Summary
Vi presenterar ett protokoll för att mäta mikro- till millisekekunder dynamik på 13C /15N-märkta och omärkta RNA med 1H R1ρ avslappning dispersion kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Fokus för detta protokoll ligger i hög renhetsprovberedning och installation av NMR-experiment.
Abstract
RNA är en mycket flexibel biomolekyl, där förändringar i strukturer spelar avgörande roller i de funktioner som RNA-molekyler utför som cellulära budbärare och modulatorer. Medan dessa dynamiska tillstånd förblir dolda för de flesta strukturella metoder, R1ρ avslappning dispersion (RD) spektroskopi gör det möjligt att studera konformationsdynamik i mikro-till millisekunder regim vid atomupplösning. Användningen av 1H som observerad kärna utökar ytterligare den tidsordning som omfattas och ger direkt tillgång till vätebindningar och basparning.
De utmanande stegen i en sådan studie är hög renhet och hög avkastning provberedning, potentiellt 13C- och 15N-märkta, samt installation av experiment och montering av data för att extrahera befolkning, växelkurs och sekundär struktur i det tidigare osynliga tillståndet. Detta protokoll ger viktiga praktiska steg i provberedning för att säkerställa beredning av ett lämpligt RNA-prov och installation av 1H R1ρ experiment med både isotopiskt märkta och omärkta RNA-prover.
Introduction
RNAs utför en mängdreglerande 1,katalytiska2, och strukturella3 funktioner i cellen, varav många är korrelerade till en flexibel molekylär struktur och invecklade förändringar av dessa strukturer4,5,6,7. Lågbefolkade tillstånd förblir osynliga för de flesta metoder för strukturbestämning eller tillåter inte studier av dessa dolda tillstånd med hög atomupplösning. Lösningstillstånd kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR) kombinerar båda aspekterna genom att ge tillgång till enskilda atomkärnor samt erbjuda en stor verktygslåda med experiment som riktar sig mot dynamik genom alla tidsregimer8. RD NMR-experiment ger tillgång till konformationsutbyte i mellantidsskalan, där förändringar i basparningsmönster och lokala strukturella omorganiseringar kan förväntas5,9,10,11,12,13,14. RD-experiment utförs som långa R2-mätningar i form av ett Carr-Purcell-Meiboom-Gill pulståg15 eller som avslappningsmätningar i den roterande ramen, kallade R1ρ RD-experiment16.
Även om båda kan användas för att extrahera population av och växelkurs och kemisk skiftskillnad till det mindre tillståndet, ger R1ρ RD-experiment också tecknet på den kemiska skiftskillnaden i det upphetsade tillståndet. Detta möjliggör en slutsats om sekundär struktur, vilket starkt korrelerar till kemisk förändring i RNA-strukturer17. Det kemiska skiftet är en bra indikator på helicitet när det gäller aromatiska protoner och kol på kärnkärnorna, basparningspartners för iminoprotoner och sockerpuckers på C4' och C1' atomer18,19. Det bör noteras att nyligen ett experiment för överföring av kemiska utbytesmättnad (CEST) med högre spinnlåskraft (SL), vilket flyttade tillämpligheten av CEST-experimentet till snabbare växelkurstidsskalor, publicerades som ett alternativ till R1ρ RD-experimentet för system med ett upphetsad tillstånd.
Även om 13C och 15N isotoper ofta har använts för att få tillgång till strukturellt utbyte, använde nyligen arbete från detta laboratorium aromatiska och imino protoner som sonder för konformationsutbyte9,10. Användningen av 1H som observerad kärna ger flera fördelar, till exempel tillgång till utbyte på snabbare och långsammare tidsskalor, högre känslighet och kortare mättider. Detta underlättas ytterligare av SELective Optimized Proton Experiment (SELOPE) strategi, ger tillgång till aromatiska protoner genom dekrowding av det endimensionella (1D) spektrumet med hjälp av homonukleära skalär kopplingar, istället för en heteronukleär magnetisering överföring, och eliminera behovet av isotop etiketter20. Detta protokoll behandlar mätningen i 1H R1ρ RD-experiment med enhetliga 13C/15N-märkta och omärkta prover. Därför presenterar detta dokument en provberedningsmetod som konstaterades vara den mest mångsidiga för olika provberedningsbehov21 och diskuterar alternativ i det sista avsnittet i denna artikel (figur 1).
Vid denna tidpunkt bör läsaren notera att andra provberedningsmetoder är godtagbara för 1H R1ρ RD-experiment och att andra metoder för strukturell och funktionell analys kan utföras med proverna syntetiserade med den presenterade tekniken. 1 (på 1) H R1ρ RD-experiment kräver höga RNA-koncentrationer (helst >1 mM) samt hög homogenitet, både i RNA-längd och strukturell konformation för att säkerställa tillförlitlig karakterisering av molekylär dynamik. In vitro-transkription (IVT) är den metod som många forskare väljer för att producera 13C/15N-märkta RNA-prover på grund av tillgången på märkta nukleosid triphosphates (NTPs) och underlätta införlivande i den enzymatiska reaktionen22. Emellertid lider den allmänt använda T7 RNA-polymerasen (T7RNAP)23,24,25 från låg 5' homogenitet vid vissa initieringssekvenser26,27 och ofta också 3' homogenitet under transkriptionavrinning 28. Rening av mål RNA-arten blir dyrare och mödosam på grund av behovet av stora mängder ~ 200 nmol. Metoden som används här har presenterats tidigare där fördelar diskuterades i stort21. Kort sagt löser det beskrivna problem genom att transkribera en större tandemavskrift som sedan specifikt klyvs av Escherichia coli RNase H, vägledd av en chimerisk oligonukleotid29,30 (se figur 2 för detaljer).
Införlivande av en distanssekvens i tandemavskriftens ändar på 5' respektive 3" gör det möjligt att använda en initieringssekvens med hög avkastning och avlägsnande av terminalöverhäng nära linjäriseringsplatsen för plasmidmallen (figur 2B). Metoden visade sig förbättra avkastningen avsevärt, samtidigt som kostnaderna och arbetet minskade, med förbehållet för en mer komplex mallsyntes och behovet av ett ytterligare enzym och oligonukleotid. Den höga specificiteten hos RNase H klyvning underlättar rening på grund av bristen på RNA arter i ett liknande storleksintervall. Det nuvarande protokollet använder ett jonutbyte högpresterande vätskekromatografi (HPLC) steg som har publicerats av detta laboratorium nyligen31, även om andra metoder är möjliga alternativ. 1 (på 1) H R1ρ RD kan i allmänhet förvärvas på märkta eller omärkta prover med två respektive pulssekvenser, det "märkta" 1H R1ρ heteronukleära enskilda kvantkorrelationsprovet (HSQC)-baserat experiment med en indirekt dimension på 13C10 och det "omärkta" 1H R1ρ SELOPE-baserade experimentet med en indirekt dimension20på 1H.
Dessa tvådimensionella (2D) experiment kan fungera som en första kontroll, oavsett om dynamiken på R1ρ-tidsskalan finns i provet. En översikt över rd för alla lösta toppar i spektra kan erhållas, och toppar av intresse för en mer grundlig RD-analys kan identifieras. Detta innebär att även omärkta prover kan kontrolleras innan ett beslut om att ta fram ett dyrare, märkt prov görs. När en topp med konformationsutbytesbidrag har valts ut för att studeras mer noggrant är det bäst att byta till 1D-versionerna av ovanstående experiment (om toppen fortfarande kan lösas) för att utföra så kallade off-resonansexperiment. För den märkta versionen HSQC-överföringen till 13C ersätts med ett selektivt heteronukleärt korspolariseringssteg (HCP) som används i 13C R1ρ experiment32,33,34,35, medan experimentet i fallet med SELOPE-experimentet helt enkelt körs som en 1D, vilket är särskilt användbart för H8- och H2-signaler som ligger på diagonalen i 2D ändå. Ett kriterium för vilken sekvens som ska användas, förutsatt att både ett märkt och omärkt prov finns tillgängligt, är hur väl isolerad toppen av intresset är i de två experimenten.
I allmänhet rekommenderas SELOPE-experimentet för RNA-prover på upp till 50 nukleotider. För större RNAs kommer överlappningen att vara större; Strukturellt intressanta nukleotider förekommer dock ofta i kemiska skiftregioner som är mindre överlappande och fortfarande kan vara tillgängliga i ännu större RNAs. Ett annat argument skulle vara att i omärkta prover sker ingen J-koppling mellan 1H och 12C. Eftersom minsta spinnlåseffekt definieras av den minsta effekt som används för att frikoppla dessa två spinn (~1 kHz) i det märkta experimentet, tillåter det omärkta experimentet användningen av ett bredare utbud av spinnlås (SL) styrkor och därmed tillgång till en bredare tidsskala för utbyte. Dessa off-resonans experiment ger ytterligare information till kex, såsom populationen av det upphetsade tillståndet (alternativ konformator), pES, liksom mycket värdefull kemisk skiftinformation i form av Δω (den kemiska skiftskillnaden mellan marktillståndet och det upphetsade tillståndet).
Figur 1: Arbetsflöde för det presenterade protokollet. Förberedelse före den faktiska storskaliga provproduktionen, bestående av mallberedning och bekräftelse av framgångsrik in vitro-transkription och RNase H-klyvning. Storskalig produktion inklusive HPLC-rening, fyllning av NMR-rör och bekräftelse av RNA-vikning. Vid isotopmärkt syntes bör en omärkt rening utföras för gradientoptimering samma dag. NMR karakterisering av konformationsdynamik med R1ρ experiment. Varje steg kan utföras självständigt, t.ex. 1H R1ρ RD-analysen kan tillämpas på alla lämpliga RNA-prov som produceras med en annan metod. Förkortningar: IVT = in vitro-transkription; HPLC = högpresterande vätskekromatografi; NMR = kärnmagnetisk resonans; RD = avslappningsspridning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Syftet med detta protokoll är att ge praktiska detaljer och kritiska parametrar för studier av konformationsdynamik med 1H R1ρ avslappningsdispersion i RNA-hårnålsmolekyler. Efter att ha tillhandahållit ett detaljerat protokoll över design, syntes och jonutbyte HPLC-rening av ett mål-RNA som kan utföras med alla, vissa eller inga NTPs som 13C /15N-märkta versioner, har arbetsflödet för att slutföra NMR-provet och bekräfta konformationsutbytet med NMR-spektroskopi beskrivits. Slutligen beskrivs detaljerna för installationen av 1H R1ρ RD-experiment på en Bruker NMR-spektrometer (figur 1). Protokollet ger varje steg för att ställa in 1D-versionen för märkta prover och ytterligare kommentarer och en tabell för att justera för inställningen av SELOPE-versionen (tabell 2). Efter protokollet diskuteras kritiska steg och alternativa vägar till prov förberedelse och 1H R1ρ RD setup.
Protocol
Figur 2: Schematisk representation av det rapporterade tandem IVT-protokollet. (A) Tandem transkription från en linjäriserad plasmid mall med T7RNAP (vänster) och successiva klyvning av RNAse H av avskriften för att uppnå mållängd RNA, regisserad av en chimeric DNA guide (höger). (B) Detaljerad schematisk av tandemmallen som börjar med den virala T7RNAP-promotorn, en initieringssekvens. Målsekvensen (mörkblå, exemplet här är 20 nt långt) upprepas "n" gånger. Repetitionerna flankeras av en 5′ respektive 3′ distanssekvens bestående av de sista åtta respektive de fyra första nukleotiderna för att möjliggöra avlägsnande av initierings- och begränsningssekvenserna från den första och sista upprepningsenheten. (C) Hybridisering av tandemavskriften (röd) och de chimeriska klyvningsguiderna (gröna). RNase H klyver RNA mittemot DNA 5′ änden. 2′-OMe RNA flanker ökar specificitet genom att förbättra den bindande affiniteten av klyvningsguide till mål-RNA. Denna siffra har ändrats från 21. Förkortningar: T7RNAP = T7 RNA-polymeras. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
1. Förbereda arbetet för en ny RNA-konstruktion
- Plasmid design och förberedelse
- Skriv mallsekvensen i ett kloningsverktyg, t.ex.seriell klonare.
- Ta T7-promotorsekvensen och lägg till en hög avkastningsinitieringssekvens (T7: 5 '-TAATACGACTCACTATA ^GGGAGA-3').
OBS: Transkriptionen börjar vid den nukleotid som anges med en vård (^). Initieringssekvensen GGGAGA är variabel, men starkt sekvensberoende; Därför rekommenderas användning av denna sekvens. - Lägg till de sista 8 nukleotiderna (nt) i målsekvensen som en 5' distans (5's).
- Lägg till upprepningar av målsekvensen (TS).
- Tillsätt de första fyra kärnorna som en 3' distans efter repetitionerna (5'S).
- Lägg till en BamHI-begränsningsplats (RS) eller liknande unik begränsningsplats.
OBS: Den totala sekvensen som visas kommer att klonas eller enkelt beställas i en bakteriell högkopiaplasmid(t.ex.pUC19): 5'-T7-5'S-(TS)n-3'S-RS-3' (Figur 2B). Antalet upprepningar bör vara så högt som tillåtet enligt gensyntesen (högst 600 nt i detta protokoll). - Förstärk plasmiden i E. coli med hjälp av ett kommersiellt kit.
- Linjärisera den renade plasmiden vid 20 ng/μL med hjälp av lämplig begränsningsplats. Skalbegränsning smälter med BamHI med upp till 1 ml.
- Rena den smälta plasmiden och bekräfta framgångsrik linjärisering på en 1% agarosgel. Förvara den linjäriserade plasmiden vid -20 °C i flera månader.
- Klyvningsguide design (Figur 2C)
- Skriv de sista åtta nukleotiderna i mål-RNA-sekvensen i riktning mot 5'-3 och lägg till de första fyra nukleotiderna i mål-RNA-sekvensen på 3' änden också i 5'-3' riktning.
- Generera det omvända DNA-komplementet av den sekvensen
- Ändra de första och sista fyra nukleotiderna till deras 2'-OMe-modifieringar genom att lägga till ett "m" före nukleotidbeteckningen.
OBS: För syntes används mU istället för mT. - Beställ oligo med standard avsaltning rening.
OBS: Kontrollera om den genererade oligo kan binda på en annan plats än anslutningen av två RNA-sekvenser. Fullständig komplementaritet i de centrala fyra DNA-nukleotiderna krävs, medan de flankerande regionerna kan tillåta en missmatchning. Om det behövs, utöka flankerna till upp till 18 nt för att generera en unik bindningssekvens36.
- Småskalig IVT
OBS: För RNase-fritt arbete, förbered alla reagenser under sterila och RNase-fria förhållanden. Använd RNase dekontamineringsreagens (se materialförteckningen)och 95 % v/v etanol för rengöring av arbetsytor och pipetter före användning. Tvätta handskar med 95% etanol och använd luddfria långärmade kläder. För att minimera RNase-kontaminering, andas inte över öppna rör.- Förbered lagerlösningar av Tris-Cl (pH 8.0), dithiothreitol, MgCl2,spermidin och NTPs/GMP (obebyggd). Blanda reagenser enligt tabell 1. Förbered en masterblandning av dessa reagenser i förväg, före tillsats av enzymer eller nukleinsyror.
OBS: Om du använder frysta reagenser, blanda dem noggrant efter upptining. Reagenser kan fällas ut om de blandas i för höga koncentrationer, så det rekommenderas starkt att följa ordningen i tabell 1. - Lägg till följande ordning: plasmid, klyvningsguide, oorganiskt fosfatas (IPPase), RNase H, T7RNAP. Eftersom enzymaktiviteten kan variera för enzymer som produceras internt, testa flera koncentrationer innan du väljer den bästa.
OBS: Inkludera en negativ kontroll för klyvningsreaktionen, t.ex. utan RNase H, för att tillskriva ett saknat målband till felaktig RNase H-klyvning och inte till misslyckad transkription. - Inkubera reaktionen vid 37 °C i 1 timme och bekräfta reaktionen på en denaturerande elektrofores av polyakrylamidgel (PAGE) (figur 3A). Späd provet 10 gånger i lastlösning och ladda 1 μL på gelén.
OBS: Gelblandning: 8 M urea, 20% akrylamid (19:1 akrylamid:bisakrylamid) i 1x TBE. Lastlösning: 5 mM etylendiamintetraättikasyra (EDTA), 300 μM bromofenolblått i formamid. RNase H klyvningsreaktioner kan inte förväntas vara kompletta efter 1 h, eftersom nytt RNA produceras ständigt. Se nu upp för ett tydligt målband och frånvaron av en art med liknande molekylvikt (t.ex.±3 nukleotid (nt) produkter).
- Förbered lagerlösningar av Tris-Cl (pH 8.0), dithiothreitol, MgCl2,spermidin och NTPs/GMP (obebyggd). Blanda reagenser enligt tabell 1. Förbered en masterblandning av dessa reagenser i förväg, före tillsats av enzymer eller nukleinsyror.
| Reagens | Lagerkoncentration | Mängd småskalig (μL) |
| H2O | - | 24 |
| Tris | 1 M | 5 |
| MgCl2 | 1 M | 0.5 |
| DTT (DTT) | 1 M | 0.5 |
| Spermidin | 250 mM | 5 |
| GMP (GMP) | 100 mM | 2.5 |
| ATP | 100 mM | 1.5 |
| GTP | 100 mM | 1.5 |
| UTP | 100 mM | 1.5 |
| CTP (ctp) | 100 mM | 1.5 |
| Plasmid | 20 ng/μL | 5 |
| Klyvningsguide | 100 μM | 10 |
| iPPase (på iPPase) | 10 mg/ml | 0.5 |
| RNase H | 10 μg/ml | 2 |
| T7 RNA-polymeras | 5 mg/ml | 2 |
Tabell 1: Reagensbord för tandem IVT och samtidig RNase H-klyvning. Lagerkoncentrationerna kan anpassas tillanvändarensbekvämlighet. Om RNase H klyvning måste utföras efter T7 IVT, lägg till klyvningsguide och RNase H efter värmeinaktivering av T7RNAP. Använda mängder skala linjärt med reaktionsskala. Förkortningar: T7RNAP = T7 RNA-polymeras; IVT = in vitro-transkription.
2. NMR-provberedning
- Skala upp reaktionen till önskad volym (vanligtvis 10 ml) och kör reaktionen över natten. Provning för reaktionsavslut nästa dag med en denaturerande PAGE-gel (Figur 3A).
OBS: Ofullständig klyvningsreaktion visas av arter med högre molekylvikt ovanför målbandet.- Om klyvningen inte lyckades eller var fullständig, reanneal RNA och klyvningsguiden i reaktionskärlet genom att värma lösningen i en konventionell mikrovågsugn vid 450 W i 15 s.
- Kyl lösningen långsamt till 37 °C i 40 min. Använd ett värmeblock för volymer under 1 ml. Notera bildandet av nytt fällning.
- Tillsätt mer IPPase och RNase H och inkubera i ytterligare 1-3 h vid 37 °C. Bekräfta att klyvningsreaktionen har slutförts med denatureringssidan.
- När RNase H klyvningsreaktionen är klar, släcka reaktionen genom att lägga till EDTA till 50 mM slutlig koncentration och virvel noggrant.
OBS: Potentiell pyrofosfatutfällning kommer att lösas upp och nytt protein fälls ut. - Filtrera lösningen genom ett 0,2 μm sprutfilter och koncentrera dig till en volym som kan injiceras i ett HPLC-system, beroende på injektionsslingans storlek.
OBS: Protokollet kan pausas här genom att frysa provet vid -20 °C.
- Storskalig HPLC-rening
- Förbered jonbytesbuffertarna A och B inom en vecka efter användning. Filtrera och avgasa buffertarna.
OBS: Buffert A: 20 mM natriumacetat; 20 mM natriumperklorat, pH 6,5. Buffert B: 20 mM natriumacetat; 600 mM natriumperklorat, pH 6,5. - Jämvikta kolonnen med 100 % buffert B följt av 100 % buffert A för minst 2 kolumnvolymer vid 75 °C.
- Förbered HPLC-sekvensen( figur 3B) med en flödeshastighet på 5,5 ml/min. Använd följande sekvens för rening av ett RNA-mått mellan 20 och 30 nt: 0-7 min: 0% B; 7-16 min: lutning 0-20% B; 16-46 min: eluering, vanligtvis med en lutning på 20-30% B (optimera efter behov); 46-62 min: 100% B; 62-73 min: 0% B.
OBS: En förändring i flödeshastigheten från 5,5 till 8 ml/min påverkade inte separationen i detta protokoll. - Optimera elueringsgradienten genom att injektionen av en ekvivalent 1 ml transkriptionsreaktion (omärkt) i taget.
OBS: För mer information och diskussion, se Karlsson et al.31 och Feyrer et al.21. - Testa de insamlade fraktionerna på en denaturerande SIDA. Om den huvudsakliga elueringstoppen är väl isolerad och innehåller det rena mål-RNA, skala upp reningen till motsvarande 10 ml transkriptionsreaktion.
- Samla in bråkdelarna av ränta, koncentrera och byt bufferten mot NMR-buffert. Använd en ultracentrifugalfilterenhet (se materialförteckningen)för volymer över 50 ml.
OBS: NMR-buffert: 15 mM natriumfosfat; 25 mM natriumklorid; 0,1 mM EDTA, pH 6,5. För att minimera förlusten från RNA som följer plaströrväggar, tvätta alla uppsamlingsrör med 1 ml vatten, virvel och centrifuger för att samla all vätska. - Bestäm koncentrationen via ultraviolett spektroskopi. Beräkna reaktionsutbytet enligt Feyrer et al21.
OBS: Koncentrationen av ett NMR-prov för RD-experiment bör inte vara lägre än 130 nmol, vilket motsvarar 500 μM i en provvolym på 250 μL med NMR-rör (Materialförteckning).
- Förbered jonbytesbuffertarna A och B inom en vecka efter användning. Filtrera och avgasa buffertarna.
- Vikning av ett RNA-prov
- Späd och alikvot provet med en volym av ~10 ml i 1 ml per rör.
- Värm RNA-alikvoterna till 95 °C i 5 minuter.
- Snäppa ner proverna genom att placera dem på is eller i en vatten-is-saltblandning och inkubera i 30 minuter.
- Poolprover och koncentrera till ~ 250 μL i en 2 ml centrifugalfilterenhet.
- Fyllning av ett NMR-rör
- Rengör NMR-röret i NMR-rörrengöringsmedel genom att spola med rikligt med vatten, RNase dekontamineringsreagens, vatten, 95% etanol (EtOH) och vatten igen. Låt torka.
- Rengör kolven genom att skölja med vatten och torka med RNase dekontamineringsreagens och 95% EtOH med en luddfri våtservett. Låt torka.
- Tillsätt 10 % (v/v) D2O i NMR-provet.
- Fyll RNA-provet i NMR-röret med en stor pipettspets. Låt vätskan flöda längs sidan av rörväggen.
- Sätt i kolven och ta bort luftbubblor genom att trycka ner kolven tillsammans med en snabb vridande rörelse.
- Dra upp kolven långsamt utan att skapa nya luftbubblor och fixa den med paraffinvaxfilm.
- Bekräfta vikning av NMR.
OBS: Vid denna tidpunkt är det nödvändigt att utföra åtminstone partiell resonans tilldelning för att bekräfta den sekundära strukturen i RNA-provet och att identifiera regioner av intresse för studier av konformationsdynamik. En uttömmande beskrivning på RNA resonans uppdrag skulle överstiga detta protokoll, därför hänvisar vi till väletablerad litteratur viddenna punkt 19,37,38. En elektroforesisk rörelseväxlingsanalys (EMSA) kan vara en användbar indikator på RNA-vikning och fungera som kompletterande data för NMR-experiment.- Jämför följande spektra i provet för vilket 1H R1ρ RD-experiment utförs med det korrekt vikta referensprovet(figur 4): 1H 1D, särskilt iminoregionen 10–15 ppm. Aromatisk 1H,13C-HSQC; 1 (på 1) H,1H-SELOPE (valfritt).
OBS: Ett aromatiskt fingeravtryck är också nödvändigt, även vid överenskommelse mellan iminosignaler, eftersom dimerbildning ofta visar samma eller liknande iminosignaler som en RNA-hårnål. SELOPE-experimentet kan ersätta en 1H,13C-HSQC för aromatisk fingeravtryck, eftersom heteronukleära experiment på omärkta prover är mycket tidskrävande. - Använd UUCG-slingan som fingeravtrycksreferens (om sådan finns).
- Utför denna jämförelse varje gång innan 1H R1ρ RD-experiment registreras.
- Jämför följande spektra i provet för vilket 1H R1ρ RD-experiment utförs med det korrekt vikta referensprovet(figur 4): 1H 1D, särskilt iminoregionen 10–15 ppm. Aromatisk 1H,13C-HSQC; 1 (på 1) H,1H-SELOPE (valfritt).
3. 1H R1ρ Avslappningsspridning–on-resonans (märkt 1D-version)
I stegen nedan beskrivs inställningen av fjärrskrivbordsexperiment för ett märkt exempel med hjälp av 1D-versionen av den HSQC-baserade pulssekvensen för fjärrskrivbord. Följ samma steg för selope-baserade 1D-sekvensen för omärkta prover. En översikt över parameternamn och inställningar för båda fallen visas i tabell 2. Fokus på 1D-versioner beror på att de är mer praktiska för off-resonansmätningar, och installationen av 2D-versionerna av SELOPE- och HSQC-baserade experiment har diskuterats i detalj av Schlagnitweit et al.20 respektive Steiner et al.10.
- Bestäm 1H effekt för en hård 90° puls (P1).
- Alternativ A: Använd kommandot Bruker pulsecal.
- Alternativ B: I ett zg-experiment, bestäm 360° pulsen genom att mäta en nötningskurva vid protonens hårdpulskraftnivå på vattentoppen.
OBS: Pulslängden på 90° är en fjärdedel av den varaktighet då nollsignal observeras (om en fullständig nötningskurva mäts är det den andra nollan; men i praktiken provtas endast regionen runt det förväntade värdet för 360° ).
- Kör en 1H 1D-spektrum zgesgp.f2f3dec med pulslängden bestämd i steg 3.1 för att bekräfta RNA-vikningen före varje R1ρ-mätning.
OBS: Om 1H SL-experiment körs för första gången, kontrollera om den beräknade SL-effekten motsvarar den effekt som levereras till provet genom att kalibrera SL-kraft för varje önskad bandbredd. Detaljerade kalibreringssteg beskrivs i Steiner et al.10. - Skapa en 1H R1ρ för märkt datauppsättning och ange nyckelparametrar.
- Skapa en ny datauppsättning. helst baserat på en 1H-13C aromatisk HSQC-datauppsättning som används på helmärkta RNA-prover för RNA-tilldelning.
OBS: Detta säkerställer att 13C samt 15N ström- och frikopplingskraft redan är inställda. - Ange de allmänna parametrarna enligt den första delen av tabell 2.
- Ange rd-specifika parametrar enligt den andra delen av tabell 2.
- Ställ in 1H SL-effekt på det lägsta värdet (1,2 kHz) för testning.
- Generera en test-vd-lista med endast en post, 0 ms, (för att optimera vd-listan, enligt beskrivningen i steg 3.4), ställ in TDF1 till 1 och uppdatera D30.
- Kör ett testspektrum med dessa inställningar.
- Skapa en ny datauppsättning. helst baserat på en 1H-13C aromatisk HSQC-datauppsättning som används på helmärkta RNA-prover för RNA-tilldelning.
- Optimera vd-listan (lista över SL-längder som ska användas).
- Kör experimentet med en testförteckning (t.ex.sex poster: 0 m, 5 m, 10 m, 20 m, 30 m, 40 m; förvräng dessa värden för att undvika systematiska fel på grund av uppvärmning).
- Uppdatera D30 och TDF1 i enlighet därmed (i det här exemplet D30 = 42m och TDF1 = 6).
- Plot intensitet av toppen kontra SL längd. Identifiera SL-längden med vilken intensiteten på den ursprungliga toppen minskar till 1/3.
- Skapa den slutliga vd-listan som ska användas i experimentet, med beaktande av följande: bestäm den längsta SL-längden enligt beskrivningen i föregående steg; undvika att använda en lista med minskande eller stigande ordning; och lägg till några dubbletter för statistiska studier. Kom ihåg att uppdatera D30 och TDF1 varje gång det sker några ändringar i vd-listan.
OBS: Experimentet körs med olika SL-längder som anges i vd-listan på ett pseudo-2D-sätt. - Välj antalet skanningar så att listans svagaste topp har ett signal-till-brusförhållande (SINO) på minst 10.
OBS: Även om vd-listan var optimerad för en låg SL-effekt (1,2 kHz), bör denna vd-lista också testas med den högstaSL-effektsom ska användas ( t.ex. 15 kHz). Detta beror på att förfallet kommer att vara mycket långsammare vid hög SL-effekt för toppar med betydande kEX-bidrag. Därför bör ett tillräckligt förfall också verifieras vid hög SL-effekt.
| Beskrivning av parameter | Parameternamn i pulssekvens | |
| 1D-märkt | 1D SELOPE (OLIKA) | |
| pulsprogram för on-resonans 1Ds | 1HR1rho_HCP_onres1D.es | 1HR1r_HH_onres1D.js |
| 1 (på 1) H-bärarfrekvenser (ppm) | O1P = vattenresonans i ppm | O1P = kemisk förskjutning av topp av intresse (ppm) |
| CNST28 = kemisk förskjutning av topp av intresse (ppm) | CNST29 = vattenresonans i ppm | |
| 1 (på 1) H hård 90º puls | P1 @ PL1 (enligt kalibrerad i 3.1.1) | P1 @ PL1 (enligt kalibrerad i 3.1.1) |
| Formade pulser och krafter för vattendämpning | P25 = 1000 oss @ sp3 | P12 = 2000 oss @ sp1 |
| - Jag har inte tid med det här. | (excitation skulptering) | |
| 13 (på 13) C bärarfrekvens, on-resonans med 13C kemisk förskjutning av topp av intresse | O2P (på 2P) | – |
| 15 (på 5) N bärarfrekvens, genomsnittlig kemisk förskjutning på 15N för frikoppling (som används vid aromatisk HSQC) | O3P (på alla) | – |
| 13 (på 13) C/15N frikoppling (konfigurerad som i HSQC) | pcpd2, cpd2 | – |
| pcpd3, cpd3 | ||
| HCP-överföring (t.ex. p=1/J @ 100 Hz) | – | |
| puls- och pulsef2-kommandon kan användas för att bestämma krafter från hårda pulser | ||
| Varaktighet (inställd på 1/J(1H-13C) av topp av intresse) | P11 (på andra) | |
| Effekt 1H och ström på 13C | SP1, SP12 | |
| SELOPE överföring (d = 1/4J(H5-H6)) | – | D5 (D5) |
| Selektiv puls (t.ex. aromatisk region) för SELOPE (4000 us, Eburp) | – | P13 & SP4 |
| SL/ RD-specifika parametrar: | ||
| 1 (på 1) H SL-effekt, erhållen från kalibrerad hård puls (t.ex. med hjälp av pulskommandot). | Pl25 & CNST12 (1,2 – 15 kHz) | Pl24 (50 Hz – 15 kHz) |
| Variabel fördröjningslista för SL-varaktighet (initialt 1 post, 0, optimering beskriven under 3.1.3) | vdlist (~ 0 – 40 ms) | vdlist (~ 0 – 150 ms på grund av det låga R2 i omärkta prover) |
| TDF1 antal poster i vd-listan (inledningsvis 1) | TDF1 (på 1997) | TDF1 (på 1997) |
| Värmekompensation: | ||
| D30 = största värdet i vd-listan + 2ms | D30 (på 10) | D30 (på 10) |
| Ytterligare värmekompensation för mycket brett spektrum av SLs | PL25 (på 1000) | |
| Särskilda parametrar utanför resonans: | ||
| pulsprogram för off-resonans 1Ds | 1HR1rho_HCP_offres1D.es | 1HR1r_HH_offres1D.js |
| Offset för off-resonans experiment | CNST30 (på andra) | CNST30 (på andra) |
Tabell 2: Översikt över parametrar för att ställa in 1D HCP-baserade och 1D-SELOPE-baserade 1H R1ρ experiment. Förkortningar: 1D = endimensionell; HCP = heteronukleär korspolarisering; SELOPE = SELective Optimerat Proton experiment; ppm = delar per miljon; HSQC= heteronukleär spinn kvantkorrelation; SL = spinnlås; RD = avslappningsspridning
- Inrättande och förvärv av on-resonans 1H R1ρ experiment
- Kopiera experimentet från avsnitt 3.4 till en ny mapp i Topspin.
- I den här mappen ställer du in experiment med olika SL-styrkor, varje gång du ändrar PL25 och CNST12. Bestäm rätt effektnivå för varje SL-styrka med hjälp av pulskommandot. Använd SL-styrkor från 1,2 till 15 kHz, med tätare provtagning för lägre SL-styrkor (se figur 5G för utvalda SL-styrkor). Lägg till kopior av några av experimenten för att ha dubbletter för några av SL-styrkorna.
- Kör experimenten.
- Analys av on-resonans 1H R1ρ experiment
- I TopSpin bearbetar du varje del av varje pseudo-2D-datauppsättning med samma bearbetningsparametrar(t.ex. linje breddning, fas) med kommandot xf2och delar upp data uppsättningen i 1Ds med hjälp av Bruker AU-programmet split2D.
- Få signalintensiteter och volymer för varje 1D-segment.
OBS: I praktiken är det bättre att dekonvolve spektra att bli av med bidrag från potentiellt överlappande toppar och tillåter användning av Bruker AU-programmet multidcon, som bekvämt sammanfattar intensiteterna eller områdena i topparna för alla segment i ett experiment i textfilen decall.txt, som sedan lätt kan läsas upp med andra program (Python-skript skrivna internt användes här, som beskrivs av Steiner et al.10) i steg 3.6.3 och 3.6.4. - Montera ett mono exponentiellt sönderfall för varje SL-styrka för att erhålla värdet R1ρ (eller on-resonance, R2+REX).
- Rita dessa R2+REX-värden (y) jämfört med. SL-styrka (x) (Figur 5F,G).
OBS: Om värdena är betydligt högre för låga SL-styrkor och minskar med högre SL-effekt (som visas i figur 5G),visar den undersökta toppen spridning, och det kan vara intressant att utföra ytterligare (off-resonance) experiment för att få information om befolkningen och kemisk skiftskillnad i det upphetsade tillståndet vs. marktillståndet.
4. 1H R1ρ Avslappningsspridning – off-resonans (märkt 1D-version)
- Inrättande och förvärv av off-resonans 1H R1ρ experiment
- I en ny topspin-mapp, ställ in experiment med en viss SL-styrka (vanligtvis först med den lägsta SL-styrkan eftersom REX-bidraget är högst där, se figur 5G för ett representativt urval av off-resonans-SLs), men med olika förskjutningar, varje gång du ändrar CNST30.
- Använd förskjutningar upp till ± (3 eller 4)*SL-styrka, med en tätare provtagning runt 0 förskjutning, vilket kan ses i figur 5H, I.
- Kör experimenten.
- Analys av off-resonans 1H R1ρ experiment
- Använd samma bearbetningsstrategi, som i 3.6.1–3.6.3, för att bestämma ett R1ρ-värde för varje förskjutning.
- Rita dessa värden mot förskjutning (figur 5G).
OBS: En asymmetri i denna kurva kan redan indikera att kemisk skiftinformation för det upphetsade tillståndet kan erhållas. Noggrann montering och analys med bloch-mcconnell- eller laguerreekvationer måste utföras för att få information om kEX, pES samt Δω10,20 ( Figur5G). Exempel på data uppsättningar, puls program och makron för båda 1D-experimenten finns i Petzold Lab Github-lagrings platsen (https://github.com/PetzoldLab). En översikt över parametrar ges i tabell 2.
Representative Results
Protokollet för RNA-produktion underlättar rening genom generering av hög renhetsavskrifter. Figur 3A visar resultaten av flera klyvningsreaktioner av tandemavskrifter, vilket ger både framgångsrika och misslyckade reaktioner. Körfält 1 visar det optimala fallet med en helt klyvd transkription med endast svaga spår av sidoprodukter. Lane 2a visar ofullständig klyvning, som kan lösas genom omglödgning och tillägg av mer RNase H (Lane 2b, steg 2.1.2). RNA-konstruktionerna av körfält 1, 2a och 2b är desamma. Provet i körfält 3 visar misslyckad klyvning. Felsökning av denna reaktion skulle innebära en kontroll av klyvningsguidesekvensen, renheten i DNA-mallen och glödgningstemperaturer. Eventuellt måste RNase H klyvning utföras efter T7 IVT som visas för prov 2.
Provet i körfält 4 visar en betydande mängd klyvning sidoprodukter, som är svåra att ta bort via jonbyte HPLC. Felsökning av ett sådant prov kan innebära a) sänkning av temperaturen, mängden RNase H eller reaktionstid, (b) minska elueringsgradienten och injektionsvolymen och försöka separera målfraktionerna från sidoprodukterna. Ytterligare information om hur man kan öka upplösningen i jonutbyte HPLC-rening har diskuterats av Karlsson et al.31. HPLC separerar mål-RNA från längre eller kortare nukleinsyror och protein- eller småmolekylsföroreningar. Figur 3B visar det optimala resultatet för jonbytet HPLC-rening. Elueringsgradienten bör väljas så att mål-RNA-arten eluerar minst en kolumnvolym (i detta exempel: 35 ml) efter nästa mindre art och en kolumnvolym före nästa större art.
Mindre arter i denna metod inkluderar enstaka nukleotider, abortiva produkter (8-12 nt), 3' och 5' distanssekvenser (5-14 nt) och klyvningsguide (12 nt chimerisk nukleinsyra), medan längre sekvenser är potentiellt uncleaved tandemrepetitioner och plasmiden. När en väl separerad elueringstopp uppnås kan reningen skalas upp till motsvarande ~20 ml IVT-reaktion per injektion. Den korrekta vikningen av ett RNA-prov är avgörande för RD-experiment och måste bekräftas före varje mätning. Figur 4 visar ett A-märkt 22-mer RNA innan vikningsprotokollet i steg 2.4 (blått) tillämpades, och samma prov efter att rätt vikning har uppnåtts (röd). En Mc-Fold sekundär struktur förutsägelse (Figur 4C) föreslår den presenterade hårnålsstrukturen med 4 baspar vilket resulterar i 5 imino signaler.
Båda spektra i figur 4A bekräftar dessa förväntade signaler, om än med något olika relativa intensiteter, vilket indikerar att vissa felveckade strukturer (här, en dimer) kan vara problematiska att bedöma med endast 1H 1D-spektra. Ett aromatiskt 1H,13C-HSQC-spektrum (figur 4B), visar dock endast 3 av de aromatiska signalerna för provet före vikningsprotokollet (blått), men alla 4 signaler för provet som har vikts enligt steg 2.4 (rött). Provet som visas i blått bildade sannolikt en homodimer (struktur som föreslås i figur 4D)som skulle resultera i samma iminosignaler som hårnålen. Signalen från A13H2 verkar börsför breddad. Dessa resultat hjälper till att belysa vikten av vikbar bekräftelse med både imino och aromatiska fingeravtrycksexperiment före varje RD-experiment. De 1H R1ρ pulssekvenser som beskrivs i detta protokoll gör det möjligt att upptäcka dynamik i mellanväxlingsregimen. Inledningsvis registreras en on-resonanskurva, och om det finns dynamik för en viss resthalt syns en dispersion inom de erhållna R2+REX-värdena, medan denna kurva är platt för rester utan utbyte.
Figur 5 visar representativa resonanskurvor som erhållits för två olika H8-atomer i en syntetisk RNA-hårnål (figur 5A), där G6H8 upplever utbyte (figur 5C), medan A4H8 inte gör det (figur 5B). Eftersom utbytet är relativt långsamt i detta prov (kEX = 292 ± 40 Hz) utnyttjades fördelen med SELOPE-experimentet för att uppnå låga SL-styrkor och de två on-resonanskurvorna registrerades med hjälp av 1D-versionen av pulssekvensen. Samma pulssekvens användes sedan för att erhålla data från avsonans för resterna som visade spridning i resonansprofilen. Figur 5D visar de erhållna R1ρ-värdena jämfört med förskjutningen där en liten asymmetri i kurvan redan anger tecknet på Δω.
Detta blir ännu tydligare i R2+REX-tomten där R1-bidraget tas bort ( figur5E). Den högra kolumnen i samma figur visar representativa resonanskurvor som erhållits för två olika H8-atomer i en något annorlunda syntetisk RNA-hårnål med snabbare utbyte, där G6H8 upplever utbyte (Figur 5G), medan A4H8 inte gör det (Figur 5F). Den snabbare växelkursen (kEX = 43 502 ± 38 478 Hz) gjorde det möjligt att omedelbart registrera alla aromatiska protoner på land med selope 2D-versionen för att erhålla både on- och off-resonansdata (G6H8-data som visas i figur 5H,I).
Allmänna identifierare för positiva och negativa resultat
Positiva resultat i tandem IVT och RNase H klyvning kan identifieras enligt följande: 1) Målbandet är det starkaste bandet i denaturering PAGE gel. 2) Det finns inga eller bara svaga band runt huvudbandet. 3) Det finns inga eller endast svaga arter med högre molekylvikt. 4) HPLC-kromatogrammet visar en väl separerad topp av mål-RNA. 5) När huvudtoppen provtas visas endast ett band på en denaturerande PAGE-gel.
Negativa resultat i tandem IVT och RNase H klyvning närvarande enligt följande: 1) Nej eller bara ett svagt huvudband är synligt på en denaturerande PAGE gel. 2) Ett mönster av arter med hög molekylvikt från RNA tandemrepetitioner är synligt. 3) Även om huvudbandet är närvarande, är band med liknande intensitet över eller under huvudbandet inom ± 3 nt.
Ett välvikt prov kan identifieras enligt följande: 1) Antalet observerade iminoprotoner matchar antalet iminoprotoner som förväntas av en sekundär struktursimulering (t.ex.Mc-Fold39, figur 4A). 2) Syn G-U wobble basparet i en UUCG-slinga (om sådan finns) är synlig vid ~9,5 ppm, ibland endast synlig vid lägre temperatur. Fürtig och kollegorna 40 har beskrivit ytterligare fingeravtryck avUUCG-slingan. 3) Det aromatiska fingeravtrycket överensstämmer med ett tidigare tilldelat prov som har bekräftats vikas korrekt(figur 4C).
Ett felaktigt eller försämrat prov kan identifieras enligt följande: 1) Det finns fler iminosignaler än en sekundär struktursimulering förutsäger (OBS: färre iminosignaler innebär inte nödvändigtvis felkning, eftersom stängning av baspar ofta inte är synliga och konformationsutbyte breddar linjer). 2) Frånvaro av iminosignaler. 3) Smala signaler med hög intensitet i det aromatiska området, vilket indikerar produkter för nedbrytning av enstaka nukleotider. 4) Skillnader mellan imino- eller aromatiska signaler till ett referensprov med bekräftad vikning(figur 4C).
En atom som inte visar något utbyte i den påvisbara tidsskalan kan identifieras enligt följande: 1) från en platt RD-profil (på grund av det saknade REX-bidraget som varierar med den applicerade SL-kraften) (figur 5B och figur 5F). 2) Försiktighet måste vidtas vid långsam mellanbörs när kEX och Δω är av samma storlek. I så fall kan resonansbidraget vara mycket litet, vilket kan ses i figur 5C (i detta fall är de monterade parametrarna kEX = 292 ± 40 Hz och Δω = 112 ± 4 Hz). Om du är osäker kan en låg SL-avsonanskurva registreras för verifiering.
En atom som visar utbyte i mellantidsskalan kan identifieras 1) från en icke-platt avslappningsdispersionsprofil i ett rd-experiment på resonans (figur 5B och figur 5F). 2) en bredare linje i HSQC- eller SELOPE-experimentet kan också vara en indikator för utbyte.
Väl valda SL-effektvärden för off-resonanskurvor (Figur 5E, F): 1) har ett betydande k EX-bidrag i resonanskurvan (valda SL-effektvärden anges i figur 5C och figur 5G). 2) Eftersom off-resonanskurvor mäts för minst 3 SL-effektvärden bör de valda SL-effektvärdena spridas ut över regionen i resonanskurvan med kEX-bidrag. 3) Leda till icke-planA R2+REX-kurvor efter Laguerre-passformen(t.ex. figur 5D:SL-styrkor 25, 50 och 75 Hz; Figur 5E).
Dåligt valda SL-effektvärden för off-resonanskurvor (Bild 5E, F) leder till planA R2+REX-kurvor efter Laguerre-passformen. Ett exempel visas i figur 5E, där 100 Hz off-resonanskurvan är mycket platt och därför inte ger någon signifikant information om Δω.
Indikationer för roterande ram nukleära Overhauser effekt (ROE) artefakter: 1) Δω erhålls från off resonans kurvor matchar kemiska förskjutningar av protoner i rumslig närhet / protoner, som visar en korstopp med toppen av intresse för kärnämnet Overhauser effekt spektroskopi (NOESY) spektrum. (t.ex.visar figur 5I breda off-resonanskurvor som förväntat för snabb mellanliggande utbyte, men kurvorna har också skarpare egenskaper, t.ex.vid -3000 Hz och +1500 Hz. Dessa beror mycket sannolikt på en ROE-artefakt snarare än en kemisk förändring för denna H8 i en annan konformator). 2) Laguerre fit fungerar, men fungerar inte bra (ger höga fel eller fysiskt omöjliga värden) för en on-resonans och minst 3 off-resonanskurvor, även om exponentiella medel erhölls från experiment med hög SINO (>20) (t.ex., kEX = 43,502 ± 38,478 Hz). Ofta passar varje SL individuellt bra, men att passa ihop dem ger ett mycket högre fel; det motsatta beteendet förväntas för ett verkligt upphetsad tillstånd.
Indikationer för "äkta" utbyte Δω:1) Δω som erhålls från off-resonanskurvor matchar inte kemiska förskjutningar av protoner i rumslig närhet/protoner, som visar en korstopp med toppen av intresset för NOESY-spektrumet (t.ex. figur 5E). 2) Laguerre fit ger låga fel för en resonans och minst 3 off-resonanskurvor(t.ex. figur 5E vs. Bild 5I, se bildtext för passformsresultat).
Figur 3: Provproduktion av tandem IVT och RNase H-klyvningsreaktion. (A) Denatureringssida av positiva och negativa resultat av tandem IVT- och RNase H-klyvning. Steghöjd avser RNA-referenser, 12* hänvisar till den chimeriska klyvningsguiden. Lane 1: Framgångsrik generation av ett 20 nt mål RNA. Få kortare och längre produkter finns. Lane 2a: Ofullständig klyvning av tandemavskriften. Även om HPLC-rening är möjlig, skulle mycket material slösas bort. Lane 2b: Fortsatt RNase H-klyvning av Lane 2 ger ett rent prov redo för HPLC-injektion (identisk med körfält 1). Lane 4: RNase H klyvning var i hög grad mislyckad, och inget upp i mål musikband producerades. Tandemavskriften i full längd är fortfarande synlig på 600 nt. Lane 5: Ett målband producerades, men ett starkt -1-band är på plats. Även om HPLC kan utföras, är noggrann borttagning av sidoprodukten nödvändig. (B) Exempel på en lyckad HPLC-injektion. Toppen på 38 min innehåller rent RNA av mållängden, medan längre och kortare produkter är väl åtskilda från mål-RNA. Panel B har ändrats från 21. Förkortningar: IVT = in vitro-transkription; HPLC = högpresterande vätskekromatografi; nt = nukleotider; AU = godtyckliga enheter. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Exempel på en RNA-hårnål före (blå) och efter (röd) det vikbara steg 2.4 (se protokoll) i NMR. (A) Imino-regionen i ett 1H-1D-spektrum av ett A-märkt 22-mer RNA. Förväntade regioner för basparidentitet för iminosignaler anges i grått nedan. B) 1H,13C-HSQC-spektrum av RNA:s aromatiska resonanser från panel A. Provet efter vikning (rött) visar 4 signaler som förväntat, medan provet före vikning (blått) endast visar 3 signaler. Mc-Folds förutsägelse av 22-mer-RNA som hårnål. Fem iminosignaler kan förväntas från denna sekundära struktur, som finns i båda proverna i panel A. (D) Föreslagen struktur av en homodimer bildad av 22-mer RNA, vilket resulterar i samma 5 baspar som hårnålsstrukturen. Förkortningar: NMR = kärnmagnetisk resonans; 1D = endimensionell; HSQC = heteronukleär enda kvantkorrelation; ppm = delar per miljon. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: 1H R1ρ RD representativa resultat för två olika konstruktioner baserade på en RNA-hårnål. (A) Den vänstra kolumnen visar resultat som erhållits på RNA med ett C-G-baspar ovanför det utbuktade U, medan den högra kolumnen visar resultat som erhållits på ett prov där basparet byttes till G-C istället. BochF visardeplatta spridningsprofiler som erhållits för A4H8 för de två konstruktionerna, vilket inte tyder på något konformationsutbyte. (C–E) visa on-resonans, off-resonans och monterade data som erhållits för G6 i (G-C) konstruktionen. Laguerre-passformen leder till följande resultat: R1 = 2,87 ± 0,01 Hz, R2 = 7,76 ± 0,03 Hz, kEX =292 ± 40 Hz, pES = 0,31 ± 0,03 %, Δω = 112 ± 4 Hz. (G–I) visa on-resonans, off-resonans och monterade data som erhållits för G6 i (G-C) konstruktionen. Laguerre-passformen leder till följande resultat: R1 = 1,93 ± 0,02 Hz, R2 = 6,71 ± 0,86 Hz, k EX = 43 502 ± 38 478 Hz, p ES = 27 ± 16 %, Δω = 203 ± 166 Hz. Denna siffra ändrades från 20. Förkortning: SL = spinnlås. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
Protokollet som presenteras häri är en syntes av flera protokoll som publicerats tidigare i form av forskningsartiklar10,20,21,31. Därför kan segment av protokollet tillämpas, medan andra kan bytas till läsarens önskemål. Till exempel kan R1ρ-mätningarna utföras på ett RNA-prov som produceras med vilken metod som helst, med tanke på att vikning och homogenitet av längden antas. Dessutom innehåller protokollet inte information om resonanstilldelning av RNA-sekvensen -ett steg som krävs för RD-experiment - eftersom detta har täckts mycket i tidigarelitteratur 19,37,38. Partiella, segmentala eller platsspecifika märkningssystem36,41,42,43,44 är metoder för att underlätta resonanstilldelning eller minska överlappningen av resonanser som är av intresse för RD-experiment och har beskrivits länge i litteraturen. Denna metod tillåter användning av enhetlig märkning av alla nukleotididentiteter, vilket redan kan förenkla resonanstilldelningen avsevärt.
IVT-metoden som presenteras här övervinner kända problem med sekvenser och märkning, ökar avkastningen och minskar kostnader och arbetstid jämfört med andra metoder. Användningen av den virala initieringssekvensen minskar behovet av reaktionsoptimering, vilket är ett känt problem inom området som kan vara tidskrävande att utföra och ger bara några kopior av avskriften vid icke-G-initiering. Tandemavskriftens T7 IVT- och RNase H-klyvning kan utföras samtidigt i samma kärl. Ett mönster av multimeriska tandemrepetitioner kan ses på en denaturerande PAGE-gel under reaktionen, som sammanförs till ett enda band på mål-RNA efter slutförandet av RNase H-reaktionen (Figur 3A, körfält 1 och 2b). Typiska utbyten med denna metod varierar mellan 30 och 70 nmol RNA per 1 ml IVT. Ändå kommer metoden baserad på RNase H klyvning av tandemrepetitioner inte utan vissa egna problem. RNase H-klyvningsreaktionen slutförs ofta inte när den körs samtidigt med T7-transkription (Figur 3A, körfält 2a).
Separationen av tandemenheter kan slutföras genom att klyvningsguiden glödgas till avskriften och lägga till fler RNase H (Figur 3A, körfält 2b, steg 2.1.2). Eftersom uppvärmningen av stora volymer är långsam och leder till Mg2 +-katalyserad hydrolys av RNA användes en konventionell mikrovågsugn, vilket värmer provet till >95 °C på 10-15 s. Negativa effekter på de producerade proverna har hittills inte observerats. Vissa konstruktioner visar ett mindre andra band som inte kunde elimineras genom optimering av reaktionsförhållandena (Figur 3A, körfält 4). Vanligtvis är dessa ganska tydligt synliga som en axel i HPLC-kromatogrammet, om en väloptimerad elueringsgradient används och kan tas bort (steg 2.2.5). Följande diskussion syftar till att belysa kritiska steg i protokollet, särskilt när det gäller att erhålla högkvalitativa data som möjliggör en tolkning av konformationsdynamiken.
RNase förorening
Extracellulära RNases är allestädes närvarande, mycket stabila och utgör det största hotet för långsiktig stabilitet hos NMR-prover. Därför är det viktigt att arbeta i en RNase-fri miljö och hålla alla reagenser och plastartiklar RNase-fria. Användningen av filterspetsar och kanske till och med ansiktsmasker rekommenderas. Detta är särskilt viktigt efter HPLC-rening. NMR-prover som är förorenade med RNases uppvisar vanligtvis smala toppar synliga i 1H-1D-spektra efter dagar eller veckor på grund av enkärniga nedbrytningsprodukter. Ett sådant prov är inte lämpligt för R1ρ-mätningar.
NMR-prov
På grund av sin mycket laddade natur kan RNA användas i höga koncentrationer utan nederbörd jämfört med de flesta proteiner. Användningen av Shigemi NMR-rör (se materialtabellen)är fördelaktig eftersom de tillåter centrering av det högkoncentrerade provet i mitten av spolen samtidigt som det ger idealiska shimming- och låsförhållanden på grund av den känslighetsmatchade glasbotten och kolven. På så sätt reduceras B1-inhomogenitet, vilket ger upphov till smalare linjer. Den typiska provvolymen i ett NMR-rör är 250 μL och den typiska koncentrationen är 1-2 mM. Prover under 500 μM rekommenderas inte för RD-experiment eftersom experimentet skulle ta för lång tid och en bra shim. På samma sätt rekommenderas inte provvolym under 200 μL eftersom en god shim och fältstabilitet (lås) krävs. Vid insättning av kolven är det viktigt att undvika bildandet av bubblor i provet (steg 2.4.5). Om kolven inte är korrekt fastsatt kan den glida ner i provet, vilket minskar den detekterbara volymen. Dessutom kan snabba temperaturförändringar leda till bildandet av nya bubblor i provet. Därför bör försiktighet vidtas vid transport av provet och vid ändring av sondtemperaturen i NMR-spektrometern. Kontrollera provet för bubblor när du mäter igen efter en längre period.
RNA-vikning
Dynamiska RNA-molekyler kan finnas i flera konformationer när de inte viks ordentligt. Även om smälttemperaturer i sekundära strukturer endast kan vara något över rumstemperaturen, rekommenderas ett grundligt uppvärmnings- och snäppkylningsförfarande före mätning. Högkoncentrerade hårnålsprover som viks under kinetisk kontroll (uppvärmning och snapkylning) kan bilda homodimers över tid, vilket kräver rigorös kontroll av RNA-vikning före varje NMR-mätning. Om det uppmätta RNA inte är en hårnålsstruktur utan en RNA-duplex, bör långsam vikning under termodynamisk kontroll appliceras.
I detta fall bör kylprocessen efter uppvärmning vara inom intervallet timmar, medan RNA används vid sin slutliga volym och koncentration i NMR-provet. En första räkning av förväntade imino och aromatiska resonanser kan ge insikt om provets homogenitet. Om provet inte ser ut som förväntat bör det vikas om. Mg2+ (tillsatt som kloridsalt) kan hjälpa till med vikbara RNA-strukturer45. I praktiken fungerar vikningskontrollen som en jämförelse med ett prov som har använts för att åtminstone delvis tilldela NMR-resonanserna och för att lösa den sekundära strukturen experimentellt.
Spinnlåskraft och värmeöverväganden
Vid körning av 1H R1ρ RD-experiment som 2D-översiktsexperiment bör SL-kraften inte vara lägre än 1,2 kHz. Radiofrekvensen ska placeras i mitten av ppm-området i de bästa topparna (t.ex. 7,5ppm för aromatiska protoner). Bandbredden på 1,2 kHz kommer då att vara tillräckligt stor för att spinna dessa protoner utan några större off-resonanseffekter. Sådana effekter kan identifieras i RD-profilen. Om de inträffar ökar R2+REX-värden istället för att minska med ökande SL-effektvärden, särskilt för låg SL-effekt. Kontrollera om de beräknade SL-effektvärdena motsvarar den effekt som levereras till provet. I praktiken kan beräknad SL-effekt användas om 1H 90° hårdpulsen kalibrerades noggrant på nyare spektrometrar; Detta kan dock kontrolleras genom att kalibrera SL-ström för varje önskad bandbredd.
Utbudet av SL-effekt, som kan användas i 1H R1ρ RD-experiment, är mycket brett, vilket leder till varierande provuppvärmning (1,2 kHz till 15 kHz för HSQC för HCP-baserade sekvenser och 50 Hz till 15 kHz för SELOPE-experiment). Ojämn provuppvärmning kan detekteras som en liten förändring i kemiskt skifte när man jämför 1D:er som erhållits för lågeffekts-SLs jämfört med. hög effekt SLs. Denna effekt beaktas vanligtvis inte i värmekompensationer i R1ρ experiment på heteronuclei. Värmekompensation i dessa experiment ställs vanligtvis in för att korrigera för olika uppvärmning på grund av de olika spinnlåslängder som anges i vd-listan för varje spinnlåskraftserie. Speciellt för SELOPE-experimentet bör en andra värmekompensation användas över alla tillämpade SL-styrkor enligt beskrivningen i20.
vd-lista överväganden
Som nämnts tidigare bör vd-listan innehålla en tidspunkt som är tillräckligt lång för att erhålla ett betydande förfall av intensitet (helst ner till 30% av den ursprungliga signalen eller så låg som möjligt om det inte är möjligt att nå ett 70% förfall inom sondens specifikationer). Även om vd-listan var optimerad för en låg SL-effekt (1,2 kHz), bör denna vd-lista också testas med den högstaSL-effektsom ska användas ( t.ex. 15 kHz). Detta beror på att för toppar med betydande REX-bidrag kommer förfallet att vara mycket långsammare vid hög SL-effekt. Så ett tillräckligt förfall bör också verifieras vid hög SL-effekt. Detsamma måste övervägas för förfall vid höga förskjutningar i off-resonans experiment. Den idealiska maximala tidspunkten för vd-listan kan vara betydligt annorlunda för de olika regionerna i spridningsexperimentet. I så fall kan fler punkter ingå i vd-listan, och ju längre vd-listpunkter för högre SL-effekt eller högre förskjutningar under analysen, baserat på den låga SINO de kommer att leda till, kan kasseras. I allmänhet bör 5-8 vd-listpunkter anses kunna upptäcka potentiella artefakter som leder till icke-exponentiella förfall som J-koppling (se nedan).
1D-HCP selektivitet överväganden
Särskild försiktighet måste vidtas när du kör den HCP-baserade 1D-versionen om det finns en annan topp som överlappar med toppen av intresset för 1H-dimensionen i det 2D HSQC-baserade experimentet. HCP-baserade överföringar är mycket, men aldrig 100% selektiva, och det kan därför hända att en annan topp bidrar till intensiteten och förfallsbeteendet hos toppen av intresset för 1D. En indikation på detta skulle vara en skillnad i värdena R1ρ som erhålls med hjälp av 1D- och 2D-versionerna av det märkta experimentet.
ROE överväganden:
För off-resonanskurvor av atomer med långsam mellanliggande utbyte, ROE artefakter kan identifieras baserat på en jämförelse av den erhållna Δω med en NOESY eller ROESY spektrum. Om en korstopp kan identifieras vid en kemisk skiftskillnad motsvarande Δω, kan det observerade upphetsade tillståndet i själva verket vara en ROE-artefakt (t.ex.hittades ROEs mellan aromatiska protoner, som alla ligger i samma kemiska skiftområde och därför omfattas av dessa off-resonanskurvor20). Av erfarenhet ledde detta alltid också till dåliga anfall med stora fel, möjligen på grund av att ROE inte följer samma mönster som REX med ökande SL-kraft. Situationen blir svårare för mellansnabbt utbyte. Medan resonanskurvan är (från jämförelse med 13C-data som erhållits på grannkärnan) fortfarande representativ för utbytesprocessen mellan GS och ES, påverkas off-resonanskurvan av flera ROE-artefakter.
I så fall är SL-kraften för att upptäcka utbytesprocessen större (>1,5 kHz) och sträcker sig därför över ett större antal protoner eftersom off-resonanskurvor sträcker sig över kemiska skiftskillnader mellan olika ROE-kandidater (för H8 skulle dessa vara: aminoprotoner vid ca. ±1000 Hz, H5/H1 är på ca -1200 Hz, imino protoner vid ca 3500 Hz). Hittills har det inte visat sig att någon metod för att undertrycka dessa ROE-artefakter (annat än att använda delvis avuteröjda nukleotider46),och data från annan än resonans bör inte registreras för snabb mellanliggande utbyte, eftersom ingen tillförlitlig information om den faktiska Δω kan extraheras med denna metod, om NOE/ROE-bidraget inte kan uteslutas via NOESY-spektra.
J-Koppling (Hartmann-Hahn) överväganden
Även om on-resonanskurvor för homonukleära J-kopplade protoner, såsom H6, framgångsrikt registrerades10,20, måste särskild försiktighet tas för off-resonansmätningar, särskilt för låg SL-kraft eftersom Hartmann-Hahn matchande villkor kan sträcka sig över ett brett spektrum av de undersökta förskjutningarna. Hartmann-Hahn artefakter kan identifieras som svängningar på det exponentiella förfallet eller ökande R2+REX-värden med ökande SL-styrkor i on-resonans RD-tomter20.
Disclosures
K.P. är konsult till Arrakis Therapeutics, ett företag som upptäcker små molekyler riktade mot RNA.
Acknowledgments
Vi tackar proteinvetenskapsanläggningen (PSF) vid Karolinska Institutet för uttryck och rening av T7 RNA-polymeras och E. coli RNase H, Martin Hällberg för den oorganiska fosfatasens generösa gåva och hela Petzoldlab för värdefulla diskussioner. Vi tackar Luca Retattino för förberedelserna av U-bulge-konstruktionerna och Emilie Steiner och Carolina Fontana för deras bidrag till makron och passande manus. Vi bekräftar Karolinska Institutet och Institutionen för medicinsk biokemi och biofysik för att stödja inköp av en 600 MHz spektrometer- och positionsfinansiering (KI FoAss och KID 2-3707/2013). Vi är tacksamma för ekonomiska bidrag från Vetenskapsrådet (#2014-4303), Stiftelsen för strategisk Forskning (ICA14-0023 och FFL15-0178) och Ragnar Söderberg Stiftelse (M91-14), Harald och Greta Jeansson Stiftelse (JS201400 09), Carl Tryggers stiftelse (CTS14-383 och 15-383), Eva och Oscar Ahréns Stiftelse, Åke Wiberg Stiftelse (467080968 och M14-0109), Cancerfonden (CAN 2015/388), J.S. erkänner finansiering genom en Marie Skłodowska-Curie IF (EU H2020, MSCA-IF projekt nr 747446).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad | 161-0144 | |
| 5-alpha Competent E. coli | NEB | C2987I | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 49199 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
| AFC-3000, HPLC Fraction collector | Thermo Scientific | 5702.1 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Amersham ImageQuant 800 UV | GE Healthcare | 29399482 | Replacing LAS-4000 or equivalent |
| Amicon ultra centrifugal filter unit | Sigma-Aldrich | UFC900324 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| ATP-13C10/15N5 | Sigma-Aldrich | 645702 | |
| BamHI restriction enzyme | NEB | R0136L | |
| Bottle top filter | VWR | 514-1019 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | 1081220005 | |
| Cleavage guide | IDT | N/A | or equivalent |
| CTP | Sigma-Aldrich | C1506 | |
| CTP-13C10/15N5 | Sigma-Aldrich | 645699 | |
| D2O | Sigma-Aldrich | 151882 | |
| Dionex Ultimate 3000 UHPLC system | Thermo Scientific | N/A | |
| DL-Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep column | Thermo Scientific | SP6734 | |
| DNAPac PA200 22x50 guard column | Thermo Scientific | SP6731 | |
| E.coli RNase H | NEB | M0297L | or made in-house uniprot ref. P0A7Y4 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44 | Eppendorf | 5804R | |
| Ethanol 95% | Fisher scientific | 11574139 | |
| Ethanol 95% denatured | VWR | 85829.29 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| GelRed | VWR | 41003 | |
| GeneRuler 1kbp Plus | Fisher Scientific | SM1333 | Optional |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377 | |
| GMP-13C10/15N5 | Sigma-Aldrich | 650684 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| GTP-13C10/15N5 | Sigma-Aldrich | 645680 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma-Aldrich | I1643-100UN | or made in-house uniprot ref. P0A7A9 |
| Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
| Julabo TW8 Water bath | VWR | 461-3117 | |
| kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis | VWR | 700-0056 | or comparable |
| LB broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Low Range ssRNA Ladder | NEB | N0364S | Optional |
| LPG-3400RS Pump | Thermo Scientific | 5040.0036 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 63068 | |
| microRNA Marker | NEB | N2102S | |
| Microwave oven | Samsung | MS23F301EAW | |
| Mini-PROTEAN electrophoresis equipment | Bio-Rad | 1658004 | |
| NucleoBond Xtra Maxi | Machinery-Nagel | 740414.10M | |
| pUC19 plasmid containing tandem insert | Genscript | N/A | or equivalent |
| RNaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | |
| Shigemi tube 5mm | Sigma-Aldrich | Z529427 | |
| Single-use syringe, Luer lock tip | VWR | 613-2008 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 730-1470 | |
| Sodium perchlorate | Sigma-Aldrich | 71853 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Spermidine trihydrochloride | Sigma-Aldrich | 85578 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher | S11494 | |
| Syringe filters | VWR | 514-0061 | |
| T7 RNA polymerase | Sigma-Aldrich | 10881767001 | or made in-house uniprot ref. P00573 |
| TCC-3000RS Column thermostat | Thermo Scientific | 5730 | |
| Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | 10103203 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375 | |
| UMP-13C9/15N2 | Sigma-Aldrich | 651370 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U6625 | |
| UTP-13C10/15N5 | Sigma-Aldrich | 645672 | |
| VWD-3100 Detector | Thermo Scientific | 5074.0005 |
References
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Doudna, J. A., Cech, T. R. The chemical repertoire of natural ribozymes. Nature. 418 (6894), 222-228 (2002).
- Sehgal, P. B., Westley, J., Lerea, K. M., DiSenso-Browne, S., Etlinger, J. D. Biomolecular condensates in cell biology and virology: phase-separated membraneless organelles (MLOs). Analytical Biochemistry. , 597 (2020).
- Herschlag, D., Allred, B. E., Gowrishankar, S. From static to dynamic: the need for structural ensembles and a predictive model of RNA folding and function. Current Opinion Structural Biology. 30, 125-133 (2015).
- Kimsey, I. J., Petzold, K., Sathyamoorthy, B., Stein, Z. W., Al-Hashimi, H. M. Visualizing transient Watson-Crick-like mispairs in DNA and RNA duplexes. Nature. 519 (7543), 315-320 (2015).
- Dethoff, E. A., Petzold, K., Chugh, J., Casiano-Negroni, A., Al-Hashimi, H. M. Visualizing transient low-populated structures of RNA. Nature. 491 (7426), 724-728 (2012).
- Baisden, J. T., Boyer, J. A., Zhao, B., Hammond, S. M., Zhang, Q. Visualizing a protonated RNA state that modulates microRNA-21 maturation. Nature Chemical Biology. 17 (1), 80-88 (2021).
- Marušič, M., Schlagnitweit, J., Petzold, K. RNA dynamics by NMR spectroscopy. Chembiochem. 20 (21), 2685-2710 (2019).
- Baronti, L., et al. Base-pair conformational switch modulates miR-34a targeting of Sirt1 mRNA. Nature. 583 (7814), 139-144 (2020).
- Steiner, E., Schlagnitweit, J., Lundström, P., Petzold, K. Capturing excited states in the fast-intermediate exchange limit in biological systems using 1H spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (51), 15869-15872 (2016).
- Moschen, T., et al. Ligand-detected relaxation dispersion NMR spectroscopy: dynamics of preQ1-RNA binding. Angewandte Chemie International Edition. 54 (2), 560-563 (2015).
- LeBlanc, R. M., Longhini, A. P., Tugarinov, V., Dayie, T. K. NMR probing of invisible excited states using selectively labeled RNAs. Journal of Biomolecular NMR. 71 (3), 165-172 (2018).
- Strebitzer, E., Nußbaumer, F., Kremser, J., Tollinger, M., Kreutz, C. Studying sparsely populated conformational states in RNA combining chemical synthesis and solution NMR spectroscopy. Methods. 1148, 39-47 (2018).
- Rangadurai, A., Shi, H., Al-Hashimi, H. M. Extending the sensitivity of CEST NMR spectroscopy to micro-to-millisecond dynamics in nucleic acids using high-power radio-frequency fields. Angewandte Chemie International Edition. 59 (28), 11262-11266 (2020).
- Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. Using relaxation dispersion NMR spectroscopy to determine structures of excited, invisible protein states. Journal of Biomolecular NMR. 41 (3), 113-120 (2008).
- Lundström, P., Akke, M. Off-resonance rotating-frame amide proton spin relaxation experiments measuring microsecond chemical exchange in proteins. Journal of Biomolecular NMR. 32 (2), 163-173 (2005).
- Lee, J., Dethoff, E. A., Al-Hashimi, H. M. Invisible RNA state dynamically couples distant motifs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), 9485-9490 (2014).
- Schnieders, R., Keyhani, S., Schwalbe, H., Fürtig, B. More than proton detection- new avenues for NMR spectroscopy of RNA. Chemistry. 26 (1), 102-113 (2020).
- Fürtig, B., Richter, C., Wöhnert, J., Schwalbe, H. NMR spectroscopy of RNA. Chembiochem. 4 (10), 936-962 (2003).
- Schlagnitweit, J., Steiner, E., Karlsson, H., Petzold, K. Efficient detection of structure and dynamics in unlabeled RNAs: The SELOPE approach. Chemistry. 24 (23), 6067-6070 (2018).
- Feyrer, H., Munteanu, R., Baronti, L., Petzold, K. One-pot production of RNA in high yield and purity through cleaving tandem transcripts. Molecules. 25 (5), 1142 (2020).
- Baronti, L., Karlsson, H., Marušič, M., Petzold, K. A guide to large-scale RNA sample preparation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (14), 3239-3252 (2018).
- Brunelle, J. L., Green, R. In vitro transcription from plasmid or PCR-amplified DNA. Methods in Enzymology. 530, 101-114 (2013).
- Borkotoky, S., Murali, A. The highly efficient T7 RNA polymerase: A wonder macromolecule in biological realm. International Journal of Biological Macromolecules. 118, Pt A 49-56 (2018).
- Arnaud-Barbe, N., Cheynet-Sauvion, V., Oriol, G., Mandrand, B., Mallet, F. Transcription of RNA templates by T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Research. 26 (15), 3550-3554 (1998).
- Guillerez, J., Lopez, P. J., Proux, F., Launay, H., Dreyfus, M. A mutation in T7 RNA polymerase that facilitates promoter clearance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (17), 5958-5963 (2005).
- Kuzmine, I., Gottlieb, P. A., Martin, C. T. Binding of the priming nucleotide in the initiation of transcription by T7 RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 278 (5), 2819-2823 (2003).
- Gholamalipour, Y., Karunanayake Mudiyanselage, A., Martin, C. T. 3' end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive and diverse in character - RNA-Seq analyses. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9253-9263 (2018).
- Inoue, H., Hayase, Y., Iwai, S., Ohtsuka, E. Sequence-dependent hydrolysis of RNA using modified oligonucleotide splints and RNase H. FEBS Letters. 215 (2), 327-330 (1987).
- Wang, X., Li, C., Gao, X., Wang, J., Liang, X. Preparation of small RNAs using rolling circle transcription and site-specific RNA disconnection. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4, 215 (2015).
- Karlsson, H., Baronti, L., Petzold, K. A robust and versatile method for production and purification of large-scale RNA samples for structural biology. RNA. 26 (8), 1023-1037 (2020).
- Hartmann, S. R., Hahn, E. L. Nuclear double resonance in the rotating frame. Physical Review. 128 (5), 2042-2053 (1962).
- Chiarparin, E., Pelupessy, I., Bodenhausen, G. Selective cross-polarization in solution state NMR. Molecular Physics. 95 (5), 759-767 (1998).
- Korzhnev, D. M., Orekhov, V. Y., Kay, L. E. Off-resonance R 1ρ NMR studies of exchange dynamics in proteins with low spin-lock fields: an application to a Fyn SH3 domain. Journal of the American Chemical Society. 127 (2), 713-721 (2005).
- Hansen, A. L., Nikolova, E. N., Casiano-Negroni, A., Al-Hashimi, H. M. Extending the range of microsecond-to-millisecond chemical exchange detected in labeled and unlabeled nucleic acids by selective carbon R 1ρ NMR spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 131 (11), 3818-3819 (2009).
- Duss, O., Maris, C., von Schroetter, C., Allain, F. H. -T. A fast, efficient and sequence-independent method for flexible multiple segmental isotope labeling of RNA using ribozyme and RNase H cleavage. Nucleic Acids Research. 38 (20), 188 (2010).
- Krähenbühl, B., Lukavsky, P., Wider, G. Strategy for automated NMR resonance assignment of RNA: application to 48-nucleotide K10. Journal of Biomolecular NMR. 59 (4), 231-240 (2014).
- LeBlanc, R. M., Longhini, A. P., Le Grice, S. F. J., Johnson, B. A., Dayie, T. K. Combining asymmetric 13C-labeling and isotopic filter/edit NOESY: a novel strategy for rapid and logical RNA resonance assignment. Nucleic Acids Research. 45 (16), 146 (2017).
- Parisien, M., Major, F. The MC-Fold and MC-Sym pipeline infers RNA structure from sequence data. Nature. 452 (7183), 51-55 (2008).
- Fürtig, B., Richter, C., Bermel, W., Schwalbe, H. New NMR experiments for RNA nucleobase resonance assignment and chemical shift analysis of an RNA UUCG tetraloop. Journal of Biomolecular NMR. 28 (1), 69-79 (2004).
- Keyhani, S., Goldau, T., Blümler, A., Heckel, A., Schwalbe, H. Chemo-enzymatic synthesis of position-specifically modified RNA for biophysical studies including light control and NMR spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 57 (37), 12017-12021 (2018).
- Marchanka, A., Kreutz, C., Carlomagno, T. Isotope labeling for studying RNA by solid-state NMR spectroscopy. Journal of Biomolecular NMR. 71, 151-164 (2018).
- Becette, O., Olenginski, L. T., Dayie, T. K. Solid-phase chemical synthesis of stable isotope-labeled RNA to aid structure and dynamics studies by NMR spectroscopy. Molecules. 24 (19), 3476 (2019).
- Zhang, X., Li, M., Liu, Y. Optimization and characterization of position-selective labelling of RNA (PLOR) for diverse RNA and DNA sequences. RNA Biology. 17 (7), 1009-1017 (2020).
- Roh, J. H., et al. Effects of preferential counterion interactions on the specificity of RNA folding. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (19), 5726-5732 (2018).
- Juen, M. A., et al. Excited states of nucleic acids probed by proton relaxation dispersion NMR spectroscopy. Angewandte Chemie German Edition. 55 (39), 12008-12012 (2016).
