Summary
Hier demonstreren we een methode om vochtscheringsspanning toe te passen op kankercellen in suspensie om de effecten van hemodynamische stress op circulerende tumorcellen te modelleren.
Abstract
Tijdens uitzaaiingen krijgen kankercellen uit vaste weefsels, waaronder epithelia, toegang tot de lymfe- en hematogene circulatie waar ze worden blootgesteld aan mechanische stress als gevolg van hemodynamische stroming. Een van deze spanningen die circulerende tumorcellen (CTC's) ervaren, is fluid shear stress (FSS). Terwijl kankercellen lage niveaus van FSS in de tumor kunnen ervaren als gevolg van interstitiële stroom, worden CTC's, zonder extracellulaire matrixaanhechting, blootgesteld aan veel grotere niveaus van FSS. Fysiologisch varieert FSS over 3-4 ordes van grootte, met lage niveaus aanwezig in lymfeklieren (<1 dyne/cm2) en de hoogste niveaus die kort aanwezig zijn als cellen door het hart en rond hartkleppen gaan (>500 dynes/cm2). Er zijn een paar in vitro modellen ontworpen om verschillende reeksen fysiologische schuifspanning over verschillende tijdsbestekken te modelleren. Dit artikel beschrijft een model om de gevolgen van korte (milliseconde) pulsen van fss op hoog niveau op kankercelbiologie te onderzoeken met behulp van een eenvoudig spuit- en naaldsysteem.
Introduction
Metastase, of de verspreiding van kanker buiten de oorspronkelijke tumorplaats, is een belangrijke factor die ten grondslag ligt aan kankersterfte1. Tijdens uitzaaiingen gebruiken kankercellen de bloedsomloop als een snelweg om zich te verspreiden naar verre locaties in het hele lichaam2,3. Terwijl op weg naar deze plaatsen, circulerende tumorcellen (CTC's) bestaan binnen een dynamische vloeibare micro-omgeving in tegenstelling tot die van hun oorspronkelijke primaire tumor3,4,5. Er is voorgesteld dat deze vloeibare micromilieu een van de vele barrières voor metastaseis 4. Er bestaat brede overeenstemming in het concept van gemetastaseerde inefficiëntie, d.w.z. dat de meeste CTC 's die in omloop komen, ofwel vergaan of geen productieve gemetastaseerde kolonies vormen6,7,8. Waarom metastase echter inefficiënt is vanuit het perspectief van een individuele CTC is minder zeker en blijft een actief onderzoeksgebied. CTC's worden losgemaakt van de extracellulaire matrix, beroofd van oplosbare groei- en overlevingsfactoren die aanwezig kunnen zijn in de primaire tumor, en op een veel andere manier blootgesteld aan het immuunsysteem en de hemodynamische krachten dan in de primaire tumor4. Elk van deze factoren kan bijdragen tot de slechte overleving van CTC's, maar hun relatieve bijdragen zijn onduidelijk. Dit artikel gaat in op de vraag hoe hemodynamische krachten CTC's beïnvloeden.
Het bestuderen van de effecten van hemodynamische krachten op CTC's is behoorlijk uitdagend. Momenteel zijn er geen in vitro systemen die de volledige spatiotemporale dynamiek (hart tot haarvaten) en reologische eigenschappen van het menselijk vasculaire systeem kunnen repliceren. Bovendien is niet helemaal duidelijk hoe CTC's de bloedsomloop ervaren. Experimenteel bewijs geeft aan dat de meeste kankercellen niet continu circuleren zoals bloedcellen. Vanwege hun relatief grote omvang (10-20 μm in diameter) raken de meeste CTC's eerder in capillaire bedden (6-8 μm in diameter) voor variabele tijdslengten (s tot dagen) waar ze kunnen sterven, extravaseren of worden verplaatst naar het volgende capillaire bed8,9,10,11. Er is echter enig bewijs dat de CTC-grootte in vivo heterogeener kan zijn en dat kleinere CTC's detecteerbaar zijn12. Daarom, op basis van afstand en bloedstroomsnelheid, kunnen CTC's slechts enkele seconden vrij circuleren tussen deze perioden van beknelling, hoewel een kwantitatieve beschrijving van dit gedragontbreekt 13.
Bovendien kunnen ze, afhankelijk van waar CTC's in de bloedsomloop terechtkomen, door meerdere capillaire bedden in de longen en andere perifere plaatsen en door zowel het rechter- als linkerhart gaan voordat ze hun eindbestemming bereiken. Onderweg worden CTC's blootgesteld aan verschillende hemodynamische spanningen, waaronder vloeistofschaarspanning (FSS), drukkrachten tijdens hun beknelling in de microcirculatie en mogelijk tractiekrachten onder omstandigheden waarin ze leukocytenachtig langs de wanden van bloedvaten kunnen rollen14. Zo is zowel het vermogen om de circulatie te modelleren als het begrip van het te modelleren CTC-gedrag beperkt. Vanwege deze onzekerheid moeten alle bevindingen van in vitro modelsystemen worden gevalideerd in een experimenteel gewerveld organisme en uiteindelijk bij kankerpatiënten.
Met de bovengenoemde kanttekeningen toont dit document een relatief eenvoudig model om FSS toe te passen op cellen in suspensie om de effecten van FSS op CTC's te onderzoeken die voor het eerst werden beschreven in 201215. FSS is het gevolg van wrijving van de bloedstroom tegen de vaatwand, die een parabolische snelheidsgradiënt produceert onder omstandigheden van laminaire stroming in grotere vaten. Cellen ervaren hogere niveaus van FSS in de buurt van vaatwanden en lagere niveaus in de buurt van het centrum van het bloedvat. Vloeibare viscositeit, debiet en afmetingen van de leiding waardoor de stroom optreedt, beïnvloeden FSS, zoals beschreven door de Hagen-Poiseuille-vergelijking. Dit geldt voor bloedstromen die zich gedragen als Newtoniaanse vloeistoffen, maar houdt geen stand voor de microcirculatie. Fysiologische FSS varieert over verschillende ordes van grootte met de laagste niveaus in de lymfeklieren (<1 dyn/cm2) en de hoogste in regio's rond hartkleppen en atherosclerotische plaques (>500 dyn/cm2)5. Gemiddelde wandschaar stress in slagaders is 10-70 dyn/cm2 en 1-6 dyn/cm2 in aderen16,17.
In het hart kunnen cellen worden blootgesteld aan turbulente stromen rond klepbijsluiters waar fss op zeer hoog niveau, maar zeer korte duur kan worden ervaren18,19. Hoewel het bioprocessingveld de effecten van FSS op zoogdiercellen in suspensie lang heeft bestudeerd, kan deze informatie van beperkte waarde zijn voor het begrijpen van de effecten van FSS op CTC's, omdat het zich over het algemeen richt op veel lagere fss-niveaus die gedurende een lange duur worden toegepast20. Zoals hieronder beschreven, kan men met behulp van een spuit en naald relatief hoge (tientallen tot duizenden dyn/cm2)FSS gedurende een relatief korte (milliseconden) duur toepassen op een celsuspensie. Sinds de eerste beschrijving van dit model15hebben anderen het gebruikt om de effecten van FSS op kankercellen21 , 22,23te bestuderen . Meerdere "pulsen" van FSS kunnen in korte tijd op celsuspensingen worden toegepast om downstream experimentele analyses te vergemakkelijken. Dit model kan bijvoorbeeld worden gebruikt om het vermogen van cellen te meten om mechanische vernietiging door FSS te weerstaan door de levensvatbaarheid van cellen te meten als functie van het aantal toegepaste pulsen. Als alternatief kunnen de effecten van FSS-blootstelling op de biologie van kankercellen worden onderzocht door cellen te verzamelen voor een verscheidenheid aan downstream-analyses. Belangrijk is dat een deel van de celophanging is gereserveerd als een statische regeling om de effecten van FSS te vergelijken met die welke kunnen worden geassocieerd met celloslating en de tijd die in de suspensie wordt vastgehouden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celvoorbereiding
- Laat cellen vrij uit weefselkweekschaal wanneer 70-90% samenvloeit door de aanbevolen richtlijnen voor de gebruikte cellijn te volgen.
- Aspireer bijvoorbeeld het groeimedium voor PC-3-cellen en was de schaal van 10 cm cellen met 5 ml calcium- en magnesiumvrije fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Aspireer de PBS voordat u 1 ml 0,25% trypsine toevoegt volgens het protocol van de fabrikant.
- Voeg na het observeren van de loslating van de cellen onder een omgekeerde microscoop 5 ml DMEM:F12-medium toe dat 10% foetale runderserum bevat om de trypsine te remmen.
- Plaats de celsuspensie in een conische buis.
- Bepaal de celconcentratie en het totale celnummer.
- Pelletcellen door centrifugeren (300 × g gedurende 3 min), aspireren het supernatant en resuspend cellen in serumvrij weefselkweekmedium tot 5 × 105 cellen/ml.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat het testmedium ten minste 1,17 mM Ca++ bevat, aangezien is aangetoond dat extracellulaire Ca++ vereist is voor cellulaire resistentie tegen FSS15.
2. Blootstelling aan vloeistofschaarspanning
- Voordat u cellen aan FSS blootstelt, snijdt u een polystyreenbuis met ronde bodem van 14 ml op de 7 ml-lijn. Meng de celsuspensie, plaats 5 ml van de suspensie in de snijbuis en verzamel statische controlemonsters.
OPMERKING: Het volume dat nodig is om het statische monster te verzamelen, is afhankelijk van de gebruikte levensvatbaarheidstest (zie stap 3). - Trek de celsuspensie in een spuit van 5 ml en bevestig een naald van 30 G 1/2". Maak de naald los, plaats de spuit op een spuitpomp, zet de spuit vast en stel het debiet in om het gewenste FSS-niveau te bereiken.
OPMERKING: Tabel 1 toont de maximale wandschuivingsspanning voor verschillende naalden en debieten, evenals het minimumniveau van FSS afhankelijk van de celgrootte (10, 15 en 20 μm). Inspecteer de naald voor gebruik om er zeker van te zijn dat deze niet gebogen is; indien onzeker, vervang de naald door een nieuwe. Naaldintegriteit kan een aanzienlijke impact hebben op het toegepaste FSS-niveau. - Laat de spuitpomp draaien en verzamel het geschoren monster in de snijbuis onder een hoek van ongeveer 45°, om schuimvorming te verminderen. Verzamel een monster afhankelijk van het type levensvatbaarheidstest of downstream-testbehoeften.
- Verwijder voorzichtig de spuit en naald uit de spuitpomp en gebruik een tang om de naald uit de spuit te verwijderen, waarbij u ervoor zorgt dat u de naald niet aanraakt.
OPMERKING: Niet-afgeschuinde naalden kunnen door elkaar worden gebruikt met afgeschuinde naalden als extra veiligheidsmaatregel.
- Verwijder voorzichtig de spuit en naald uit de spuitpomp en gebruik een tang om de naald uit de spuit te verwijderen, waarbij u ervoor zorgt dat u de naald niet aanraakt.
- Trek de geschoren suspensie terug in de spuit, bevestig de naald voorzichtig opnieuw met een tang en plaats deze terug in de spuitpomp.
- Herhaal stap 2.3 en 2.4 totdat de celsuspensie is blootgesteld aan het gewenste aantal pulsen FSS.
OPMERKING: Om het vermogen van cellen te beoordelen om mechanische vernietiging door FSS-blootstelling te weerstaan, wordt de celsuspensie meestal onderworpen aan 10 pulsen FSS. Het is echter aangetoond dat cellen biologische aanpassingen beginnen te ondergaan als reactie op FSS na 2 pulsen24.
3. Levensvatbaarheidsmeting
OPMERKING: De levensvatbaarheid kan worden beoordeeld met behulp van enzymatische assays (luciferase, resazurin en WST-1), het tellen van intacte cellen, flowcytometrie of door clonogene assays.
- Verzamel voor alle levensvatbaarheidsmetingen een monster voordat u cellen aan FSS blootstelt.
- Neem voor enzymatische assays dubbele 100 μL aliquots en plaats ze in een 96-well plaat.
- Neem voor flowcytometrie één 500 μL aliquot en plaats deze in een buis van 1,5 ml.
- Verzamel voor clonogene assay een aliquot van 100 μL.
- Enzymatische test
- Verzamel 100 μL monsters na 1, 2, 4, 6, 8 en 10 pulsen fss-blootstelling en plaats ze in een 96-put plaat.
- Voeg het gewenste substraat toe en volg het protocol voor de gebruikte test:
- Voeg voor resazurin 20 μL van een 0,15 mg/ml oplossing toe aan elke put. Voeg 20 μL resazurin-oplossing van 0,15 mg/ml toe aan putten die alleen al 100 μL medium bevatten. Incubeer gedurende 2 uur in een weefselkweek-incubator van 37 °C. Meet de absorptie met behulp van een plaatlezer die fluorescentie kan lezen (579 excitatie/ 584 emissie).
- Voeg voor luciferase-uitdrukkende cellen 100 μL van 15 mg/ml D-luciferine toe aan 5 ml medium. Voeg 100 μL van die oplossing toe aan elke put die cellen bevat. Wacht 5 minuten en lees de plaat vervolgens met een lezer die compatibel is met luminescentie.
- Voeg voor WST-1 10 μL WST-1 toe aan elke put, inclusief putten die alleen medium bevatten. Incubeer gedurende 4 uur en lees vervolgens de absorptie tussen 420 en 480 nm met behulp van een plaatlezer.
- Vergelijk het gemiddelde signaal van elk van de fss-blootgestelde monsters met het gemiddelde statische controlemonster om het percentage levensvatbare cellen te verkrijgen.
- Flow cytometrie24
- Verzamel 500 μL monsters en plaats ze in 1,5 ml centrifugebuizen na 1, 2, 5 en 10 pulsen FSS.
- Centrifugeer monsters (500 × g gedurende 3 min) en gooi de supernatanten weg.
- Resuspendeer de pellets met 1 ml calcium- en magnesiumvrije PBS en centrifugeer de monsters (300 × g gedurende 3 min).
- Schors de pellets met 500 μL fluorescentie-geactiveerde celsorteerbuffer (FACS) (PBS met 0,5% runderserumalbumine en 0,1% natriumaziide) met telparels en membraanondoorlatende of levensvatbaarheidskleurstoffen zoals propidiumjodide (1,75 μg/ml).
- Bepaal de levensvatbaarheid door de verhouding van levensvatbare cellen, genormaliseerd tot het tellen van kralen, in geschoren monsters te vergelijken met die van het statische monster.
- Clonogene assay
- Neem 100 μL van het statische monster en voeg 900 μL groeimedium toe om een verdunning van 1:10 te maken.
- Neem 100 μL van het verdunde monster van 1:10 en voeg 900 μL groeimedium toe om een laatste verdunning van 1:100 te maken.
- Voeg 100 μL van het verdunningsmonster van 1:100 toe aan elk van de 3 putten van een 6-wells schaal met 2 ml groeimedium.
- Herhaal stap 3.4.1-3.4.3 met monsters die zijn onderworpen aan 10 pulsen FSS.
- Laat de cellen 7-10 dagen groeien zonder het medium te veranderen en controleer op kolonievorming. Zodra kolonies van ≥50 cellen zijn gevormd, aspireren het groeimedium, spoel elk goed af met 1 ml PBS, aspireer de PBS en fix gedurende 5 minuten met 1 ml ijskoude 70% ethanol (EtOH). Belangrijk is dat u zowel geschoren als statische monsters tegelijkertijd repareert
- Na het bevestigen van de monsters, aspireer de EtOH en voeg 1 tot 2 ml kristalvioletoplossing (0,1% kristalviolet in 90% H2O, 10% EtOH) toe gedurende 5 minuten.
- Spoel af met een teveel aan water en laat de plaat drogen
- Tel de kolonies (clusters van ≥50 cellen) voor zowel de statische als de geschoren monsters. Vergelijk de verhouding tussen het gemiddelde aantal kolonies van het geschoren monster en het gemiddelde aantal kolonies uit het statische monster om de levensvatbaarheid te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eerder is aangetoond dat verhoogde resistentie tegen fss-geïnduceerde mechanische vernietiging een geconserveerd fenotype is over meerdere kankercellijnen en kankercellen die vers geïsoleerd zijn van tumoren ten opzichte van niet-getransformeerde epitheelcelvergelijkers15,24. Hier werden aanvullende kankercellijnen van verschillende weefseloorsprongen (tabel 2) getest om aan te tonen dat de meerderheid van deze cellen levensvatbaarheid ≥ 20% vertoont na 10 pulsen FSS bij 250 μL/s. De enige uitzondering zijn MiaPaCa2-cellen, die relatief gevoelig waren voor mechanische vernietiging door FSS (levensvatbaarheid ≤ 10%). Om het FSS-resistentieprofiel van een cellijn adequaat te beschrijven, worden n ≥ 3 biologische replica's aanbevolen.
Ter vergelijking: alle onderzochte niet-getransformeerde epitheelcellen hebben onder deze omstandigheden een levensvatbaarheid <10% 15,24. Hoewel er dus een bereik in FSS-resistentie wordt waargenomen, vertonen de meerderheid van de geteste kankercellijnen een grotere FSS-resistentie dan niet-getransformeerde cellen. Kankercellijnen kunnen worden afgeleid van zowel primaire tumorweefsels als uitzaaiingen. Men zou kunnen postuleren dat cellen afgeleid van uitzaaiingen een grotere FSS-resistentie kunnen vertonen, omdat dit fenotype mogelijk is geselecteerd tijdens gemetastaseerde verspreiding. Het fss-resistentieniveau bleek echter niet afhankelijk te zijn van de vraag of cellen afkomstig waren van primaire tumoren of uitzaaiingen15,24. Bovendien correleerden de niveaus van FSS-resistentie niet met gemetastaseerd potentieel in een reeks menselijke prostaatkankercellijnen15.
Om dit verder te testen werden BALB/c melkklierepitheelcellen met wisselend gemetastaseerd potentieel (4T1 = zeer gemetastaseerd, 4T07 = zwak tot matig gemetastaseerd potentieel, 67NR = nee tot laag gemetastaseerd potentieel25,26) gebruikt. Uit dit experiment is gebleken dat fss-resistentie niet gecorreleerd is met gemetastaseerd potentieel (figuur 1). Bovendien vertonen zowel 4T1- als 4T07-cellen een bifasisch verlies van levensvatbaarheid van cellen - een groter verlies aan levensvatbaarheid in pulsen 1-2 dan waargenomen in daaropvolgende pulsen. Dit is typerend voor de meeste kankercellijnen die door deze groep worden onderzocht. 67NR vertoont daarentegen een meer lineair verlies van cel levensvatbaarheid als functie van FSS. Gezamenlijk tonen de gegevens uit tabel 2 en figuur 1 aan dat FSS-resistentie een eigenschap is van getransformeerde cellen.
Figuur 1: Fluid shear stress resistance of syngeneic BALB/c mammary epithelial cancer cells. Cellen werden blootgesteld aan FSS (30 G naald, 10 pulses@250 ml/s), en de levensvatbaarheid werd gemeten met behulp van resazurin conversie (n = 4/cel lijn). Terwijl fss-blootstelling het aantal levensvatbare cellen verminderde (p < 0,0001, 2-weg ANOVA), en elke cellijn verschillende weerstandsprofielen vertoonde (p = 0,0446, 2-weg ANOVA), was er geen significant verschil tussen cellijnen na 10 pulsen van FSS-blootstelling (p = 0,2833, 2-weg ANOVA). Afkortingen: FSS = fluid shear stress; ANOVA = analyse van variantie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Afschuiving (τ): | wand (maximaal) | minimum | |||||||||||
| Celdiameter: | N.V.T | 10 μm | 15 μm | 20 μm | |||||||||
| Naald gauge: | 30 | 27 | 25 | 30 | 27 | 25 | 30 | 27 | 25 | 30 | 27 | 25 | |
| Debiet (μL/s) | 20 | 507 | 220 | 116 | 32 | 10 | 4 | 48 | 16 | 7 | 64 | 21 | 9 |
| 50 | 1267 | 550 | 290 | 80 | 26 | 11 | 120 | 39 | 17 | 159 | 52 | 22 | |
| 100 | 2534 | 1100 | 580 | 159 | 52 | 22 | 239 | 79 | 33 | 319 | 105 | 45 | |
| 150 | 3801 | 1650 | 869 | 239 | 79 | 33 | 359 | 118 | 50 | 478 | 157 | 67 | |
| 200 | 5068 | 2200 | 1159 | 319 | 105 | 45 | 478 | 157 | 67 | 637 | 210 | 89 | |
| 250 | 6335 | 2750 | 1449 | 398 | 131 | 56 | 598 | 196 | 84 | 797 | 262 | 111 | |
Tabel 1: Maximale afschuifspanning (τwand)niveaus. De tabel geeft de maximale FSS-niveaus aan de muur in dyn/cm2 voor naalden van 30 G, 27 G en 25 G bij de debieten van 20, 50, 100, 150, 200 en 250 μL/s. De afschuifspanningsniveaus werden berekend met behulp van de Poiseuille-vergelijking ( 
), beschikbare informatie voor de binnendiameter van elke naaldmeter, evenals de veronderstelling dat μ = 0,01 dyn·s/cm2. De minimale FSS-niveaus voor elke grootte werden berekend met behulp 
van de straal van de cel r en R de straal van de naald. Afkorting: FSS = fluid shear stress; τ = afschuiving; τmuur = maximale afschuiving; μ = viscositeit; Q = volumetrisch debiet.
| Cellijn | Weefselbron | Soort | Gemiddelde levensvatbaarheid (%) na 10 pulsen |
| TRAMPC1 | Prostaat | Muis | 40 |
| 4T01 | Borst | Muis | 32 |
| 4T7 | Borst | Muis | 43 |
| 67NR | Borst | Muis | 46 |
| 66CL4 | Borst | Muis | 28 |
| RT4 | Blaas | Menselijk | 62 |
| W17-266-4 | Melanoom | Menselijk | 46 |
| HS852 | Melanoom | Menselijk | 41 |
| HS695 | Melanoom | Menselijk | 41 |
| A2058 | Melanoom | Menselijk | 37 |
| A375 | Melanoom | Menselijk | 37 |
| RPMI-7951 | Melanoom | Menselijk | 35 |
| SKMEL2 | Melanoom | Menselijk | 29 |
| A101D | Melanoom | Menselijk | 28 |
| MiaPaCa | Alvleesklier | Menselijk | 7 |
Tabel 2: Vochtschering stressbestendigheid van verschillende kankercellijnen. Elke kankercellijn werd blootgesteld aan vloeistofschuivingsspanning van het spuit- en naaldmodel (30 G naald, 10 pulses@250 ml/s) (n ≥ 3/cellijn), en de levensvatbaarheid werd gemeten door luciferaseactiviteit of resazurineconversie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel demonstreert de toepassing van FSS op kankercellen in suspensie met behulp van een spuit en naald. Met behulp van dit model is aangetoond dat kankercellen beter bestand zijn tegen korte pulsen van fss op hoog niveau ten opzichte van niet-getransformeerde epitheelcellen15,22,24. Bovendien resulteert blootstelling aan FSS met behulp van dit model in een snelle toename van celstijfheid, activering van RhoA en verhoogde corticale F-actine en myosine II-gebaseerde contractiliteit24,27. Snelle mechano-aanpassing (het vermogen van CTC 's om min of meer stijf te worden, afhankelijk van de omstandigheden) kan de mechanische vernietiging van CTC 's voorkomen en andere aspecten van gemetastaseerde kolonisatievergemakkelijken 24,28. De bevindingen met behulp van dit in vitro model zijn namelijk bevestigd met behulp van experimentele CTC's in diermodellen24. Deze snelle mechano-aanpassing verklaart waarschijnlijk het bifasische verlies van cel levensvatbaarheid dat doorgaans in dit model wordt waargenomen (figuur 1), d.w.z. FSS-naïeve cellen zijn vatbaarder voor vernietiging dan cellen die zelfs zijn blootgesteld aan een enkele puls FSS. Alles bij elkaar genomen geeft dit aan dat FSS een snelle celverstijving in kankercellen veroorzaakt die hen beschermt tegen daaropvolgende pulsen van FSS.
Hoewel de RhoA-actomyosine-as een belangrijke aanjager is van FSS-weerstand15,21,24, zijn er waarschijnlijk andere mechanismen betrokken29. Verder bewijs dat celstijfheid een belangrijke determinant van FSS-resistentie is, is dat verstoring van lamin A, die de structurele integriteit van de kern- het stijfste onderdeel van de cel regelt, de FSS-weerstand in kankercellen vermindert met behulp van dit model22. We gebruiken dit model om de mechanismen van FSS-resistentie in kankercellen verder te onderzoeken. Hier is dit model gebruikt om de capaciteit van verschillende kankercellijnen te meten om mechanische vernietiging te weerstaan door cellen bloot te stellen aan korte pulsen van hoge fss-niveaus. Hoewel dit een relatief goedkoop, eenvoudig model is om in het laboratorium te ontwikkelen, met als duurste element de spuitpomp, moet ervoor worden gezorgd dat het protocol trouw wordt gevolgd om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Meerdere pulsen van FSS kunnen in zeer korte tijd op cellen worden aangebracht, < 10min. De totale verstreken tijd voor het experiment is afhankelijk van het suspensievolume, het debiet, het pulsnummer en de behendigheid van de gebruiker die de suspensie tussen pulsen overbrengt. Met ervaring kan een 5 ml suspensie blootgesteld aan FSS met een 30 G naald gedurende 10 pulses@250 μL/s worden verwerkt in ~ 10 min. Voor de meeste cellijnen is er minimaal verlies van levensvatbaarheid als gevolg van het feit dat deze tijd in schorsing wordt gehouden.
Omdat de blootstelling aan FSS relatief snel optreedt, wordt FSS meestal toegepast op celsuspensusingen in serumvrij medium om schuimvorming van de monsters te verminderen. Het verschil in viscositeit tussen 0-10% foetale runderserum is verwaarloosbaar in deze test. Het is echter van cruciaal belang om fysiologische calciumniveaus te garanderen in het medium waarin de cellen worden geschoren. Bovendien werd met betrekking tot de methoden voor celdissociatie vóór fss-blootstelling geen verschil in FSS-resistentie gedetecteerd in PC-3-celsuspensingen bereid door trypsinisatie of behandeling met niet-enzymatische dissociatiemiddelen15. De celconcentratie kan groter of lager zijn dan 5 × 105 cellen/ml, afhankelijk van de downstreamtoepassingsbehoeften. De respons van PC-3 prostaatkankercellen is vergelijkbaar in een bereik van 5 × 104 tot 5 × 105,15. De effecten van celconcentratie op de levensvatbaarheid na fss-blootstelling moeten echter empirisch worden bepaald.
Voor de meeste toepassingen die zijn bedoeld met gekweekte cellen, mag de celdichtheid de viscositeit en dus de hoeveelheid FSS die wordt toegepast, niet significant beïnvloeden. Variabelen, zoals de tijd waarvoor de cellen in suspensie worden gehouden voorafgaand aan fss-blootstelling, moeten constant worden gehouden in experimentele duplo's. Zoals hierboven vermeld, is naaldintegriteit ook van cruciaal belang. In de loop van de tijd zijn in naalden partijvariaties geconstateerd met betrekking tot deze test. Injectienaalden zijn ontworpen voor klinisch gebruik, niet voor de hier gebruikte debieten. In zeldzame gevallen kan de naaf van de naald gedeeltelijk worden afgesloten, wat tijdens daaropvolgende pulsen de doorgang van suspensie door de naald en uiteindelijk de terugstroom rond de zuiger van de spuit afsluit. Verder is het erg belangrijk om te begrijpen dat dode / stervende cellen uitzonderlijk gevoelig zijn voor FSS, zoals eerder getoond24. Daarom, als een bepaalde cellijn een hoog niveau van stervende cellen heeft, hetzij als een routinematig kenmerk of experimentele manipulaties (bijv. medicamenteuze behandelingen), zal dit resulteren in een zeer sterk verlies van levensvatbaarheid van de cel dat mogelijk niet volledig wordt genormaliseerd in vergelijking met de statische controle.
De toepassing van FSS kan worden gecombineerd met andere assays, zoals immunofluorescentie, pulldown-assays en westerse blotting, om het effect van FSS op de kankercelbiologie te bestuderen 24. In principe kan dit model ook worden gebruikt om de effecten van fss op hoog niveau en op korte duur op andere celtypen, waaronder bloedcellen, te onderzoeken. Normale rode bloedcellen en leukocyten zijn veel resistenter tegen FSS die op deze manier worden toegepast dan zelfs kankercellen, wat fysiologisch15. In feite, het niveau van FSS toegepast, met behulp van een 30 G 1/2 " naald met een debiet van 250 ml / s, brackets het bereik dat nodig is voor de verstoring van het rode celmembraan (op basis van milliseconde toepassing van kracht)30,31. Een beperking van dit model, of een beperking waarbij vloeistof door een buis wordt gepasseerd, is dat het precieze niveau van FSS dat cellen ervaren binnen het bereik van de maximale wandschaarspanning en het minimum in het midden van de buis niet bekend is. Bij elke puls ervaren dus niet alle cellen hetzelfde niveau van FSS, en bij herhaalde pulsen wordt van individuele cellen verwacht dat ze bij elke puls binnen het gespecificeerde bereik verschillende niveaus van FSS ervaren.
Hydrodynamische scherpstelling onder de omstandigheden die in dit model worden gebruikt, resulteert er echter in dat cellen worden gericht op het midden van de stroom, weg van de muur, en dus in de richting van een lagere FSS-blootstelling32. Andere modellen, zoals kegel- en plaatviscometers of Couette-kamers, zijn beter geschikt voor het aanbrengen van FSS op constante niveaus op een celsuspensie. Zoals hierboven vermeld, blijft het een uitdaging om fss-blootstelling van CTC's in vitro te modelleren. Dit model is het meest geschikt om de effecten van hoge, maar korte blootstelling aan FSS te testen, zoals zou kunnen gebeuren in het hart. Doorstroming door slagaders en aderen resulteert in langere blootstelling aan lagere niveaus van FSS. Zoals gezegd is het echter onduidelijk hoe lang CTC's in continue stroom in de circulatie blijven, en het meeste experimentele bewijs tot nu toe is consistent met korte perioden (seconden) vrije stroom onderbroken door langere perioden van beknelling in de microcirculatie.
Modellen die kankercellen in suspensie blootstellen aan lagere niveaus van FSS (0,5-60 dyn/cm2) voor langere duur (minuten tot dagen) omvatten kegel- en plaatviscometers, Couette-kamers, continue stroomlussen, spuit met een buisverlenging en microfluïdische apparaten33,34,35,36,37. Deze zijn ook gebruikt om inzicht te krijgen in hoe FSS CTC's kan beïnvloeden en hebben ertoe geleid dat blootstelling aan FSS oxidatieve stress, celproliferatie en invasie, en stamcelachtige kenmerken in verschillende kankercellijnen verhoogt. Het zal interessant zijn om de resultaten van die modellen te vergelijken met de hier beschreven modellen. Met behulp van een continu stroomlusmodel stelden Xin et al. bijvoorbeeld vast dat de ROCK-actomyosine-as een verlies van cel levensvatbaarheid bevorderde in kankercellijnen die gedurende 2-12 uur aan FSS(20dyn/cm 2 ) werden blootgesteld, in schril contrast met de hierboven beschreven gegevens38. De biologische context is dus zeer waarschijnlijk van belang voor al deze in vitro modellen, wat de noodzaak versterkt om bevindingen over CTC's te vertalen naar in vivo modellen en uiteindelijk kankerpatiënten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MDH is medeoprichter, president en aandeelhouder van SynderBio, Inc. DLM is consultant voor SynderBio, Inc.
Acknowledgments
De ontwikkeling van het hier gedemonstreerde model werd ondersteund door DOD-subsidie W81XWH-12-1-0163, NIH-subsidies R21 CA179981 en R21 CA196202 en het Sato Metastasis Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| 14 mL round bottom tubes | Falcon - Corning | 352059 | |
| 30 G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 5 mL syringe | BD | 309646 | |
| 96-well black bottom plate | Costar - Corning | 3915 | |
| Bioluminescence detector | AMI | AMI HTX | |
| BSA, Fraction V | Sigma | 10735086001 | |
| Cell Titer Blue | Promega | G8081 | |
| crystal violet | Sigma | C0775 | |
| D-luciferin | GoldBio | D-LUCK | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Plate Reader | BioTek | Synergy HT | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S2002 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3005 |
References
- Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Strilic, B., Offermanns, S. Intravascular survival and extravasation of tumor cells. Cancer Cell. 32 (3), 282-293 (2017).
- Labelle, M., Hynes, R. O. The initial hours of metastasis: the importance of cooperative host-tumor cell interactions during hematogenous dissemination. Cancer Discovery. 2 (12), 1091-1099 (2012).
- Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
- Weiss, L. Metastatic inefficiency. Advances in Cancer Research. 54, 159-211 (1990).
- Zeidman, I., Mc, C. M., Coman, D. R. Factors affecting the number of tumor metastases; experiments with a transplantable mouse tumor. Cancer Research. 10 (6), 357-359 (1950).
- Fidler, I. J. Metastasis: quantitative analysis of distribution and fate of tumor embolilabeled with 125 I-5-iodo-2'-deoxyuridine. Journal of the National Cancer Institute. 45 (4), 773-782 (1970).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Research. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Luzzi, K. J., et al. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. American Journal of Pathology. 153 (3), 865-873 (1998).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Takagi, H., et al. Analysis of the circulating tumor cell capture ability of a slit filter-based method in comparison to a selection-free method in multiple cancer types. International journal of molecular sciences. 21 (23), 9031 (2020).
- Scott, J., Kuhn, P., Anderson, A. R. Unifying metastasis--integrating intravasation, circulation and end-organ colonization. Nature Reviews Cancer. 12 (7), 445-446 (2012).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Barnes, J. M., Nauseef, J. T., Henry, M. D. Resistance to fluid shear stress is a conserved biophysical property of malignant cells. PLoS One. 7 (12), 50973 (2012).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Brass, L. F., Diamond, S. L. Transport physics and biorheology in the setting of hemostasis and thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 906-917 (2016).
- Stein, P. D., Sabbah, H. N. Turbulent blood flow in the ascending aorta of humans with normal and diseased aortic valves. Circulation Research. 39 (1), 58-65 (1976).
- Strony, J., Beaudoin, A., Brands, D., Adelman, B. Analysis of shear stress and hemodynamic factors in a model of coronary artery stenosis and thrombosis. The American Journal of Physiology. 265 (5), Pt 2 1787-1796 (1993).
- Chalmers, J. J. Mixing, aeration and cell damage, 30+ years later: what we learned, how it affected the cell culture industry and what we would like to know more about. Current Opinion in Chemical Engineering. 10, 94-102 (2015).
- Vennin, C., et al. Trsient tissue priming via ROCK inhibition uncouples pancreatic cancer progression, sensitivity to chemotherapy, and metastasis. Science Translational Medicine. 9 (384), 126 (2017).
- Mitchell, M. J., et al. Lamin A/C deficiency reduces circulating tumor cell resistance to fluid shear stress. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 309 (11), 736-746 (2015).
- Ortiz-Otero, N., et al. Cancer associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression. Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).
- Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
- Miller, B. E., Miller, F. R., Wilburn, D. J., Heppner, G. H. Analysis of tumour cell composition in tumours composed of paired mixtures of mammary tumour cell lines. British Journal of Cancer. 56 (5), 561-569 (1987).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Research. 52 (6), 1399 (1992).
- Chivukula, V. K., Krog, B. L., Nauseef, J. T., Henry, M. D., Vigmostad, S. C. Alterations in cancer cell mechanical properties after fluid shear stress exposure: a micropipette aspiration study. Cell Health Cytoskeleton. 7, 25-35 (2015).
- Gensbittel, V., et al. Mechanical adaptability of tumor cells in metastasis. Developmental Cell. 56 (2), 164-179 (2021).
- O'Leary, B. R., et al. Pharmacological ascorbate inhibits pancreatic cancer metastases via a peroxide-mediated mechanism. Scientific Reports. 10 (1), 17649 (2020).
- Williams, A. R., Hughes, D. E., Nyborg, W. L. Hemolysis near a transversely oscillating wire. Science. 169 (3948), 871-873 (1970).
- Rooney, J. A. Hemolysis near an ultrasonically pulsating gas bubble. Science. 169 (3948), 869-871 (1970).
- Connolly, S., McGourty, K., Newport, D. The in vitro inertial positions and viability of cells in suspension under different in vivo flow conditions. Scientific Reports. 10 (1), 1711 (2020).
- Brooks, D. E. The biorheology of tumor cells. Biorheology. 21 (1-2), 85-91 (1984).
- Triantafillu, U. L., Park, S., Klaassen, N. L., Raddatz, A. D., Kim, Y. Fluid shear stress induces cancer stem cell-like phenotype in MCF7 breast cancer cell line without inducing epithelial to mesenchymal transition. Internation Journal of Oncology. 50 (3), 993-1001 (2017).
- Fan, R., et al. Circulatory shear flow alters the viability and proliferation of circulating colon cancer cells. Scientific Reports. 6, 27073 (2016).
- Fu, A., et al. High expression of MnSOD promotes survival of circulating breast cancer cells and increases their resistance to doxorubicin. Oncotarget. 7 (31), 50239-50257 (2016).
- Li, S., et al. Shear stress promotes anoikis resistance of cancer cells via caveolin-1-dependent extrinsic and intrinsic apoptotic pathways. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3730-3743 (2019).
- Xin, Y., et al. Mechanics and actomyosin-dependent survival/chemoresistance of suspended tumor cells in shear flow. Biophysical Journal. 116 (10), 1803-1814 (2019).
