Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الكشف عن الأجسام المضادة المحايدة للسارس-CoV-2 باستخدام التصوير الفلوري عالي الإنتاجية للعدوى بالفيروس الزائف

Published: June 5, 2021 doi: 10.3791/62486
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

Summary

يحدد البروتوكول الموصوف هنا طريقة سريعة وفعالة لقياس تحييد الأجسام المضادة ضد بروتين ارتفاع السارس-CoV-2 من خلال تقييم قدرة عينات المصل النقاهة على منع العدوى عن طريق فيروس التهاب الفم الفلوري الأخضر المعزز المسمى بالبروتين المركبات الزائف مع ارتفاع الجليكوبروتين.

Abstract

ومع استمرار تطور جائحة COVID-19 الناجمة عن الفيروس التاجي للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (سارس-كوف-2)، أصبح من الواضح أن وجود أجسام مضادة لتحييد الفيروس قد يوفر الحماية من العدوى في المستقبل. وهكذا، ومع استمرار إنشاء وترجمة لقاحات فعالة من نوع COVID-19 بسرعة لم يسبق لها مثيل، فإن تطوير أساليب سريعة وفعالة لقياس تحييد الأجسام المضادة ضد السارس-CoV-2 سيصبح ذا أهمية متزايدة لتحديد الحماية طويلة الأجل من العدوى لكل من الأفراد المصابين سابقا والمحصنين. تصف هذه الورقة بروتوكولا عالي الإنتاجية باستخدام فيروس التهاب الفم الحويصلات (VSV) الزائف مع بروتين ارتفاع السارس-CoV-2 لقياس وجود الأجسام المضادة المحايدة في مصل النقاهة من المرضى الذين تعافوا مؤخرا من COVID-19. إن استخدام فيروس زائف التكرار يلغي الحاجة إلى مرفق احتواء من المستوى 3 مطلوب للتعامل مع السارس-CoV-2، مما يجعل هذا البروتوكول في متناول أي مختبر من مستوى الاحتواء 2 تقريبا. استخدام شكل 96 جيدا يسمح للعديد من العينات ليتم تشغيلها في نفس الوقت مع وقت تحول قصير من 24 ساعة.

Introduction

في ديسمبر 2019 ، تم تحديد فيروس كورونا الجديد ، والذي نعرفه الآن باسم SARS-CoV-2 ، العامل المسبب لمرض الفيروس التاجي 2019 (COVID-19)1. سارس-كوف-2 هو فيروس بيتاكورونا ينتمي إلى عائلة كورونافيريداي. هذه الفيروسات المغلفة تضم جينوم الحمض النووي الريبي كبير إيجابي الإحساس وهي مسؤولة عن التهابات الجهاز التنفسي والأمعاء في كل من البشر والحيوانات2. وحتى مايو 2021، تم الإبلاغ عن أكثر من 157 مليون حالة إصابة ب COVID-19 على مستوى العالم وأكثر من 3.2 مليون حالة وفاة3. أصبح تطوير لقاح فعال الهدف الرئيسي للباحثين في جميع أنحاء العالم مع ما لا يقل عن 77 لقاحا قبل السريري قيد التحقيق و90 يخضع حاليا لتجارب سريرية4.

الفيروسات التاجية ترميز أربعة بروتينات الهيكلية بما في ذلك البروتين ارتفاع (S), nucleocapsid (N), بروتين المغلف (E), وبروتين الغشاء (M). دخول سارس-CoV-2 يتطلب التفاعل بين المجال مستقبلات ملزمة (RBD) من S مع مستقبلات المضيف, أنزيم تحويل الأنجيوتنسين الإنسان 2 (hACE2), وانصهار الغشاء اللاحقة بعد انشقاق بروتيوليتيك بواسطة بروتياز سيرين الخلوية المضيفة, transmembrane protease سيرين 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . وقد تم الإبلاغ سابقا عن المناعية الفكاهية للبروتين S من السارس-CoV وقد ثبت الآن أيضا للسارس-CoV-211,12,13. في الواقع ، تم الكشف عن تحييد استجابات الأجسام المضادة ضد S في مصل النقاهة من مرضى السارس -CoV بعد 24 شهرا من العدوى14، مما يسلط الضوء على دورهم الحاسم في الاستجابة المناعية على المدى الطويل. وقد تم تحديد البروتين S كهدف لقاح واعدة، وبالتالي أصبح عنصرا رئيسيا في معظم اللقاحات قيد التطوير15،16.

وفي حين أن الكشف السريع عن تحييد الأجسام المضادة جانب حاسم من جوانب تطوير اللقاح، فإنه قد يلقي الضوء أيضا على معدل العدوى والمراقبة المصلية الوبائية في المناطق المتضررة17. النسخ المتماثل المختصة VSV الزائفة مع السارس-CoV-2 S glycoprotein, بدلا من البروتين البروتيني VSV البرية من نوع, لدراسة عدوى السارس-CoV-2 في إعدادات مستوى السلامة البيولوجية 2 تبرعت بلطف من قبل ويلان وزملاء العمل18. سيتم استخدام VSV التعبير عن ارتفاع (VSV-S) لتحديد استجابة الأجسام المضادة تحييد ضد بروتين ارتفاع السارس-CoV-2. كما VSV-S المستخدمة هنا يعبر أيضا عن تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (eGFP), قد يتم الكشف عن بؤر eGFP في غضون 24 ساعة لقياس العدوى, في حين أن تشكيل البلاك يمكن أن يستغرق 48 إلى 72 ساعة. ملخص هنا هو بروتوكول بسيط وفعال لتحديد قدرة مصل المريض النقاهة لتحييد العدوى VSV-S-eGFP. ويمكن أيضا تكييف هذه الطريقة بسهولة لاستجواب العلاجات المحتملة الأخرى التي تهدف إلى تعطيل التفاعل الفيروسي المضيف للبروتين سارس-CoV-2 S.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. خلايا الطلاء (اليوم 1) لإنتاج وتحديد كمي من الفيروس الزائف سارس-CoV-2

  1. التحضير زراعة الأنسجة
    1. دافئ 1x دولبيكو الفوسفات العازلة المالحة (DPBS); دولبيكو النسر المعدل المتوسط (DMEM) التي تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / العقدية (اختياري)؛ و 0.25٪ من حمض التتراكسيتيك تريبسين-إيثيلينديامين (EDTA) إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 15 دقيقة تقريبا.
    2. تطهير غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة مع الإيثانول 70٪، ووضع أطباق زراعة الأنسجة، ماصة باستور، وماصة المصلية في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة حسب الحاجة. إزالة برنامج تلفزيوني، DMEM، والتريبسين من حمام الماء، وتطهير مع الإيثانول 70٪ قبل وضعها في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة.
  2. طلاء والحفاظ على الخلايا
    1. تنمو خلايا Vero E6 في DMEM (التي تحتوي على 10٪ FBS) في قوارير زراعة الأنسجة T75 أو أطباق زراعة الأنسجة 15 سم في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. مرور الخلايا حسب الحاجة عندما تكون الخلايا التقاء 80-90٪.
    2. غسل الخلايا بإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني 1x إلى كل طبق وهزاز بلطف 4-5 مرات; يستنشق برنامج تلفزيوني. إضافة 3 مل من تريبسين-EDTA إلى كل طبق، صخرة لوحة لضمان تغطية السطح بأكمله. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 5 دقائق تقريبا، أو حتى الخلايا قد انفصلت.
    3. إضافة 7 مل من DMEM (التي تحتوي على 10٪ FBS) لتعطيل تريبسين، وإعادة إنفاق الخلايا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات. تدور أسفل الخلايا لإزالة التريبسين باستخدام جهاز طرد مركزي benchtop في 500 × ز لمدة 5 دقائق، يستنشق وسائل الإعلام دون إزعاج بيليه الخلية، وإعادة إنفاق الخلايا في 10 مل من DMEM (التي تحتوي على 10٪ FBS). إذا كانت الخلايا مطلوبة للتجارب المستقبلية، ضع 1 مل في طبق جديد يحتوي على 15 مل من DMEM الطازج (يحتوي على 10٪ FBS).
    4. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس الدم، وإضافة ما يقرب من 1 × 107 خلايا إلى كل لوحة 15 سم، واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 حتى أنها التقاء 100٪ (1-2 أيام).

2. VSV-S-EGFP إعداد الفيروس الزائف

  1. عدوى
    1. تصيب الخلايا في تعدد العدوى (MOI) 0.01 مع VSV-S-eGFP فيروس الأسهم في 12 مل من DMEM خالية من المصل لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2، هزاز لوحات في بعض الأحيان. استبدال inoculum مع DMEM جديدة (تحتوي على 2٪ FBS و 20 MM HEPES، درجة الحموضة 7.7)، والانتقال إلى حاضنة تعيين إلى 34 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
      ملاحظة: يلزم وجود درجة حرارة 34 درجة مئوية لنشر VSV-S-eGFP في زراعة الخلايا.
    2. جمع الخلايا الفائقة عند ملاحظة تأثير الاعتلال الخلوي واسعة النطاق (CPE) وانفصال الخلية، ما يقرب من 48 ساعة بعد العدوى. استخدام المجهر الفلورسنت لتصور التعبير واسعة من eGFP من قبل الخلايا المصابة ابتداء من 24 ساعة بعد العدوى.
  2. مجموعة
    1. طرد مركزي للناطجات باستخدام جهاز طرد مركزي على سطح المقعد لمدة 5 دقائق عند 1000 × غرام عند 4 درجات مئوية لإزالة حطام الخلية. Aliquot العملاقة لتجنب عدة دورات تجميد ذوبان الجليد، وتخزينها في -80 درجة مئوية.

3. تأليه VSV-S-eGFP الزائفة

  1. تخفيف المسلسل لتحديد التيتر الفيروسية
    1. لوحة Vero E6 الخلايا على لوحات 6-جيدا في كثافة البذر من 6 × 105 خلايا لكل بئر في DMEM (مع 10٪ FBS), واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام خلايا Vero التي تفرط في التعبير عن TMPRSS2 و hACE2.
    2. إعداد سلسلة تخفيف تسلسلي 10 أضعاف من فيروس VSV-S-eGFP في DMEM الخالية من المصل البارد عن طريق وضع 900 ميكرولتر من الوسائط في سبعة أنابيب الطرد المركزي الدقيق. أنابيب التسمية من 1 إلى 7. إضافة 100 ميكرولتر من المخزون الفيروسي إلى الأنبوب الأول ودوامة لفترة وجيزة. نقل 100 ميكرولتر من الفيروس المخفف من الأنبوب 1 إلى الأنبوب 2 ودوامة لفترة وجيزة؛ يستمر حتى الأنبوب 7.
    3. يستنشق الوسط من جميع آبار لوحة 6-well التي تحتوي على خلايا Vero E6 ، ويستبدل ب 500 ميكرولتر من التخفيفات10-2 إلى 10-7. احتضان لوحات لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2،هزاز بلطف كل 15 دقيقة.
    4. أسبيرات inoculum واستبدال مع تراكب تحتوي على خليط 1:1 من 2x DMEM و 6٪ كاربوكسي ميثيل السليلوز (CMC)، والتركيز النهائي من 3٪ CMC، تكملها مع 10٪ FBS؛ حضانة في 34 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة.
      ملاحظة: قم بتدفئة خليط التراكب مسبقا في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أثناء خطوة العدوى. ويمكن استخدام خليط 1:1 من 1٪ agarose مع 2x DMEM تكملها مع 10٪ FBS بدلا من CMC. لتراكب مع agarose، يغلي 1٪ agarose (في DH2O) وتخلط مع DMEM 2x الباردة. تأكد من أن الخليط هو درجة حرارة مناسبة قبل إضافة إلى أحادي الخلية (حوالي 37-40 درجة مئوية). إذا تم استخدام الآغاروز للتراكب ، فيجب إصلاح الخلايا عن طريق احتضان 2 مل من الميثانول 3:1: حمض الخليك لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل التلطيخ.
  2. تلطيخ وحساب التيتر الفيروسي
    1. تصور لويحات عن طريق تلطيخ مع الكريستال البنفسجي أو التصور المباشر من eGFP تحت المجهر الفلورسنت.
    2. إلى لوحات وصمة عار، يستنشق تراكب، يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، ثم إضافة 2 مل من 0.1٪ البنفسجي الكريستال (في 80٪ الميثانول وDH2O) إلى كل بئر. ضعه على طبق روك لمدة 20 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة قبل إزالة التلطيخ. إزالة الكريستال البنفسجي، وغسل بلطف كل بئر مرتين باستخدام DH2O أو PBS.
      ملاحظة: يجب إجراء خطوات الغسيل والتلطيخ بلطف عن طريق الأنابيب ببطء نحو جانب كل بئر لضمان بقاء الطبقة الأحادية الخلية سليمة طوال العملية.
    3. السماح للوحات لتجف لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل عد لويحات. تأكد من الحصول على عدد البلاك من الآبار التي تحتوي على 20 إلى 200 لويحة. لحساب تأصل الفيروس في وحدات تشكيل البلاك (PFU) لكل مل ، قم بضرب عامل التخفيف من البئر الذي تم عده بحجم العدوى ، وقسم هذا العدد من اللويحات الموجودة في البئر المعني.
      Equation 1

4. الخلايا الطلاء (اليوم 1) لقياس تحييد الفيروس الزائف سارس-CoV-2 بواسطة الأجسام المضادة المتاحة تجاريا ومصل المريض النقاهة

  1. التحضير زراعة الأنسجة
    1. إعداد غطاء محرك السيارة متوسطة وزراعة الأنسجة كما هو موضح في القسم 1. وبالإضافة إلى ذلك، إعداد العدد اللازم من 96 لوحة بئر لاستيعاب ما لا يقل عن 2 تكرار لكل عينة (أي لوحة واحدة لكل 6 عينات)؛ إضافة نسخ متماثلة إضافية إذا سمح نموذج وحدة التخزين.
  2. طلاء والحفاظ على الخلايا
    1. تنمو والحفاظ على خلايا Vero E6 كما هو موضح في القسم 1. إعداد ما لا يقل عن 10 مل من تعليق الخلية لكل لوحة 96 بئر بتركيز 2 × 105 خلايا لكل مل (لوحة 1.5 × 105 خلايا لكل مل للمقاهات التي أجريت بعد 48 ساعة، إذا لزم الأمر). إضافة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة 96 بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات، واحتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
      ملاحظة: اخلط تعليق الخلية جيدا، وهز كل لوحة بلطف في جميع الاتجاهات لضمان التوزيع حتى للخلايا.

5. الأجسام المضادة أو تخفيف المصل والالتهابات (اليوم 2)

ملاحظة: يمكن تطبيق هذا البروتوكول لقياس تحييد VSV-S-eGFP من قبل كل من الأجسام المضادة المتاحة تجاريا ومصل المريض، وكذلك المصل الذي تم جمعه من الحيوانات لدراسات تطوير اللقاح قبل السريرية. *يحيط علما بالخطوات الإضافية المدرجة عند التعامل مع عينات مصل المريض / الحيوان.

  1. سلسلة التخفيف التسلسلي
    1. قبل تمييع عينات المصل، بالحرارة تعطيل كل عينة في حمام مائي 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لاتعطل تكملة. ضمان اتخاذ احتياطات السلامة اللازمة عند التعامل مع عينات المرضى؛ فقط فتح حاويات العينة عندما تكون في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة، وضمان احتواء المناسبة مستوى 2 معدات الحماية الشخصية هو بالية.
    2. إعداد سلسلة التخفيف في لوحة فارغة 96 جيدا (لوحة 1).
    3. ابدأ جميع التخفيفات في الصف A من لوحة 96-well في 80 ميكرولتر. * لعينات المرضى ، ابدأ سلسلة التخفيف في 1 من كل 10 عن طريق وضع 8 ميكرولتر من المصل في 72 ميكرولتر من DMEM الخالية من المصل (مع 1٪ البنسلين / الستريبتوميسين).
      ملاحظة: تركيز تحييد الأجسام المضادة المستخدمة سيعتمد على النشاط الذي تنبأت به الشركة المصنعة. للاطلاع على الأجسام المضادة لتحييد السارس-CoV-2 Spike المستخدمة هنا (انظر جدول المواد)،ابدأ ب 5 ميكروغرام/مل لمراقبة تحييد 50٪ على الأقل.
    4. إضافة 40 ميكرولتر من DMEM خالية من المصل (مع 1٪ البنسلين / العقدية) إلى الصفوف B إلى G، و 80 ميكرولتر إلى الصف H. لا تقم بإضافة فيروس إلى الصف H، حيث أنه يعمل كعنصر تحكم للخلايا فقط.
    5. باستخدام ماصة متعددة القنوات 12 جيدا، مزيج ونقل 40 ميكروغرام من المصل المخفف أو الأجسام المضادة من الصف A إلى الصف B. ميكس وكرر حتى الصف F، تجاهل 40 ميكروغرام من الصف F. لا تقم بإضافة مصل إلى الصف G لأنه يمثل صف التحكم بالفيروسات فقط.
  2. العدوى والتراكب
    1. إعداد حجم مناسب من VSV-S-eGFP المخفف لعلاج كل بئر في MOI 0.05 (أو 2000 pfu). (عند الانتهاء من هذا الحساب، ضع في اعتبارك أنه سيتم نقل 60 ميكرولتر فقط من إجمالي حجم 80 ميكرولتر إلى الخلايا؛ وبالتالي، تأكد من مضاعفة حجم الفيروس بنسبة 1.33 للحفاظ على 2000 pfu).
      ملاحظة: بما أن VSV-S-eGFP حساس لدرجة الحرارة، فتأكد من بقاء المخزونات الفيروسية على الجليد كلما لم تكن قيد الاستخدام، وتجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة حيث سيختلف الثدي بعد التجميد المتكرر.
    2. إضافة 40 ميكرولتر من الفيروس المخفف إلى كل بئر في الصفوف من ألف إلى ز من لوحة 1 ومزيج عن طريق pipetting صعودا وهبوطا 4-5 مرات. احتضان لوحة لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    3. إزالة لوحة تحتوي على خلايا من الحاضنة (لوحة 2)، وتنشق بعناية وسائل الإعلام من جميع الآبار. نقل 60 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة / الفيروسات من لوحة 1 إلى لوحة 2، واحتضان لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2،هزاز لوحة كل 20 دقيقة.
    4. أعلى كل بئر مع 140 ميكرولتر من تراكب تحتوي على CMC في DMEM لتركيز النهائي من 3٪ CMC (مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين / العقدية). ضع اللوحة 2 في حاضنة تم ضبطها على 34 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة تقريبا قبل التصوير.
      ملاحظة: قم بتدفئة خليط التراكب مسبقا في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أثناء خطوة العدوى.

6. التصوير والتحديد الكمي (اليوم الثالث)

  1. لوحات الصور باستخدام صور الفلورسنت الآلي (باستخدام مرشح ايزوثيوسيانات الفلورسين (FITC) أو مرشح بديل مع الطول الموجي للإثارة من 488 نانومتر). قياس العدوى الفيروسية عن طريق إنشاء بروتوكول يحدد تلقائيا ويحسب بؤر eGFP الفردية. إذا لم تتوفر ميزة العد التلقائي، فاستخدم برنامج ImageJ لتحديد عدد بؤر eGFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يحدد هذا البروتوكول طريقة سريعة وفعالة للكشف عن تحييد الأجسام المضادة ضد بروتين سارس-CoV-2 S عن طريق تثبيط عدوى الفيروس الزائف VSV-S-eGFP (قابلة للقياس الكمي عن طريق فقدان بؤر eGFP المكتشفة). يتم تصوير تمثيل تخطيطي للبروتوكول في الشكل 1. من المستحسن استخدام الأجسام المضادة المتاحة تجاريا كتحكم إيجابي في كل مرة يتم فيها تشغيل المقايسة لضمان اتساق المقايسة. هنا، ونحن نظهر منحنى التخفيف باستخدام الأجسام المضادة IgG تحييد المتاحة تجاريا ضد السارس-CoV-2 سبايك RBD مقارنة مع التحكم IgG (انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول كل من الأجسام المضادة؛ الشكل 2).

تم جمع عينات المريض النقاهة بعد حوالي ثلاثة أشهر من العدوى بالسارس-CoV-2، وتم تحديد تحييد الفيروس الزائف باستخدام الطريقة الموضحة أعلاه(الشكل 3). الأهم من ذلك، لوحظ الحد الأدنى من تثبيط الخلفية باستخدام مصل المتبرع صحية. وعلاوة على ذلك، من الجدير بالذكر أن هذا المقايسة تميز بين المرضى الذين يعانون من شدة الأعراض العالية مقابل أولئك الذين يعانون من مرض أكثر اعتدالا على أساس الحاجة إلى العلاج في المستشفى. وتمشيا مع تقارير أخرى، لاحظنا داخل مجموعتنا الصغيرة أن المرضى في المستشفى يميلون إلى إظهار قدرة تحييد متزايدة من أولئك الذين لم يحتاجوا إلى دخول المستشفى19،20. في حين أن هذا قد لا يكون الحال دائما لعينات المرضى في المستشفى مقابل غير المستشفى ، فإن قدرة المقايسة على التمييز بين درجات متفاوتة من الحياد هي أحد الأصول. قد تكون هناك أيضا حالات تكون فيها قدرة تحييد مصل المريض أعلى بكثير من تلك التي تظهر هنا. إذا لزم الأمر ، يمكن تعديل تخفيف مصل المريض ، أو قد يتم تنفيذ خطوات تخفيف إضافية على طبق إضافي.

Figure 1
الشكل 1:مخطط البروتوكول الذي يوضح تحييد VSV-S-eGFP عن طريق مصل النقاهة. الاختصارات: VSV = فيروس التهاب الفم الحويكسي; eGFP = بروتين فلوري أخضر محسن؛ COVID-19 = مرض الفيروس التاجي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2:تم استخدام الأجسام المضادة المتاحة تجاريا لتحييد ضد السارس-CoV-2 كمثال على السيطرة الإيجابية جنبا إلى جنب مع IgG كسيطرة سلبية. قدرة تحييد الأجسام المضادة لمنع العدوى الفيروسية سوف تختلف; الرجوع إلى المعلومات المتاحة للأجسام المضادة المحددة التي تم شراؤها لتحديد التركيز الذي لبدء منحنى التخفيف (تم تشغيل العينات في ثلاثية، تمثل أشرطة الخطأ ± SD). (أ)تم حساب تثبيط النسبة المئوية استنادا إلى عدد بؤر eGFP التي تم اكتشافها عن طريق التصوير الفلوري(B). المختصرات: سارس-CoV-2 = فيروس كورونا متلازمة الجهاز التنفسي الحاد الوخيمة 2; IgG = الغلوبولين المناعي; SD = الانحراف المعياري؛ eGFP = بروتين فلوري أخضر محسن؛ RBD = مجال ربط المستقبلات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:قدرة مصل النقاهة من المرضى على تحييد VSV-S-eGFP يختلف تبعا لشدة الأعراض. تم جمع عينات مصل المريض بعد حوالي 3 أشهر من العدوى بالسارس-CoV-2، وتم جمع عينات التحكم من المرضى غير المصابين (تم تشغيل العينات في ثلاثية الفركتات، وتمثل قضبان الخطأ ± SD). (أ)تم حساب تثبيط النسبة المئوية استنادا إلى عدد بؤر eGFP التي تم اكتشافها عن طريق التصوير الفلوري(B). المختصرات: سارس-CoV-2 = فيروس كورونا متلازمة الجهاز التنفسي الحاد الوخيمة 2; SD = الانحراف المعياري؛ eGFP = البروتين الفلوري الأخضر المحسن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويمكن تكييف الطريقة الموصوفة هنا لتناسب بيئات المختبر وموارده المختلفة حسب الحاجة. الأهم من ذلك، القيد الرئيسي لهذا البروتوكول هو ضرورة وجود مستوى الاحتواء 2 الفضاء والأنسجة غطاء محرك السيارة. إن تطبيق فيروس الحمض النووي الريبي المستنسخ الزائف مع ارتفاع السارس-CoV-2، مثل VSV-S-eGFP، هو بديل هائل لفيروس سارس-كوف-2، الذي يتطلب منطقة عمل من المستوى 3 للاحتواء، ولكنه قد يظل قيدا بالنسبة لبعض المجموعات. جميع الخطوات الأخرى الموصوفة هنا مرنة للغاية ويمكن إجراؤها في أي مختبر من مستوى الاحتواء 2 تقريبا. على سبيل المثال، استخدام صور الفلورسنت مع ميزة العد الآلي ليست ضرورية. تنسيق 96 جيدا المستخدمة هنا يعني أن هناك حاجة فقط ما يقرب من 4 مجالات للعرض لتصوير ما يقرب من البئر بأكمله باستخدام أدنى هدف متاح (2x).

ويمكن استخدام المجهر الفلوري اليدوي لتصوير حقول متعددة من كل بئر، ويمكن بعد ذلك استخدام ImageJ (البرمجيات الحرة) لتحديد بؤر eGFP. بالإضافة إلى ذلك ، اخترنا استخدام تنسيق 96 جيدا لاستخدام أقل حجم ممكن من المصل بالإضافة إلى الحفاظ على الاستخدام الاستهلاكي إلى أدنى حد ممكن. إذا لم يتوفر مجهر فلوري، فقد يتم توسيع نطاق هذا البروتوكول إلى تنسيق 6 أو 12 بئرا للكشف عن تكوين البلاك بعد تثبيت وتلطيخ اللون البنفسجي البلوري (على غرار بروتوكول التيتر الفيروسي الموصوف أعلاه). الاعتبار الأكثر أهمية أن نأخذ في الاعتبار عند تنفيذ هذا البروتوكول هو حساسية درجة الحرارة من VSV-S-eGFP. عند العمل مع VSV-S-eGFP، قم دائما بتحويل الفيروس إلى كميات صغيرة لتجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة، والحفاظ على الفيروس على الجليد كلما كان ذلك ممكنا. بالإضافة إلى ذلك، قد يتم الكشف عن إشارة فلورية قوية بعد 24 ساعة؛ ومع ذلك، حصلنا على نتائج مماثلة بعد التصوير في 20 إلى 28 ساعة بعد العدوى.

هناك العديد من الطرق المتاحة للكشف عن وجود أجسام مضادة ضد السارس-CoV-2، بما في ذلك المقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA) ذات المعيار الذهبي، والتي تحدد كميا إجمالي كمية الأجسام المضادة ضد S21،22. هنا، حددنا طريقة سريعة وموثوقة للكشف على وجه التحديد تحييد الأجسام المضادة ضد البروتين الحاد سارس-CoV-2 المناعي في مصل النقاهة من المرضى. لقد قمنا بتحسين اختبار تحييد الحد من البلاك الكلاسيكي (PRNT) من خلال التكيف بنجاح مع شكل 96 بئرا ، والذي يسمح بالكشف عن تحييد الأجسام المضادة في عدد كبير من العينات في غضون 24 ساعة عن طريق القياس الكمي الآلي لعدوى الفيروس الزائف ، مما يسمح بالتحول السريع لتقارير البيانات النهائية. بالإضافة إلى الكشف عن تحييد الأجسام المضادة داخل المصل ، يمكن تكييف هذه الطريقة لإجراء فحص عالي الإنتاجية للاستراتيجيات العلاجية الأخرى ، والتي تهدف إلى منع تفاعل بروتين السارس-CoV-2 بشكل مباشر مع hACE2 ، مثل الأجسام المضادة أحادية النسيلة ، hACE2 القابلة للذوبان المؤتلفة ، أو مثبطات البروتيز ، لعرقلة الدخول الفيروسي23 . مع ظهور العديد من المتغيرات البروتين ارتفاع سارس-CoV-2، من المهم أيضا أن نلاحظ أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها لتحديد ما إذا كانت مستويات تحييد مماثلة تحدث بعد العدوى مع المتغيرات المختلفة للفيروس24.

ومن الأمثلة الأخرى على الأساليب المتاحة للكشف عن الأجسام المضادة ضد السارس-CoV-2 ELISAs، والمقاايسات القائمة على الفيروسات العدسية، والأطقم التجارية لتقييم قدرة تحييد عينات المصل. في حين أن IGM-أو IGG-ملزم ELISAs شائعة الاستخدام هي طريقة فعالة لتحديد وجود تركيز الأجسام المضادة لتتبع العدوى السابقة أو التحصين ، إلا أنها غير قادرة على التمييز بين قدرة تحييد الأجسام المضادة الملزمة25. تحتوي مقايسات التحييد المستندة إلى الفيروسات العدسية الزائفة على ملف تعريف أمان محسن ، باستخدام جزيئات فيروسية غير متماثلة بدلا من تكرار VSV-S-eGFP ؛ ومع ذلك ، فإن هذا يخلق حاجزا من حيث القدرة على الاختبار حيث تميل التيتر العدسي إلى أن تكون أقل بكثير26،27. هناك العديد من مجموعات المتاحة تجاريا التي تقيس قدرة الأجسام المضادة لمنع العدوى عن طريق تثبيط تنافسية من البروتين ارتفاع سارس-CoV-2 (RBD على وجه التحديد) ملزمة مع مستقبلات hACE2 بعد الحضانة مع مصل النقاهة (على سبيل المثال، CUSABIO، GenScript، أبنوفا). في حين أن العديد من هذه المجموعات لها حساسية وخصوصية ذات سمعة طيبة ، إلا أنها تميل أيضا إلى أن تكون مكلفة نسبيا وبالتالي فهي ليست مثالية لحجم كبير من العينات. البروتوكول المقدم هنا سريع وموثوق وغير مكلف. ويمكن استخدام هذه الطريقة عالية الإنتاجية لاختبار العديد من العينات، وتحقيق قراءات قوية في غضون 24 ساعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة تتعلق بهذا المنشور.

Acknowledgments

نود أن نشكر مختبر ويلان على توفير فيروس VSV-S-eGFP المستخدم في هذا البروتوكول بسخاء (الموصوف في الحالة وآخرون 2020). نشكر أيضا الدكتورين بيل كاميرون وجوثابورن كوان (والفريق) لجمع عينات دم المريض (معرف بروتوكول REB 20200371-01H). يكشف المؤلفون عن تلقي الدعم المالي التالي للبحث والتأليف و / أو نشر هذه المقالة: تم تمويل هذا العمل من الدعم السخي من مؤسسة مستشفى أوتاوا ومنحة من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (#448323) ومنحة سريعة من مؤسسة Thistledown للعلوم COVID-19 إلى C.S.I. T.R.J. يتم تمويلها من منحة أونتاريو للدراسات العليا وزمالة Mitacs العنقودية. يتم تمويل JP من قبل زمالة Mitacs العنقودية. T.A. ممولة من زمالة CIHR Banting. كما نود أن نشكر جميع الأفراد الذين شاركوا وتبرعوا بعينات دمهم لهذه الدراسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA (Gibco) Fisher scientific LS25200114
ArrayScan VTI HCS Thermo Fisher Scientific Automated fluorescent imager
carboxymethyl cellulose Sigma C5678
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) Fisher scientific 10-013-CV
Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) Thermo Fisher Scientific 12-800-017
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Fisher scientific 21-031-CV
HEPES Fisher scientific BP-310-500
IgG Isotype Control (mouse) Thermo Fisher Scientific 31903
Penicillin/streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab SinoBiological 40592-MM57
Vero E6 cells ATCC  CRL-1586

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
  3. COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center. , Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021).
  4. Zimmer, C., Corum, J., Wee, S. L. Covid-19 vaccine tracker. The New York Times. , Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021).
  5. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  6. Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
  7. Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
  8. Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
  9. Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
  10. Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
  11. Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299 (2010).
  12. To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
  13. Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
  14. Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
  15. Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
  16. Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
  17. Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
  18. Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
  19. Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
  20. Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
  21. Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
  22. Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
  23. Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).
  24. Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).
  25. Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
  26. Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
  27. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 172، سارس-كوف-2، COVID-19، فيروس زائف، تحييد الأجسام المضادة، فيروس التهاب الفم المركبات، سبايك بروتين الجليكوبروتين
الكشف عن الأجسام المضادة المحايدة للسارس-CoV-2 باستخدام التصوير الفلوري عالي الإنتاجية للعدوى بالفيروس الزائف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jamieson, T. R., Poutou, J., Marius, … More

Jamieson, T. R., Poutou, J., Marius, R., He, X., Rezaei, R., Azad, T., Ilkow, C. S. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (172), e62486, doi:10.3791/62486 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter