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Biochemistry

नमूना तैयारी के व्यावहारिक पहलू और आरएनए के 1एच आर 1 ο विश्राम प्रसार प्रयोगों के सेटअप

Published: July 9, 2021 doi: 10.3791/62470
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institutet

Summary

हम 13 सी/15एन-लेबल और अवेलेबलआरएनए पर माइक्रो-टू मिलीसेकंड गतिशीलता को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें 1एच आर1, विश्राम प्रसार परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी है । इस प्रोटोकॉल का ध्यान उच्च शुद्धता नमूना तैयारी और एनएमआर प्रयोगों के सेटअप में निहित है।

Abstract

आरएनए एक अत्यधिक लचीला बायोमॉलिक्यूल है, जिसमें संरचनाओं में परिवर्तन कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं जो आरएनए अणु सेलुलर दूतों और मॉड्यूलर के रूप में निष्पादित करते हैं। जबकि ये गतिशील राज्य अधिकांश संरचनात्मक तरीकों से छिपे रहते हैं, आर1ο छूट फैलाव (आरडी) स्पेक्ट्रोस्कोपी परमाणु संकल्प पर मिलीसेकंड शासन के लिए सूक्ष्म में अनुरूप गतिशीलता के अध्ययन की अनुमति देता है। मनाया नाभिक के रूप में 1एच का उपयोग आगे समय शासन कवर का विस्तार और हाइड्रोजन बांड और आधार बांधना के लिए सीधी पहुंच देता है ।

इस तरह के अध्ययन में चुनौतीपूर्ण कदम उच्च शुद्धता और उच्च उपज नमूना तैयारी, संभावित 13सी-और 15एन-लेबल, साथ ही प्रयोगों की स्थापना और पहले अदृश्य राज्य की जनसंख्या, विनिमय दर और माध्यमिक संरचना निकालने के लिए डेटा की फिटिंग हैं । यह प्रोटोकॉल एक उपयुक्त आरएनए नमूने की तैयारी और 1एच आर1 के सेटअप की तैयारी सुनिश्चित करने के लिए नमूना तैयार करने में महत्वपूर्ण हाथों पर कदम प्रदान करता है, दोनों आइसोटोपिकली लेबल और अवेलेबल आरएनए नमूनों के साथ प्रयोग करते हैं।

Introduction

आरएनए कोशिका में नियामक 1 , उत्प्रेरक2और संरचनात्मक3 कार्यों की एक भीड़ करते हैं, जिनमें से कई एक लचीली आणविक संरचना और उन संरचनाओं के जटिल परिवर्तन 4,5,6,7से सहसंबद्ध हैं। कम आबादी वाले राज्य संरचना निर्धारण के अधिकांश तरीकों के लिए अदृश्य रहते हैं या उच्च परमाणु संकल्प पर इन छिपे हुए राज्यों के अध्ययन की अनुमति नहीं देते हैं । समाधान-राज्य परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी व्यक्तिगत परमाणु नाभिक तक पहुंच प्रदान करके दोनों पहलुओं को जोड़ती है और साथ ही सभी समय व्यवस्थाओं के माध्यम से गतिशीलता को लक्षित करने वाले प्रयोगों का एक बड़ा टूलबॉक्स प्रदान करती है8। आरडी एनएमआर प्रयोग मध्यवर्ती टाइमस्केल में अनुरूप विनिमय तक पहुंच प्रदान करते हैं, जिसमें आधार बांधना पैटर्न और स्थानीय संरचनात्मक पुनर्व्यवस्थाओं में परिवर्तन की उम्मीद की जा सकती है5,9,10,11,12, 13,14। आरडी प्रयोगों को कैर-पुरसेल-मेबूम-गिल पल्स ट्रेन15 के रूप में या घूर्णन फ्रेम में विश्राम माप के रूप में लंबे आर2 माप के रूप में किया जाता है, जिसे आर1ο RD प्रयोग16कहा जाता है।

हालांकि दोनों की आबादी और विनिमय दर और मामूली राज्य के लिए रासायनिक बदलाव अंतर निकालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, आर1ο RD प्रयोगों को भी उत्तेजित राज्य के रासायनिक बदलाव अंतर का संकेत दे । यह माध्यमिक संरचना पर अनुमान लगाने की अनुमति देता है, जो आरएनए संरचनाओं17में रासायनिक बदलाव से दृढ़ता से संबंधित है। रासायनिक बदलाव न्यूक्लियोबाज़ पर सुगंधित प्रोटॉन और कार्बन के मामले में हेलीसिटी का एक अच्छा संकेतक है, इमिनो प्रोटॉन के लिए बेस पेयरिंग भागीदारों का, और सी 4 पर चीनी पकने का ' और सी 1 ' परमाणु18,19। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हाल ही में उच्च स्पिन लॉक (एसएल) पावर का उपयोग करके एक रासायनिक विनिमय संतृप्ति हस्तांतरण (सीईटी) प्रयोग, जिससे CEST प्रयोग की प्रयोज्यता को तेजी से विनिमय टाइमस्केल में स्थानांतरित किया गया था, एक उत्साहित राज्य के साथ प्रणालियों के लिए आर1ο RD प्रयोग के विकल्प के रूप में प्रकाशित किया गया था।

यद्यपि 13सी और 15एन आइसोटोप का उपयोग अक्सर संरचनात्मक विनिमय तक पहुंचने के लिए किया जाता है, लेकिन इस प्रयोगशाला से हाल के काम में सुगंधित और इमिनो प्रोटॉन का उपयोग संरचना विनिमय9,10के लिए जांच के रूप में किया जाता है। मनाया नाभिक के रूप में 1एच का उपयोग कई फायदे लाता है, उदाहरण के लिए, तेजी से और धीमी timescales, उच्च संवेदनशीलता, और कम माप समय पर विनिमय करने के लिए उपयोग । यह सेलेक्टिव ऑप्टिमाइज्ड प्रोटोन एक्सपेरिमेंट (एसईएलईपी) दृष्टिकोण द्वारा और अधिक सुविधा प्रदान करता है, जो एक-आयामी (1D) स्पेक्ट्रम के डिक्रोडिंग के माध्यम से सुगंधित प्रोटॉन तक पहुंच प्रदान करता है, जिसमें हेट्रोन्यूक्लियर मैग्नेटाइजेशन ट्रांसफर के बजाय होमोन्यूक्लियर स्केलर कपलिंग का उपयोग किया जाता है, जो आइसोटोप लेबल20की आवश्यकता को समाप्त करता है और समाप्त करता है। यह प्रोटोकॉल समान रूप से 13 सी/15 एन-लेबल और अवेलेबल नमूनों के 1एच आर1आरआरडी प्रयोगों में माप को संबोधित करता है । इसलिए, यह पेपर एक नमूना तैयारी विधि प्रस्तुत करता है जिसे विभिन्न नमूना तैयारी के लिए सबसे बहुमुखी पाया गया था21 की आवश्यकता है और इस लेख के अंतिम खंड(चित्र 1)में विकल्पों पर चर्चा करता है।

इस बिंदु पर, पाठक को ध्यान देना चाहिए कि अन्य नमूना तैयारी तकनीक 1 एच आर 1οRD प्रयोगों के लिए स्वीकार्य हैं, और संरचनात्मक और कार्यात्मक विश्लेषण के अन्य तरीकों को प्रस्तुत तकनीक के साथ संश्लेषित नमूनों के साथ किया जा सकता है। 1 एच आर1ο RD प्रयोगों के लिए उच्च आरएनए सांद्रता (आदर्श रूप से >1 mM) के साथ-साथ उच्च एकरूपता की आवश्यकता होती है, दोनों आरएनए लंबाई और संरचनात्मक संरचना में आणविक गतिशीलता के विश्वसनीय लक्षण वर्णन सुनिश्चित करने के लिए। इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन (आईवीटी) कई शोधकर्ताओं के लिए पसंद की विधि है 13सी/15 एन लेबल आरएनए नमूनों लेबल न्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट (एनटीपीएस) और रहस्यपूर्ण प्रतिक्रिया22में फेसियल निगमन की उपलब्धता के कारण । हालांकि, ट्रांसक्रिप्शन अपवाह28के दौरान व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले T7 आरएनए पॉलीमरेज (T7RNAP)23, 24,25 कुछ दीक्षा दृश्यों26, 27और अक्सर 3' एकरूपता के मामले में कम5 ' एकरूपता सेग्रस्तहै। लक्ष्य आरएनए प्रजातियों का शुद्धिकरण ~200 एनएमोल की बड़ी मात्रा की आवश्यकता के कारण अधिक महंगा और श्रमसाध्य हो जाता है। यहां उपयोग की जाने वाली विधि पहले प्रस्तुत की गई है जहां21वर्ष की अत्यंत लाभप्रदों पर चर्चा की गई थी . संक्षेप में, यह एक बड़े टैंडेम ट्रांसक्रिप्ट को पार करके वर्णित मुद्दों को हल करता है जो तब साइट-विशेष रूप से एस्चेरिचिया कोलाई आरएनएस एच द्वारा क्लीव्ड है, जो एक चिमरिक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड29,30 द्वारा निर्देशित है (विवरण के लिए चित्रा 2 देखें)।

टैंडेम ट्रांसक्रिप्ट के 5 ' और 3 ' सिरों पर एक स्पेसर अनुक्रम का समावेश क्रमशः प्लाज्मिड टेम्पलेट(चित्रा 2B)की रैकराइजेशन साइट के करीब उच्च उपज दीक्षा अनुक्रम और टर्मिनल ओवरहैंग को हटाने की अनुमति देता है। इस विधि को अधिक जटिल टेम्पलेट संश्लेषण की चेतावनी और अतिरिक्त एंजाइम और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड की आवश्यकता के साथ लागत और श्रम को कम करते हुए पैदावार में काफी सुधार करने के लिए दिखाया गया था। आरएनएसई एच दरार की उच्च विशिष्टता समान आकार की सीमा में आरएनए प्रजातियों की कमी के कारण शुद्धि की सुविधा प्रदान करती है। वर्तमान प्रोटोकॉल एक आयन एक्सचेंज उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) कदम का उपयोग करता है जो हाल ही में इस प्रयोगशाला द्वारा प्रकाशित किया गया है31,हालांकि अन्य तरीके संभावित विकल्प हैं। 1 एच आर1ο RD, सामान्य तौर पर, दो संबंधित पल्स दृश्यों के साथ लेबल या अवेलेबल नमूनों पर प्राप्त किया जा सकता है, "लेबल" 1एच आर1ο heteronuclear एकल क्वांटम सहसंबंध (एचएसक्यूसी) आधारित प्रयोग के साथ एक 13सी अप्रत्यक्ष आयाम10 और "अवेलेबल" 1एच आर1ο SELOPE आधारित प्रयोग के साथ एक 1एच अप्रत्यक्ष आयाम20.

ये दो आयामी (2D) प्रयोग पहली जांच के रूप में काम कर सकते हैं, भले ही आर1ο टाइमस्केल पर गतिशीलता नमूने में मौजूद हैं या नहीं। स्पेक्ट्रा में सभी हल चोटियों के लिए आरडी का अवलोकन प्राप्त किया जा सकता है, और अधिक गहन आरडी विश्लेषण के लिए ब्याज की चोटियों की पहचान की जा सकती है। इसका मतलब यह है कि यहां तक कि अवेलेबल नमूनों को अधिक महंगा, लेबल नमूना बनाने का निर्णय लेने से पहले जांच की जा सकती है। एक बार जब अनुरूप विनिमय योगदान के साथ एक चोटी को अधिक अच्छी तरह से अध्ययन करने के लिए चुना जाता है, तो तथाकथित ऑफ-प्रतिध्वनि प्रयोगों को पूरा करने के लिए उपरोक्त प्रयोगों (यदि चोटी को अभी भी हल किया जा सकता है) के 1D संस्करणों पर स्विच करना सबसे अच्छा है। लेबल किए गए संस्करण के लिए, एचएसक्यूसी ट्रांसफर को 13सी में एक चयनात्मक हेट्रोन्यूक्लियर क्रॉस-ध्रुवीकरण (एचसीपी) चरण के साथ प्रतिस्थापित किया गया है जैसा कि 13सी आर1ο प्रयोगों 32,33,34, 35में उपयोग कियाजाताहै, जबकि सेलोप प्रयोग के मामले में, प्रयोग को बस 1D के रूप में चलाया जाता है, जो एच 8 और एच2 संकेतों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जो 2 डी में डायगोनल पर झूठ बोल रहे हैं। एक कसौटी के रूप में जो अनुक्रम का उपयोग करने के लिए, बशर्ते कि दोनों, एक लेबल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अवेलेबल नमूना उपलब्ध हैं, कितनी अच्छी तरह ब्याज की चोटी अलग है दो प्रयोगों में है ।

सामान्य तौर पर, 50 न्यूक्लियोटाइड्स तक के आरएनए नमूनों के लिए सेलोप प्रयोग की सिफारिश की जाती है। बड़े आरएनए के लिए, ओवरलैप बड़ा होगा; हालांकि, संरचनात्मक रूप से दिलचस्प न्यूक्लियोटाइड अक्सर रासायनिक बदलाव वाले क्षेत्रों में दिखाई देते हैं जो कम छा जाते हैं और अभी भी बड़े आरएनए में सुलभ हो सकते हैं। एक अन्य तर्क यह होगा कि अवेलेबल नमूनों में 1एच और 12सी के बीच कोई जे-कपलिंग नहीं होती है । हालांकि, चूंकि न्यूनतम स्पिन लॉक पावर को लेबल किए गए प्रयोग में उन दो स्पिन (~ 1 kHz) को अलग करने के लिए उपयोग की जाने वाली न्यूनतम शक्ति द्वारा परिभाषित किया गया है, अवेलेबल प्रयोग स्पिन लॉक (एसएल) ताकत की एक व्यापक रेंज के उपयोग की अनुमति देता है और इसलिए, विनिमय के व्यापक टाइमस्केल तक पहुंच। ये ऑफ-प्रतिध्वनि प्रयोग कश्मीरपूर्वको अतिरिक्त जानकारी प्रदान करते हैं, जैसे उत्तेजित राज्य की आबादी (वैकल्पिक अनुरूप), पीईएस, साथ ही बहुत मूल्यवान रासायनिक बदलाव की जानकारी ω के रूप में (जमीनी राज्य और उत्साहित राज्य का रासायनिक बदलाव अंतर)।

Figure 1
चित्रा 1:प्रस्तुत प्रोटोकॉल का कार्यप्रवाह। वास्तविक बड़े पैमाने पर नमूना उत्पादन से पहले तैयारी, टेम्पलेट तैयारी और विट्रो ट्रांसक्रिप्शन और RNase एच दरार में सफल की पुष्टि से मिलकर। एचपीएलसी शुद्धिकरण, एनएमआर ट्यूब को भरने और आरएनए फोल्डिंग की पुष्टि सहित बड़े पैमाने पर उत्पादन। आइसोटोप-लेबल संश्लेषण के मामले में, उसी दिन ढाल अनुकूलन के लिए एक अवेलेबल शुद्धिकरण किया जाना चाहिए। आर1ο प्रयोगों के साथ अनुरूप गतिशीलता के एनएमआर लक्षण वर्णन। प्रत्येक चरण स्वतंत्र रूप से किया जा सकता है, उदाहरण के लिए,1 एच आर 1οRD विश्लेषण किसी अन्य विधि के साथ उत्पादित किसी भी उपयुक्त आरएनए नमूने पर लागू किया जा सकता है। संक्षिप्त रूप: आईवीटी = इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन; एचपीएलसी = उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी; एनएमआर = परमाणु चुंबकीय अनुनाद; आरडी = छूट फैलाव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य आरएनए हेयरपिन अणुओं में 1एच आर1 डी विश्राम प्रसार के साथ अनुरूप गतिशीलता के अध्ययन के लिए व्यावहारिक विवरण और महत्वपूर्ण पैरामीटर प्रदान करना है। डिजाइन, संश्लेषण, और आयन विनिमय एचपीएलसी शुद्धिकरण का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने के बाद एक लक्ष्य आरएनए का उपयोग करके किया जा सकता है, कुछ, या कोई भी एनटीपी 13सी/15एन-लेबल संस्करणों के रूप में, एनएमआर नमूने को अंतिम रूप देने और एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ अनुरूप विनिमय की पुष्टि करने का कार्यप्रवाह वर्णित किया गया है । अंत में, ब्रुकर एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर पर 1 एच आर1आर आरडी प्रयोगों के सेटअप के लिए विवरण (चित्रा 1)वर्णित हैं। प्रोटोकॉल लेबल नमूनों और अतिरिक्त टिप्पणियों और SELOPE संस्करण (तालिका2)की स्थापना के लिए समायोजित करने के लिए एक तालिका के लिए 1D संस्करण स्थापित करने के लिए प्रत्येक कदम देता है । प्रोटोकॉल के बाद, नमूना तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण कदम और वैकल्पिक मार्गों और 1एच आर1ο RD सेटअप पर चर्चा की जाती है।

Protocol

Figure 2
चित्रा 2: रिपोर्ट किए गए टैंडेम IVT प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ए)T7RNAP (बाएं) के साथ एक रैखिक प्लाज्मिड टेम्पलेट से टैंडेम ट्रांसक्रिप्शन और एक चिमरिक डीएनए गाइड (दाएं) द्वारा निर्देशित लक्ष्य लंबाई आरएनए प्राप्त करने के लिए ट्रांसक्रिप्ट के आरएनई एच द्वारा क्रमिक दरार। (ख)वायरल T7RNAP प्रमोटर, एक दीक्षा अनुक्रम के साथ शुरू मिलकर टेम्पलेट की विस्तृत योजनाबद्ध । लक्ष्य अनुक्रम (गहरा नीला, उदाहरण यहां 20 nt लंबा है) दोहराया जाता है "एन" बार। पहली और अंतिम दोहराने इकाई से दीक्षा और प्रतिबंध दृश्यों को हटाने के लिए अनुमति देने के लिए क्रमशः पिछले आठ और पहले चार न्यूक्लियोटाइड से मिलकर एक 5 ' और 3 ' स्पेसर दृश्यों से घिरा हुआ दोहराता है । (ग)टैंडेम ट्रांसक्रिप्ट (लाल) और चिमरिक क्लीवेज गाइड (ग्रीन) का संकरण । RNase एच डीएनए 5 ' अंत के विपरीत आरएनए cleaves । 2'-OMe आरएनए फ्लैंक लक्ष्य आरएनए के लिए दरार गाइड के बाध्यकारी आत्मीयता को बढ़ाकर विशिष्टता बढ़ाते हैं। इस आंकड़े को 21से संशोधित किया गया है । संक्षिप्त: T7RNAP = T7 आरएनए बहुलक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

1. एक नए आरएनए निर्माण के लिए काम की तैयारी

  1. प्लाज्मिड डिजाइन और तैयारी
    1. एक क्लोनिंग टूल में टेम्पलेट अनुक्रम लिखें, उदाहरण के लिए,सीरियल क्लोनर।
    2. T7 प्रमोटर अनुक्रम लें और एक उच्च उपज दीक्षा अनुक्रम (T7: 5'-TAATACGACTCACTATA ^GGGAGA-3') जोड़ें।
      नोट: प्रतिलेखन एक कैरट (^) के साथ इंगित न्यूक्लियोटाइड पर शुरू होगा। दीक्षा अनुक्रम GGGAGA चर है, लेकिन दृढ़ता से अनुक्रम पर निर्भर है; इसलिए, इस अनुक्रम के उपयोग की सिफारिश की जाती है।
    3. लक्ष्य अनुक्रम के अंतिम 8 न्यूक्लियोटाइड (एनटी) को 5'स्पेसर (5's) के रूप में जोड़ें।
    4. लक्ष्य अनुक्रम (टीएस) के दोहराता जोड़ें।
    5. दोहराता (5's) के बाद एक 3 ' स्पेसर के रूप में पहले चार न्यूक्लियोटाइड जोड़ें ।
    6. एक BAMHI प्रतिबंध साइट (RS) या इसी तरह की अनूठी प्रतिबंध साइट जोड़ें ।
      नोट: दिखाए गए कुल अनुक्रम को एक बैक्टीरियल हाई-कॉपी प्लाज्मिड(जैसे,pUC19): 5'-T7-5'S-(TS)n-3'S-RS-3'(चित्रा 2B)में आसानी से ऑर्डर किया जाएगा। दोहराने की संख्या जीन संश्लेषण (इस प्रोटोकॉल में अधिकतम 600 एनटी) द्वारा अनुमति के रूप में उच्च होनी चाहिए।
    7. एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर ई. कोलाई में प्लाज्मिड बढ़ाना।
    8. उचित प्रतिबंध स्थल का उपयोग करके 20 एनजी/μL पर शुद्ध प्लाज्मिड को रैकराइज करें। 1 एमएल तक बम्ही के साथ स्केल प्रतिबंध पचाता है।
    9. पचा हुआ प्लाज्मिड को शुद्ध करें, और 1% एगर उठे जेल पर सफल रैखिकीकरण की पुष्टि करें। कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रैखिक प्लाज्मिड स्टोर करें।
  2. दरार गाइड डिजाइन(चित्रा 2C)
    1. 5'-3' दिशा में लक्ष्य आरएनए अनुक्रम के अंतिम आठ न्यूक्लियोटिड्स लिखें, और 5'-3' दिशा में भी 3 'अंत पर लक्ष्य आरएनए अनुक्रम के पहले चार न्यूक्लियोटाइड जोड़ें।
    2. उस अनुक्रम के रिवर्स डीएनए पूरक उत्पन्न करें
    3. न्यूक्लियोटाइड पत्र से पहले एक 'एम' जोड़कर पहले और अंतिम चार न्यूक्लियोटाइड को उनके 2'-OMe संशोधनों में बदलें।
      नोट: संश्लेषण के लिए, mT के बजाय mU का उपयोग किया जाता है।
    4. मानक डीसल्टिंग शुद्धिकरण के साथ ओलिगो ऑर्डर करें।
      नोट: जांच करें कि क्या उत्पन्न ओलिगो दो आरएनए दृश्यों के कनेक्शन के अलावा किसी अन्य स्थान पर बांध सकता है। केंद्रीय चार डीएनए न्यूक्लियोटाइड में पूर्ण पूरकता की आवश्यकता है, जबकि फ्लैंकिंग क्षेत्र बेमेल की अनुमति दे सकते हैं । यदि आवश्यक हो, तो एक अद्वितीय बाध्यकारी अनुक्रम36उत्पन्न करने के लिए फ्लैंक को 18 एनटी तक बढ़ाएं।
  3. छोटे पैमाने पर आईवीटी
    नोट: RNase मुक्त काम के लिए, बाँझ और RNase मुक्त शर्तों के तहत सभी reagents तैयार करते हैं । उपयोग से पहले काम की सतहों और पिपेट को साफ करने के लिए RNase विसंदूषण अभिकर्मक (सामग्री की तालिकादेखें) और 95% v/v इथेनॉल का उपयोग करें। 95% इथेनॉल के साथ दस्ताने धोएं और लिंट-फ्री लंबी बाजू के कपड़े पहनें। RNase संदूषण को कम करने के लिए, खुली ट्यूबों पर सांस न लें।
    1. ट्रिस-सीएल (पीएच 8.0), डिथिओथ्रेटोल, एमजीसीएल2,शुक्राणु, और एनटीपीएस/जीएमपी (बिना खरीदार) के स्टॉक समाधान तैयार करें। टेबल 1में दिखाए गए रिएजेंट्स को मिक्स करें । एंजाइमों या न्यूक्लिक एसिड के अलावा पहले से इन अभिकर्णों का एक मास्टर मिश्रण तैयार करें।
      नोट: यदि जमे हुए अभिकर्णों का उपयोग कर रहे हैं, तो उन्हें विगलन के बाद अच्छी तरह से मिलाएं। यदि बहुत अधिक सांद्रता पर मिश्रित होता है तो अभिकर्षक हो सकते हैं, इसलिए तालिका 1में आदेश का पालन करने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है।
    2. निम्नलिखित क्रम में जोड़ें: प्लाज्मिड, क्लीवेज गाइड, अकार्बनिक फॉस्फेट (आईपीपीए), आरएनएसई एच, T7RNAP। चूंकि एंजाइम गतिविधि घर में उत्पादित एंजाइमों के लिए भिन्न हो सकती है, सबसे अच्छा चयन करने से पहले कई सांद्रता का परीक्षण करें।
      नोट: दरार प्रतिक्रिया के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल करें, उदाहरण के लिए, RNase एच के बिना, त्रुटिपूर्ण RNase एच दरार के लिए एक लापता लक्ष्य बैंड का श्रेय और असफल प्रतिलेखन के लिए नहीं ।
    3. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें और एक डेन्चरिंग पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (पेज)(चित्र 3 ए)पर प्रतिक्रिया की पुष्टि करें। लोडिंग समाधान में नमूना 10 गुना पतला करें, और जेल पर 1 माइक्रोन लोड करें।
      नोट: जेल मिश्रण: 1x TBE में 8 एम यूरिया, 20% एक्रिलामाइड (19:1 एक्रिलैमाइड: बिस्क्रेलामाइड) । लोडिंग समाधान: 5 एमएम एथिलेंडियामाइन टेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए), फॉर्मामाइड में 300 माइक्रोन ब्रोमोफेनॉल ब्लू। RNase एच दरार प्रतिक्रियाओं को 1 घंटे के बाद पूरा होने की उम्मीद नहीं की जा सकती है, क्योंकि नए आरएनए का उत्पादन लगातार किया जाता है। इस बिंदु पर, एक स्पष्ट लक्ष्य बैंड और समान आणविक वजन(जैसे,±3 न्यूक्लियोटाइड (एनटी) उत्पादों की प्रजातियों की अनुपस्थिति की तलाश करें।
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) स्टॉक एकाग्रता राशि छोटे पैमाने पर (μL)
एच2ओ - 24
ट्रिस 1 मीटर 5
एमजीसीएल2 1 मीटर 0.5
डीटीटी 1 मीटर 0.5
शुक्राणुनाशक 250 एमएमएम 5
जीएमपी 100 एमएमएम 2.5
एटीपी 100 एमएमएम 1.5
जीटीपी 100 एमएमएम 1.5
यूटीपी 100 एमएमएम 1.5
सीटीपी 100 एमएमएम 1.5
प्लाज्मिड 20 एनजी/μL 5
क्लीवेज गाइड 100 माइक्रोन 10
आईपीपेस 10 मिलीग्राम/एमएल 0.5
RNase एच 10 μg/एमएल 2
T7 आरएनए पॉलीमरेज 5 मिलीग्राम/एमएल 2

तालिका 1: मिलकर IVT और एक साथ RNase एच दरार के लिए अभिकर्ण तालिका । स्टॉक सांद्रता को उपयोगकर्ता की सुविधा के अनुकूल किया जासकताहै। यदि T7 IVT के बाद RNase H दरार किया जाना चाहिए, तो T7RNAP की गर्मी-निष्क्रियता के बाद दरार गाइड और RNase H जोड़ें । मात्रा प्रतिक्रिया पैमाने के साथ रैखिक रूप से उपयोग की जाने वाली मात्रा। संक्षिप्त रूप: T7RNAP = T7 आरएनए बहुलक; आईवीटी = इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन।

2. एनएमआर नमूना तैयार करना

  1. वांछित मात्रा (आमतौर पर 10 एमएल) की प्रतिक्रिया को बढ़ाएं, और प्रतिक्रिया को रात भर चलाएं। एक डेन्चरिंग पेज जेल(चित्रा 3A)के साथ अगले दिन प्रतिक्रिया पूरा करने के लिए परीक्षण करें।
    नोट: अधूरा दरार प्रतिक्रिया लक्ष्य बैंड के ऊपर उच्च आणविक वजन प्रजातियों द्वारा दिखाया गया है ।
    1. यदि दरार सफल या पूर्ण नहीं था, तो 15 एस के लिए 450 डब्ल्यू पर पारंपरिक माइक्रोवेव में समाधान को गर्म करके प्रतिक्रिया पोत में रेनियल आरएनए और दरार गाइड।
    2. समाधान को धीरे-धीरे 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। 1 मिलीएल से नीचे की मात्रा के लिए एक हीटिंग ब्लॉक का उपयोग करें। नए तेज़ी के गठन पर ध्यान दें।
    3. अधिक आईपीपैस और आरएनएसई एच जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 1-3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। डेन्चरिंग पेज के साथ दरार प्रतिक्रिया के पूरा होने की पुष्टि करें।
    4. जब RNase H दरार प्रतिक्रिया पूरी हो जाती है, तो EDTA को 50 एमएम अंतिम एकाग्रता और भंवर में अच्छी तरह से जोड़कर प्रतिक्रिया को बुझाें।
      नोट: संभावित पायरोफॉस्फेट वर्षा भंग हो जाएगा, और नए प्रोटीन रूपों वर्षा ।
    5. 0.2 माइक्रोन सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें, और इंजेक्शन लूप आकार के आधार पर एचपीएलसी सिस्टम में इंजेक्शन की मात्रा पर ध्यान केंद्रित करें।
      नोट: प्रोटोकॉल -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना ठंड से यहां रोका जा सकता है।
  2. बड़े पैमाने पर एचपीएलसी शुद्धिकरण
    1. उपयोग के एक सप्ताह के भीतर आयन-एक्सचेंज बफ़र्स ए और बी तैयार करें। बफर को फ़िल्टर करें और डिगैस करें।
      नोट: बफर ए: 20 mm सोडियम एसीटेट; 20 mm सोडियम परक्लोरेट, पीएच 6.5। बफर बी: 20 mm सोडियम एसीटेट; 600 mm सोडियम परक्लोरेट, पीएच 6.5।
    2. 100% बफर बी के साथ कॉलम को बराबर करें और इसके बाद 75 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 2 कॉलम वॉल्यूम के लिए 100% बफर ए करें।
    3. एचपीएलसी अनुक्रम(चित्रा 3बी)को 5.5 एमएल/न्यूनतम की प्रवाह दर पर तैयार करें। 20 और 30 एनटी के बीच आकार के आरएनए के शुद्धिकरण के लिए निम्नलिखित अनुक्रम का उपयोग करें: 0-7 मिनट: 0% बी; 7-16 मिनट: ढाल 0-20% बी; 16-46 मिनट: एल्यूशन, आमतौर पर 20-30% बी के ढाल के साथ (जरूरतों के अनुसार अनुकूलित); 46-62 मिनट: 100% बी; 62-73 मिनट: 0% बी
      नोट: ५.५ से 8 ml/min के प्रवाह दर में परिवर्तन इस प्रोटोकॉल में जुदाई को प्रभावित नहीं किया ।
    4. एक समय में ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन (अवेलेबल) के 1 एमएल के बराबर के इंजेक्शन के इंजेक्शन द्वारा एल्यूशन ढाल को अनुकूलित करें।
      नोट: अधिक जानकारी और चर्चा के लिए, कार्लस्सन एट अल31 और Feyrer एट अल21का उल्लेख है ।
    5. एक डेन्चरिंग पेज पर एकत्र किए गए अंशों का परीक्षण करें। यदि मुख्य एल्यूशन चोटी अच्छी तरह से अलग है और शुद्ध लक्ष्य आरएनए शामिल है, तो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के 10 एमएल के बराबर शुद्धि को स्केल करें।
    6. ब्याज के अंशों को इकट्ठा करें, ध्यान केंद्रित करें, और एनएमआर बफर के साथ बफर का आदान-प्रदान करें। 50 एमएल से ऊपर की मात्रा के लिए एक अल्ट्रासेंट्रफ्यूगल फिल्टर यूनिट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें।
      नोट: एनएमआर बफर: 15 एमएम सोडियम फॉस्फेट; 25 एमएम सोडियम क्लोराइड; 0.1 m EDTA, पीएच 6.5. प्लास्टिक ट्यूब दीवारों का पालन आरएनए से नुकसान को कम करने के लिए, सभी तरल इकट्ठा करने के लिए 1 मिलीएमएल पानी, भंवर और अपकेंद्रित्र के साथ सभी संग्रह ट्यूबों को धोएं।
    7. पराबैंगनी स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से एकाग्रता का निर्धारण करें। फीयर एट अल21के अनुसार प्रतिक्रिया उपज की गणना करें ।
      नोट: आरडी प्रयोगों के लिए एनएमआर नमूने की सांद्रता 130 एनएमओएल से नीचे नहीं होनी चाहिए, जो एनएमआर ट्यूब(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करके 250 माइक्रोन के नमूना मात्रा में 500 माइक्रोन से मेल खाती है।
  3. आरएनए नमूने की तह
    1. पतला और 1 एमएल प्रति ट्यूब में ~ 10 एमएल की मात्रा का नमूना एलिंकेट करें।
    2. आरएनए एलिकोट्स को 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    3. स्नैप-नमूनों को बर्फ पर या पानी-बर्फ-नमक मिश्रण में रखकर ठंडा करें और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. पूल नमूने और एक 2 एमएल सेंट्रलाइज फिल्टर इकाई में ~ 250 μL करने के लिए ध्यान केंद्रित।
  4. एनएमआर ट्यूब का भरना
    1. एनएमआर ट्यूब क्लीनर में एनएमआर ट्यूब को प्रचुर मात्रा में पानी, आरएनईईस डेक्थेमिनेशन रिएजेंट, पानी, 95% इथेनॉल (एटोह) और पानी के साथ फिर से फ्लश करके साफ करें। सूखने के लिए छोड़ दें।
    2. पानी के साथ कुल्ला करके प्लंजर को साफ करें और एक लिंट-फ्री वाइप का उपयोग करके RNase विसंदूषण रिएजेंट और 95% एटोह के साथ पोंछते हैं। सूखने के लिए छोड़ दें।
    3. एनएमआर सैंपल में डी2ओ का 10% (v/v) जोड़ें।
    4. आरएनए के नमूने को एक बड़े पिपेट टिप का उपयोग करके एनएमआर ट्यूब में भरें। ट्यूब वॉल के किनारे तरल प्रवाह होने दें।
    5. प्लंजर डालें और एक तेज घुमा गति के साथ एक साथ नीचे प्लंजर धक्का द्वारा हवा बुलबुले को हटा दें।
    6. नए हवा बुलबुले बनाने के बिना धीरे-धीरे प्लंजर खींचें और पैराफिन मोम फिल्म के साथ इसे ठीक करें।
  5. एनएमआर द्वारा तह की पुष्टि करें।
    नोट: इस बिंदु पर, आरएनए नमूने की माध्यमिक संरचना की पुष्टि करने और अनुरूप गतिशीलता के अध्ययन के लिए ब्याज के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए कम से कम आंशिक प्रतिध्वनि असाइनमेंट करना आवश्यक है। आरएनए अनुनाद असाइनमेंट पर एक विस्तृत विवरण इस प्रोटोकॉल से अधिक होगा, इसलिएहम इस बिंदु19,37,38पर अच्छी तरह से स्थापित साहित्य का उल्लेख करते हैं। एक इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता बदलाव परख (EMSA) आरएनए तह का एक उपयोगी संकेतक हो सकता है और एनएमआर प्रयोगों के लिए पूरक डेटा के रूप में काम करता है।
    1. नमूने के निम्नलिखित स्पेक्ट्रा की तुलना करें जिसके लिए 1एच आर1आर आरडी प्रयोग ठीक से मुड़ा हुआ संदर्भनमूने (चित्रा 4): 1एच 1D,विशेष रूप से इमिनो क्षेत्र 10 - 15 पीपीएमकेसाथ किया जाता है; सुगंधित 1एच,13सी-एचएसक्यूसी; 1 एच,1एच-सेलोप (वैकल्पिक)।
      नोट: इमिनो संकेतों के बीच समझौते के मामले में भी एक सुगंधित फिंगरप्रिंट भी आवश्यक है, क्योंकि डिमर गठन अक्सर आरएनए हेयरपिन के समान या समान इमिनो संकेतों को दिखाता है। सेलोप प्रयोग सुगंधित फिंगरप्रिंटिंग के लिए 1एच,13सी-एचएसक्यूसी की जगह ले सकता है, क्योंकि अवेलेबल नमूनों पर विषमतांत प्रयोग बहुत समय लेने वाले होते हैं ।
    2. फिंगरप्रिंट संदर्भ (यदि वर्तमान) के रूप में यूयूसीजी लूप का उपयोग करें।
    3. 1एच आर1 rd प्रयोग दर्ज किए जाने से पहले हर बार इस तुलना को करें।

3. 1एच आर1ο छूट फैलाव-पर गूंज(लेबल 1D संस्करण)

नोट: नीचे दिए गए चरण एचएसक्यूसी-आधारित आरडी पल्स अनुक्रम के 1D संस्करण का उपयोग करके लेबल किए गए नमूने के लिए आरडी प्रयोगों के सेटअप का वर्णन करते हैं। अवेलेबल नमूनों के लिए SELOPE-आधारित 1D अनुक्रम के लिए एक ही चरण का पालन करें। दोनों मामलों के पैरामीटर नामों और सेटिंग्स का अवलोकन तालिका 2में दिखाया गया है । 1D संस्करणों पर ध्यान केंद्रित इसलिए है क्योंकि वे ऑफ-रेओनेंस मापन के लिए अधिक व्यावहारिक हैं, और SELOPE और एचएसक्यूसी-आधारित प्रयोगों के 2D संस्करणों के सेटअप पर क्रमशः Schlagnitweit एट अल20 और स्टेनर एट अलद्वाराविस्तार से चर्चा की गई है।

  1. एक कठिन 90 ° पल्स (P1) के लिए 1 एच शक्ति निर्धारित करें।
    1. विकल्प ए: ब्रूकर पल्सकल कमांड का उपयोग करें।
    2. विकल्प बी: एक zg प्रयोग में, पानी के शिखर पर प्रोटॉन हार्ड पल्स पावर स्तर पर एक अखरोट वक्र को मापने के द्वारा 360डिग्री नाड़ी का निर्धारण करें।
      नोट: 90 डिग्री नाड़ी की लंबाई अवधि का एक चौथाई है जहां शून्य संकेत मनाया जाता है (यदि पूर्ण अखरोट वक्र मापा जाता है, तो यह दूसरा शून्य है; हालांकि, व्यवहार में, केवल 360डिग्री के लिए अपेक्षित मूल्य के आसपास के क्षेत्र का नमूना लिया जाता है)।
  2. हर आर 1οमाप से पहले आरएनए तह की पुष्टि करने के लिए कदम 3.1 में निर्धारित पल्स लंबाई का उपयोग कर एक 1 एच1D स्पेक्ट्रम zgesgp.f2f3dec चलाएं।
    नोट: यदि 1एच एसएल प्रयोग पहली बार चलाए जाते हैं, तो जांचें कि क्या गणना की गई एसएल पावर प्रत्येक वांछित बैंडविड्थ के लिए SL पावर को कैलिब्रेट करके नमूने को दी गई शक्ति से मेल खाती है। विस्तृत अंशांकन कदम स्टेनर एट अल10में वर्णित हैं ।
  3. लेबल किए गए डेटा सेट के लिए 1एच आर10 बनाएं, और प्रमुख पैरामीटर सेट करें।
    1. एक नया डेटा सेट बनाएं; आदर्श रूप से आरएनए असाइनमेंटके लिए पूरी तरह से लेबल किए गए आरएनए नमूनों पर उपयोग किए जाने वाले 1 एच-13 सी सुगंधित एचएसक्यूसी डेटा सेट के आधार पर।
      नोट: यह सुनिश्चित करेगा कि 13सी के साथ-साथ 15एन पावर और डियुपलिंग पावर पहले से ही स्थापित हैं।
    2. तालिका 2के पहले भाग के अनुसार सामान्य मापदंड निर्धारित करें।
    3. तालिका 2के दूसरे भाग के अनुसार आरडी-विशिष्ट पैरामीटर निर्धारित करें।
    4. परीक्षण के लिए सबसे कम मूल्य (1.2 किलोहर्ट्ज) के लिए 1 एच एसएल पावर सेट करें।
    5. केवल एक प्रविष्टि, 0 एमएसके साथ एक परीक्षण वीडी सूची उत्पन्न करें, (वीडी सूची को अनुकूलित करने के लिए, जैसा कि चरण 3.4 में वर्णित है), TDF1 से 1 सेट करें, और D30को अपडेट करें।
    6. इन सेटिंग्स के साथ एक परीक्षण स्पेक्ट्रम चलाएं।
  4. वीडी सूची (उपयोग की जाने वाली एसएल लंबाई की सूची) को अनुकूलित करें।
    1. एक परीक्षण वीडी सूची के साथ प्रयोग चलाएं(उदाहरण के लिए,छह प्रविष्टियां: 0 मीटर, 5 मीटर, 10 मीटर, 20 मीटर, 30 मीटर, 40 मीटर; हीटिंग के कारण व्यवस्थित त्रुटियों से बचने के लिए इन मूल्यों को हाथापाई करें)।
    2. तदनुसार D30 और TDF1 अपडेट करें (इस उदाहरण में, D30 = 42m और TDF1 = 6)।
    3. चोटी बनाम SL लंबाई की साजिश तीव्रता। एसएल की लंबाई की पहचान करें जिस पर मूल चोटी की तीव्रता 1/3 तक कम हो जाती है।
    4. प्रयोग में उपयोग की जाने वाली अंतिम वीडी सूची बनाएं, निम्नलिखित को ध्यान में रखते हुए: पिछले चरण में वर्णित सबसे लंबी एसएल लंबाई निर्धारित करें; घटने या आरोही क्रम के साथ एक सूची का उपयोग करने से बचें; और सांख्यिकीय अध्ययन के लिए कुछ डुप्लिकेट जोड़ें। हर बार वीडी सूची में कोई भी बदलाव होने पर D30 और TDF1 को अपडेट करना याद रखें।
      नोट: प्रयोग विभिन्न SL लंबाई के साथ चलाया जाता है जैसा कि वीडी सूची में छद्म-2D तरीके से दिया गया है।
    5. स्कैन की संख्या का चयन करें ताकि सूची के सबसे कमजोर शिखर में कम से कम 10 का सिग्नल-टू-शोर अनुपात (SINO) हो।
      नोट: हालांकि वीडी सूची को कम एसएल पावर (1.2 kHz) के लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन इस वीडी सूची का उपयोग किए जाने वाले उच्चतम एसएल पावर(जैसे,15 किलोहर्ट्ज) पर भी किया जाना चाहिए। इसका कारण यह है कि क्षय महत्वपूर्ण कश्मीरपूर्व योगदान के साथ चोटियों के लिए उच्च SL शक्ति पर बहुत धीमी हो जाएगा । इसलिए, उच्च एसएल शक्ति पर पर्याप्त क्षय का सत्यापन भी किया जाना चाहिए।
पैरामीटर विवरण पल्स सीक्वेंस में पैरामीटर नाम
1D लेबल 1D सेलोप
ऑन-रेमॉनेंस 1Ds के लिए पल्स प्रोग्राम 1HR1rho_HCP_onres1D.es 1HR1r_HH_onres1D.js
1 एच वाहक आवृत्तियों (पीपीएम) O1P = पीपीएम में पानी की गूंज O1P = ब्याज की चोटी के रासायनिक बदलाव (पीपीएम)
CNST28 = ब्याज की चोटी के रासायनिक बदलाव (पीपीएम) CNST29 = पीपीएम में पानी की गूंज
1 एच हार्ड 90º पल्स P1 @ PL1 (3.1.1 में अंशांकित के रूप में) P1 @ PL1 (3.1.1 में अंशांकित के रूप में)
आकार की दालें और पानी के दमन के लिए शक्तियां P25 = 1000 हमें @ sp3 P12 = 2000 हमें @ sp1
(वाटरगेट) (उत्तेजन मूर्तिकला)
13 सी वाहक आवृत्ति, ब्याज की चोटी के 13सी रासायनिक बदलाव के साथ पर गूंज O2P –
15 एन वाहक आवृत्ति, डीयुग्मन के लिए औसत 15एन रासायनिक बदलाव (जैसा कि सुगंधित एचएसक्यूसी में उपयोग किया जाता है) O3P –
13 C/15N decoupling (एचएसक्यूसी में के रूप में स्थापित) पीसीपीडी2, सीपीडी2 –
पीसीपीडी3, सीपीडी3
एचसीपी स्थानांतरण (उदाहरण के लिए, पी = 1/J @ 100 हर्ट्ज) –
पल्स और पल्सएफ2 कमांड का उपयोग कठोर दालों से शक्तियों का निर्धारण करने के लिए किया जा सकता है
अवधि (1/J(1एच-13सी) ब्याज की पीक की) P11
पावर 1एच और पावर 13सी पर एसपी1, एसपी12
SELOPE स्थानांतरण (d = 1/4J (H5-H6)) – D5
सेलोप (4000 यूएस, एबुआरपी) के लिए चयनात्मक नाड़ी (उदाहरण के लिए, सुगंधित क्षेत्र) – P13 और SP4
SL/RD-विशिष्ट पैरामीटर:
1 एच एसएल पावर, कैलिब्रेटेड हार्ड पल्स (उदाहरण के लिए, पल्स कमांड का उपयोग करके) से प्राप्त किया जाता है। Pl25 और CNST12 (1.2 - 15 kHz) Pl24 (50 हर्ट्ज - 15 किलोहर्ट्ज)
SL अवधि के लिए परिवर्तनीय देरी सूची (शुरू में 1 प्रविष्टि, 0, अनुकूलन 3.1.3 के तहत वर्णित) vdlist (~ 0 - 40 एमएस) अवेलेबल नमूनों में कम आर 2 के कारण vdlist (~0 - 150 एमएस)
वीडी सूची में प्रविष्टियों की TDF1 संख्या (शुरू में 1) टीडीएफ1 टीडीएफ1
गर्मी मुआवजा:
D30 = वीडी सूची में सबसे बड़ा मूल्य + 2ms D30 D30
एसएलएस की बहुत विस्तृत रेंज के लिए अतिरिक्त गर्मी मुआवजा PL25
ऑफ-प्रतिध्वनि विशिष्ट पैरामीटर:
ऑफ-प्रतिध्वनि 1Ds के लिए पल्स कार्यक्रम 1HR1rho_HCP_offres1D.ईएस 1HR1r_HH_offres1D.js
ऑफ-प्रतिध्वनि प्रयोगों के लिए ऑफसेट सीएनटीटी30 सीएनटीटी30

तालिका 2: 1D एचसीपी-आधारित और 1D-SELOPE-आधारित 1एच आर 1प्रयोगों कोस्थापित करने के लिए मापदंडों का अवलोकन। संक्षिप्त रूप: 1D = एक आयामी; एचसीपी = हेट्रोन्यूक्लियर क्रॉस-ध्रुवीकरण; SELOPE = SELective अनुकूलित प्रोटोन प्रयोग; पीपीएम = भाग प्रति मिलियन; एचएसक्यूसी = हेट्रोन्यूक्लियर स्पिन क्वांटम सहसंबंध; SL = स्पिन लॉक; आरडी = छूट फैलाव

  1. सेट-अप और ऑन-ग्रेसेंस 1एच आर1ο प्रयोगों का अधिग्रहण
    1. सेक्शन 3.4 से प्रयोग को टॉपस्पिनमें एक नए फ़ोल्डर में कॉपी करें।
    2. इस फ़ोल्डर में, हर बार PL25 और CNST12को बदलते हुए विभिन्न एसएल शक्तियों पर प्रयोग स्थापित करें। पल्स कमांड का उपयोग करके प्रत्येक एसएल ताकत के लिए सही शक्ति स्तर निर्धारित करें। 1.2 से 15 kHz तक एसएल ताकत का उपयोग करें, कम SL ताकत के लिए एक सघन नमूने के साथ (चयनित SL ताकत के लिए चित्रा 5G देखें)। कुछ एसएल शक्तियों के लिए डुप्लिकेट करने के लिए कुछ प्रयोगों की प्रतियां जोड़ें।
    3. इन प्रयोगों को चलाएं।
  1. ऑन-प्रतिध्वनि 1 एच आर 1οप्रयोगों का विश्लेषण
    1. टॉपस्पिन में, कमांड xf2का उपयोग करके एक ही प्रसंस्करण मापदंडों(जैसे, लाइन विस्तार, चरण) का उपयोग करके प्रत्येक छद्म-2D डेटा सेट के प्रत्येक स्लाइस को संसाधित करें, और ब्रुकर एयू प्रोग्राम स्प्लिट2डीका उपयोग करके डेटासेट को 1Ds में विभाजित करें।
    2. प्रत्येक 1D स्लाइस के लिए सिग्नल तीव्रता और मात्रा प्राप्त करें।
      नोट: व्यवहार में, संभावित ओवरलैपिंग चोटियों से योगदान से छुटकारा पाने के लिए स्पेक्ट्रा को विघटित करना बेहतर होता है और ब्रुकर एयू कार्यक्रम मल्टीडकॉनके उपयोग की अनुमति देताहै, जो पाठ फ़ाइल डेकॉल में एक प्रयोग में सभी स्लाइस की चोटियों की तीव्रता या क्षेत्रों को आसानी से संक्षेप में प्रस्तुत करता है.txt जिसे तब अन्य कार्यक्रमों के साथ आसानी से पढ़ा जा सकता है (घर में लिखे गए पायथन स्क्रिप्ट का उपयोग यहां किया गया था, जैसा कि स्टेनर एट अल10द्वारा वर्णित है) चरण 3.6.3 और 3.6.4 में।
    3. आर1ο (या पर गूंज, आर2 + आरEX)मूल्य प्राप्त करने के लिए प्रत्येक SL ताकत के लिए एक मोनोघातीय क्षयफिट करें ।
    4. उन आर2+आरEX मूल्यों (y) बनामप्लॉट । SL ताकत (x)(चित्रा 5F,जी)।
      नोट: यदि मूल्य कम SL ताकत के लिए काफी अधिक है और उच्च SL शक्ति के साथ कमी (जैसा कि चित्रा 5Gमें दिखाया गया है), तो जांच की चोटी फैलाव से पता चलता है, और यह बाहर ले जाने के लिए अतिरिक्त (ऑफ प्रतिध्वनि) प्रयोगों को प्राप्त करने के लिए जनसंख्या और उत्साहित राज्य के रासायनिक बदलाव अंतर बनामदिलचस्प हो सकता है । जमीनी स्थिति।

4. 1एच आर11 शिथिलता फैलाव-ऑफ-प्रतिध्वनि (लेबल 1D संस्करण)

  1. सेट-अप और ऑफ-रेsonance 1एच आर1ο प्रयोगों का अधिग्रहण
    1. एक नए टॉपस्पिन फ़ोल्डर में, एक निश्चित SL ताकत पर प्रयोग स्थापित करें (आमतौर पर सबसे कम एसएल ताकत पर आर एक्स योगदान के रूप में सबसे अधिक है, ऑफ-रेनेस एसएलएस के प्रतिनिधि चयन के लिए चित्रा 5G देखें), लेकिन विभिन्न ऑफसेट के साथ, हर बार CNST30बदलते हैं।
    2. 0 ऑफसेट के आसपास एक सघन नमूना के साथ ± (3 या 4) * SL ताकत तक ऑफसेट का उपयोग करें, जैसा कि चित्रा 5H,Iमें देखा जा सकता है।
    3. इन प्रयोगों को चलाएं।
  2. ऑफ-प्रतिध्वनि 1 एच आर 1οप्रयोगों का विश्लेषण
    1. प्रत्येक ऑफसेट के लिए एक आर1ο मूल्य निर्धारित करने के लिए, 3.6.1-3.6.3 के रूप में एक ही प्रसंस्करण रणनीति का उपयोग करें।
    2. उन मूल्यों बनाम ऑफसेट(चित्रा 5G) प्लॉट।
      नोट: इस वक्र में एक विषमता पहले से ही संकेत दे सकते है कि उत्तेजित राज्य के लिए रासायनिक बदलाव की जानकारी प्राप्त की जा सकती है । केएक्स, पीईएस के साथ-साथ10,20 (चित्रा 5G) केबारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए ब्लोच-मैककॉनेल या लागुएरे समीकरणों का उपयोग करके पूरी तरहसे फिटिंग और विश्लेषण किया जाना चाहिए। उदाहरण के दोनों 1D प्रयोगों के लिए डेटासेट, पल्स प्रोग्राम और मैक्रो पेट्ज़ल्ड लैब गिथुब भंडार (https://github.com/PetzoldLab) पर पाए जा सकते हैं। तालिका 2में मापदंडों का अवलोकन किया गया है।

Representative Results

आरएनए उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल उच्च शुद्धता टेप के उत्पादन के माध्यम से शुद्धि की सुविधा प्रदान करता है। चित्रा 3A मिलकर टेप के कई दरार प्रतिक्रियाओं के परिणामों से पता चलता है, दोनों सफल और असफल प्रतिक्रियाओं प्रदान करते हैं । लेन 1 साइड उत्पादों के केवल बेहोश निशान के साथ एक पूरी तरह से क्लीव्ड ट्रांसक्रिप्ट के इष्टतम मामले को दर्शाता है। लेन 2a अधूरा दरार है, जो फिर से annealing और अधिक RNase एच (लेन 2b, चरण 2.1.2) के अलावा द्वारा हल किया जा सकता है दिखाता है । लेन 1, 2a, और 2b के आरएनए निर्माण एक ही हैं । लेन 3 में नमूना असफल दरार से पता चलता है । इस प्रतिक्रिया का निवारण दरार गाइड अनुक्रम, डीएनए टेम्पलेट की शुद्धता, और एनेलिंग तापमान की जांच शामिल होगी। संभावित रूप से, RNase एच दरार T7 IVT के बाद प्रदर्शन के रूप में नमूना 2 के लिए दिखाया जाएगा ।

लेन 4 में नमूना दरार पक्ष उत्पादों की एक महत्वपूर्ण राशि है, जो आयन विनिमय HPLC के माध्यम से हटाने के लिए मुश्किल है दिखाता है । इस तरह के नमूने में समस्या निवारण में शामिल हो सकते हैं (क) तापमान को कम करना, RNase H की मात्रा, या प्रतिक्रिया समय, (ख) एल्यूशन ढाल और इंजेक्शन की मात्रा को कम करना और साइड उत्पादों से लक्ष्य अंशों को अलग करने का प्रयास करना। आयन एक्सचेंज एचपीएलसी शुद्धिकरण में संकल्प को कैसे बढ़ाया जाए, इस बारे में और जानकारी कार्लस्सन एट अल31द्वारा चर्चा की गई है । एचपीएलसी लक्ष्य आरएनए को लंबे या छोटे न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन या छोटे अणु संदूषकों से अलग करता है। चित्रा 3 बी आयन-एक्सचेंज एचपीएलसी शुद्धिकरण के लिए इष्टतम परिणाम दिखाता है। एल्यूशन रेडिएंट को इस तरह चुना जाना चाहिए कि अगली बड़ी प्रजातियों से पहले अगली छोटी प्रजातियों और एक कॉलम वॉल्यूम के बाद लक्ष्य आरएनए प्रजातियां कम से कम एक कॉलम वॉल्यूम (इस उदाहरण में: 35 एमएल) को elutes।

इस विधि में छोटी प्रजातियों में एकल न्यूक्लियोटाइड, निष्फल उत्पाद (8-12 एनटी), 3' और 5' स्पेसर सीक्वेंस (5-14 एनटी), और क्लीवेज गाइड (12 एनटी चिमेरिक न्यूक्लिक एसिड) शामिल हैं, जबकि लंबे दृश्य संभावित रूप से अंकल्व्ड टैंडेम रिपीट्स और प्लाज्मिड होते हैं। जब एक अच्छी तरह से अलग एल्यूशन चोटी प्राप्त की जाती है, तो शुद्धिकरण को प्रति इंजेक्शन आईवीटी प्रतिक्रिया के ~ 20 एमएल के बराबर तक बढ़ाया जा सकता है। आरएनए नमूने का सही गुना आरडी प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है और हर माप से पहले इसकी पुष्टि की जानी चाहिए। चित्रा 4 चरण 2.4 (नीला) में तह प्रोटोकॉल से पहले एक लेबल 22-मेर आरएनए से पता चलता है, और सही तह (लाल) प्राप्त किया गया है के बाद एक ही नमूना। एक मैक गुना माध्यमिक संरचना भविष्यवाणी(चित्रा 4C) 4आधार जोड़े के साथ प्रस्तुत हेयरपिन संरचना का प्रस्ताव है जिसके परिणामस्वरूप 5 इमिनो संकेत हैं।

चित्रा 4A में दोनों स्पेक्ट्रा इन भविष्यवाणी संकेतों की पुष्टि करते हैं, हालांकि थोड़ा अलग सापेक्ष तीव्रता के साथ, जो इंगित करता है कि कुछ गलत मुड़ा हुआ संरचना (यहां, एक डिमर) केवल 1 एच 1डी स्पेक्ट्राके साथ आकलन करने के लिए समस्याग्रस्त हो सकता है। एक सुगंधित 1एच,13सी-एचएसक्यूसी स्पेक्ट्रम(चित्रा 4B),हालांकि, फोल्डिंग प्रोटोकॉल (ब्लू) से पहले नमूने के लिए सुगंधित संकेतों में से केवल 3 दिखाता है, लेकिन नमूना है कि कदम 2.4 (लाल) के अनुसार मुड़ा हुआ है के लिए सभी 4 संकेतों। नीले रंग में दिखाए गए नमूने की संभावना एक होमोडिमर (चित्रा 4 डीमें प्रस्तावित संरचना) का गठन किया है कि हेयरपिन के रूप में एक ही imino संकेतों में परिणाम होगा । A13H2 का संकेत विनिमय-विस्तृत लगता है । ये परिणाम प्रत्येक आरडी प्रयोग से पहले इमिनो और सुगंधित फिंगरप्रिंट प्रयोगों दोनों के साथ तह पुष्टि के महत्व को उजागर करने में मदद करते हैं। इस प्रोटोकॉल में वर्णित 1एच आर1ο पल्स दृश्यों मध्यवर्ती विनिमय शासन में गतिशीलता का पता लगाने की अनुमति देते हैं। प्रारंभ में एक ऑन-प्रतिध्वनि वक्र दर्ज किया जाता है, और यदि किसी विशिष्ट अवशेषों के लिए गतिशीलता मौजूद होती है, तो प्राप्त आर2+आरएक्स मूल्यों के भीतर एक फैलाव दिखाई देता है, जबकि यह वक्र बिना एक्सचेंज के अवशेषों के लिए सपाट है।

चित्रा 5 एक सिंथेटिक आरएनए हेयरपिन(चित्रा 5A)में दो अलग एच8 परमाणुओं के लिए प्राप्त प्रतिनिधि पर प्रतिध्वनि घटता से पता चलता है, जिसमें G6H8 अनुभवों विनिमय(चित्रा 5C),जबकि A4H8 नहीं है(चित्रा 5B)। चूंकि एक्सचेंज इस नमूने में अपेक्षाकृत धीमा है(kEX = 292 ± 40 हर्ट्ज), कम SL ताकत प्राप्त करने के लिए SELOPE प्रयोग का लाभ शोषण किया गया था, और पल्स अनुक्रम के 1D संस्करण का उपयोग करके दो ऑन-प्रतिध्वनि घटता दर्ज किया गया था। एक ही पल्स अनुक्रम तो पर गूंज प्रोफ़ाइल में फैलाव दिखा अवशेषों के लिए बंद गूंज डेटा प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । चित्रा 5D प्राप्त आर1 οο मानों बनाम ऑफसेट से पता चलता है जिसमें वक्र की एक मामूली विषमता पहले से ही Τωके हस्ताक्षर इंगित करता है ।

यह आर 2+ आरEX प्लॉट में और भी स्पष्ट हो जाताहै जहां आर1 योगदान को हटा दियाजाता है(चित्रा 5E)। एक ही आंकड़े का सही कॉलम तेजी से विनिमय के साथ थोड़ा अलग सिंथेटिक आरएनए हेयरपिन में दो अलग एच8 परमाणुओं के लिए प्राप्त प्रतिनिधि ऑन-रेनेस घटता दिखाता है, जिसमें G6H8 अनुभवों का आदान-प्रदान(चित्रा 5G),जबकि A4H8(चित्रा 5F)नहीं है । तेज विनिमय दर(kEX = 43,502 ± 38,478 हर्ट्ज) ने SELOPE 2D संस्करण का उपयोग करके सभी सुगंधित प्रोटॉनों की आरडी रिकॉर्डिंग को एक बार में सभी सुगंधित प्रोटॉन की आरडी रिकॉर्डिंग की अनुमति दी, दोनों को प्राप्त करने के लिए, ऑन-एंड-आउट-प्रतिध्वनि डेटा (G6H8 डेटा चित्रा 5H,Iमें प्रदर्शित) ।

सकारात्मक और नकारात्मक परिणामों के लिए सामान्य पहचानकर्ता
टैंडेम आईवीटी और RNase एच दरार में सकारात्मक परिणाम इस प्रकार की पहचान की जा सकती है: 1) लक्ष्य बैंड denaturing पृष्ठ जेल में सबसे मजबूत बैंड है । 2) मुख्य बैंड के आसपास कोई या केवल कमजोर बैंड नहीं हैं। 3) कोई या केवल कमजोर उच्च आणविक वजन प्रजातियां हैं। 4) एचपीएलसी क्रोमाटोग्राम लक्ष्य आरएनए की एक अच्छी तरह से अलग चोटी दिखाता है। 5) जब मुख्य चोटी का नमूना लिया जाता है, तो केवल एक बैंड एक डेन्चरिंग पेज जेल पर दिखाई देता है।

मिलकर IVT और RNase एच दरार में नकारात्मक परिणाम इस प्रकार के रूप में मौजूद: 1) नहीं या सिर्फ एक कमजोर मुख्य बैंड एक denaturing पृष्ठ जेल पर दिखाई दे रहा है । 2) आरएनए टैंडेम रिपीट्स से उच्च आणविक वजन प्रजातियों का एक पैटर्न दिखाई देता है। 3) हालांकि मुख्य बैंड मौजूद है, इसी तरह की तीव्रता के बैंड ऊपर या 3 nt ± भीतर मुख्य बैंड के नीचे हैं ।

एक अच्छी तरह से मुड़ा हुआ नमूना इस प्रकार पहचाना जा सकता है: 1) मनाया imino प्रोटॉन की संख्या एक माध्यमिक संरचना सिमुलेशन से अपेक्षित imino प्रोटॉन की संख्या से मेल खाता है(जैसे,Mc-fold39, चित्रा 4A)। 2) एक UUCG पाश में सिन जी-यू लड़खड़ा आधार जोड़ी (यदि वर्तमान) ~ 9.5 पीपीएम पर दिखाई देता है, कभी-कभी केवल कम तापमान पर दिखाई देता है। यूयूसीजी लूप के आगे फिंगरप्रिंटिंग का वर्णन फ्यूर्टिग और सहयोगियों द्वारा40किया गया है। 3) सुगंधित फिंगरप्रिंट पहले से सौंपे गए नमूने से सहमत है जिसे सही ढंग से गुना करने की पुष्टि की गई है(चित्रा 4C)।

एक गलत मुड़ा हुआ या अपमानित नमूने को इस प्रकार पहचाना जा सकता है: 1) एक माध्यमिक संरचना सिमुलेशन की भविष्यवाणी की तुलना में अधिक इमिनो संकेत हैं (नोट: कम इमिनो संकेत जरूरी गलत गुना का मतलब नहीं है, क्योंकि बंद आधार जोड़े अक्सर दिखाई नहीं देते हैं, और अनुरूप विनिमय लाइनों को विस्तृत करता है)। 2) इमिनो संकेतों की अनुपस्थिति। 3) सुगंधित क्षेत्र में उच्च तीव्रता के संकीर्ण संकेत, एकल न्यूक्लियोटाइड क्षरण उत्पादों का संकेत देते हैं। 4) पुष्टि तह(चित्रा 4C)के संदर्भ नमूने के लिए इमिनो या सुगंधित संकेतों के बीच फर्क।

पता लगाने योग्य टाइमस्केल में कोई एक्सचेंज नहीं दिखाने वाले परमाणु को इस प्रकार पहचाना जा सकता है: 1) एक फ्लैट आरडी प्रोफाइल से (लागू एसएल पावर के साथ अलग-अलग आर एक्स योगदान के कारण)(चित्रा 5B और चित्रा 5F)। 2) धीमी गति से मध्यवर्ती विनिमय के मामले के लिए देखभाल की जानी चाहिए जब कश्मीरEX और Ω एक ही परिमाण के हैं । उस मामले में, ऑन-रेनेस योगदान बहुत छोटा हो सकता है जैसा कि चित्रा 5C में देखा जा सकता है (इस मामले में फिट पैरामीटर kEX = 292 ± 40 हर्ट्ज और ω = 112 ± 4 हर्ट्ज) हैं। यदि संदेह में, एक कम SL बंद गूंज वक्र सत्यापन के लिए दर्ज किया जा सकता है ।

मध्यवर्ती समय पैमाने में विनिमय दिखाने वाले परमाणु की पहचान 1) एक गैर-फ्लैट छूट फैलाव प्रोफ़ाइल से ऑन-रेक्शन आरडी प्रयोग(चित्रा 5B और चित्रा 5F)में की जा सकती है; 2) एचएसक्यूसी या सेलोप प्रयोग में एक व्यापक लाइनविड्थ भी विनिमय के लिए एक संकेतक हो सकता है।

ऑफ-रेओनेंस वक्र्स(चित्रा 5E,एफ):1) के लिए अच्छी तरह से चयनित एसएल पावर वैल्यूज में ऑन-रेनेस कर्व (चयनित एसएल पावर वैल्यूज फिगर 5सी और फिगर 5जी में इंगित किए गए हैं) में काफी k EX योगदान है। 2) के रूप में ऑफ-प्रतिध्वनि घटता कम से कम 3 SL बिजली मूल्यों के लिए मापा जाता है, चयनित SL बिजली मूल्यों को कश्मीरEX योगदान के साथ ऑन-प्रतिध्वनि वक्र के क्षेत्र में फैलाया जाना चाहिए। 3) लैगुएरे फिट(उदाहरणके लिए, चित्रा 5D:SL ताकत25,50, और 75 हर्ट्ज) के बाद गैर-फ्लैट आर2 +आरएक्स घटता है; चित्रा 5E)।

ऑफ-रेओनेंस वक्र्स(चित्रा 5E,एफ)के लिए खराब चयनित एसएल पावर मान लैगुएरे फिट होने के बाद फ्लैट आर2+ आरएक्स वक्र्स का नेतृत्व करते हैं। चित्रा 5Eमें एक उदाहरण दिखाया गया है, जिसमें 100 हर्ट्ज ऑफ-रेनेस कर्व बहुत सपाट है और इसलिए इसबारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान नहीं करता हैω ।

घूर्णन-फ्रेम परमाणु ओवरहायूजर प्रभाव (आरओई) कलाकृतियों के लिए संकेत: 1) Ω ω बंद अनुनाद घटता से प्राप्त स्थानिक आसपास के क्षेत्र में प्रोटॉन के रासायनिक बदलाव मैच/ (उदाहरणके लिए, चित्रा 5I तेज-मध्यवर्ती एक्सचेंज के लिए अपेक्षित व्यापक ऑफ-रेओनेंस घटता दिखाता है, लेकिन घटता में तेज विशेषताएं भी हैं, उदाहरण के लिए-3000 हर्ट्ज और +1500 हर्ट्ज। ये एक अलग अनुरूप में इस H8 के लिए एक रासायनिक बदलाव के बजाय एक आरओई विरूपण साक्ष्य के कारण बहुत संभावना है) । 2) Laguerre फिट काम करता है, लेकिन अच्छी तरह से काम नहीं करता है (उच्च त्रुटियों या शारीरिक रूप से असंभव मूल्यों देता है) पर गूंज और कम से कम 3 ऑफ-प्रतिध्वनि घटता है, भले ही घातीय उच्च SINO (>20)(जैसे,, कश्मीरEX = 43,502 ± 38,478 8 hz 3)। अक्सर प्रत्येक एसएल व्यक्तिगत रूप से अच्छी तरह से फिट बैठता है, लेकिन उन्हें एक साथ फिट करना एक बहुत अधिक त्रुटि देता है; विपरीत व्यवहार एक सच्चे उत्साहित राज्य के लिए उम्मीद है।

"सच" विनिमय के लिए संकेत ω:1) ω से प्राप्त ω ω से प्राप्त स्थानिक आसपास के क्षेत्र में प्रोटॉन के रासायनिक बदलाव से मेलनहीं खाते/ 2) Laguerre फिट एक पर गूंज के लिए कम त्रुटियों देता है और कम से कम 3 ऑफ-प्रतिध्वनि घटता(जैसे, चित्रा 5E बनाम। चित्रा 5I,फिट परिणामों के लिए कैप्शन देखें)।

Figure 3
चित्रा 3:T7 टैंडेम आईवीटी और RNase H दरार प्रतिक्रिया द्वारा नमूना उत्पादन । (A)टैंडेम IVT और RNase एच दरार के सकारात्मक और नकारात्मक परिणामों के Denaturing पृष्ठ । सीढ़ी ऊंचाई आरएनए संदर्भों को संदर्भित करता है, 12 * चिमरिक क्लीवेज गाइड को संदर्भित करता है। लेन 1: एक 20 nt लक्ष्य आरएनए की सफल पीढ़ी । कुछ छोटे और लंबे उत्पाद मौजूद हैं। लेन 2a: मिलकर प्रतिलिपि के अधूरे दरार । हालांकि एचपीएलसी शुद्धिकरण संभव है, बहुत सारी सामग्री बर्बाद हो जाएगी। लेन 2b: लेन 2 के निरंतर RNase एच दरार एचपीएलसी इंजेक्शन के लिए तैयार एक साफ नमूना पैदा करता है (लेन 1 के समान) । लेन 4: RNase एच दरार काफी हद तक असफल रहा था, और कोई लक्ष्य बैंड का उत्पादन किया गया था । पूर्ण लंबाई टैंडेम ट्रांसक्रिप्ट अभी भी ६०० एनटी पर दिखाई दे रही है । लेन 5: एक लक्ष्य बैंड का उत्पादन किया गया था, लेकिन एक मजबूत-1 बैंड मौजूद है । हालांकि एचपीएलसी किया जा सकता है, साइड उत्पाद को सावधानीपूर्वक हटाना आवश्यक है। (ख)एक सफल एचपीएलसी इंजेक्शन का उदाहरण। ३८ मिनट पर चोटी लक्ष्य लंबाई के शुद्ध आरएनए शामिल हैं, जबकि अब और छोटे उत्पादों को अच्छी तरह से लक्ष्य आरएनए से अलग कर रहे हैं । पैनल बी को 21से संशोधित किया गया है । संक्षिप्त रूप: आईवीटी = इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन; एचपीएलसी = उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी; nt = न्यूक्लियोटाइड; AU = मनमानी इकाइयां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:एक आरएनए हेयरपिन से पहले (नीला) और बाद में (लाल) एनएमआर में फोल्डिंग स्टेप 2.4 (प्रोटोकॉल देखें) का उदाहरण।(ए)इमिनो क्षेत्र ए-लेबल 22-मेर आरएनए के 1एच-1डी स्पेक्ट्रम का। इमिनो संकेतों की आधार जोड़ी पहचान के लिए अपेक्षित क्षेत्रों को नीचे ग्रे में इंगित किया गया है। (ख)पैनल ए से आरएनए की सुगंधित अनुनादों के 1 एच,13सी-एचएसक्यूसी स्पेक्ट्रम । फोल्डिंग (रेड) के बाद का नमूना उम्मीद के मुताबिक 4 सिग्नल दिखाता है, जबकि फोल्डिंग (ब्लू) से पहले का नमूना केवल 3 सिग्नल दिखाता है। (ग)मैक-फोल्ड भविष्यवाणी 22-मेर आरएनए को हेयरपिन के रूप में । इस माध्यमिक संरचना से पांच इमिनो संकेतों की उम्मीद की जानी चाहिए, जो 22-मेर आरएनए द्वारा गठित एक होमोडामर की पैनल ए(डी)प्रस्तावित संरचना में दोनों नमूनों में पाया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप हेयरपिन संरचना के समान 5 आधार जोड़े होते हैं । संक्षिप्त रूप: एनएमआर = परमाणु चुंबकीय अनुनाद; 1D = एक आयामी; एचएसक्यूसी = विषमताबंधिक एकल क्वांटम सहसंबंध; पीपीएम = भागों प्रति मिलियन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा। 5: आरएनएहेयरपिन के आधार पर दो अलग-अलग निर्माणों के लिए 1 एच आर1 1) आरडी प्रतिनिधि परिणाम। (ए)बाएं कॉलम में आरएनए पर उभार यू के ऊपर सी-जी बेस जोड़ी के साथ प्राप्त परिणाम दिखाई देते हैं, जबकि सही कॉलम एक नमूने पर प्राप्त परिणाम दिखाता है जहां आधार जोड़ी को इसके बजाय जी-सी में बंद कर दिया गया था । (ख)और(एफ)दो निर्माणों के लिए A4H8 के लिए प्राप्त फ्लैट फैलाव प्रोफाइल दिखाते हैं, जो कोई अनुरूप विनिमय नहीं दर्शाता है । (सी-ई)(जी-सी) निर्माण में G6 के लिए प्राप्त ऑन-रेनेस, ऑफ-रेनेस और फिट डेटा दिखाते हैं। Laguerre फिट निम्नलिखित परिणाम की ओर जाता है: आर1 = 2.87 ± 0.01 हर्ट्ज, आर2 = 7.76 ± 0.03 हर्ट्ज, kEX = 292 ± 40 हर्ट्ज, पीईएस = 0.31 ± 0.03%, ω = 112 ± 4 हर्ट्ज.(जी-I)पर-गूंज, ऑफ-प्रतिध्वनि, और (जी-सी) निर्माण में G6 के लिए प्राप्त डेटा दिखाते हैं। Laguerre फिट निम्नलिखित परिणाम की ओर जाता है: आर1 = 1.93 ± 0.02 हर्ट्ज, आर2 = 6.71 ± 0.86 हर्ट्ज, कश्मीर EX = 43,502 ± 38,478 हर्ट्ज, पी ईएस = 27 ± 16%, ω = 203 ± 166 हर्ट्ज। इस आंकड़े को 20से संशोधित किया गया था । संक्षिप्त नाम: SL = स्पिन लॉक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल 10 , 20 ,21,31 , 31शोध लेखों के रूप में पहले प्रकाशित कईप्रोटोकॉलोंका संश्लेषण है । इसलिए, प्रोटोकॉल के खंडों को लागू किया जा सकता है, जबकि अन्य पाठक की वरीयता के लिए आदान-प्रदान किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, आर1ο मापन किसी भी विधि के साथ उत्पादित आरएनए नमूने पर किया जा सकता है, यह देखते हुए कि लंबाई की तह और एकरूपता ग्रहण कर रहे हैं। इसके अलावा, प्रोटोकॉल में आरएनए अनुक्रम के अनुनाद असाइनमेंट के बारे में जानकारी नहीं है - आरडी प्रयोगों के लिए आवश्यक एक कदम - क्योंकि इसे पिछले साहित्य19,37,38में बड़े पैमाने पर शामिल किया गया है। आंशिक, खंडीय, या साइट-विशिष्ट लेबलिंग योजनाएं36,41,42,43,44 अनुनाद कार्य को सुविधाजनक बनाने या आरडी प्रयोगों में रुचि रखने वाले प्रतिध्वनियों के ओवरलैप को कम करने के लिए दृष्टिकोण हैं और साहित्य में विस्तार से वर्णित की गई हैं। यह विधि किसी भी न्यूक्लियोटाइड पहचान की एक समान लेबलिंग के उपयोग की अनुमति देती है, जो पहले से ही अनुनय असाइनमेंट को काफी सरल बना सकती है।

यहां प्रस्तुत आईवीटी विधि दृश्यों और लेबलिंग के साथ ज्ञात मुद्दों पर काबू पा रही है, उपज बढ़ाती है, और अन्य तरीकों की तुलना में लागत और काम के समय को कम करती है। वायरल दीक्षा अनुक्रम का उपयोग प्रतिक्रिया अनुकूलन की आवश्यकता को कम करता है, जो क्षेत्र में एक ज्ञात समस्या है जो गैर-जी दीक्षा के मामले में प्रतिलिपि की केवल कुछ प्रतियां देने और पैदावार करने के लिए समय लेने वाली हो सकती है। टी 7 आईवीटी और आरएनएसई एच क्लीवेज ऑफ टैंडेम ट्रांसक्रिप्ट एक ही पोत में एक साथ किया जा सकता है। मल्टीमेरिक टैंडेम रिपीट्स का एक पैटर्न प्रतिक्रिया के दौरान एक डेन्चरिंग पेज जेल पर देखा जा सकता है, जो RNase H प्रतिक्रिया(चित्रा 3A,लेन 1 और 2b) के पूरा होने पर लक्ष्य आरएनए पर एक बैंड को मिलाता है। इस विधि का उपयोग करने वाले विशिष्ट पैदावार प्रति 1 एमएल आईवीटी 30 और 70 एनएमोल आरएनए के बीच होती हैं। फिर भी, मिलकर दोहराता के RNase एच दरार पर आधारित विधि अपनी खुद की कुछ समस्याओं के बिना नहीं आता है । RNase एच दरार प्रतिक्रिया अक्सर पूरा करने के लिए जब T7 प्रतिलेखन(चित्रा 3A, लेन 2a)के साथ एक साथ चलाने के लिए नहीं जाना है ।

टेंपरिंग इकाइयों के पृथक्करण को ट्रांसक्रिप्ट में दरार गाइड को एनीलिंग करके और अधिक RNase H(चित्रा 3A,लेन 2b, चरण 2.1.2) जोड़कर अंतिम रूप दिया जा सकता है। चूंकि बड़ी मात्रा का हीटिंग धीमा होता है और आरएनए के एमजी2 +-उत्प्रेरक हाइड्रोलिसिस की ओर जाता है, एक पारंपरिक माइक्रोवेव ओवन का उपयोग किया जाता था, जो नमूने को 10-15 एस में >95 डिग्री सेल्सियस तक तपता है। उत्पादित नमूनों पर अब तक प्रतिकूल प्रभाव नहीं देखा गया है। कुछ स्ट्रगल एक मामूली दूसरा बैंड दिखाते हैं जिसे प्रतिक्रिया शर्तों(चित्रा 3 ए,लेन 4) के अनुकूलन से समाप्त नहीं किया जा सकता है। आमतौर पर ये एचपीएलसी क्रोमाटोग्राम में कंधे के रूप में स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं, यदि एक अच्छी तरह से अनुकूलित एल्यूशन ढाल का उपयोग किया जाता है, और इसे हटाया जा सकता है (चरण 2.2.5)। निम्नलिखित चर्चा का उद्देश्य प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों को उजागर करना है, विशेष रूप से उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के संबंध में जो अनुरूप गतिशीलता की व्याख्या की अनुमति देते हैं।

RNase संदूषण
बाहुलर RNases सर्वव्यापी, अत्यधिक स्थिर हैं, और एनएमआर नमूनों की दीर्घकालिक स्थिरता के लिए सबसे बड़ा खतरा पैदा करते हैं । इसलिए, आरएनएएस-मुक्त वातावरण में काम करना और सभी अभिकर् थों और प्लास्टिकवेयर आरएनएसई-मुक्त रखना महत्वपूर्ण है। फ़िल्टर सुझावों का उपयोग और शायद फेसमास्क की भी सिफारिश की जाती है। एचपीएलसी शुद्धिकरण के बाद यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। आरएनएस से दूषित एनएमआर नमूने आमतौर पर एकल-न्यूक्लियोटाइड क्षरण उत्पादों के कारण दिनों या हफ्तों के बाद 1एच-1डी स्पेक्ट्रा में दिखाई देने वाली संकीर्ण चोटियों को प्रदर्शित करते हैं। इस तरह के एक नमूना आर1 माप के लिए उपयुक्त नहीं है।

एनएमआर नमूना
अपनी अत्यधिक आवेशित प्रकृति के कारण, आरएनए का उपयोग अधिकांश प्रोटीन की तुलना में वर्षा के बिना उच्च सांद्रता में किया जा सकता है। शिगेमी एनएमआर ट्यूबों का उपयोग (सामग्री की तालिकादेखें) लाभप्रद है क्योंकि वे कुंडली के केंद्र में अत्यधिक केंद्रित नमूने को केंद्रित करने की अनुमति देते हैं, जबकि अभी भी संवेदनशीलता से मेल खाने वाले ग्लास बॉटम और प्लंजर के कारण आदर्श शिमिंग और लॉकिंग की स्थिति प्रदान करते हैं। इस तरह, B1-inhomogeneity कम हो जाती है, जिससे संकरी रेखाओं को जन्म देता है। एनएमआर ट्यूब में विशिष्ट नमूना मात्रा 250 माइक्रोन है, और विशिष्ट एकाग्रता 1-2 mM है। आरडी प्रयोगों के लिए 500 माइक्रोनएम से नीचे के नमूनों की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि प्रयोग में बहुत लंबा और एक अच्छा शिम लगेगा। इसी तरह, 200 माइक्रोन से नीचे के नमूने की मात्रा की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि एक अच्छी शिम और फील्ड स्थिरता (लॉक) की आवश्यकता होती है। प्लंजर डालते समय, नमूने में बुलबुले के गठन से बचने के लिए महत्वपूर्ण है (चरण 2.4.5)। यदि ठीक से तय नहीं किया जाता है, तो प्लंजर नमूने में नीचे स्लाइड कर सकता है, जिससे पता लगाने योग्य मात्रा कम हो सकती है। इसके अलावा, तापमान में तेजी से परिवर्तन नमूने में नए बुलबुले के गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इसलिए, नमूना परिवहन करते समय और एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में जांच तापमान को बदलते समय देखभाल की जानी चाहिए। लंबी अवधि के बाद फिर से मापने पर बुलबुले के लिए नमूने की जांच करें।

आरएनए फोल्डिंग
गतिशील आरएनए अणु कई संरचनाओं में मौजूद हो सकते हैं जब ठीक से मुड़ा नहीं जा सकता है। हालांकि माध्यमिक संरचनाओं के पिघलने के तापमान केवल कमरे के तापमान से थोड़ा ऊपर हो सकता है, एक पूरी तरह से हीटिंग और स्नैप-कूलिंग प्रक्रिया माप से पहले की सिफारिश की है । गतिज नियंत्रण (हीटिंग-एंड-स्नैप-कूलिंग) के तहत तह किए जाने वाले अत्यधिक केंद्रित हेयरपिन नमूने समय के साथ होमोसिडमर बना सकते हैं, जो प्रत्येक एनएमआर माप से पहले आरएनए तह के कठोर नियंत्रण की आवश्यकता होती है। यदि मापा गया आरएनए हेयरपिन संरचना नहीं है बल्कि आरएनए डुप्लेक्स है, तो थर्मोडायनामिक नियंत्रण के तहत धीमी गति से तह लागू किया जाना चाहिए।

इस मामले में, हीटिंग के बाद ठंडा करने की प्रक्रिया घंटों की सीमा में होनी चाहिए, जबकि आरएनए का उपयोग एनएमआर नमूने में अपनी अंतिम मात्रा और एकाग्रता पर किया जाता है। अपेक्षित इमिनो और सुगंधित अनुनदों की प्रारंभिक गणना नमूने की एकरूपता के बारे में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है। यदि नमूना अपेक्षा की तरह नहीं दिखता है, तो इसे फिर से मोड़ा जाना चाहिए। एमजी2 + (क्लोराइड नमक के रूप में जोड़ा गया) आरएनए संरचनाओं45को तह करने में मदद कर सकता है। व्यवहार में, तह नियंत्रण एक नमूने की तुलना में कार्य करता है जिसका उपयोग कम से कम आंशिक रूप से एनएमआर अनुनाद करने और माध्यमिक संरचना को प्रायोगिक रूप से हल करने के लिए किया गया है।

स्पिन लॉक पावर और हीटिंग विचार
2D अवलोकन प्रयोगों के रूप में 1एच आर1 1 1 1 ο RD प्रयोगों को चलाने के मामले में, एसएल पावर 1.2 kHz से कम नहीं होनी चाहिए। रेडियोफ्रीक्वेंसी ट्रांसमीटर आवृत्ति को ब्याज की चोटियों के पीपीएम क्षेत्र के बीच में रखा जाना चाहिए(उदाहरण केलिए, सुगंधित प्रोटॉन के लिए 7.5 पीपीएम)। इसके बाद 1.2 kHz की बैंडविड्थ इन प्रोटॉन को बिना किसी बड़े ऑफ-रेथन इफेक्ट के स्पिन-लॉक करने के लिए काफी बड़ी होगी। आरडी प्रोफाइल में ऐसे प्रभावों की पहचान की जा सकती है। यदि वे होते हैं, तो आर2+आरEX मूल्यों में वृद्धि के बजाय एसएल पावर मूल्यों में वृद्धि होती है, विशेष रूप से कम एसएल पावर के लिए। जांच करें कि गणना की गई एसएल पावर मान नमूने को दी गई शक्ति के अनुरूप हैं या नहीं। व्यवहार में, गणना एसएल पावर का उपयोग किया जा सकता है यदि 1एच 90 ° हार्ड पल्स को नए स्पेक्ट्रोमीटर पर सावधानीपूर्वक कैलिब्रेट किया गया था; हालांकि, प्रत्येक वांछित बैंडविड्थ के लिए एसएल पावर को कैलिब्रेट करके इसकी जांच की जा सकती है।

एसएलपावर की रेंज, जिसका उपयोग 1 एच आर1 एक्स आरडी प्रयोगों में किया जा सकता है, बहुत व्यापक है, जिससे एचसीपी-आधारित दृश्यों के लिए एचएसक्यूसी के लिए अलग-अलग नमूना हीटिंग (1.2 किलो हर्ट्ज से 15 किलोहर्ट्ज और SELOPE प्रयोगों के लिए 50 हर्ट्ज से 15 किलोहर्ट) होता है। कम शक्ति एसएलएस बनामके लिए प्राप्त 1Ds की तुलना करते समय रासायनिक बदलाव में मामूली परिवर्तन के रूप में असमान नमूना हीटिंग का पता लगाया जा सकता है। हाई पावर एसएलएस। यह प्रभाव आमतौर पर हेट्रोन्यूक्लिनी पर आर1ο प्रयोगों में गर्मी के मुआवजे में नहीं माना जाता है। उन प्रयोगों में गर्मी मुआवजा आमतौर पर प्रत्येक स्पिन लॉक पावर श्रृंखला की वीडी सूची में निर्दिष्ट विभिन्न स्पिन लॉक अवधियों के कारण विभिन्न हीटिंग के लिए सही करने के लिए स्थापित किया जाता है। विशेष रूप से SELOPE प्रयोग के लिए, एक दूसरी गर्मी मुआवजा सभी लागू SL ताकत भर में इस्तेमाल किया जाना चाहिए के रूप में20में वर्णित है ।

वीडी सूची के विचार
जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, वीडी सूची में तीव्रता का एक महत्वपूर्ण क्षय प्राप्त करने के लिए पर्याप्त समय बिंदु होना चाहिए (आदर्श रूप से प्रारंभिक संकेत का 30% तक नीचे, या जांच के विनिर्देशों के भीतर 70% क्षय तक पहुंचना संभव नहीं है)। हालांकि वीडी सूची को कम एसएल पावर (1.2 किलोहर्ट्ज) के लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन इस वीडी सूची का उपयोग किए जाने वाले उच्चतम एसएल पावर(जैसे,15 किलोहर्ट्ज) पर भी किया जाना चाहिए। यह इस तथ्य के कारण है, कि महत्वपूर्ण आरएक्स योगदान के साथ चोटियों के लिए, क्षय उच्च SL शक्ति पर बहुत धीमी हो जाएगी। इसलिए उच्च एसएल पावर पर पर्याप्त क्षय का सत्यापन भी किया जाना चाहिए। ऑफ-प्रतिध्वनि प्रयोगों में उच्च ऑफसेट पर क्षय के लिए समान रूप से विचार किया जाना चाहिए। वीडी सूची का आदर्श अधिकतम समय बिंदु फैलाव प्रयोग के विभिन्न क्षेत्रों के लिए काफी अलग हो सकता है। उस मामले में, अधिक अंक वीडी सूची में शामिल किया जा सकता है, और उच्च SL शक्ति या विश्लेषण के दौरान उच्च ऑफसेट के लिए अब vd सूची अंक, कम SINO वे नेतृत्व करेंगे के आधार पर, खारिज किया जा सकता है । सामान्य तौर पर, 5-8 वीडी सूची बिंदुओं को संभावित कलाकृतियों को हाजिर करने में सक्षम माना जाना चाहिए जिससे जे-कपलिंग (नीचे देखें) जैसे गैर-घातीय क्षय होते हैं।

1D-एचसीपी चयनशीलता विचार
यदि 2डी एचएसक्यूसी-आधारित प्रयोग के 1 एच आयाम में रुचि के शिखर के साथ एक और चोटी ओवरलैपिंग है तो एचसीपी-आधारित 1Dसंस्करण चलाते समय विशेष सावधानी बरती जानी चाहिए। एचसीपी-आधारित स्थानान्तरण बहुत हैं, लेकिन कभी भी 100% चयनात्मक नहीं हैं, और इसलिए ऐसा हो सकता है कि एक और चोटी 1D में ब्याज के चरम की तीव्रता और क्षय व्यवहार में योगदान देती है। इसके लिए एक संकेत लेबल किए गए प्रयोग के1D और 2D संस्करणों का उपयोग करके प्राप्त ऑन-प्रतिध्वनि आर1οο मानों में अंतर होगा।

आरओई विचार:
धीमी गति से मध्यवर्ती विनिमय के साथ परमाणुओं की ऑफ-प्रतिध्वनि घटता के लिए, आरओई कलाकृतियों की पहचान एनओईएसवाई या आरओसीवाई स्पेक्ट्रम के साथ प्राप्त ω की तुलना के आधार पर की जा सकती है। यदि एक क्रॉस पीक की पहचान एक रासायनिक बदलाव अंतर पर की जा सकती है,तो मनाया गया उत्तेजित राज्य वास्तव में एक आरओई विरूपण साक्ष्य हो सकता है(उदाहरण के लिए,आरओई सुगंधित प्रोटॉन के बीच पाए गए थे, जो सभी एक ही रासायनिक बदलाव सीमा में हैं और इसलिए उन ऑफ-प्रतिध्वनि घटता20द्वारा कवर किए गए हैं)। अनुभव से, यह हमेशा बड़ी त्रुटियों के साथ गरीब फिट बैठता है, संभवतः आरओई के कारण एसएल पावर बढ़ाने के साथ आरएक्स के समान पैटर्न का पालन नहीं करता है। इंटरमीडिएट-फास्ट एक्सचेंज के लिए स्थिति और कठिन हो जाती है । जबकि ऑन-प्रतिध्वनि वक्र (पड़ोसी नाभिक पर प्राप्त 13सी डेटा के साथ तुलना से) अभी भी जीएस और ईएस के बीच विनिमय प्रक्रिया का प्रतिनिधि है, ऑफ-प्रतिध्वनि वक्र कई आरओई कलाकृतियों से प्रभावित है।

उस मामले में, विनिमय प्रक्रिया का पता लगाने के लिए SL शक्ति बड़ा है (>१.५ kHz) और इसलिए ऑफ-प्रतिध्वनि घटता विभिन्न आरओई उम्मीदवारों के रासायनिक बदलाव मतभेदों पर अवधि के रूप में प्रोटॉन की एक बड़ी संख्या में फैला है (एच8 के लिए ये होंगे: सीए में अमीनो प्रोटॉन। ±1000 हर्ट्ज, एच5/एच1 सीए में है। -1200 हर्ट्ज, सीए में इमिनो प्रोटॉन। 3500 हर्ट्ज) । अब तक, इन आरओई कलाकृतियों (आंशिक रूप से deuterated न्यूक्लियोटाइड्स46का उपयोग करने के अलावा) को दबाने के लिए कोई विधि नहीं पाई गई है, और फास्ट-इंटरमीडिएट एक्सचेंज के लिए ऑफ-रेथेंस डेटा दर्ज नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि वास्तविक ω पर कोई विश्वसनीय जानकारी इस विधि के साथ निकाली जा सकती है, यदि NOE/आरओई योगदान को NOESY स्पेक्ट्रा के माध्यम से बाहर नहीं रखा जा सकता है।

जे-कपलिंग (हार्टमैन-हान) विचार
यद्यपि एच 6 जैसे होमोन्यूक्लियर जे-युग्मित प्रोटॉन के लिए ऑन-प्रतिध्वनि घटता है, सफलतापूर्वक10, 20दर्ज किए गए थे, विशेष सावधानी को ऑफ-प्रतिध्वनि मापन के लिए लिया जाना चाहिए, विशेष रूप से कम एसएल पावर के लिए हार्टमैन-हान मिलान की स्थिति जांच ऑफसेट की एक विस्तृत श्रृंखला का विस्तार कर सकती है। हार्टमैन-हान कलाकृतियों को घातीय क्षय पर दोलनों के रूप में पहचाना जा सकता है या ऑन-प्रतिध्वनिआरडीभूखंडों 20में SL ताकत बढ़ाने के साथ आर2+आरEX मूल्यों में वृद्धि की जा सकती है।

Disclosures

के.पी. Arrakis चिकित्सा विज्ञान, एक कंपनी है कि आरएनए को लक्षित छोटे अणुओं का पता चलता है के लिए सलाहकार है ।

Acknowledgments

हम अभिव्यक्ति और T7 आरएनए बहुलक और ई. कोलाई RNase एच, मार्टिन Hällberg के अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण के लिए कारोलिंस्का संस्थान में प्रोटीन विज्ञान सुविधा (PSF) अकार्बनिक फॉस्फेट के उदार उपहार के लिए धन्यवाद, और मूल्यवान चर्चाओं के लिए पूरे Petzoldlab। हम यू-उभार निर्माण और एमिली स्टेनर और कैरोलिना फोंटाना को मैक्रो और फिटिंग स्क्रिप्ट में उनके योगदान के लिए तैयार करने के लिए लुका रेटटिनो का शुक्रिया अदा करते हैं। हम कारोलिंस्का संस्थान और मेडिकल बायोकेमिस्ट्री और बायोफिजिक्स विभाग को 600 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रोमीटर और स्थिति वित्तपोषण (KI FoAss और KID 2-3707/2013) की खरीद के समर्थन के लिए स्वीकार करते हैं। हम Vetenskapsrådet (#2014-4303), Stiftelsen för रणनीति Forskning (ICA14-0023 और FFL15-0178) और रागनार Söderberg Stiftelse (M91-14), Harald Etoch Gretason Stiftelse () से वित्तीय योगदान के लिए आभारी हैं JS20140009), कार्ल ट्रिगर्स स्टिफल्स (सीटीएस14-383 और 15-383), ईवा ओच ऑस्कर एहरेन्स स्टिफल्स, Åke Wiberg Stiftelse (467080968 और M14-0109), Cancerfonden (CAN 2015/388), J.S. मैरी स्क्लोडोवस्का-क्यूरी आईएफ (ईयू H2020) के माध्यम से धन को स्वीकार करता है, एमएससीए- आईएफ प्रोजेक्ट नंबर 747446)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40% Acrylamide/Bis Solution  Bio-Rad  161-0144
5-alpha Competent E. coli NEB C2987I
Acetic Acid  Sigma-Aldrich 49199
Acetonitrile  Sigma-Aldrich 34851
AFC-3000, HPLC Fraction collector  Thermo Scientific 5702.1
Agarose  Sigma-Aldrich  A9414
Amersham ImageQuant 800 UV GE Healthcare 29399482 Replacing LAS-4000 or equivalent
Amicon ultra centrifugal filter unit  Sigma-Aldrich  UFC900324
Ammonium persulfate  Sigma-Aldrich  A3678
Ampicillin  Sigma-Aldrich  A9518
ATP  Sigma-Aldrich  A2383
ATP-13C10/15N5  Sigma-Aldrich 645702
BamHI restriction enzyme NEB  R0136L
Bottle top filter  VWR  514-1019
Bromophenol Blue  Sigma-Aldrich 1081220005
Cleavage guide IDT N/A or equivalent
CTP  Sigma-Aldrich  C1506
CTP-13C10/15N5  Sigma-Aldrich 645699
D2O  Sigma-Aldrich 151882
Dionex Ultimate 3000 UHPLC system  Thermo Scientific N/A
DL-Dithiotreitol  Sigma-Aldrich 43815
DMSO  Sigma-Aldrich  D8418
DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep column  Thermo Scientific SP6734
DNAPac PA200 22x50 guard column  Thermo Scientific SP6731
E.coli RNase H  NEB  M0297L  or made in-house uniprot ref. P0A7Y4 
EDTA  Sigma-Aldrich  E6758
Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44 Eppendorf  5804R
Ethanol 95%  Fisher scientific 11574139
Ethanol 95% denatured  VWR 85829.29
Formamide  Sigma-Aldrich 47671
GelRed  VWR 41003
GeneRuler 1kbp Plus  Fisher Scientific  SM1333 Optional
GMP  Sigma-Aldrich  G8377
GMP-13C10/15N5  Sigma-Aldrich 650684
GTP  Sigma-Aldrich  G8877
GTP-13C10/15N5  Sigma-Aldrich 645680
Hydrochloric Acid  Sigma-Aldrich  H1758
Inorganic pyrophosphatase  Sigma-Aldrich  I1643-100UN  or made in-house uniprot ref. P0A7A9
Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer  Sigma-Aldrich  T4415
Julabo TW8 Water bath  VWR 461-3117
kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis VWR 700-0056 or comparable
LB broth (Lennox)  Sigma-Aldrich  L3022
LB broth with agar (Lennox)  Sigma-Aldrich  L2897
Low Range ssRNA Ladder  NEB  N0364S Optional
LPG-3400RS Pump  Thermo Scientific 5040.0036
Magnesium chloride hexahydrate  Sigma-Aldrich 63068
microRNA Marker  NEB N2102S
Microwave oven  Samsung  MS23F301EAW
Mini-PROTEAN electrophoresis equipment  Bio-Rad 1658004
NucleoBond Xtra Maxi  Machinery-Nagel  740414.10M
pUC19 plasmid containing tandem insert  Genscript  N/A or equivalent
RNaseZAP  Sigma-Aldrich  R2020
Shigemi tube 5mm  Sigma-Aldrich Z529427
Single-use syringe, Luer lock tip VWR 613-2008
Sodium acetate  Sigma-Aldrich  S2889
Sodium chloride  Sigma-Aldrich  730-1470
Sodium perchlorate  Sigma-Aldrich 71853
Sodium phosphate dibasic  Sigma-Aldrich  S3264
Sodium phosphate monobasic  Sigma-Aldrich  S3139
Spermidine trihydrochloride  Sigma-Aldrich 85578
SYBR Gold  ThermoFisher  S11494
Syringe filters VWR 514-0061
T7 RNA polymerase  Sigma-Aldrich 10881767001  or made in-house uniprot ref. P00573
TCC-3000RS Column thermostat  Thermo Scientific 5730
Tetramethylethylenediamine  Sigma-Aldrich T9281
Tris Base  Fisher Scientific 10103203
UMP  Sigma-Aldrich U6375
UMP-13C9/15N2  Sigma-Aldrich 651370
Urea  Sigma-Aldrich U5378
UTP  Sigma-Aldrich U6625
UTP-13C10/15N5  Sigma-Aldrich 645672
VWD-3100 Detector  Thermo Scientific 5074.0005

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References

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Feyrer, H., Schlagnitweit, J., Petzold, K. Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ρ Relaxation Dispersion Experiments of RNA. J. Vis. Exp. (173), e62470, doi:10.3791/62470 (2021).

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