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Biochemistry

टुकड़ा आधारित लीड डिस्कवरी में स्क्रीनिंग के लिए नैनो-अंतर स्कैनिंग फ्लोरीमीटर

Published: May 16, 2021 doi: 10.3791/62469
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 2, 1, 1
1Oncode Institute and Division of Biochemistry, the Netherlands Cancer Institute, 2Institute for Organic Chemistry and Chemical Biology, Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ), Johann Wolfgang Goethe-University

Summary

एक लक्ष्य प्रोटीन(यानी,थर्मल शिफ्ट परख, टीएसए) के पिघलने के तापमान में परिवर्तन की निगरानी कुछ सौ यौगिकों के टुकड़े पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए एक कुशल तरीका है । हम एक TSA प्रोटोकॉल प्रस्तुत रोबोटिक्स-सहायता प्राप्त नैनो-अंतर स्कैनिंग फ्लोरिमेट्री (नैनो-डीएसएफ) को लागू करने के लिए आंतरिक ट्रिप्टोफान फ्लोरेसेंस और लाइट बैक-बिखरने की निगरानी के लिए टुकड़ा स्क्रीनिंग के लिए ।

Abstract

थर्मल शिफ्ट परख (TSAs) की जांच कैसे एक लक्ष्य प्रोटीन के पिघलने तापमान (टीएम)अपने पर्यावरण में परिवर्तन के जवाब में बदलता है(उदाहरण केलिए, बफर संरचना) । टीएसए की उपयोगिता, और विशेष रूप से नैनो-डिफरेंशियल स्कैनिंग फ्लोरीमीटर (नैनो-डीएसएफ) की स्थापना वर्षों में की गई है, दोनों ऐसी स्थितियों को खोजने के लिए जो एक विशिष्ट प्रोटीन को स्थिर करने में मदद करती हैं और स्पष्ट टीएममें परिवर्तनों की निगरानी करके लिगांड बाध्यकारी को देखने के लिए । यह पेपर नैनो-डीएसएफ के उपयोग से डायमंड-एसजीसी-आईनेक्स्ट पोरियड (डीएसआई-पोरेटेड) खंड पुस्तकालय (768 यौगिकों) की एक कुशल स्क्रीनिंग प्रस्तुत करता है, संभावित टुकड़ा बाध्यकारी की पहचान करने के लिए टीएम की निगरानी करता है। नैनो-डीएसएफ प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए प्रोटीन की गुणवत्ता और एकाग्रता के बारे में आवश्यकताओं को संक्षेप में एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल द्वारा रेखांकित किया जाता है जो आमतौर पर 96-अच्छी प्लेटों में आवश्यक नमूनों को तैयार करने के लिए संरचनात्मक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में उपयोग किए जाने वाले नैनो-लीटर रोबोटिक डिस्पेंसर का उपयोग करता है। प्रोटोकॉल बताता है कि कैसे अभिकर् चर मिश्रण नैनो-डीएसएफ मापन के लिए आवश्यक केशिकाओं को हस्तांतरित किए जाते हैं। इसके अलावा, यह पेपर थर्मल डेनैचेशन (आंतरिक ट्रिप्टोफान फ्लोरेसेंस की निगरानी) और एकत्रीकरण (प्रकाश बैक-बिखरने की निगरानी) और डेटा हस्तांतरण और विश्लेषण के लिए बाद के चरणों को मापने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करता है। अंत में, लीड डिस्कवरी अभियानों के संदर्भ में इस प्रक्रिया के उपयोग को समझाने के लिए तीन विभिन्न प्रोटीन लक्ष्यों के साथ स्क्रीनिंग प्रयोगों पर चर्चा की जाती है । वर्णित विधि के समग्र सिद्धांत को आसानी से अन्य खंड पुस्तकालयों में स्थानांतरित किया जा सकता है या अन्य उपकरणों के अनुकूल किया जा सकता है।

Introduction

दवा खोज कार्यक्रम अक्सर उनके साथ बातचीत करने की क्षमता के लिए रासायनिक यौगिकों स्क्रीनिंग द्वारा शुरू और/ तथाकथित "हिट" है कि इस तरह की स्क्रीन में पाए जाते हैं, उपन्यास सुराग और विकास उंमीदवारों की खोज के लिए आधार रखना, और नई दवाओं है कि इन दिनों लाइसेंस प्राप्त किया जा रहा है की सबसे के लिए । इसलिए उच्च-थ्रूपुट विधियों की उपलब्धता विभिन्न यौगिकों की एक बड़ी संख्या के साथ उपलब्ध लक्ष्यों की एक विशाल संख्या को स्क्रीन करने के लिए अपरिहार्य है ताकि उनके तंग बाध्यकारी या लक्ष्य के एक विशिष्ट कार्य को मिलाना करने की उनकी क्षमता को जल्दी से पहचाना जा सके । हिट की पहचान के बाद, सबसे होनहार हिट-टारगेट संयोजनों को "संरचना-गतिविधि संबंधों" (एसएआर) को समझने के लिए अन्य, अक्सर महंगी और समय लेने वाली प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके एक व्यापक दवा विकास पाइपलाइन में धकेल दिया जाता है।

संरचनात्मक जीव विज्ञान दृष्टिकोण, जैसे यूरोपीय संघ द्वारा प्रदान किए जाने वाले एक्सेस प्रोग्राम "एनएमआर, ईएम, और ट्रांसएक्सएक्सटी के लिए एक्स-रे" (iNEXT) और इसके वर्तमान उत्तराधिकारी iNEXT-डिस्कवरी, अक्सर सिंथेटिक रसायन विज्ञान 1 के कई दौरों द्वारा शुरू की गई हिट के आत्मीयता और औषधीय गुणों में सुधार करतेहुएचरम विस्तार से कई यौगिकों की बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। लीड यौगिक जो इन "हिट से लीड तक" अभियानों से उभरते हैं, विकास उम्मीदवार बन जाते हैं और प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में प्रवेश करते हैं। अच्छी तरह से विकसित आणविक स्क्रीनिंग पद्धति को मोटे तौर पर दो दृष्टिकोणों में वर्गीकृत किया जा सकता है, अर्थात् लिगांड-आधारित लीड डिस्कवरी (एलबीएलडी) और टुकड़ा-आधारित लीड डिस्कवरी (एफबीएलडी)। एलबीएलडी अभियानों में, प्रोटीन रिसेप्टर्स की जांच या तो कुछ हजार हाथ से चुनी गई लिगांड (प्राकृतिक लिगांड की संरचना या लक्ष्य की संरचना के आधार पर) के साथ की जाती है, या दवा की तरह लिगांड पुस्तकालयों में हजारों यौगिकों के साथ जो रासायनिक अंतरिक्ष के एक बड़े हिस्से को कवर करते हैं।

आमतौर पर, यौगिकों को एक गतिविधि परख में उनकी निरोधात्मक गतिविधि के लिए परीक्षण किया जाता है, आमतौर पर एक एंजाइमेटिक फ़ंक्शन की निगरानी करता है। FBLD अभियानों में2,3,4,5,हालांकि, कुछ सैकड़ों यौगिक जो आमतौर पर दवाओं (100-200 डाल्टन) की तुलना में छोटे होते हैं, एक गतिविधि परख के उपयोग के बिना सीधे लक्ष्य को बांधने की उनकी क्षमता के लिए परीक्षण किए जाते हैं। यह बाध्यकारी लक्ष्य गतिविधि में हस्तक्षेप कर सकता है और कई जैव भौतिक तरीकों से मापा जा सकता है जो सीधे लक्ष्य से बांधने के लिए टुकड़ों की क्षमता पर रिपोर्ट करते हैं, या एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी6 और परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी7जैसे संरचनात्मक तरीकों से, और हाल ही में, क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी भी। जब टुकड़े प्रोटीन पर एक दूसरे के करीब हैं कि विभिन्न स्थानों पर बांध, अलग, आमतौर पर कम आत्मीयता बाध्यकारी टुकड़े तर्कसंगत रूप से रासायनिक रूप से जोड़ा जा सकता है सुराग का एक छोटा सा सेट है कि अधिक विस्तार से अध्ययन किया जा सकता है बनाने के लिए । यह अक्सर उच्च आत्मीयता, अधिक शक्तिशाली यौगिकों में परिणाम है, और इस पद्धति नैदानिक क्षमता के साथ महत्वपूर्ण अणुओं उपज शुरू कर दिया है । रासायनिक समूहों का कुशलतापूर्वक शोषण करने वाली "आदर्श" खंड पुस्तकालय का चुनाव कई वर्षों से अनुसंधान का सक्रिय क्षेत्र रहा है8,9,10.

जबकि प्रारंभिक जोर पूर्ण रासायनिक अंतरिक्ष को कवर करने पर था, बाद में ध्यान टुकड़ा हिट के डाउनस्ट्रीम रासायनिक संयोजन को सक्षम करने के लिए नेतृत्व यौगिकों का उत्पादन करने पर ध्यान केंद्रित किया गया । इस तरह के शोध के कारण तथाकथित "तैयार" पुस्तकालय हैं । इनमें कम से कम एक कार्यात्मक समूह वाले टुकड़े होते हैं जो एसएआर का अध्ययन करने में कुशल प्रगति के लिए तेजी से, सस्ते अनुवर्ती सिंथेटिक रसायन शास्त्र की अनुमति देते हैं। iNEXT द्वारा उत्प्रेरित गतिविधियों में से एक डायमंड लाइट सोर्स और स्ट्रक्चरल जीनोमिक्स कंसोर्टियम में शोधकर्ताओं द्वारा विकसित तैयार पुस्तकालय को अद्यतन करना था। इस संयुक्त प्रयास के परिणामस्वरूप डीएसआई-तैयार पुस्तकालय11हुआ, जिसे iNEXT12के भीतर भी मान्य किया गया है। बाद में, इस पुस्तकालय को एनमाइन लिमिटेड के REAL डाटाबेस में यौगिकों की उपलब्धता के साथ गठबंधन किया गया था, जो एक रासायनिक अनुसंधान संगठन है और स्क्रीनिंग के लिए ब्लॉक और यौगिक पुस्तकालयों के निर्माण के बड़े संग्रह के निर्माता हैं। DSi-Poised अब खरीद के लिए किसी के लिए उपलब्ध है, लेकिन यह भी समर्थित टुकड़ा स्क्रीनिंग परियोजनाओं के लिए कई iNEXT-डिस्कवरी साथी प्रयोगशालाओं में उपलब्ध है ।

उच्च अंत एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और एनएमआर संरचनात्मक जीव विज्ञान प्रौद्योगिकियों दोनों के अपने फायदे और FBLD के लिए नुकसान है । दोनों को अलग-थलग लक्ष्य नमूनों की आवश्यकता होती है और एफबीएलडी के लिए आवश्यक उच्च-संकल्प परमाणु विवरण प्राप्त करते हैं। हालांकि, एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए क्रिस्टल आवश्यक हैं, और टुकड़े अच्छी तरह से आदेश दिए गए प्रोटीन क्षेत्रों में गुहाओं से बांधते हैं जो त्रि-आयामी क्रिस्टल जाली के निर्माण में शामिल नहीं हैं। समाधान एनएमआर अक्सर एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी से अलग-अलग हिट देता है, क्योंकि यह क्रिस्टल पर्यावरण से अप्रभावित होता है और आंशिक रूप से आदेशित प्रोटीन क्षेत्रों में भी बाध्यकारी का पता लगाने में अच्छा होता है। हालांकि, जबकि ligand आधारित एनएमआर प्रयोग अपेक्षाकृत तेज हैं, उन्हें अभी भी पर्याप्त समय और सामग्री की आवश्यकता होती है और नियमित रूप से केवल अपेक्षाकृत छोटे प्रोटीन लक्ष्यों या डोमेन के लिए किया जा सकता है। क्रिस्टलीय या एनएमआर प्रयोगों के यौगिकों को प्राथमिकता देने के उद्देश्य से जैव भौतिक दृष्टिकोणों का प्रयोग13,14,15किया गया है .

जैसा कि हाल के इंस्ट्रूमेंटेशन और कम्प्यूटेशनल प्रोटोकॉल संरचनाओं का निर्धारण करके और ~ 1,000 टुकड़ों का बहुत कुशलता से विश्लेषण करके एफबीएलडी के लिए कुशल क्रिस्टलीय स्क्रीनिंग की अनुमति देते हैं, एक्स-रे आधारित अनुसंधान में यह प्राथमिकता कम आवश्यक हो गई है। एनएमआर के लिए हालांकि, पुस्तकालय स्क्रीनिंग को प्राथमिकता देने और उच्चतम अंत उपकरणों पर साधन समय बचाने के लिए सस्ता और तेज प्रयोगों का उपयोग करना वांछनीय रहता है। साथ ही, अनिवार्य रूप से विभिन्न प्रौद्योगिकियों के संयोजन का उपयोग करके बाध्यकारी घटनाओं, या यहां तक कि अतिरिक्त हिट की स्वतंत्र पुष्टि प्रदान की जा सकती है जिन्हें केवल क्रिस्टलोग्राफी या एनएमआर विधि को नियोजित करके नहीं उठाया जाता है। क्रिस्टलीय और एनएमआर तकनीकों दोनों को बहुत महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है और अक्सर केवल स्थानीय, अत्यधिक कुशल विशेषज्ञों की मदद से समर्पित बाहरी सुविधाओं में किया जा सकता है। इसके अलावा, परिणामों का उचित विश्लेषण भी उच्च विशेषज्ञता की मांग करता है। जबकि iNEXT और iNEXT-डिस्कवरी जैसे कार्यक्रम ऐसी सुविधाओं16तक पहुंच का लोकतंत्रीकरण कर रहे हैं, यह माना गया है कि अन्य तरीकों से सस्ते, तेज और उच्च थ्रूपुट एफबीएलडी स्क्रीनिंग प्रयोगशालाओं की एक बहुत व्यापक श्रृंखला में दवा स्क्रीनिंग कार्यक्रमों को प्रोत्साहित कर सकते हैं। इस तरह के परिणामों को औषधीय दवा की दुकानों के साथ सहयोग बनाने के लिए एक संकेत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और सबसे होनहार यौगिकों के लिए सबसे महंगी स्क्रीनिंग प्रयोगों को प्राथमिकता अगर एनएमआर और क्रिस्टलोग्राफी सुविधाओं यौगिकों की संख्या है कि जांच की जा सकती है पर प्रतिबंध लागू ।

टीएसए एक त्वरित, कुशल और अपेक्षाकृत सस्ते और सुलभ जैव भौतिक विधि17 बनाता है जिसका उपयोग एफबीएलडी स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है। इसका उपयोग कई सेटिंग्स में किया गया है, क्रिस्टलीकरण परीक्षणों के लिए स्थिर प्रोटीन की स्थिति खोजने के लिए सहायता करने से18,उन यौगिकों को खोजने के लिए जो कोशिकाओं में विशिष्ट लक्ष्यों से बांधते हैं19। TSAs भी ligands बाध्यकारी लक्ष्य प्रोटीन के लिए वियोजन स्थिरांक को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है, के रूप में ligand बाध्यकारी अक्सर थर्मल स्थिरता में परिवर्तन की ओर जाता है । सभी TSAs में, एक प्रोटीन (इसकी स्थिरता) के विकृति तापमान में परिवर्तन एक धीमी गति से तापमान में वृद्धि के एक समारोह के रूप में मापा जाता है । हीटिंग पर प्रोटीन डेनैचेशन का पालन करने का एक कुशल तरीका डीएसएफ या थर्मोफ्लूर द्वारा है, जो तापमान वृद्धि के कारण आने वाले प्रोटीन के उजागर हाइड्रोफोबिक क्षेत्रों के साथ बातचीत पर हाइड्रोफोबिक डाई (आमतौर पर सिप्रो ऑरेंज) की फ्लोरेसेंस शमन की मात्रा है।

नैनो-डीएसएफ आमतौर पर बाहरी रंगों की अनुपस्थिति में प्रोटीन की थर्मल स्थिरता के माप को संदर्भित करता है। इस संभावना की पेशकश करने वाले पहले उपकरणों में से एक OPTIM1000 था जो प्रकाश तीव्रता के व्यापक स्पेक्ट्रम के साथ-साथ एक नमूने के प्रकाश बिखरने को मापता है। इस मशीन ने प्रोटीन खुलासा (आमतौर पर ट्रिप्टोफान फ्लोरेसेंस के बाद) और प्रोटीन एकत्रीकरण (जैसा कि गठित नैनोकणों के परिणामस्वरूप ~ 400 एनएम पर प्रकाश बिखरने की वृद्धि होती है) के एक साथ माप की अनुमति दी जाती है। बाद में, प्रोमेथियस ने फ्लोरेसेंस सिग्नल के एकत्रीकरण और संवेदनशील पहचान को मापने के लिए बैक-रिफ्लेक्शन का उपयोग शुरू किया, जिससे कम प्रोटीन सांद्रता की स्क्रीनिंग को अच्छी संवेदनशीलता20के साथ अनुमति मिली। निम्नलिखित अनुभाग बताता है कि विभिन्न प्रोटीन लक्ष्यों के लिए हिट का पता लगाने के लिए एक खंड स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल प्रदर्शित करने के लिए प्रोमेथियस का उपयोग कैसे किया गया था। अपेक्षित प्रोटीन गुणवत्ता और मात्रा के बारे में एक संक्षिप्त परिचय के बाद खंड स्क्रीनिंग प्रयोगों को तैयार करने, प्रदर्शन करने और विश्लेषण करने के लिए कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का पालन किया जाता है। तीन प्रोटीन के लिए स्क्रीनिंग परिणाम iNEXT-डिस्कवरी सहयोग के भाग के रूप में प्राप्त उदाहरण डेटा के रूप में दिखाया गया है ।

Protocol

नोट: नैनो-डीएसएफ प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन शुद्ध (>95%) और सजातीय होने चाहिए जैसा कि सोडियम डॉडिल्सुफेट-पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा आंका जाता है। टुकड़ा स्क्रीन प्रदर्शन करने से पहले, प्रोटीन की स्थिरता विभिन्न बफर स्थितियों में निर्धारित किया जाना चाहिए। एक कम आयनिक शक्ति, कम नमक बफर जो प्रोटीन के साथ न्यूनतम हस्तक्षेप करता है, का उपयोग किया जाना चाहिए ताकि टुकड़ों के साथ इसकी सीधी बातचीत को प्रभावित न किया जा सके। आमतौर पर स्थिरता की जांच के लिए इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स पूरक तालिका S1में दिखाए जाते हैं। स्टॉक समाधान के रूप में इस प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन की सांद्रता आमतौर पर 0.2 मिलीग्राम एमएल-1होती है। पूरे डीएसआई-पोरेपी लाइब्रेरी (768 यौगिकों) की स्क्रीनिंग के लिए, उस एकाग्रता के प्रोटीन की कुल ~ 12 मिलील, कुल ~ 2.5 मिलीग्राम की आवश्यकता है। इन प्रयोगों में उपयोग की जाने वाली डीएसआई-पोरेड लाइब्रेरी को 96-वेल फॉर्मेट(चित्रा 1)में आपूर्ति की गई थी। टुकड़ों की एकाग्रता को 20% v/v डाइमेथाइल्सुल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में 100 mm में समायोजित किया गया था। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यहां वर्णित मिश्रण प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप 0.4% v/v की कम अंतिम डीएमएसओ सांद्रता होती है; हालांकि यह प्रोटीन की स्थिरता को प्रभावित करने की संभावना नहीं है, DMSO के प्रभाव प्रत्येक नए प्रोटीन के लिए जांच की जानी चाहिए ।

Figure 1
चित्र 1:इन प्रयोगों के लिएउपयोग की जाने वालीप्लेटों के प्रकार। (ख)96-अच्छी थाली। (ग)सबवेल 1 दिखाते हुए ९६-वेल प्लेट का क्लोज-अप व्यू । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

1. प्लेट तैयार करना

  1. -20 डिग्री सेल्सियस/-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से एक टुकड़ा प्लेट बाहर ले लो, और यह कमरे के तापमान पर गल, एक बेंचटॉप शेखर पर कोमल मिलाते हुए के साथ । कुओं के किनारे से चिपकी किसी भी बूंदों को इकट्ठा करने के लिए 30 एस के लिए 500 × ग्राम पर प्लेट को सेंट्रलाइज करें।
    नोट: चूंकि टुकड़ा पुस्तकालय DMSO-d6 (पिघलने बिंदु 19 डिग्री सेल्सियस) में भंग उपलब्ध है, यह सुनिश्चित करें कि प्रत्येक यौगिक पूरी तरह से गल और घुलनशील है बनाने के लिए आवश्यक है ।
  2. प्रत्येक उप-वेल में प्रोटीन स्टॉक समाधान के एमआरसी 2-वेल क्रिस्टलाइजेशन प्लेट(चित्रा 1 ए)और पिपेट 14.7 माइक्रोन लें। ऐसा करने के लिए समय-कुशल तरीके से प्रोटीन को एक अभिकर्मित जलाशय(सामग्री की तालिका)में रखें और वितरण के लिए मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें(चित्रा 2A,B)।
    नोट: DSi-Poised पुस्तकालय के लिए, प्रारूप के आधार पर, नहीं ९६ अच्छी तरह से थाली के सभी कुओं यौगिकों होते हैं । आमतौर पर, पंक्तियां ए, एच और कॉलम 1, 12 DMSO से भरे हुए हैं। इस प्रकार, पंक्तियों ए, एच और कॉलम 1, 12 को प्रोटीन से नहीं भरा जाना है, क्योंकि इन कुओं में अगले चरण के अंत में कोई टुकड़े नहीं होंगे; रोबोट द्वारा केवल डीएमएसओ को ही वहां स्थानांतरित किया जाएगा। कृपया ध्यान दें कि खाली पंक्तियां और कॉलम कुछ प्लेटों में भिन्न होते हैं।

Figure 2
चित्र 2:खंड स्क्रीनिंग प्रक्रिया की रूपरेखा। (क)प्रोटीन को बांटने के लिए मल्टीचैनल पिपेट और रीएजेंट जलाशय का उपयोग करना । (ख)96-वेल प्लेट में प्रोटीन का वितरण। (ग)डिस्पेंसर रोबोट द्वारा खंड वितरण । (घ)केशिकाओं में प्रोटीन की लोडिंग। (ई)केशिका धारक को दिखाने वाला दराज । (च)केशिका धारक का क्लोज-अप दृश्य । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3-इन प्रयोगों में प्रयुक्त उपकरणों का अवलोकन। (ए)नैनोडिस्पनर रोबोट का उपयोग टुकड़े वितरण के लिए किया जाता है। प्लेट की स्थिति इंगित की जाती है। (ख)एक नई थाली को परिभाषित करने के लिए कार्यक्रम इंटरफेस । (ग)डिस्पेंसिंग प्रोग्राम का इंटरफेस । (घ)वितरण कार्यक्रम टुकड़ों को बांटने के लिए इस्तेमाल किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

2. मच्छर रोबोट द्वारा टुकड़ा नैनो वितरण

  1. उस प्लेट के प्रकार की जांच करें जिसमें टुकड़ों की आपूर्ति की जातीहै (सामग्री की तालिका)।
  2. मच्छर पर टुकड़ा और प्रोटीन प्लेट परिभाषाओं की जांच करें।
    1. नैनोडिस्पनर(चित्रा 3A)पर स्विच करें । सुनिश्चित करें कि चलती घटकों के आसपास कोई बाधा नहीं है।
    2. ग्राफिकल यूजर इंटरफेस खोलें, सेटअप टैब पर क्लिक करें, और डेक कॉन्फ़िगरेशनके तहत, यह जांचें कि जिस प्रकार की प्लेट में यौगिकों की आपूर्ति की जाती है और जिसमें प्रोटीन को धारा 1 में स्थानांतरित किया गया है, वह पहले से ही उपलब्ध प्लेटोंकी सूची में मौजूद है। यदि नहीं, तो विकल्पों पर क्लिक करें| प्लेटें और संपत्ति प्रकार(चित्रा 3B)के लिए सही मूल्यों में भरने के द्वारा एक नई प्लेट परिभाषा बनाएं ।
      नोट: एमआरसी 2-वेल प्लेट और इस प्रयोग में उपयोग की जाने वाली 96-अच्छी प्लेट के लिए ये मान क्रमशः पूरक तालिका S2 और पूरक तालिका S3में दिखाए गए हैं।
  3. वितरण कार्यक्रम
    1. सेटअप टैब के तहत, डेक कॉन्फ़िगरेशनके तहत प्लेट पदों को निर्दिष्ट करें।
      नोट: इस प्रयोग में इस्तेमाल मच्छर डेक पर दो प्लेट पदों पर है । स्थिति 1 को स्रोत प्लेटके रूप में परिभाषित किया गया है और स्थिति 2 गंतव्य प्लेटहै ।
    2. ड्रॉपडाउन मेनू का उपयोग करके, स्थिति 1 और एमआरसी 2के लिए ग्रेनर यू बॉटम प्लेट चुनें -स्थिति 2 (चित्रा 2 सी)के लिए अच्छी तरह से प्लेट। प्रोटोकॉल को सहेजें।
  4. टुकड़ा वितरण
    1. डेक (चित्रा 3A)की स्थिति 2 पर खंड प्लेट और प्रोटीन प्लेट रखें।
    2. प्रोटोकॉल टैब(चित्रा 3डी)पर, फ़ाइल पर क्लिक करें और टुकड़ों को वितरित करने के लिए धारा 2.3 में सहेजे गए प्रोटोकॉल का चयन करें। तिरस्कृत किए जाने वाले टुकड़ों की मात्रा को परिभाषित करें; 0.3 माइक्रोन का उपयोग करें। एक विशिष्ट प्लेट के लिए, जहां कॉलम 1 और 12 में टुकड़े नहीं होते हैं, स्तंभ 2 के लिए स्टार्ट स्थान और कॉलम 11 में अंतिम स्थान को परिभाषित करते हैं। कुछ प्लेटों में, यदि कॉलम 2 या 11 खाली हैं, तो क्रमशः कॉलम 3 और 10 को प्रारंभ और अंत मूल्यों के रूप में उपयोग करें।
      नोट: मच्छर सेटअप के कारण, केवल कॉलम को छोड़ दिया जा सकता है, पंक्तियां नहीं; पंक्तियों के लिए, मच्छर DMSO पिपेट करेगा। सुनिश्चित करें कि टिप चेंजिंग विकल्प हमेशाके रूप में चुना जाता है, ताकि टुकड़ा पुस्तकालय को पार न किया जा सके।
    3. कार्यक्रम शुरू करने के लिए रन पर क्लिक करें। वितरण के बाद, जो ~ 2 मिनट लेता है, पूरा हो जाता है, रोबोट से प्रोटीन और टुकड़ा प्लेटों को हटा दें, और उन्हें एक चिपकने वाली सीलिंग फिल्म के साथ वापस सील करें। अगले चरण में आगे बढ़ने से पहले कुओं के किनारों से चिपकी किसी भी बूंद को इकट्ठा करने के लिए प्रोटीन प्लेट (500 × जी,30 एस) को संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें।

3. नैनो-डीएसएफ का मापन

नोट: प्रोमेथियस NT.48 का उपयोग कर TSAs प्रदर्शन के बारे में एक विस्तृत विवरण पहले20प्रकाशित किया गया है । खंड स्क्रीनिंग के संदर्भ में महत्वपूर्ण बिंदुओं का उल्लेख यहां किया गया है ।

  1. माप से पहले प्लेट निरीक्षण
    1. नेत्रहीन वर्षा के लिए प्रोटीन प्लेट के कुओं का निरीक्षण करें जो टुकड़ों के अलावा होने के कारण हो सकता है। यदि कई कुओं में वर्षा पाई जाती है, तो टुकड़ों की एकाग्रता को कम करें, और प्रयोग दोहराएं।
      नोट: कमरे के तापमान पर प्रोटीन प्लेट रखने की सिफारिश की जाती है; टुकड़े कम तापमान पर अघुलनशील हो जाते हैं ।
  2. प्रोमेथियस की तैयारी
    1. प्रोमेथियस इंस्ट्रूमेंट पर स्विच करें। टचस्क्रीन पर, उपकरण के केशिका लोडिंग मॉड्यूल तक पहुंचने के लिए ओपन ड्रावर दबाएं। लोडिंग मॉड्यूल से चुंबकीय पट्टी निकालें, और किसी भी धूल कणों को हटाने के लिए इथेनॉल के साथ दर्पण को साफ करें।
  3. प्रोटीन-टुकड़े प्लेट से केशिकाओं में स्थानांतरित करें
    नोट: इस कदम में प्रोटीन प्लेट में प्रत्येक कुएं से मिश्रित प्रोटीन/टुकड़ा नमूना प्रोमेथियस के साथ उपयोग के लिए केशिकाओं को स्थानांतरित करना शामिल है । इसके लिए, हालांकि मानक केशिका प्रकार का उपयोग आमतौर पर किया जाता है, लेकिन बहुत कम प्रोटीन सांद्रता के लिए उच्च संवेदनशीलता केशिकाओं का उपयोग करना संभव है।
    1. केशिका लोडिंग मॉड्यूल तक आसान पहुंच के लिए प्रोटीन प्लेट और केशिकाओं को उपकरण के बगल में रखें।
    2. एक केशिका लें, इसे एक छोर पर पकड़ें, और केशिका कार्रवाई द्वारा नमूने को स्थानांतरित करने के लिए केशिका के दूर अंत के साथ प्रोटीन प्लेट में समाधान को स्पर्श करें। हमेशा दस्ताने पहनें, और सुनिश्चित करें कि बीच में केशिका को स्पर्श न करें, क्योंकि दस्ताने से अशुद्धियों(जैसे,धूल कण) माप को प्रभावित करेंगे।
    3. धारक की निर्धारित स्थिति में केशिका रखें, यह सुनिश्चित करें कि यह ठीक से गठबंधन और केंद्रित है।
    4. चरण 3.3.2 और 3.3.3 दोहराएं, जिससे लोडिंग मॉड्यूल में सभी पदों को भरा जा सके। माप के लिए आप की आवश्यकता होगी सभी केशिकाओं लोड।
      नोट: एक रन के लिए, अधिकतम 48 केशिकाएं लोड की जा सकती हैं।
    5. अंत में, उन्हें जगह में पकड़ने के लिए केशिकाओं के शीर्ष पर चुंबकीय पट्टी रखें, और प्रयोग शुरू करने के लिए क्लोज दराज दबाएं।
  4. नैनो-डीएसएफ प्रयोग करें
    1. फ्लोरेसेंस स्कैन
      1. प्रोमेथियस एप्लीकेशन पीआर खोलें। थर्मकंट्रोलऔर ProteinName_ScreenName_PlateNumberनाम का उपयोग करके स्टार्ट न्यू सेशन पर क्लिक करके एक नई परियोजना बनाएं । सबसे पहले, नमूनों के फ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए डिस्कवरी स्कैन करें।
        नोट: फ्लोरेसेंस का स्तर आदर्श रूप से प्रत्येक नमूने के लिए 3,000 मामलों से ऊपर होना चाहिए। उपकरण (20,000 मायने रखता है) की संतृप्ति सीमा से ऊपर फ्लोरेसेंस वाले नमूनों को मापा नहीं जाएगा।
      2. लेजर(चित्रा 4)के उत्तेजन शक्ति को समायोजित करके नमूनों के फ्लोरेसेंस सिग्नल को बदलें।
    2. थर्मल डेनैचेशन
      1. मेल्टिंग स्कैन टैब पर क्लिक करें। प्रयोग करने के लिए, प्रारंभ तापमान को 20 डिग्री सेल्सियस, अंत तापमान को 95 डिग्री सेल्सियस तक और तापमान ढलान को 1 डिग्री सेल्सियस न्यूनतम-1पर सेट करें। स्टार्ट मेजरमेंटपर क्लिक करें ।
    3. प्रयोग को एनोटेट करना
      1. प्रयोग शुरू होने के बाद, एनोटेशन और परिणाम टैब पर क्लिक करें। प्रत्येक केशिका को एक अद्वितीय प्लेट और अच्छी तरह से नंबर देकर एनोटेट करें।
        नोट: उदाहरण के लिए, केशिका 1 B2 प्लेट 1 और अच्छी तरह से B2 के अनुरूप होगा। इस टैब में प्रयोग के लिए अतिरिक्त कॉलम जोड़े जा सकते हैं, जैसेप्रोटीन नाम, बफर, प्रोटीन एकाग्रता। प्रयोग समाप्त होने के बाद, परिणाम भी इस टैब में प्रदर्शित किए जाते हैं। यह दिन के अंत में ठहराव के लिए एक अच्छा समय है; प्रयोग रातोंरात होते हैं, परिणाम अगले दिन एकत्र किए जा सकते हैं।
    4. डेटा विज़ुअलाइज़ेशन और निर्यात
      1. प्रयोग समाप्त होने के बाद, नमूनों के लिए पिघलने और बिखरने वाले घटता देखने के लिए पिघलने वाले स्कैन टैब पर क्लिक करें। स्प्रेडशीट में परिणामों को निर्यात करने के लिए, पिघलने वाले स्कैन टैब पर क्लिक करें, निर्यातपर क्लिक करें, और ड्रॉप-डाउन मेनू से निर्यात प्रसंस्कृत डेटा चुनें।

Figure 4
चित्र 4:उत्तेजना शक्ति और फ्लोरेसेंस सिग्नल को समायोजित करना। (ए)80% उत्तेजना शक्ति पर, अधिकांश नमूनों के लिए फ्लोरेसेंस सिग्नल संतृप्ति सीमा से बाहर है। (ख)फ्लोरेसेंस सिग्नल को उत्तेजन शक्ति को 60% तक कम करके मापने योग्य स्तर तक कम किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

4. पुनरावृत्ति

  1. 768 यौगिकों (16 × 48 = 768) के पूरे एनमाइन पुस्तकालय पर 16 रन प्रदर्शन करने के लिए 1-3 कदम दोहराएं।
  2. जैसा कि प्रत्येक प्लेट की माप को पूरा करने के लिए ~ 1.5 घंटे लगते हैं, एनोटेशन (3.4.3) को पूरा करें, और सेक्शन 1 और 2 में कदम दोहराकर अगले प्रोटीन-टुकड़े प्लेट तैयार करें।
    नोट: एक ठेठ कार्य दिवस में, अनुभव के आधार पर 4-6 प्लेटों को मापा जा सकता है। पूरी डीएसआई-लाइब्रेरी की स्क्रीनिंग कुल 3-4 दिनों में खत्म हो सकती है।

5. डेटा विश्लेषण

  1. उत्पन्न डेटा की जांच
    1. एक बार प्रत्येक रन पूरा हो जाने के बाद, परिणाम प्रदर्शित करने के लिए एनोटेशन और परिणाम टैब पर क्लिक करें। प्रत्येक नमूने के लिए, दो गणना मूल्यों पर ध्यान केंद्रित करें जो इस अवलोकन में सबसे महत्वपूर्ण हैं: 1) बिखरने की शुरुआत का तापमान(बिखरने के लिए शुरुआत #1),जो बढ़ी हुई नमूना बिखरने की घटनाओं की शुरुआत में तापमान को इंगित करता है और एकत्रीकरण की विशेषता है; 2) टीएम (इनफ्लेक्शन प्वाइंट #1 अनुपात के लिए)मूल्य 330 और 350 एनएम-मूल्यों पर फ्लोरेसेंस घटनाओं के बीच अनुपात से निकाला गया जो आमतौर पर अपने पर्यावरण में परिवर्तन पर ट्राइप्टोफान फ्लोरोरेसेंस के अधिकतम परिवर्तनों के अनुरूप होते हैं।
    2. यह सुनिश्चित करने के लिए कि ये मान विश्वसनीय हैं, पिघलने वाले स्कैन टैब में प्रत्येक केशिका के लिए बिखरने और पिघलने वाले घटता की जांच करना सुनिश्चित करें।
  2. स्प्रेडशीट के लिए निर्यात और निरीक्षण
    1. निरीक्षण के लिए सभी अलग-अलग रन से डेटा को स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में निर्यात करें, जैसा कि 3.4.4 में वर्णित है, और अवलोकन तालिकाओं और भूखंडों को बनाने के लिए। प्रत्येक शीट में जानकारी नोट करने के लिए स्प्रेडशीट फ़ाइल में विभिन्न शीट्स पर क्लिक करें।
      1. अवलोकन पत्रक में, ध्यान दें कि प्रत्येक पंक्ति एक प्रयोग से मेल खाती है। मापदंडों के अवलोकन के साथ(जैसे,शुरू और अंत तापमान), टीएम और बिखरने की शुरुआत के लिए गणना मूल्यों का निरीक्षण करें (नाम और स्पष्टीकरण के लिए ऊपर 5.1 देखें, और एक उदाहरण के लिए पूरक फ़ाइलें 1 और 2)। जैसा कि सॉफ्टवेयर कुछ नमूनों के लिए दो या अधिक टीएम मूल्यों (इंफ्लेक्शन पॉइंट #1 और अनुपात के लिए #2) की गणना करता है, यह निर्धारित करने के लिए पिघलने वाले संक्रमण वक्र को देखें कि टीएम मूल्यों में से कौन सा सही है।
      2. अनुपात पत्रक में, ध्यान दें कि प्रत्येक कॉलम एक नमूने से मेल खाता है, और प्रत्येक तापमान चरण में डेटा को पढ़ने के लिए प्रत्येक पंक्ति। प्रत्येक तापमान चरण के अनुरूप फ्लोरेसेंस गिनती मूल्यों का निरीक्षण करें, और उन्हें विशिष्ट नमूनों के लिए पिघलने वाले घटता साजिश करने के लिए उपयोग करें, फ्लोरेसेंस गिनती कॉलम के खिलाफ तापमान कॉलम की साजिश रचें। ध्यान रहे कि अनुपात (पहले डेरिवेटिव), 330 एनएम, 330 एनएम (पहले डेरिवेटिव), 350 एनएम, 350 एनएम (पहले डेरिवेटिव) में डेटा का उपयोग अनुपात और उसके पहले डेरिवेटिव (जिसमें अधिकतम परिवर्तन दर पर अधिकतम है) की गणना करने के लिए इसी तरह के प्रारूप में किया जाता है।
      3. बिखरने वाली शीट में बिखरने के लिए इसी तरह के डेटा का निरीक्षण करें। बिखरने वाले कॉलम के खिलाफ तापमान कॉलम की साजिश रचकर प्रत्येक नमूने के लिए बिखरने वाले वक्र उत्पन्न करें। पहले व्युत्पन्न बिखरने के लिए शीट के लिए देखो।
  3. सभी टुकड़ों के लिए वैश्विक अवलोकन बनाना और मान्य करना
    1. टुकड़ों के लिए सही टीएम मूल्यों की पुष्टि करने के बाद, प्रत्येक रन से इन कॉलम की नकल करते हुए, एक ही नए परिणाम फ़ाइल में सभी रन से 330/350 एनएम अनुपात (टीएम)के कॉलम नमूना आईडी और इंफ्लेमेक्शन पॉइंट को मिलाएं।
    2. देशी प्रोटीन के औसत टीएम मूल्य का उपयोग करें (आम तौर पर दस रन से अधिक की गणना) और यह प्रत्येक नमूने के टीएम मूल्यों से घटाना, ΤTमीटरपाने के लिए । सबसे बड़ी पारीमें परिणाम वाले नमूनों की पहचान करने के लिए उतरते मीटर पर परिणामों को क्रम में क्रम में क्रमबद्ध करें।
    3. टुकड़ों को एमशिफ्ट के आधार पर डिब्बे में विभाजित करें, और टुकड़ों की संख्या(चित्रा 5)के खिलाफ प्रत्येक बिन के लिए एएमटीएम की साजिश रचकर पूरी लाइब्रेरी के लिए एक आवृत्ति तालिका उत्पन्न करें। सुविधा के लिए, लॉग स्केल में टुकड़ों की संख्या का प्रतिनिधित्व करने वाली धुरी दिखाएं। बीएमटीएम ±1 के साथ नमूना बिन, और अनुभवजन्य रूप से आउटलर्स की संख्या को समायोजित करने के लिए प्रत्येक रन के लिए अन्य डिब्बे को अनुकूलित करें।

Representative Results

चिकित्सा हित के तीन प्रोटीन पर डीएसआई-तैयार पुस्तकालय (768 टुकड़े) की एक पूर्ण स्क्रीन का प्रदर्शन किया गया था, अर्थात्, बाहरी किनेटोकोर अत्यधिक कैंसर 1 प्रोटीन (Hec1, या Ndc80) में व्यक्त, नियामक टेट्रारिकोपेप्टाइड रिपीट (टीपीआर) एकाधिकार धुरी kinase 1 (Mps1) के डोमेन, और सार्स-CoV-2 3C-प्रोटीज, Nsp5, जो प्रतिकृति पॉलीप्रोटीन के सी-टर्मिनस को बंद करता है। प्रत्येक प्रोटीन के लिए चुनी गई बफर स्थितियां, साथ ही प्रोटीन की प्रोटीन एकाग्रता और टीएम, पूरक तालिका S4में दिखाई जाती हैं।

Figure 5
चित्रा 5:तीन प्रोटीन, Hec1, Mps1, और Nsp5 के लिए पिघलने के तापमान (1Tमीटर)में बदलाव की आवृत्ति वितरण, प्रतिनिधि परिणामों के रूप में इस अध्ययन में प्रस्तुत किया । संक्षिप्त रूप: Hec1 = अत्यधिक कैंसर 1 प्रोटीन में व्यक्त; Mps1 = एकाधिकार धुरी kinase 1; Nsp5 = सार्स-CoV-2 3C की तरह प्रोटीज । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके तीन स्क्रीनिंग के परिणाम, टीएम बनाम टुकड़ों की संख्या में परिवर्तन के आवृत्ति वितरण के रूप में प्रदर्शित, चित्र 5में दिखाए गए हैं। इन भूखंडों को प्रोटोकॉल की धारा 5.3 में वर्णित के रूप में उत्पन्न किया गया है, जो टीएममें मनाए गए परिवर्तन की आवृत्ति की साजिश रचते हैं। बदलाव के महत्व को हर अलग परियोजना के लिए एक व्यक्तिपरक तरीके से परिभाषित करने की जरूरत है, जैसा कि नीचे चर्चा अनुभाग में वर्णित है । नकारात्मक मूल्य एक टुकड़े की उपस्थिति में पिघलने के तापमान में कमी का संकेत देते हैं, एक सकारात्मक मूल्य टीएममें वृद्धि। इस तरह के भूखंडों से, यह देखना आसान है कि एनएसपी 5 के लिए, सभी टुकड़ों का अस्थिर प्रभाव पड़ता है, जबकि एचईसी 1 और एमपीएस1 के लिए, स्थिर और अस्थिर हिट दोनों देखे जाते हैं। इससे उम्मीद की जा सकती है और इस पर चर्चा होगी।

Discussion

यह प्रोटोकॉल कुछ आम रोबोटिक्स और माप उपकरणों का उपयोग करके खंड पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए एक मध्यम से उच्च थ्रूपुट विधि का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित उन लोगों की तरह स्क्रीन नियमित रूप से एम्स्टर्डम में NKI प्रोटीन सुविधा द्वारा किया जा सकता है, उदाहरण के लिए एक iNEXT-डिस्कवरी सेवा के रूप में, अक्सर भी प्रस्ताव आवेदन और सहकर्मी की समीक्षा के बाद उपयोगकर्ताओं के लिए मुफ्त के लिए । ऐसे में डीएसआई-ओरिंशियल लाइब्रेरी की सुविधा दी जा सकती है, लेकिन हर अलग-अलग यूजर एप्लीकेशन और सर्विस एग्रीमेंट के संदर्भ में अन्य लाइब्रेरी के इस्तेमाल पर भी चर्चा की जा सकती है। इस प्रोटोकॉल में उपकरणों का चुनाव कई प्रयोगशालाओं के लिए व्यावहारिक समाधान का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन एक सोने के मानक के रूप में नहीं माना जाना चाहिए। लेबल मुक्त तरीकों के टुकड़े स्क्रीनिंग के लिए लक्ष्य प्रोटीन की थर्मल स्थिरता को मापने के लिए सिफारिश कर रहे हैं, बजाय तरीकों है कि एक रिवर्स प्रतिलेखन पॉलीमरेज चेन प्रतिक्रिया थर्मोसाइकिलर में खुलासा का पता लगाने के लिए पर्यावरण की दृष्टि से संवेदनशील लेबल का उपयोग करें ।

लेबल-मुक्त तरीके, जैसे कि प्रोमेथियस उपकरण का उपयोग करके यहां प्रस्तुत किया गया है, कुछ फायदे हैं: वे प्रोटीन की कम मात्रा का उपयोग करते हैं, अक्सर परिमाण के कुछ आदेश कम; वे एक साथ नमूने के बिखरने को मापने और इस तरह एकत्रीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; और अन्य दृष्टिकोणों में खुलासा करने के लिए उपयोग किए जाने वाले लेबल प्रत्येक टुकड़े के साथ अलग-अलग बातचीत कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप माप कलाकृतियों में शामिल हो सकते हैं। इस प्रोटोकॉल को मच्छर रोबोट के संदर्भ में वर्णित किया गया है, जो नमूने की एक बहुत छोटी मात्रा (0.3 माइक्रोएल) की पिपिंग की अनुमति देता है जिसे मैन्युअल रूप से नहीं किया जा सकता है। मच्छर एक लोकप्रिय रोबोट है, जो संरचनात्मक जीव विज्ञान और दवा खोज परियोजनाओं पर काम करने वाली कई प्रयोगशालाओं में मौजूद है; हालांकि, प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से कम मात्रा वाले पिपटिंग के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण का उपयोग कर सकता है।

खंड पुस्तकालयों में डीएमएसओ में भंग यौगिक होते हैं। प्रारंभिक चुनौतियों में से एक इष्टतम DMSO एकाग्रता जिस पर प्रोटीन स्थिर रहता है खोजने के लिए है, और यौगिकों घुलनशील रहते हैं । इसमें स्क्रीनिंग के लिए इष्टतम स्थितियों को निर्धारित करने के लिए विभिन्न डीएमएसओ सांद्रता पर माप करना शामिल है। यहां उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन से कमजोर पड़ने के कारण 0.2% की डीएमएसओ सांद्रता होती है; इन स्थितियों में अधिकांश प्रोटीन काफी स्थिर होते हैं। 768-यौगिक पुस्तकालय के लिए स्क्रीनिंग करने के लिए आवश्यक प्रोटीन की मात्रा कुल में ~ 2-3 मिलीग्राम है, क्योंकि माप आमतौर पर कम प्रोटीन सांद्रता (0.2 मिलीग्राम एमएल-1)पर किए जाते हैं। इस तरह के अपेक्षाकृत कम प्रोटीन सांद्रता के साथ काम करना न केवल प्रोटीन उत्पादन लागत को कम करता है, बल्कि प्रोटीन वर्षा की संभावना को भी कम करता है। कम प्रोटीन एकाग्रता टुकड़े बाध्यकारी का पता लगाने को प्रभावित नहीं करती है, क्योंकि प्रयोग में टुकड़ों की एकाग्रता ~ 2 mM है, जिससे कमजोर बाइंडर्स की पहचान भी की जा सकती है।

चूंकि इन प्रयोगों में पिघलने वाले संक्रमण का पता फ्लोरेसेंस तीव्रता पर आधारित है, इसलिए एक महत्वपूर्ण पहलू लेजर की उत्तेजन शक्ति का निर्धारण करना है जिस पर माप को पूरा करना है। प्रोटीन के साथ यौगिकों की बातचीत (i) का आंतरिक फ्लोरेसेंस पर कोई प्रभाव नहीं पड़ सकता है, (ii) जिसके परिणामस्वरूप शमन होता है, या (iii) इसकी आंतरिक फ्लोरेसेंस में वृद्धि होती है। इसके अलावा, कम प्रोटीन सांद्रता के साथ काम करने का मतलब है कि देशी प्रोटीन के लिए फ्लोरेसेंस गिनती कम होगी। इसलिए उत्तेजन शक्ति को इस तरह से समायोजित किया जाना चाहिए कि अधिकांश नमूनों को मापा जा सके । हर रन का बिखरने वाला प्रोफ़ाइल एकत्रीकरण प्रभावों के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है जो किसी भी टुकड़े के अलावा से ट्रिगर हो सकता है। इसके अलावा कंपाउंड घुलनशीलता पर तापमान का असर बिखरने वाले प्रोफाइल पर भी देखा जा सकता है।

अप्रत्याशित रूप से, कई यौगिकों के लिए यह देखा गया कि बढ़ते तापमान(चित्र 6)के साथ बिखरने में वास्तव में कमी आई। इसलिए यह दोनों पिघलने संक्रमण वक्र और साथ बिखरने प्रोफ़ाइल को देखने के लिए प्रत्येक प्रयोग की विश्वसनीयता के बारे में तय करने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से उन टुकड़ों के लिए है कि एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी या एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा अधिक मांग माप के लिए उंमीदवारों माना जाता है, या यहां तक कि अनुवर्ती रसायन विज्ञान के लिए हिट के रूप में माना जाता है । टुकड़ा स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए विधि की एक विशिष्ट सीमा यह है कि DSi-Poised पुस्तकालय में कई टुकड़ों महत्वपूर्ण आंतरिक फ्लोरेसेंस है, कभी कभार भी डिटेक्टर की संतृप्ति सीमा से परे है, और इसलिए इन ठीक से कम उत्तेजना शक्ति पर भी बाध्यकारी लक्ष्य के लिए जांच नहीं की जा सकती है । इस विधि के लिए ध्यान देने वाली एक और बात यह है कि इसका उपयोग केवल ट्रिप्टोफान अवशेषों वाले प्रोटीन के साथ किया जा सकता है।

Figure 6
चित्र 6:यौगिक घुलनशीलता पर तापमान का प्रभाव। पिघलने संक्रमण वक्र और दो अलग यौगिकों के साथ Hec1 के बिखरने प्रोफ़ाइल। (क)बिखरने वाली प्रोफाइल से पता चलता है कि इस सैंपल के लिए घुलनशीलता तापमान से प्रभावित नहीं होती है । (ख)बिखरने वाली प्रोफाइल से पता चलता है कि बढ़ते तापमान के साथ इस सैंपल की घुलनशीलता बढ़ जाती है। इस मामले में पिघलने संक्रमण वक्र इसलिए विश्वसनीय नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एक खुला सवाल यह है कि टीएममें एक महत्वपूर्ण परिवर्तन के रूप में क्या माना जाना चाहिए, गणितीय परिप्रेक्ष्य से नहीं, लेकिन व्यावहारिक दृष्टिकोण से: टीएम में क्या परिवर्तन एक प्रोटीन के लिए एक ligand के बाध्यकारी के संकेत के रूप में विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है? इन उदाहरणों में, 1 डिग्री सेल्सियस से कम की पाली एचईसी 1 के लिए 74% टुकड़ों के लिए, एमपी 1 के लिए 66% और एनएसपी 5 के लिए 53% देखी जाती है। 1 डिग्री सेल्सियस को 'महत्वपूर्ण परिवर्तन' के रूप में देखते हुए शायद ही हिट प्रदान करेगा जो अनुवर्ती रसायन शास्त्र द्वारा आगे बढ़ाने के योग्य हैं। अवलोकन रेखांकन(चित्रा 5)में, 1, 2, 5, या टीएम शिफ्ट के 5 डिग्री से अधिक के डिब्बे, या तो सकारात्मक या नकारात्मक, माना जाता था । यह एक अच्छा सिंहावलोकन देने के लिए और सूचित निर्णय लेने की अनुमति देने के लिए प्रत्येक विशिष्ट मामले के अनुसार संशोधन की आवश्यकता है, अगले कदम का निर्धारण । विशेष रूप से, कुछ प्रोटीन के लिए, विचार किए गए टुकड़ों के आधार पर लक्ष्य के स्थिरीकरण और डी-स्थिरीकरण दोनों देखे गए। दोनों घटनाओं दिलचस्प हैं, के रूप में दोनों टुकड़ा बाध्यकारी का परिणाम हो सकता है, और दोनों एक अच्छा अनुवर्ती अणु के लिए प्रोटीन व्यवहार में हेरफेर करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

एक अंतिम प्रश्न रहता है, अर्थात्, "क्या एक उपयोगी हिट को परिभाषित करता है?" । वास्तव में, उत्तर विशिष्ट स्थिति पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, Hec1 के लिए, सभी टुकड़े जो प्रोटीन को 2 डिग्री से अधिक स्थिर करते हैं या इसे 5 से अधिक अस्थिर करते हैं, हमारे रसायन विज्ञान सहयोगियों को सूचित किए गए थे, जिन्होंने इन हिट के आधार पर नए अणुओं को डिजाइन किया था । Nsp5 के लिए, हालांकि, एनएमआर प्रयोगों के साथ नैनोडीएसएफ-व्युत्पन्न हिट की पुष्टि करने के लिए हमारे एनएमआर सहयोगियों को सबसे अधिक डी-स्थिर हिट सूचित किए गए थे। दूसरे शब्दों में, इस प्रोटोकॉल से प्राप्त स्क्रीनिंग परिणामों का विश्लेषण सावधानी के साथ और संदर्भ-निर्भर तरीके से किया जाना चाहिए, जो विशिष्ट प्रश्न और आसपास की कार्यप्रणाली के आधार पर सूचित निर्णय लेते हैं । किसी भी मामले में, यहां वर्णित विधि एक्स-रे और एनएमआर-आधारित स्क्रीनिंग जैसे मौजूदा तरीकों के लिए एक पूरक दृष्टिकोण है, जिसका उद्देश्य रसायन विज्ञान अभियानों के लिए नए विचारों की पुष्टि, प्राथमिकता या देना हो सकता है ।

पूरक तालिका S1: प्रोटीन की स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स की सूची। संक्षिप्त: HEPES = 4-(2-हाइड्रोक्सीथिल) -1-piperazineethanesulfonic एसिड; डीटीटी = डिइयोथरेटोल; MOBS = 4-(N-morpholino) ब्यूटेनसुल्फोनिक एसिड। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक तालिका S2: नैनोडिस्पनर रोबोट के साथ उपयोग के लिए एमआरसी 2-वेल प्लेट के लिए गुण। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका S3: नैनोडिस्पनर रोबोट के साथ उपयोग के लिए 96-अच्छी तरह से वी-बॉटम प्लेट के गुण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक तालिका S4: बफर, प्रोटीन एकाग्रता, औरप्रोटीन के टीएम प्रतिनिधि परिणामों में चर्चा की । संक्षिप्त: डीटीटी = डिइयोथरेटोल; Hec1 = अत्यधिक कैंसर 1 प्रोटीन में व्यक्त; Mps1 = एकाधिकार धुरी kinase 1; Nsp5 = सार्स-CoV-2 3C की तरह प्रोटीज । कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फ़ाइल 1: अवलोकन पैरामीटर-उदाहरण डेटा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 2: टीएम और 406 टुकड़े-उदाहरण डेटा के लिएटी एम मान। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Disclosures

कोई खुलासे नहीं हुए हैं।

Acknowledgments

"यह काम NKI प्रोटीन सुविधा, एक निर्देश-एरिक केंद्र के लिए उपयोग से लाभा हुआ । यूरोपीय आयोग के क्षितिज 2020 कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित 871037 परियोजना संख्या iNEXT, परियोजना संख्या 653706, और iNEXT-डिस्कवरी द्वारा वित्तीय सहायता प्रदान की गई है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ClearVue Sheets Molecular Dimensions adhesive sealing film for protein plate
CORNING 6570 Aluminium Sealing Tape CORNING adhesive sealing film for fragment plate
DSi poised library Enamine Fragment library containing 768 compounds used in this study
Elisa Reagent Reservior ThermoFisher Scientific 15075 Reagent reservior used for pipetting the protein
Greiner round (U) bottom plates Cat. No. 650201 Fragments supplied in these plates
Mosquito type X1 sptlabtech Part nr- 3019-0003 Nanolitre dispenser
MRC 2-well crystallization plate MRC96T-PS
Pierce ELISA Reagent Reservoirs Pierce
Prometheus High Sensitivity capillaries Catalog PR-C006
Prometheus NT.48 nanoDSF Nanotemper Catalog nr PR001 (+ Aggregation Detection Optics, catalog nr PR-AGO) nanoDSF and light back scattering
Prometheus Standard capillary type Catalog PR-C002
TX-1000 Thermoscientific Centrifuge for plates

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 171 थर्मल शिफ्ट परख खंड स्क्रीनिंग दवा डिजाइन सार्स-CoV-2 Nsp5 Hec1 Mps1
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Ahmad, M. U. D., Fish, A., Molenaar, … More

Ahmad, M. U. D., Fish, A., Molenaar, J., Sreeramulu, S., Richter, C., Altincekic, N., Schwalbe, H., Wienk, H., Perrakis, A. Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery. J. Vis. Exp. (171), e62469, doi:10.3791/62469 (2021).

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