Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

זיהוי נוגדנים מנטרלים SARS-CoV-2 באמצעות הדמיה פלואורסצנטית בתפוקה גבוהה של זיהום פסאודווירוס

Published: June 5, 2021 doi: 10.3791/62486
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

Summary

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר שיטה מהירה ויעילה למדידת נוגדנים מנטרלים נגד חלבון ספייק SARS-CoV-2 על ידי הערכת היכולת של דגימות סרום הבראה לעכב זיהום על ידי חלבון פלורסנט ירוק משופר שכותרתו וירוס סטומטיטיס פסאודוטיפ עם גליקופרוטאין ספייק.

Abstract

ככל שמגפת COVID-19 הנגרמת על ידי תסמונת נשימתית חריפה חמורה נגיף הקורונה 2 (SARS-CoV-2) ממשיכה להתפתח, התברר כי נוכחות של נטרול נוגדנים נגד הנגיף עשויה לספק הגנה מפני זיהום עתידי. כך, ככל שיצירה ותרגום של חיסוני COVID-19 יעילים יימשכו במהירות חסרת תקדים, פיתוח שיטות מהירות ויעילות למדידת נוגדנים מנטרלים נגד SARS-CoV-2 יהפוך לחשוב יותר ויותר כדי לקבוע הגנה ארוכת טווח מפני זיהום עבור אנשים נגועים בעבר וחיסון. מאמר זה מתאר פרוטוקול תפוקה גבוהה באמצעות וירוס סטומטיטיס ארסי (VSV) פסאודוטיפ עם חלבון ספייק SARS-CoV-2 כדי למדוד את נוכחותם של נוגדנים נטרול בסרום הבראה מחולים שהחלימו לאחרונה מ- COVID-19. השימוש בווירוס פסאודוטיפ משוכפל מבטל את הצורך במתקן בלימה ברמה 3 הנדרש לטיפול SARS-CoV-2, מה שהופך פרוטוקול זה לנגיש כמעט לכל מעבדת בלימה ברמה 2. השימוש בפורמט של 96 באר מאפשר דגימות רבות לרוץ בו זמנית עם זמן תפנית קצר של 24 שעות.

Introduction

בדצמבר 2019 זוהה נגיף קורונה חדש, שכעת אנו מכירים כסארס-CoV-2, הסוכן הסיבתי של מחלת הקורונה 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 הוא נגיף בטאקורונה השייך למשפחת קורונה-וירוס. וירוסים עטופים אלה מהווים גנום RNA גדול בעל חוש חיובי ואחראים לזיהומים בדרכי הנשימה ובמעיים הן בבני אדם והן בבעלי חיים2. נכון למאי 2021 דווחו יותר מ-157 מיליון מקרים מדווחים של COVID-19 ברחבי העולם ויותר מ-3.2 מיליון מקרי מוות3. פיתוח חיסון יעיל הפך למטרה העיקרית של חוקרים ברחבי העולם עם לפחות 77 חיסונים פרה-קליניים תחת חקירה ו -90 עוברים כיום ניסויים קליניים4.

נגיפי קורונה מקודדים ארבעה חלבונים מבניים כולל חלבון ספייק (S), נוקלאוקפסיד (N), חלבון מעטפה (E) וחלבון הממברנה (M). הכניסה של SARS-CoV-2 דורשת אינטראקציה של תחום מחייב הקולטן (RBD) של S עם הקולטן המארח, אנזים ממיר אנגיוטנסין אנושי 2 (hACE2), והיתוך ממברנה לאחר מכן בעקבות מחשוף פרוטאוליטי על ידי פרוטאז סרין תאי מארח, סרין פרוטאז transmembrane 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . אימונודומיננטיות הומוריסטית של חלבון S של SARS-CoV דווחה בעבר וכעת הוצגה גם עבור SARS-CoV-211,12,13. ואכן, נטרול תגובות נוגדנים נגד S זוהו בסרום הבראה מחולי SARS-CoV 24 חודשים לאחר זיהום14, המדגיש את תפקידם הקריטי בתגובה החיסונית לטווח ארוך. חלבון S זוהה כיעד חיסון מבטיח ובכך הפך למרכיב מרכזי ברוב החיסונים בפיתוח15,16.

בעוד גילוי מהיר של נוגדנים מנטרלים הוא היבט קריטי של פיתוח חיסון, זה עשוי גם לשפוך אור על קצב ההדבקה ומעקב sero-epidemiologic באזורים מושפעים17. פסאודוטיפדת VSV מוסמכת לשכפול עם גליקופרוטאין SARS-CoV-2 S, במקום גליקופרוטאין VSV מסוג פראי, כדי לחקור זיהום SARS-CoV-2 בהגדרות ברמת בטיחות ביולוגית 2 נתרם בחביבות על ידי וילן ושותפיו לעבודה18. VSV ביטוי ספייק (VSV-S) ישמש כדי לקבוע את תגובת הנוגדנים המנטרלת נגד חלבון ספייק SARS-CoV-2. כמו VSV-S המשמש כאן גם מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP), מוקדי eGFP עשויים להיות מזוהים בתוך 24 שעות כדי לכמת זיהום, בעוד היווצרות פלאק יכול לקחת 48 עד 72 שעות. סיכום כאן הוא פרוטוקול פשוט ויעיל כדי לקבוע את היכולת של סרום החולה הבראה לנטרל VSV-S-eGFP זיהום. שיטה זו עשויה גם להיות מותאמת בקלות כדי לחקור טיפולים פוטנציאליים אחרים שמטרתם לשבש את האינטראקציה המארחת-ויראלית של חלבון SARS-CoV-2 S.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תאי ציפוי (יום 1) לייצור וכימות של SARS-CoV-2 פסאודווירוס

  1. הכנה לתרבות רקמות
    1. תמיסת מלח חמה עם חוצץ פוספט (DPBS); מדיום הנשר (DMEM) של Dulbecco המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (אופציונלי); ו 0.25% טריפסין-אתילנדיאמין טטראצטית חומצה (EDTA) עד 37 °C (5 °F) באמבט מים במשך כ 15 דקות.
    2. מחטאים מכסה המנוע של תרבית הרקמות עם 70% אתנול, ומניחים מנות תרבית רקמות, פיפטות פסטר ופיפטות סרולוגיות במכסה המנוע של תרבית הרקמות לפי הצורך. הסר PBS, DMEM, וטרפסין מאמבט המים, ולחטא עם 70% אתנול לפני הצבה במכסה המנוע תרבית הרקמות.
  2. ציפוי ותחזוקת תאים
    1. לגדל תאי Vero E6 ב- DMEM (המכיל 10% FBS) בבקבוקי תרבית רקמות T75 או 15 ס"מ תרבית רקמות מנות באינקובטור 37 °C עם 5% CO2. מעבר התאים לפי הצורך כאשר תאים הם 80-90% מפגש.
    2. לשטוף את התאים על ידי הוספת 10 מ"ל של 1x PBS לכל מנה בעדינות נדנדה 4-5 פעמים; לשאוף PBS. מוסיפים 3 מ"ל של טריפסין-EDTA לכל מנה, מנענעים את הצלחת כדי להבטיח שהמשטח כולו מכוסה. לדגור על התאים ב 37 °C עם 5% CO2 במשך כ 5 דקות, או עד התאים מנותקים.
    3. הוסף 7 מ"ל של DMEM (המכיל 10% FBS) כדי לבטל את פעולתו של טריפסין, וקבע מחדש את התאים על-ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים. לסובב את התאים כדי להסיר את טריפסין באמצעות צנטריפוגה ספסל ב 500 × g במשך 5 דקות, לשאוף את התקשורת מבלי להפריע לכדור התא, ו resuspend התאים ב 10 מ"ל של DMEM (המכיל 10% FBS). אם נדרשים תאים לניסויים עתידיים, מקם 1 מ"ל בצלחת חדשה המכילה 15 מ"ל של DMEM טרי (המכיל 10% FBS).
    4. לספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או hemocytometer, ולהוסיף כ 1 × 107 תאים לכל צלחת 15 ס"מ, ודגורה ב 37 °C עם 5% CO2 עד שהם 100% משתף (1-2 ימים).

2. VSV-S-EGFP הכנה מדומהוירוס

  1. זיהום
    1. להדביק תאים בריבוי של זיהום (MOI) 0.01 עם וירוס מלאי VSV-S-eGFP ב 12 מ"ל של DMEM ללא סרום עבור 1 שעה ב 37 °C עם 5% CO2, מדי פעם נדנדה הצלחות. החלף את האינקולום ב- DMEM טרי (המכיל 2% FBS ו- 20 mM HEPES, pH 7.7), ועבר לאינקובטור שנקבע ל- 34 °C עם 5% CO2.
      הערה: טמפרטורה של 34 °C (70 °F) נדרשת עבור התפשטות VSV-S-eGFP בתרבות התא.
    2. לאסוף supernatants התא עם תצפית של אפקט ציטוטופתי נרחב (CPE) וניתוק התא, כ 48 שעות לאחר זיהום. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לדמיין את הביטוי הנרחב של eGFP על ידי תאים נגועים החל מ 24 שעות לאחר זיהום.
  2. אוסף
    1. צנטריפוגות supernatants באמצעות צנטריפוגה ספסל במשך 5 דקות ב 1,000 × g ב 4 °C (70 °F) כדי להסיר את פסולת התא. Aliquot supernatant כדי למנוע מחזורים להפשיר הקפאה מרובים, ולאחסן ב -80 °C (70 °F).

3. טיטינג VSV-S-eGFP פסאודווירוס

  1. דילול טורי כדי לקבוע טיטר ויראלי
    1. תאי Vero E6 על לוחות 6-בארות בצפיפות זריעה של 6 × 105 תאים לבאר ב- DMEM (עם 10% FBS), ודגרה לילה ב 37 °C (5% CO2).
      הערה: ניתן להשתמש גם בתאי Vero המפרסמים יתר על המידה TMPRSS2 ו- hACE2.
    2. הגדר סדרת דילול טורית פי 10 של וירוס VSV-S-eGFP ב- DMEM קר ללא סרום על ידי הצבת 900 μL של מדיה בשבעה צינורות microcentrifuge. תוויות צינורות מ 1 עד 7. הוסף 100 μL של מלאי ויראלי לצינור הראשון מערבולת לזמן קצר. העבר 100 μL של וירוס מדולל מצינור 1 לצינור 2 ומערבולת לזמן קצר; להמשיך עד צינור 7.
    3. שאפו את המדיום מכל בארות של צלחת 6-באר המכילה תאי Vero E6, והחליפו ב-500 מיקרו-אל של דילול10-2 עד 10-7. לדגור על הצלחות במשך 45 דקות ב 37 °C (5 °F) עם 5% CO2,בעדינות מתנדנד כל 15 דקות.
    4. שאפו את האינוקולום והחליפו בשכבת-על המכילה תערובת 1:1 של 2X DMEM ו-6% תאית קרבוקסיתיל (CMC), ריכוז סופי של 3% CMC, בתוספת 10% FBS; דגירה ב 34 °C (5°F) עם 5% CO2 עבור 48 שעות.
      הערה: לחמם מראש את תערובת כיסוי באמבט מים 37 °C במשך 15 דקות במהלך שלב הזיהום. תערובת 1:1 של 1% אגרוז עם 2x DMEM בתוספת 10% FBS ניתן להשתמש במקום CMC. כדי לכסות עם אגרוז, להרתיח 1% אגרוז (ב dH2O) ומערבבים עם DMEM 2x קר. ודא שהתערובת היא טמפרטורה מתאימה לפני הוספת monolayer התא (כ 37-40 מעלות צלזיוס). אם agarose משמש עבור שכבת-על, התאים חייבים להיות קבועים על ידי דגירה ב 2 מ"ל של 3:1 מתנול:חומצה אצטית לפחות שעה אחת לפני הכתם.
  2. הכתמת וחישוב טיטר ויראלי
    1. דמיינו לוחות על ידי כתמים עם סגול קריסטל או הדמיה ישירה של eGFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    2. כדי להכתים צלחות, לשאוף את שכבת העל, לשטוף פעם אחת עם PBS, ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל של 0.1% סגול קריסטל (ב 80% מתנול ו dH2O) לכל באר. מניחים על צלחת נדנדה במשך כ -20 דקות בטמפרטורת החדר לפני דה-הכתמים. הסר את סגול הגביש, בעדינות לשטוף כל טוב פעמיים באמצעות dH2O או PBS.
      הערה: שלבי כביסה והכתמה צריכים להתבצע בעדינות על ידי צנרת איטית לכיוון הצד של כל באר כדי להבטיח את monolayer התא נשאר שלם לאורך כל ההליך.
    3. אפשר צלחות להתייבש לפחות 1 שעה לפני ספירת לוחות. ודא כי ספירת פלאק מתקבלים מבארות המכילות 20 עד 200 לוחות. כדי לחשב את titer של הנגיף ביחידות יוצרות פלאק (PFU) לכל mL, להכפיל את גורם הדילול של הבאר שנספרה עם נפח הזיהום, ולחלק את המספר הזה מן הלוחות הנוכחים בבאר המתאימה.
      Equation 1

4. תאי ציפוי (יום 1) למדידת נטרול נגיף פסאודו-וירוס SARS-CoV-2 על ידי נוגדנים זמינים מסחרית וסרום מטופל החלמה

  1. הכנה לתרבות רקמות
    1. הכן ברדס תרבית בינונית ורקמות כמתואר בסעיף 1. בנוסף, להכין את המספר הדרוש של 96 לוחות היטב כדי להכיל מינימום של 2 שכפולים לדגימה (כלומר, צלחת אחת לכל 6 דגימות); הוסף עותקים משוכפלים נוספים אם אמצעי האחסון לדוגמה מאפשר זאת.
  2. ציפוי ותחזוקת תאים
    1. הגדלה ותחזוקה של תאי Vero E6 כמתואר בסעיף 1. הכן לפחות 10 מ"ל של השעיית תא לכל צלחת 96-well בריכוז של 2 × 105 תאים למ"ל (צלחת 1.5 × 105 תאים לכל mL לבדיקות המבוצעות לאחר 48 שעות, במידת הצורך). הוסף 100 μL של השעיית תא לכל באר של צלחת 96-well באמצעות pipette רב ערוצי, ודגרה עבור 24 שעות ב 37 °C (5% CO2).
      הערה: מערבבים היטב את מתלה התא, ומנענעים כל צלחת בעדינות לכל הכיוונים כדי להבטיח חלוקה אחידה של התאים.

5. דילולים וזיהומים נוגדנים או סרום (יום 2)

הערה: פרוטוקול זה ניתן ליישם כדי למדוד את הנטרול של VSV-S-eGFP על ידי נוגדנים זמינים מסחרית סרום המטופל, כמו גם סרום שנאסף מבעלי חיים למחקרי פיתוח חיסון פרה קליניים. *שימו לב לשלבים הנוספים המפורטים בעת טיפול בדגימות סרום של מטופל/בעלי חיים.

  1. סדרת דילול טורי
    1. לפני דילול דגימות סרום, לאטום כל דגימה באמבט מים 56 °C במשך 30 דקות כדי לאטום את ההשלמה. ודא אמצעי זהירות הכרחיים ננקטים בעת טיפול בדגימות המטופל; פתחו רק מיכלי דגימה כאשר הם בשכונת תרבית הרקמות, והבטיחו שציוד מגן אישי מתאים ברמה 2 משוחק.
    2. הגדר את סדרת הדילול בצלחת ריקה של 96 באר (לוח 1).
    3. התחל את כל הדילול בשורה A של צלחת 96-well ב 80 μL. * עבור דגימות המטופל, להתחיל את סדרת דילול ב 1 ל 10 על ידי הצבת 8 μL של סרום ב 72 μL של DMEM ללא סרום (עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין).
      הערה: ריכוז הנוגדן המנטרל המשמש יהיה תלוי בפעילות החזויה של היצרן. עבור הנוגדן המנטרל SARS-CoV-2 ספייק המשמש כאן (ראה טבלת החומרים),התחל עם 5 מיקרוגרם / מ"ל כדי לצפות לפחות 50% נטרול.
    4. הוסף 40 μL של DMEM ללא סרום (עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין) לשורות B ל- G, ו- 80 μL לשורה H. אל תוסיף וירוס לשורה H, מכיוון שהוא משמש כפקד בתא בלבד.
    5. בעזרת פיפטה רב-ערוצית של 12 בארות, מערבבים ומעבירים 40 μL של סרום או נוגדן מדוללים משורה A לשורה B. מערבבים וחוזרים על הפעולה עד שורה F, יש להשליך 40 μL משורה F. אין להוסיף סרום לשורה G מכיוון שהוא מייצג את שורת הבקרה של וירוסים בלבד.
  2. זיהום ושכבת-על
    1. הכן נפח מתאים של VSV-S-eGFP מדולל לטיפול בכל טוב ב- MOI 0.05 (או 2000 pfu). (בעת השלמת חישוב זה, זכור כי רק 60 μL של נפח 80 μL הכולל יועברו על התאים; לכן, הקפד להכפיל את נפח הנגיף על ידי 1.33 כדי לשמור על 2000 pfu).
      הערה: מכיוון ש-VSV-S-eGFP רגיש לטמפרטורה, ודאו שמלאי ויראלי יישאר על הקרח בכל פעם שאינם בשימוש, והימנע ממחזורי הפשרת הקפאה מרובים, שכן טיטרים יהיו שונים לאחר הקפאה חוזרת ונשנית.
    2. הוסף 40 μL של וירוס מדולל לכל באר בשורות A ל- G של צלחת 1 ולערבב על ידי צנרת למעלה ולמטה 4-5 פעמים. לדגור על הצלחת במשך 1 שעות ב 37 °C (5% CO2).
    3. הסר את הצלחת המכילה תאים מן האינקובטור (צלחת 2), בזהירות לשאוף את התקשורת מכל בארות. העבר 60 μL של תערובת נוגדנים / וירוסים מצלחת 1 לצלחת 2, ודגרה במשך 1 שעות ב 37 °C (5% CO2, נדנדההצלחת כל 20 דקות.
    4. למעלה כל באר עם 140 μL של שכבת-על המכילה CMC ב- DMEM לריכוז סופי של 3% CMC (עם 10% FBS ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין). מניחים את צלחת 2 באינקובטור להגדיר 34 °C (5°F) עם 5% CO2 עבור כ 24 שעות לפני הדמיה.
      הערה: לחמם מראש את תערובת כיסוי באמבט מים 37 °C במשך 15 דקות במהלך שלב הזיהום.

6. הדמיה וכימות (יום 3)

  1. לוחות תמונה באמצעות תמונה פלואורסצנטית אוטומטית (באמצעות מסנן פלואורסין איסותיוצינט (FITC) או מסנן חלופי עם אורך גל עירור של 488 ננומטר). לכמת זיהום ויראלי על-ידי יצירת פרוטוקול המזהה וסופר באופן אוטומטי מוקדי eGFP בודדים. אם תכונת ספירה אוטומטית אינה זמינה, השתמש בתוכנת ImageJ כדי לכמת את מספר מוקדי eGFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה ויעילה לאיתור נוגדנים מנטרלים נגד חלבון SARS-CoV-2 S באמצעות עיכוב של זיהום פסאודווירוס VSV-S-eGFP (ניתן לכימות על ידי אובדן מוקדי eGFP שזוהו). ייצוג סכמטי של הפרוטוקול מתואר באיור 1. מומלץ כי נוגדן זמין מסחרית ישמש כשליטה חיובית בכל פעם שההתראה מופעלת כדי להבטיח את עקביות ההסתה. כאן, אנו מדגימים עקומת דילול באמצעות נוגדן IgG זמין מסחרית נגד SARS-CoV-2 ספייק RBD בהשוואה לבקרת IgG (ראה טבלת החומרים לקבלת פרטים על שני הנוגדנים; איור 2).

דגימות של מטופלי הבראה נאספו כשלושה חודשים לאחר ההדבקה ב-SARS-CoV-2, ונקבעה נטרול פסאודווירוס בשיטה שתוארה לעיל (איור 3). חשוב לציין, עיכוב רקע מינימלי נצפתה באמצעות סרום תורם בריא. יתר על כן, ראוי לציין, בדיקה זו מבדילה בין חולים עם חומרת סימפטום גבוהה לעומת אלה עם מחלה קלה יותר בהתבסס על הצורך באשפוז. בהתאם לדיווחים אחרים, ראינו בתוך הקבוצה הקטנה שלנו כי חולים מאושפזים נוטים להפגין יכולת נטרול מוגברת מאשר אלה שלא נזקקו לאשפוז19,20. אמנם זה לא תמיד המקרה עבור דגימות חולים מאושפזים לעומת לא מאושפזים, היכולת של ההבחנה להבדיל בין דרגות שונות של נטרול היא נכס. ייתכנו גם מקרים שבהם יכולת הנטרול של סרום המטופל גבוהה בהרבה מאלה שהפגינו כאן. במידת הצורך, דילול ההתחלתי של סרום המטופל עשוי להיות מותאם, או צעדי דילול נוספים עשויים להתבצע על צלחת נוספת.

Figure 1
איור 1: מתאר פרוטוקול המדגים נטרול VSV-S-eGFP על ידי סרום הבראה. קיצורים: VSV = וירוס סטומטיטיס ארסי; eGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר; COVID-19 = מחלת קורונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: נוגדן נטרול זמין מסחרית נגד SARS-CoV-2 שימש כדוגמה לשליטה חיובית לצד IgG כשליטה שלילית. היכולת לנטרל נוגדנים לעכב זיהום ויראלי תשתנה; עיין במידע הזמין עבור הנוגדן הספציפי שנרכש כדי לקבוע איזה ריכוז להתחיל את עקומת הדילול (דגימות הופעלו במשולש, סרגלי שגיאה מייצגים ± SD). (A)אחוז עיכוב חושב בהתבסס על מספר מוקדי eGFP שזוהו באמצעות (B) הדמיה פלואורסצנטית. קיצורים: SARS-CoV-2 = תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2; IgG = אימונוגלובולין; SD = סטיית תקן; eGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר; RBD = תחום איגוד קולטן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: היכולת של סרום הבראה מחולים לנטרל VSV-S-eGFP משתנה בהתאם לחומרת הסימפטומים. דגימות סרום המטופל נאספו כשלושה חודשים לאחר זיהום SARS-CoV-2, ודגימות בקרה נאספו מחולים לא נגועים (דגימות הופעלו במשולש, סרגלי שגיאה מייצגים ± SD). (A)אחוז עיכוב חושב בהתבסס על מספר מוקדי eGFP שזוהו באמצעות (B) הדמיה פלואורסצנטית. קיצורים: SARS-CoV-2 = תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2; SD = סטיית תקן; eGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המתוארת כאן עשויה להיות מותאמת לסביבות מעבדה ומשאבים שונים לפי הצורך. חשוב לציין, המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא הצורך במכסה המנוע של רמת בלימה ברמה 2 ותרבות רקמות. היישום של שכפול וירוס RNA פסאודוטיפ עם ספייק SARS-CoV-2, כגון VSV-S-eGFP, הוא חלופה אימתנית לנגיף SARS-CoV-2, אשר דורש אזור עבודה ברמת בלימה 3, אך עשוי להישאר מגבלה עבור קבוצות מסוימות. כל השלבים האחרים המתוארים כאן הם גמישים למדי וניתן לבצעם כמעט בכל מעבדת בלימה ברמה 2. לדוגמה, אין צורך בשימוש בדימוי פלואורסצנטי עם תכונת ספירה אוטומטית. תבנית 96-well המשמשת כאן פירושה שרק כ-4 שדות תצוגה נדרשים כדי לדמות כמעט את כל הבאר באמצעות המטרה הנמוכה ביותר הזמינה (2x).

מיקרוסקופ פלואורסצנטי ידני עשוי לשמש לתמונה של שדות מרובים של כל באר, ולאחר מכן ניתן להשתמש ב- ImageJ (תוכנה חופשית) כדי לכמת את מוקדי eGFP. בנוסף, בחרנו להשתמש בפורמט 96-well כדי להשתמש בנפח הנמוך ביותר האפשרי של סרום, כמו גם שמירה על שימוש מתכלה למינימום. אם מיקרוסקופ פלואורסצנטי אינו זמין, פרוטוקול זה עשוי להיות קנה מידה עד פורמט 6 או 12-well כדי לזהות היווצרות פלאק לאחר קיבוע סגול קריסטל וכתמים (בדומה לפרוטוקול טיטר ויראלי המתואר לעיל). השיקול הקריטי ביותר שיש לזכור בעת ביצוע פרוטוקול זה הוא רגישות הטמפרטורה של VSV-S-eGFP. בעת עבודה עם VSV-S-eGFP, תמיד aliquot הווירוס לתוך כרכים קטנים כדי למנוע מחזורי הפשרת הקפאה מרובים, ולשמור את הנגיף על קרח במידת האפשר. בנוסף, אות פלואורסצנטי חזק עשוי להתגלות לאחר 24 שעות; עם זאת, קיבלנו תוצאות דומות לאחר הדמיה ב 20 עד 28 שעות לאחר זיהום.

ישנן מספר שיטות זמינות כדי לזהות את נוכחותם של נוגדנים נגד SARS-CoV-2, כולל תקן זהב הקשורים אנזים חיסוני (ELISA) בדיקות, אשר כימת את הכמות הכוללת של נוגדנים נגד S21,22. כאן, התווינו שיטה מהירה ואמינה לזיהוי ספציפי של נוגדנים מנטרלים נגד חלבון ספייק SARS-CoV-2 אימונודומיננטי בסרום הבראה מחולים. שיפרנו את מבחן הנטרול הקלאסי להפחתת פלאק (PRNT) על ידי הסתגלות מוצלחת לפורמט של 96 בארות, המאפשר זיהוי של נוגדנים מנטרלים במספר רב של דגימות בתוך 24 שעות על ידי כימות אוטומטי של זיהום פסאודווירוס, המאפשר תפנית מהירה של דוחות נתונים סופיים. בנוסף לזיהוי נוגדנים מנטרלים בתוך סרום, ניתן להתאים שיטה זו לביצוע סינון בעל תפוקה גבוהה של אסטרטגיות טיפוליות אחרות, שמטרתן לעכב ישירות את האינטראקציה של חלבון ספייק SARS-CoV-2 עם hACE2, כגון נוגדנים חד שבטיים, hACE2 מסיס רקומביננטי, או מעכבי פרוטאז, כדי לעכב כניסה ויראלית23 . עם הופעתם של מספר גרסאות חלבון ספייק SARS-CoV-2, חשוב גם לציין כי שיטה זו עשויה להיות מיושמת כדי לקבוע אם רמות נטרול דומות להתרחש בעקבות זיהום עם גרסאות שונות של הנגיף24.

דוגמאות נוספות לשיטות זמינות לזיהוי נוגדנים נגד SARS-CoV-2 כוללות ELISAs, בבדיקות מבוססות לנטיוירוס וערכות מסחריות להערכת יכולת הנטרול של דגימות סרום. בעוד IgM- או IgG מחייב ELISAs נפוץ הם שיטה יעילה כדי לקבוע את נוכחותו של ריכוז נוגדנים כדי לעקוב אחר זיהום או חיסון קודמים, הם אינם מסוגלים להבחין בין יכולת נטרול הנוגדנים מחייב25. בדיקות נטרול מבוססות lentivirus מדומה יש פרופיל בטיחות משופר, באמצעות חלקיקים ויראליים שאינם משכפלים בניגוד לשכפול VSV-S-eGFP; עם זאת, זה יוצר מחסום במונחים של יכולת הבדיקה כמו טיטרים lentiviral נוטים להיות הרבה יותר נמוך26,27. ישנן מספר ערכות זמינות מסחרית המודדות את היכולת של נוגדנים לחסום זיהום באמצעות עיכוב תחרותי של חלבון ספייק SARS-CoV-2 (RBD במיוחד) המקשר עם קולטן hACE2 לאחר דגירה עם סרום הבראה (למשל, CUSABIO, GenScript, Abnova). בעוד רבים של ערכות אלה יש רגישות מכובדת וספציפיות, הם גם נוטים להיות יקרים יחסית ולכן לא אידיאלי עבור נפח גדול של דגימות. הפרוטוקול המסופק כאן הוא מהיר, אמין וזול. שיטה זו תפוקה גבוהה עשוי לשמש כדי לבדוק דגימות רבות, השגת קריאה חזקה בתוך 24 שעות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים הקשורים לפרסום זה.

Acknowledgments

ברצוננו להודות למעבדת וילן על שסיפקה בנדיבות את נגיף VSV-S-eGFP המשמש בפרוטוקול זה (המתואר במקרה ואח ' 2020). אנו מודים גם לד"ר ביל קמרון וג'ותאפורן קאוון (ולצוות) על איסוף דגימות הדם של המטופל (זיהוי פרוטוקול REB 20200371-01H). המחברים חושפים את קבלת התמיכה הכספית הבאה למחקר, המחבר ו/או הפרסום של מאמר זה: עבודה זו מומנה על ידי תמיכה נדיבה של קרן בית החולים אוטווה ומענק מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (#448323) ומענק מהיר מקרן גדילן למדע COVID-19 ל- C.S.I. T.R.J. ממומן על ידי מלגת בוגרים אונטריו ומלגת Mitacs אשכול. ג'יי.פי ממומן על ידי אחוות מיטקים מקבצי. T.A. ממומן על ידי אחוות CIHR בנטינג. ברצוננו גם להודות לכל האנשים שהשתתפו ותרמו את דגימות הדם שלהם למחקר זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA (Gibco) Fisher scientific LS25200114
ArrayScan VTI HCS Thermo Fisher Scientific Automated fluorescent imager
carboxymethyl cellulose Sigma C5678
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) Fisher scientific 10-013-CV
Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) Thermo Fisher Scientific 12-800-017
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Fisher scientific 21-031-CV
HEPES Fisher scientific BP-310-500
IgG Isotype Control (mouse) Thermo Fisher Scientific 31903
Penicillin/streptomycin Thermo Fisher Scientific 15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab SinoBiological 40592-MM57
Vero E6 cells ATCC  CRL-1586

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
  3. COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center. , Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021).
  4. Zimmer, C., Corum, J., Wee, S. L. Covid-19 vaccine tracker. The New York Times. , Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021).
  5. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  6. Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
  7. Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
  8. Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
  9. Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
  10. Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
  11. Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299 (2010).
  12. To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
  13. Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
  14. Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
  15. Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
  16. Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
  17. Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
  18. Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
  19. Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
  20. Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
  21. Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
  22. Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
  23. Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).
  24. Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).
  25. Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
  26. Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
  27. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 172 SARS-CoV-2 COVID-19 פסאודווירוס נוגדן מנטרל וירוס סטומטיטיס ווסקולרי גליקופרוטאין ספייק
זיהוי נוגדנים מנטרלים SARS-CoV-2 באמצעות הדמיה פלואורסצנטית בתפוקה גבוהה של זיהום פסאודווירוס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jamieson, T. R., Poutou, J., Marius, … More

Jamieson, T. R., Poutou, J., Marius, R., He, X., Rezaei, R., Azad, T., Ilkow, C. S. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (172), e62486, doi:10.3791/62486 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter