muller, C., Roche, P., Morelli, X. Chemistry-driven hit-to-lead optimization guided by structure-based approaches. Molecular Informatics. 37 (9-10), 1800059 (2018).
  2. Lamoree, B., Hubbard, R. E. Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD). Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).
  3. Ress, D. C., Congreve, M., Murray, C. W., Carr, R. Fragment-based lead discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 660-672 (2004).
  4. Carr, R. A. E., Congreve, M., Murray, C. W., Rees, D. C. Fragment-based lead discovery: Leads by design. Drug Discovery Today. 10 (14), 987-992 (2005).
  5. Bradley, A. R., et al. The SGC beyond structural genomics: Redefining the role of 3D structures by coupling genomic stratification with fragment-based discovery. Essays in Biochemistry. 61 (5), 495-503 (2017).
  6. Davies, T. G., Tickle, I. J. Fragment screening using X-ray crystallography. Topics in Current Chemistry. 317, 33-59 (2012).
  7. Ma, R., Wang, P., Wu, J., Ruan, K. Process of fragment-based lead discovery - A perspective from NMR. Molecules. 21 (7), 854 (2016).
  8. Troelsen, N. S., Clausen, M. H. Library design strategies to accelerate fragment-based drug discovery. Chemistry. 26 (50), 11391-11403 (2020).
  9. Shi, Y., von Itzstein, M. How size matters: Diversity for fragment library design. Molecules. 24 (15), 2838 (2019).
  10. Taylor, A., Doak, B. C., Scanlon, M. J. Design of a fragment-screening library. Methods in Enzymology. 610, 97-115 (2018).
  11. Cox, O. B., et al. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).
  12. Sreeramulu, S., et al. NMR quality control of fragment libraries for screening. Journal of Biomolecular NMR. 74 (10-11), 555-563 (2020).
  13. Pfaff, S. J., Chimenti, M. S., Kelly, M. J. S., Arkin, M. R. Biophysical methods for identifying fragment-based inhibitors of protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1278, 587-613 (2015).
  14. Fattori, D., Squarcia, A., Bartoli, S. Fragment-based approach to drug lead discovery: Overview and advances in various techniques. Drugs in R & D. 9 (4), 217-227 (2008).
  15. Winter, A., et al. Biophysical and computational fragment-based approaches to targeting protein-protein interactions: Applications in structure-guided drug discovery. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (4), 383-426 (2012).
  16. Boelens, R., et al. iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
  17. Zhang, R., Monsma, F. Fluorescence-based thermal shift assays. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 13 (4), 389-402 (2010).
  18. Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).
  19. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  20. Bruce, D., Cardew, E., Freitag-Pohl, S., Pohl, E. How to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the Virus-X Project. Journal of Visualized Experiments JoVE. (144), e58666 (2019).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 171، المقايسة التحول الحراري، فحص جزء، تصميم المخدرات، سارس-CoV-2 Nsp5، Hec1، Mps1
قياس فلوري المسح الضوئي النانوي للفحص في اكتشاف الرصاص القائم على الشظايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmad, M. U. D., Fish, A., Molenaar, … More

Ahmad, M. U. D., Fish, A., Molenaar, J., Sreeramulu, S., Richter, C., Altincekic, N., Schwalbe, H., Wienk, H., Perrakis, A. Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery. J. Vis. Exp. (171), e62469, doi:10.3791/62469 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter