Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Çok Katlı Boncuk Tabanlı Akış Analiz Sistemi için Hızlı, Çok Katlı Çift Muhabir IgG ve IgM SARS-CoV-2 Nötralizasyon Tahlil

Published: April 6, 2021 doi: 10.3791/62487
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 1
1Luminex Corporation, 2Departments of Pathology and Laboratory Medicine, Clinical Microbiology, University of Rochester Medical Center, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

Summary

SARS-CoV-2 için nötralize IgG ve IgM antikorlarını aynı anda ölçebilen multipleks serolojik ve antikor nötralizasyon tahlillerinin geliştirilmesi için iki muhabirli okuma sağlayan boncuk bazlı çok katlı tahliller için bir akış analiz sistemi kullanılmıştır.

Abstract

COVID-19 salgını, SARS-CoV-2 gibi yeni patojenlerle enfeksiyonun hassas ve spesifik serolojik tespiti için hızlı yüksek verimli yöntemlere duyulan ihtiyacın altını çizmektedir. Multipleks serolojik test özellikle yararlı olabilir, çünkü patojen kapsamını optimize eden birden fazla antijene karşı antikorları aynı anda analiz edebilir ve organizmada ve bireysel konak yanıtta değişkenlik kontrollerini yapabilir. Burada, üç büyük SARS-CoV-2 antijeni-başak (S) proteini, spike anjiyotensin dönüştürücü enzim-2 (ACE2) reseptör bağlayıcı etki alanı (RBD) ve nükleokapsid (Nc) için hem IgM hem de IgG antikorlarını tespit edebilen SARS-CoV-2 IgG 3-pleks floresan mikrokürebilgi bazlı bir test açıklıyoruz. Test, semptom başlangıcından itibaren ≥21 gün sonra elde edilen serumda IgG için SARS-CoV-2 referans testine benzer performansa sahip olduğu, ancak semptom başlangıcından itibaren ≤5 günde toplanan örneklerle daha yüksek hassasiyete sahip olduğu gösterilmiştir. Ayrıca nötralizasyon testi formatında çözünür ACE2 kullanılarak S ve RBD için antikor bağlanmasının inhibisyonu gösterilmiştir.

Introduction

COVID-19 salgını, SARS-CoV-2 gibi yeni patojenlerin tanı ve gözetimi için kullanılabilecek hızlı, yüksek verimli, yüksek performanslı serolojik testleri hızla geliştirebilmenin ve uygulayabilmenin önemini vurgulamıştır. Multipleks serolojik test, organizmada değişkenlik ve enfeksiyona konak yanıtı için geniş patojen kapsamı ve kontrolleri sağlayan birden fazla antijene karşı antikorları aynı anda analiz edebildiği için bir pandemide son derece yararlı olabilir. Spike (S) proteinine karşı antikorları tespit edebilen sars-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), spike anjiyotensin dönüştürücü enzim-2 (ACE2) reseptör bağlayıcı etki alanı (RBD) ve SARS-CoV-2'nin nükleokapsit (Nc) olan çok katlı floresan boncuk bazlı bir testinin geliştirilmesi yakın zamanda bildirilmiştir1. 3Flex'in semptom başlangıcından itibaren ≥21 gün sonra elde edilen serum için referans SARS-CoV-2 IgG testine benzer performansa sahip olduğu, ancak semptom başlangıcından itibaren ≤5 günde toplanan örneklerle daha yüksek hassasiyete sahip olduğu gösterilmiştir. Ayrıca çözünür ACE2 kullanılarak S ve RBD antijenleri için nötralizasyon testi formatında antikor bağlanmasının inhibisyonu gösterilmiştir. Multipleks boncuk tabanlı teknoloji, çok katlı serolojik testler için kanıtlanmış bir teknoloji olarak yaygın olarak benimsenmiştir ve kısa sonuç alma süresi, küçük numune gereksinimleri ve azaltılmışişçilik2,3,4dahil olmak üzere büyük ölçekli tarama için belirgin avantajlara sahiptir.

Son zamanlarda, önceki çalışma1'de gösterilen sistemin aynı yüksek pleks, yüksek aktarım hızı yeteneğini sağlayan yeni bir akış analizi aracı kullanılabilir hale geldi, ancak iki muhabir kanalının ek avantajıyla. İki floresan muhabir sinyalini tek bir reaksiyonda ölçme yeteneği, her örnek için analiz başına iki sonucun değerlendirilmesine izin verir ve genellikle ayrı reaksiyon kuyularında yapılması gereken isotyping uygulamaları için idealdir5. Çift muhabir yeteneği, her numune için örnek hacmi gereksinimlerinin yarısı kadar reaksiyon kuyusunda iki kat veri sağlar ve böylece tek muhabir sistemlerine göre açık bir avantaja sahiptir. Bu çalışma standart serolojik tahlil protokolünü detaylandırmaktadır ve nötralizasyon testine adaptasyonu açıklar. Ek olarak, bu rapor, sars-CoV-2 S, RBD ve Nc antijenlerine karşı hem IgG hem de IgM izotiplerinin nötralize edici antikorlarını aynı anda ölçmek için tek muhabir testinin çift muhabir serolojik testine ve daha sonra çift muhabir nötralizasyon testine dönüştürülmesini açıklar. Şekil 1'detahlil protokolüne görsel bir genel bakış sağlanmaktadır.

Protocol

Rochester Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan bu çalışmada daha önce SARS-CoV-2 tanı analizleri için test edilen artık insan serum örnekleri kullanılmıştır.

1. Reaktifler ve ekipmanlar

  1. Ticari kaynaklardan koronavirüs antijenleri ve insan IgG ve IgM elde edin.
  2. Test kontrolü (AC) boncuk setlerini (45 ve 220) cihaz satıcısından alın. AC boncuk seti 45 monitörler OrtaNca Floresan Yoğunluğu (MFI) koleksiyonu tek muhabir kanalı (RP1) enstrümanlarında. AC boncuk seti 220 ikinci muhabir kanalında (RP2) MFI koleksiyonunu izler.
  3. Algılama antikorları ve antijene özgü tavşan serası ve kavrama onayı için kullanılan antikorları elde edin.
  4. Bir streptavidin, R-phycoerythrin konjuge (SAPE) veya florofor Super Bright 436 'nın (SASB; 405 nanometrede (nm) eksitasyon ve 436 nm emisyondan oluşan bir streptavidin konjugesi ile biotin etiketli antikorlarla tespiti gerçekleştirin.
  5. İnsan ACE2 proteini (yani SARS Reseptörü) elde edin. Kullanmadan önce, nükleaz içermeyen suda (DEPC işlem görmüş, otoklavlı ve 0,2-μm steril filtrelenmemiş) 1 mg/mL konsantrasyonda çözünerek liyofilize ACE2 proteini rehidrat ve 4 °C'de saklayın.
  6. Tüm reaksiyonları 96 kuyuya bağlı olmayan yüzey (NBS) siyah düz tabanlı plakalarda gerçekleştirin. Plakaları 96 kuyu mikro plakalı alüminyum sızdırmazlık bandı ile tahlil inkübasyon adımları için kapatın. Test yıkama adımları için manyetik bir plaka ayırıcı kullanın.

2. Antijen bağlantılı ve antikor bağlantılı kontrol boncukları hazırlama

  1. Cameron ve ark.1'deaçıklandığı gibi S, RBD ve Nc antijenleri ile manyetik, polistiren ve renk kodlu mikroküren setlerini (6,5-μm çapında) eş zamanlı olarak birleştirilmiştir. Koronavirüs antijenleri 10 pmol/106 boncuk (S) ve 100 pmol/106 boncukta (RBD ve Nc) birleştirilmiştir. İnsan IgG veya IgM ile birleştirilen kontrol boncukları daha önce açıklandığı gibi oluşturulur1. IgG ve IgM 5 μg/106 boncukta birleştirilmiştir.
  2. Kaplinden sonra, boncuk konsantrasyonlarını belirleyin ve açıklanan prosedürleri kullanarak her stoğu 1 x10 6 boncuk / mL'ye seyreltin6.
  3. Cameron ve ark.1'deaçıklandığı gibi, tavşandan antijene özgü antikorlarla veya pozitif insan serasıyla antijen bağlantısı teyidi gerçekleştirin.
    1. Tahlilin biyotinilize anti-insan IgG/SAPE algılama reaktifleri ile insan IgG bağlantısı ve bir fikoerythrin (PE) etiketli keçi anti-insan IgM ile IgM bağlantısı onaylayın.
      NOT: Kavrama onayı proteine özgü serum veya antikor titrasyonu kullanılarak gerçekleştirilir, çünkü bu reaktifler için kullanılacak en uygun konsantrasyon bilinmemektedir. Serum için seri kat seyreltmeler kullanılırken mg/mL stokları olarak sağlanan antikorlar için seri μg/mL seyreltme serileri kullanılır.
  4. İki muhabir kanalında MFI koleksiyonunu izleyen test kontrolü (AC) boncuklarını, çok yönlü boncuk karışımlarında kullanmadan önce 1 x10 6 boncuk/mL konsantrasyonda seyreltin.

3. Taze multipleks boncuk karışımı hazırlığı

  1. Çok sayıda boncuk hazırlayın ve 1 x 106 boncuk/mL'de boncuk stoklarını kontrol edin.
    NOT: Multipleks boncuk karışımları, her boncuk bölgesi için 50 μL hacimde 2.500 boncuk teslim etmek için hazırlanır. Herhangi bir sayıda reaksiyon için çoklamalı boncuk karışımlarının nasıl hazırlanacağına ilişkin hesaplamalar Angeloni (2020) tarafından yayınlanan blogda açıklanmıştır6.

4. Örnek seyreltme

  1. %0,05 Ara 20, %0,02 sodyum azit ve %1 sığır serum albümini (BSA) (PBS-TBN tamponu) içeren 990 μL fosfat tamponlu saline (PBS) 1:100 μL serum karıştırarak 1:100 serum örnek seyreltme hazırlayın.
  2. 1:100 seyreltmenin 20 μL'lik kısmını 180 μL PBS-TBN'ye ekleyerek numuneleri tekrar 10 kat seyreltin.
    NOT: Serum örnekleri, COVID-19 pandemisi öncesinde 2019 yılında toplanan örneklerden negatif sera ve sars-CoV-2 PCR pozitif hastalardan düşük ve yüksek antikor titrelerini temsil eden pozitif seradan oluşur. Pozitif örnekler semptom başlangıcından (DFSO) itibaren ≈3 ila >60 gün arasında toplanarak alındı. Tüm serum örnekleri ve IgG sıyrılmış negatif kontrol serası aşağıda açıklandığı gibi 1:1000'e kadar seyreltilir. Nötralizasyon tahlilleri için sera, aşağıdaki nötralizasyon protokollerinde (bölüm 6 ve 8) açıklandığı gibi 1:500 seyreltilir.

5. Tek muhabir serolojik tahlil protokolü

  1. 96 kuyuya bağlanmayan bir mikrotiter plakanın atanmış her kuyusuna 50 μL çok katlı boncuk karışımı ekleyin.
  2. Uygun kuyulara pipet 50 μL 1:1000 serum veya PBS-TBN; Serumun kuyudaki son seyreltilmesi 1:2000'dir.
  3. Plakayı bir mikro plaka folyo contası ile örtün ve 37 °C'de ısıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca 600 rpm'de sallanarak kuluçkaya yatırın.
  4. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin.
  5. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın.
  6. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın.
  7. Reaksiyon kuyularını aşağıda açıklandığı gibi yıkayın (ilk numune sonrası kuluçka yıkama).
    1. Plaka mıknatısından plakayı çıkarın ve her kuyuya 150 μL PBS-TBN ekleyin.
    2. Plakayı taze bir folyo conta ile örtün ve 37 °C'de 600 rpm'de 2 dakika çalkalayın.
    3. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca plaka mıknatısına yerleştirin.
    4. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın.
    5. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın.
  8. Reaksiyon kuyularını aşağıda açıklandığı gibi yıkayın (ikinci numune sonrası kuluçka yıkama).
    1. Plaka mıknatısından plakayı çıkarın ve her kuyuya 150 μL PBS-TBN ekleyin.
    2. Plakayı taze bir folyo conta ile örtün ve 37 °C'de 600 rpm'de 2 dakika çalkalayın.
    3. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca plaka mıknatısına yerleştirin.
    4. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın.
    5. Plakayı mıknatıstan çıkarın.
  9. Antikoru 0,62 μg/mL'ye ve SAPE'yi 1 μg/mL'ye seyrelterek SAPE ile biyotin-anti-insan IgG'nin taze bir karışımını yapın. Her kuyuya 100 μL ekleyin.
  10. Plakayı bir mikro plaka folyo contası ile örtün ve 37 °C'de ısıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca 600 rpm'de sallanarak kuluçkaya yatırın.
  11. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin.
  12. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın.
  13. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın.
  14. Reaksiyon kuyularını aşağıda açıklandığı gibi yıkayın (ilk tespit sonrası antikor inkübasyon yıkama).
    1. Plaka mıknatısından plakayı çıkarın ve her kuyuya 150 μL PBS-TBN ekleyin.
    2. Plakayı taze bir folyo conta ile örtün ve 37 °C'de 600 rpm'de 2 dakika çalkalayın.
    3. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca plaka mıknatısına yerleştirin.
    4. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın.
    5. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın.
  15. Reaksiyon kuyularını aşağıda açıklandığı gibi yıkayın (ikinci tespit sonrası antikor inkübasyon yıkama).
    1. Plaka mıknatısından plakayı çıkarın ve her kuyuya 150 μL PBS-TBN ekleyin.
    2. Plakayı taze bir folyo conta ile örtün ve 37 °C'de 600 rpm'de 2 dakika çalkalayın.
    3. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin.
    4. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın.
    5. Plakayı mıknatıstan çıkarın.
  16. Her kuyuya 100 μL PBS-TBN ekleyin.
  17. Folyo conta ile örtün ve 37 °C'de 2 dakika çalkalayın.
  18. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın. Daha sonra folyo contayı çıkarın ve Kullanım Kılavuzu'na göre akış analizöründeki her kuyunun 50 μL'sini okuyun. Aşağıda kısa bir açıklama verilmiştir.
    1. Ekranın sol üst köşesindeki açılır menüyü seçin ve Plaka Yapılandırması'na gidin.
    2. Çalışma Plakası 'nınöğesini seçin.
    3. Plaka taşıyıcısını çıkarmak için Çıkar simgesini seçin.
    4. Plakayı plaka taşıyıcısına yükleyin ve plaka taşıyıcısını geri çekmek için Geri Çek simgesini seçin.
    5. Plakayı çalıştırmak için Çalıştır simgesini seçin.

6. Tek muhabir nötralizasyon tahlil protokolü

  1. Yukarıdaki bölüm 3'te açıklandığı gibi taze bir çoklayıcı boncuk karışımı hazırlayın.
  2. Hastayı seyreltin ve sera 1:500'i aşağıdaki gibi kontrol edin.
    1. 10 μL serumu 990 μL PBS-TBN'ye karıştırarak serum 1:100'u seyreltin.
    2. 160 μL PBS-TBN'ye 40 μL 1:100 serum ekleyerek serumu 5 kat daha seyreltin.
  3. 96 kuyuya bağlanmayan bir mikrotiter plakanın atanmış her kuyusuna 50 μL çok katlı boncuk karışımı ekleyin.
  4. Her kuyuya 25 μL 2 μg/mL ACE2 seyreltme ekleyin.
  5. Plakayı bir mikro plaka folyo contası ile örtün ve 37 °C'de ısıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde 2 dakika boyunca 600 rpm'de sallanarak kuluçkaya yatırın.
  6. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve folyo contayı çıkarın.
  7. Atanan kuyulara 25 μL 1:500 serum veya PBS-TBN ekleyin.
  8. Plakayı bir mikro plaka folyo contası ile örtün ve 37 °C'de ısıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca 600 rpm'de sallanarak kuluçkaya yatırın.
  9. Tahlil prosedürünün geri kalanı için, yukarıda açıklandığı gibi 5.4 ile 5.18.5 arasında olan adımları izleyin.

7. Çift muhabir IgG ve IgM serolojik teste dönüştürme

  1. Yukarıdaki Bölüm 2'de açıklandığı gibi antijen bağlantılı boncuklar hazırlayın.
    NOT: İnsan IgM ile birlikte ek bir boncuk seti, anti-IgM algılama reaktiflerinin yanı sıra RP2 için MFI koleksiyonunu izlemek için ek bir AC boncuk seti (220) eklenmesini izlemek için dahildir. Tüm boncuk stokları, aşağıda açıklandığı gibi çok yönlü boncuk karışımlarına dahil edilmek üzere 1 x10 6 boncuk / mL'dedir.
  2. Yukarıdaki Bölüm 3'te açıklandığı gibi taze çoklayıcı boncuk karışımları hazırlayın.
  3. Yukarıdaki Bölüm 4'te açıklandığı gibi serum örneklerini seyreltin ve IgG-sıyrılmış negatif kontrol sera 1:1000.
  4. 96 kuyuya bağlanmayan bir mikrotiter plakanın atanmış her kuyusuna 50 μL çok katlı boncuk karışımı ekleyin.
  5. Pipet 50 μL 1:1000 serum veya PBS-TBN uygun kuyulara. Serumun kuyudaki son seyreltilmesi 1:2000'dir.
  6. Plakayı bir mikro plaka folyo contası ile örtün ve 37 °C'de ısıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca 600 rpm'de sallanarak kuluçkaya yatırın.
  7. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin.
  8. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın.
  9. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın.
  10. Reaksiyon kuyularını aşağıda açıklandığı gibi yıkayın (ilk numune sonrası kuluçka yıkama).
    1. Plaka mıknatısından plakayı çıkarın ve her kuyuya 150 μL PBS-TBN ekleyin.
    2. Plakayı taze bir folyo conta ile örtün ve 37 °C'de 600 rpm'de 2 dakika çalkalayın.
    3. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca plaka mıknatısına yerleştirin.
    4. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın.
    5. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın.
  11. 7.10.1-7.10.5 adımlarında yukarıda açıklandığı gibi, reaksiyon kuyularını PBS-TBN (ikinci numune sonrası kuluçka yıkama) ile tekrar yıkayın.
  12. Plakayı mıknatıstan çıkarın.
  13. Gerekli reaktif kombinasyonu ile yeni bir Algılama Reaktif karışımı yapın ve her kuyuya 50 μL veya 100 μL ekleyin.
    NOT: Brilliant Violet 421 muhabir boyasına (BV; 405 nm'de eksitasyon ve 421 nm'de emisyon) konjuge edilen anti-human IgG içeren Algılama Reaktif karışımları, mevcut stok reaktiflerinin sınırlı miktarları nedeniyle 50 μL / kuyuda kullanılmıştır. Diğer tüm Algılama Reaktif karışımları 100 μL/kuyuda kullanılır.
  14. Plakayı bir mikro plaka folyo contası ile örtün ve 37 °C'de ısıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca 600 rpm'de sallanarak kuluçkaya yatırın.
  15. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin.
  16. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın.
  17. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın.
  18. Reaksiyon kuyularını aşağıda açıklandığı gibi PBS-TBN ile yıkayın (antikor inkübasyonu tespit edildikten sonra ilk yıkama).
    1. Plaka mıknatısından plakayı çıkarın ve her kuyuya 150 μL PBS-TBN ekleyin.
    2. Plakayı taze bir folyo conta ile örtün ve 37 °C'de 600 rpm'de 2 dakika çalkalayın.
    3. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin.
    4. Plakayı mıknatıs üzerinde tutarken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın.
    5. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın.
  19. 7.17.1-7.17.5 adımlarında yukarıda açıklandığı gibi, reaksiyon kuyularını PBS-TBN (tespit antikor inkübasyonundan sonra ikinci yıkama) ile tekrar yıkayın.
  20. Plakayı mıknatıstan çıkarın.
  21. Her kuyuya 100 μL PBS-TBN ekleyin.
  22. Folyo conta ile örtün ve 37 °C'de 2 dakika çalkalayın.
  23. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın. Daha sonra folyo contayı çıkarın ve 5.18.1-5.18-5 adımlarında yukarıda açıklandığı gibi akış analizöründeki her kuyunun 50 μL'sini okuyun.

8. Çift muhabir nötralizasyon testine dönüştürme

  1. Yukarıdaki 7.1 adımında açıklandığı gibi birleştirilmiş boncukları kullanın.
  2. 7.2 adımında açıklandığı gibi yeni bir çoklayıcı boncuk karışımı hazırlayın.
  3. Serum örnekleri ve IgG-sıyrılmış negatif kontrol serası aşağıdaki gibi 1:500 seyreltilir.
    1. 10 μL serumu 990 μL PBS-TBN'ye karıştırarak 1:100 seyreltme hazırlayın.
    2. 1:100 numuneleri 1:100 μL'den 160 μL PBS-TBN'ye 40 μL ekleyerek 5 kat daha seyreltin.
  4. 96 kuyuya bağlanmayan bir mikrotiter plakanın atanmış her kuyusuna 50 μL çok katlı boncuk karışımı ekleyin.
  5. Her kuyuya 25 μL 2 μg/mL ACE2 seyreltme ekleyin.
  6. Plakayı bir mikro plaka folyo contası ile örtün ve 37 °C'de ısıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde 2 dakika boyunca 600 rpm'de sallanarak kuluçkaya yatırın.
  7. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve folyo contayı çıkarın.
  8. Atanan kuyulara 25 μL 1:500 serum veya PBS-TBN ekleyin.
  9. Plakayı bir folyo conta ile örtün ve 37 °C'de ısıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca 600 rpm'de sallanarak kuluçkaya yatırın.
  10. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin.
  11. Plaka mıknatıs üzerinde tutulurken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın.
  12. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın.
  13. Reaksiyon kuyularını aşağıda açıklandığı gibi yıkayın (ilk numune sonrası kuluçka yıkama).
    1. Plaka mıknatısından plakayı çıkarın ve her kuyuya 150 μL PBS-TBN ekleyin.
    2. Plakayı taze bir folyo conta ile örtün ve 37 °C'de 600 rpm'de 2 dakika çalkalayın.
    3. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin.
    4. Plaka mıknatıs üzerinde tutulurken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın.
    5. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın.
  14. 8.13.1-8.13.5 adımlarında yukarıda açıklandığı gibi, reaksiyon kuyularını PBS-TBN (ikinci numune sonrası kuluçka yıkama) ile tekrar yıkayın.
  15. Plakayı mıknatıstan çıkarın.
  16. Gerekli reaktif kombinasyonu ile yeni bir Algılama Reaktif karışımı yapın ve her kuyuya 50 μL veya 100 μL ekleyin.
    NOT: BV muhabir boyasına konjuge edilen anti-human IgG'yi içeren Algılama Reaktif karışımları, mevcut stok reaktiflerinin sınırlayıcı miktarları nedeniyle 50 μL / kuyuda kullanılmıştır (bkz. Malzeme Tablosu). Diğer tüm Algılama Reaktif karışımları 100 μL/kuyuda kullanılır.
  17. Plakayı bir mikro plaka folyo contası ile örtün ve 37 °C'de ısıtılmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca 600 rpm'de sallanarak kuluçkaya yatırın.
  18. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin.
  19. Plaka mıknatıs üzerinde tutulurken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın.
  20. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın.
  21. Reaksiyon kuyularını aşağıda açıklandığı gibi yıkayın (birincisi antikor inkübasyonunun tespit edilmesinden sonraydı).
    1. Plaka mıknatısından plakayı çıkarın ve her kuyuya 150 μL PBS-TBN ekleyin.
    2. Plakayı taze bir folyo conta ile örtün ve 37 °C'de 600 rpm'de 2 dakika çalkalayın.
    3. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin.
    4. Plaka mıknatıs üzerinde tutulurken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın.
    5. Plakayı mıknatısta tutarken emici kağıda damlatın.
  22. Reaksiyon kuyularını PBS-TBN (antikor inkübasyonu tespit edildikten sonra ikinci yıkama) ile tekrar yıkayın, tam olarak yukarıda 8.21.1-8.21.5 adımlarında ayrıntılı olarak belirtildiği gibi.
    1. Plaka mıknatısından plakayı çıkarın ve her kuyuya 150 μL PBS-TBN ekleyin.
    2. Plakayı taze bir folyo conta ile örtün ve 37 °C'de 600 rpm'de 2 dakika çalkalayın.
    3. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın ve boncukları reaksiyon karışımından ayırmak için 2 dakika boyunca manyetik plaka ayırıcıya yerleştirin.
    4. Plaka mıknatıs üzerinde tutulurken, folyo contayı çıkarın, plakayı dikkatlice bir atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı kuyulardan hafifçe dışarı doğru hareket ettirın.
    5. Plakayı mıknatıstan çıkarın.
  23. Her kuyuya 100 μL PBS-TBN ekleyin.
  24. Folyo conta ile örtün ve 37 °C'de 2 dakika çalkalayın.
  25. Plakayı plaka çalkalayıcıdan çıkarın. Daha sonra folyo contayı çıkarın ve 5.18.1-5.18-5 adımlarında yukarıda açıklandığı gibi akış analizöründeki her kuyunun 50 μL'sini okuyun.

Representative Results

Tek Muhabir Serolojik Tahlilinin Optimizasyonu.
Tüm SARS-CoV-2 antijenleri için bağlantı stratejisi Cameron, ve diğerleri, 20201 ve yukarıdaki 2.1 adımda açıklanmıştır. Bağlantı onayı stratejisi yukarıdaki 2.3. Etkili bir kavrama için, ortanca floresan yoğunluğu (MFI) değerleri serumsuz /antikorsuz negatif kontrol reaksiyonlarından önemli ölçüde daha yüksek olmalı ve azalan MFI sinyalinin azalan algılama reaktifi ile doz tepkisini göstermelidir. Yaklaşık 1.000 MFI birimi veya daha büyük arka plan MFI'lerinin MFI'leri genellikle verimli protein kavramasını gösterir ve kullanılan algılama reaktifinin konsantrasyonuna ve özgüllüğüne bağlıdır. Bu yöntem kullanılarak, S, RBD ve Nc antijen kavramasının teyidi iki sürü boncuk için test edilmiştir (Şekil 2). Tüm antijenler için MFI sinyalleri arka plan MFI'den önemli ölçüde daha yüksekti ve algılama reaktiflerinin titrasyon ile bir doz yanıtı gösterdi. Veriler ayrıca iki farklı çift boncuk arasında MFI seviyelerinin iyi tekrarlanabilirliğini gösterdi.

Tek muhabir tahlilinin optimizasyonu Cameron'da açıklandığı gibi yapıldı, vd., 20201. Her antijen, yüksek, orta, düşük ve negatif örnekleri temsil eden çeşitli serum örneklerinin farklı seyreltmeleri ile farklı kavrama konsantrasyonlarında test edildi. Ek olarak, test IgG titrelerini ölçtüğü için, igg sıyrılmış bir serum ek negatif örnek olarak kullanılmıştır. Farklı antijen kavrama seviyelerine sahip temsili bir numune seyreltme serisinin sonuçları Şekil 3'tegösterilmiştir. Bu ilk seyreltme serisi, potansiyel bir temsili antijene özgü ve arka plan MFI seviyesi aralığı elde etmek için sabit bir algılama reaktif konsantrasyonu ile test edildi. Bu verilerden ek numune seyreltme aralıkları ve antijen kavrama düzeyleri belirlenmiş ve ek numunelerle daha fazla test edilmiştir (veriler gösterilmemektedir).

Daha sonra, algılama reaktifinin konsantrasyonu farklı serum seyreltmeleri ve antijen kavrama seviyeleri ile kullanılmak üzere optimize edildi. Şekil 4'te6 pozitif ve 2 negatif örnek kullanılarak temsili veriler gösterilmiştir. Covid-19 öncesi birkaç yüz serum örneği ile yapılan ek testlerin ardından, bölüm 5'te açıklandığı gibi son tahlil protokolü için nihai optimal antijen kavrama seviyeleri ve algılama naibi konsantrasyonları seçildi.

Tek bir muhabir nötralizasyon testine dönüştürme
Tek muhabir serolojik testinin nötralizasyon testine dönüştürülmesi, serum örneğini eklemeden önce boncuklarla ACE2 (rakip bir reaktif olarak) kullanılarak bir kuluçka adımı eklenerek elde edildi. Eklenen ACE2 miktarının titratlanmasıyla, Şekil 5'tegösterildiği gibi, S ve RBD antijenlerine IgG bağlanmasının inhibisyonu gözlenmiştir. 11 hasta serada farklı IgG titreleri varken, her biri artan ACE2 konsantrasyonu ile MFI sinyalinde önemli bir azalma gösterdi. Beklendiği gibi, ACE2 sadece S ve RBD'nin MFI sinyallerini etkiler, ancak Nc antijenini etkilemez.

Tüm numuneler için 0 μg/mL ACE2'ye göre kalan MFI sinyali yüzdesi Şekil 6'dagösterilmiştir. Çoğu örnek için, artan ACE2 konsantrasyonu ile S ve RBD için % 30'> bir sinyal kaybı gözlendi. Beklendiği gibi, ACE2'nin Nc sinyali üzerinde bir etkisi olmadı.

Çift muhabir IgG ve IgM serolojik testine dönüştürme
Çift muhabir IgG ve IgM testi için, standart tek muhabir tahlil koşulları, iki muhabir kanalı için farklı antikor ve muhabir kombinasyonlarını test etmek için kullanıldı. RP1 kanalı, PE gibi muhabir boyaları için "turuncu" floresan tespiti ile önceki akış analiz araçlarına benzer. İkinci kanal olan RP2, 421-441 nm aralığında emisyon spektrum zirveleri ile 402 nm'de heyecanlanan boyaların "mavi" floresanını tespit etmek için kullanılabilecek bir menekşe ekscitasyon lazeri kullanmaktadır.

Bölüm 6'da ayrıntılı olarak açıklanan standart 2.000 kat numune seyreltme ve kuluçka koşulları ile çeşitli konsantrasyonlarda birkaç farklı anti-insan IgG ve IgM antikor kombinasyonu test edilmiştir. RP2 kanalı için DyLight 405 muhabir boyasına (DL 405; 400 nm'de eksilasyon ve 420 nm emisyon) eşlenen anti-IgM'nin ilk testi, DFSO ile 5 ila > 60 gün arasında değişen 11 PCR pozitif örnek seti ve IgG-sıyrılmış serum örneği kullanılarak gerçekleştirildi. Bu algılama reaktifi, Şekil 7A,B,C'degösterildiği gibi RP2 kanalında yüksek bir sinyal üretmedi. Yüksek IgM RP2 MFI'ye sahip numuneler için, rbd ve nc için en yüksek sinyaller görülmüştür (Şekil 7B, C). Bazı örneklerde igm titrelerinin şu anda yükseltilmesi gerekirken, gözlemlenen MFI seviyeleri IgM algılama reaktifi ile 140 MFI ünitesini geçmedi. Ayrıca, IgM için kontrol boncuk, aynı konsantrasyonlarda kullanılan PE etiketli bir anti-IgM RP1 muhabirine kıyasla anti-IgM'ye konjuge edilmiş DL 405 kullanırken MFI için önemli bir dinamik aralıkta değildi (Şekil 7D).

IgM için uygun bir RP2 muhabir etiketli algılama reaktifi mevcut olmadığından, SASB'li orijinal biotin anti-IgG, RP2 kanalında kullanılmak üzere test edildi. SASB'li RP2 kanalındaki IgG sinyali SAPE ile aynı dinamik aralığa sahip değildi, ancak yine de S, RBD ve Nc için IgG titerlerini ölçmek için uygun bir menzile sahipti (Şekil 8). Bu veriler, aşağıda açıklandığı gibi farklı RP1 IgM ve RP2 IgG algılama reaktif kombinasyonlarının test edilmesine yol açtı.

Çift muhabir nötralizasyon testine dönüştürme
Çift muhabir serolojik tahlili, serum örneğini eklemeden önce ACE2 ve boncuklarla bir kuluçka adımı eklenerek nötralizasyon testine dönüştürüldü. 16 μg/ml'den başlayan 2 kat ACE2 seyreltme serisi kullanıldı ve daha sonra yukarıda açıklandığı gibi 11 numune ve soyulmuş sera setleri ile test edildi. Ayrıca 3 farklı RP1 IgM ve RP2 IgG algılama antikor karışımı kombinasyonu 11 örnek ve soyulmuş serum kontrolleri seti üzerinde test edildi. En uygun olduğu belirlenen son kombinasyonlar ve reaktif konsantrasyonları Tablo 1'de ayrıntılı olarak yer uzamaktadır.

IgG tespiti için, orijinal tek muhabir testinde kullanılan biyotin anti-insan IgG /SASB, BV muhabir boyasına konjuge edilmiş başka bir anti-IgG ile birlikte test edildi. BV konjugesi yüksek RP2 MFI sinyallerine sahipken, IgG titer için MFI sinyal yoğunluğu ACE2 titrasyonları(Şekil 9A,C, E)arasında değişmektedir. Biotin anti-insan IgG/SASB kombinasyonu, ACE2 titrasyon boyunca BV konjugesine kıyasla daha tutarlı MFI sinyal düşüşüne sahipti ve MFI seviyeleri daha düşük olmasına rağmen bir doz yanıtı gösterdi. BV konjugesinin ACE2 konsantrasyonlarında yaptığı sinyal dalgalanması, biotin anti-insan IgG/SASB kombinasyonuna kıyasla IgG titrleri aralığında ACE2 tarafından yüzde inhibisyonunun belirlenmesine de müdahale etti (Şekil 9B, D, F). DFSO 3 örneği gibi düşük MFI sinyallerine sahip numuneler, bu reaktiflerin performansını değerlendirmek veya IgG nötralizasyon kapasitesini ölçmek için yeterince yüksek titrelere sahip değildir.

RP1 kanalındaki IgM titratörlerini belirlemek için, PE-konjuge bir anti-IgM, Tablo 1'delistelenen konsantrasyonlarda DyLight 549 muhabir boyasına (DL 549; 562 nm'de heyecan ve 576 nm'de emisyon) eşleştirilmiş bir anti-insan IgM ile karşılaştırıldı. Bu iki reaktiften PE anti-IgM, test edilen numuneler için DL 549 anti-insan IgM tarafından üretilenlerden daha yüksek MFI'ler görüntüledi (Şekil 9A, C,E). Bu reaktiflerin eklenmesini ölçen IgM kontrol boncukunun ortalama MMI'leri PE anti-IgM için 17.000 ≈ ve DL 549 konjugesi için 2.723'tür. Bu farklılıklarla bile, çeşitli ACE2 konsantrasyonlarının MFI üzerindeki etkisi DL 549 konjuge ile ölçülebilirdi. IgM bağlamasının ACE2 yüzde inhibisyonunu belirlemek için, iki IgM algılama reaktifi (Şekil 9B, D, F) arasında hafif ama önemsiz bir fark vardı.

Kombinasyon Muhabir Kuyuda Son Konsantrasyon (μg/mL)
RP1 RP2
1 PE anti-IgM 2 -
Biotin-Ig - 0.62
SASB - 4
2 DyLight 549 anti-insan ateşleme 1 -
Parlak Menekşe 421 anti-insan igg - 1
3 DyLight 549 anti-insan ateşleme 1 -
Biotin-Ig - 0.62
SASB - 4

Tablo 1: Test edilen RP1 ve RP2 muhabir boya kombinasyonlarının listesi. IgG ve IgM titrlerini ölçmek için birkaç farklı RP1 ve RP2 muhabir boyası değerlendirildi. Yukarıda gösterilen üç kombinasyon farklı RP1 algılama modlarında ve nötralizasyon testinin optimizasyonu için test edilmiştir. SASB kullanan RP2 kombinasyonları için biyotinilasyonlu algılama antikoru ve SASB konsantrasyonları gösterilmiştir. *Son Konsantrasyon reaksiyondaki son konsantrasyonu iyi temsil eder.

Figure 1
Şekil 1: Ana test protokolü adımlarını vurgulayan akış çizelgesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Antijen kavramasının teyidi. Antijenler 100, 10 ve 1 pmol/106 boncukta birleştirilmiştir. S ve RBD antijenleri için tavşan anti-S sera kullanıldı ve PE anti-tavşan IgG ile tespit edildi. Nc için Protein G-saflaştırılmış tavşan poliklonal anti-Nc kullanıldı. Boncuklar için titrasyon eğrileri 10 pmol S (A), 100 pmol RBD (B) ve 100 pmol Nc (C) ile birleştiğinde gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Serum seyreltmenin farklı antijen kavrama seviyeleri ile optimizasyonu. Yüksek, orta, düşük ve negatif örnekleri temsil eden serum örnekleri farklı pmol antijeni/106 boncuk kaplinleri ile test edildi. Bölüm 5'te açıklanan test protokolü kullanılarak antijen bağlantılı boncukların multipleks karışımı ile 4 katlı serum titrasyonu test edildi. S (A), RBD (B) ve Nc (C) için titrasyon eğrilerinin MFI değerleri gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Optimal serum seyreltme ve algılama reaktif konsantrasyonunun belirlenmesi. Negatif hastalar (2 örnek) ve düşük ila yüksek pozitif (6 örnek) dahil olmak üzere sekiz serum örneği, üç farklı algılama reaktif konsantrasyonu ile ek serum seyreltmelerinde test edildi. MFI sonuçları S (A), RBD (B) ve Nc (C) için gösterilir. Bu ve diğer verilere dayanarak (gösterilmeyen), 1:2.000'lik bir örnek seyreltme ve 0.62 μg/mL'lik bir biotin tespit antikor konsantrasyonu seçilmişti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Tek muhabir nötralizasyon testinin optimizasyonu. Tek muhabir serolojik testinin nötralize edici antikor tespit testinde modifikasyonu, Bölüm 6'da açıklandığı gibi rakip olarak ACE2 ile bir kuluçka adımı eklenerek gerçekleştirildi. Düşük pozitif titer sera ve IgG çizgili serum örneğinden oluşan 11 örnek seti, standart test koşulları kullanılarak 4 μg/mL'den başlayan iki kat seyreltme serisi ACE2 ile test edildi. Bu ACE2 konsantrasyon aralığında, MFI'de S ( A ) ve RBD (B) için artanACE2ile bir azalma görülebilir, ancak Nc (C) için değil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: ACE2 ile sinyalin yüzde inhibisyonu. 11 örnek kümesi için kalan sinyallerin yüzdesi (Şekil 4'tenitibaren) gösterilmiştir. Her numune için, IgG titresine bakılmaksızın, en yüksek ACE2 konsantrasyonunda S (A) ve RBD (B) için maksimum % ≥30 MFI sinyali düşüşü elde edildi. Nc antijeni (C) için herhangi bir ACE2 miktarı test edilmiş önemli bir sinyal inhibisyonu yoktu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: DyLight 405 anti-IgM'nin RP2 IgM algılama reaktifi olarak test edilmesi. DL 405 konjuge anti-IgM'yi RP2 algılama reaktifi olarak test etmek için 11 örnek ve IgG sıyrılmış sera seti kullanıldı. S (A), RBD (B) ve Nc (C) için RP2 IgM MFI sinyalleri gösterilir. Herhangi bir numuneye sahip herhangi bir antijen için en yüksek MFI sinyali, H (B)örnekli RBD için yaklaşık 140 MFI birimiydi. IgM kontrol boncuk setinin sinyali bile tüm antikor titre aralığında RP2 kanalında 1.000 MFI'den azdı ve RP1 kanalındaki(D)PE anti-IgM algılama antikoru ile gözlenen artan dinamik aralığı göstermedi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Biotin anti-IgG ile RP2 muhabiri olarak SASB optimizasyonu. Standart 0.62 μg/mL biotin anti-IgG ile sasb seyreltme serisini test etmek için 11 örnek ve IgG sıyrılmış sera seti kullanıldı. S (A), RBD (B) ve Nc (C) için RP2 kanalında elde edilen IgG MFI'leri gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9: RP1 IgM ve RP1 IgG algılama karışımlarının üç farklı kombinasyonunun karşılaştırılması. 11 örnek üzerinde üç farklı algılama antikor karışımı test edildi ve IgG serayı sıyırdı. Kullanılan kombinasyonlar ve son konsantrasyonlar Tablo 1'deaçıklanmıştır. Tüm numuneler 16 μg/mL'den başlayan 2 katlı ACE2 seyreltmelerle test edildi. DFSO'daki 3, 12 ve 30 günlük örnekler için veriler gösterilir. RP1 IgM (turuncu) ve RP2 IgG (mavi) için MFI sinyalleri A (DFSO 3), C (DFSO 12) ve E (DFSO 30) olarak gösterilir. ACE2 artık MPI'lar B (DFSO 3), D (DFSO 12) ve F (DFSO 30) olarak gösterilir. ACE2 kontrolü yok ile karşılaştırıldığında %>30'luk bir düşüşü temsil eden sinyaller açık yeşil olarak vurgulanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bu çalışma, SARS-CoV-21tarafından enfeksiyona igg yanıtını nitel olarak değerlendiren çok katlı floresan mikroküreci test, 3Flex'in işlevselliğini genişletti. COVID-19 için birçok serolojik test tek bir antijen tespit ederken, bu test aynı anda S, RBD ve Nc antijenlerini değerlendirir ve bir iç antikor izotip kontrolüiçerir 7. Ek olarak, ACE2 SARS-CoV-2 nötralize edici antikor titrelerini tespit etmek için bir gösterge olarak kullanılır.

Multi-antijen tahlilleri, enfekte ve aşılanmış kişiler arasında bağışıklık yanıtlarını ayırt etmek için gelecekte özellikle yararlı olabilir. SARS-CoV-2 ile, sadece S ve RBD antikorları değerlendirilirse, bunun geçmişteki bir enfeksiyondan mı yoksa aşı antikor yanıtına mı bağlı olduğunu ayırt etmek imkansız olacaktır. Şu anda kullanılmakta olan aşıların hiçbiri Nc antijenini hedef almamaktadır, bu nedenle S / RBD ve Nc antijenlerini değerlendirerek, geçmiş viral enfeksiyonu (Nc- ve S / RBD-pozitif) bir aşılama yanıtından (yalnızca S / RBD pozitif) ayırt etmek mümkündür; Nc-negatif).

Mevcut çalışmada, 3Flex serolojik ve nötralizasyon tahlilleri (bölüm 5 ve 6) yeni bir çift muhabir akış analiz cihazına (bölüm 7 ve 8) aktarıldı. Boncuk bazlı multipleks tahlilleri için tipik immünoassay protokolleri, numune inkübasyonu, algılama antikor/ muhabir inkübasyonu ve sonuçların analizi için karşılaştırılabilir adımları izleyerek standart ELISA protokollerine benzer8. Önceki çalışmalar, standart ELISA testlerinin boncuk tabanlı çoklama platformuna nasıl aktarabileceğini degöstermiştir 9.

Test protokolleri, test örnekleri ve kontrolleri için elde edilen sonuçlarda gösterildiği gibi, selefi tek muhabir cihazından yeni çift muhabir sistemine sorunsuz bir şekilde aktarılabilir (Şekil 4 ve Şekil 5). Serolojik testte, tüm pozitif serum örnekleri hem daha yüksek bir numune seyreltme hem de daha düşük bir algılama antikor konsantrasyonuna karşılık gelen sinyalde karakteristik bir doza duyarlı düşüş gösterirken, negatif numunelerin sinyalleri arka plan seviyelerinde kaldı. Benzer şekilde, nötralizasyon tahlilleri için, S ve RBD için azalan sinyaller, ancak Nc değil, ACE2 rakibinin artan konsantrasyonlarına karşılık gelirken, IgG soyulmuş serum ACE2'nin eklenmesinden çok daha az etkilendi. Serum örneğinin eklenmesinden önce 2 dakika boyunca ACE2 ile boncukların önceden inkübe edilmesi (bölüm 6 ve 8'de açıklandığı gibi), boncukların aynı anda ACE2 ve serum ile birleştirilmesiyle karşılaştırıldı ve sonuçlarda çok az fark yarattı (veriler gösterilmedi). Bununla birlikte, boncuklar artı ACE2 ön kuluçka adımı ile elde edilen sonuçlar daha tutarlı olduğundan, nötralizasyon test protokolü için kabul edilen son prosedürdü (bölüm 6 ve 8).

çift muhabir sistemi ikinci bir floresan muhabir kanalı içerdiğinden, her iki test de hem IgG hem de IgM yanıtlarını aynı anda ölçmek için isotyping testlerine dönüştürüldü. Akış çözümleyicisinin çift muhabir işlevselliği, her örnek için çoklamadaki her bir analiz için iki muhabir algılama reaktifinden floresan sinyallerin toplanmasına izin verir ve bir testte örnek başına oluşturulan verileri etkili bir şekilde iki katına çıkarır. Çift muhabir tahlil protokollerinin geliştirilmesi ve optimizasyonu için, mevcut en iyi seçenekleri belirlemek için yeni RP2 kanalı(Şekil 7 ve Şekil 8)için piyasada bulunan birkaç muhabir boyası ve algılama antikoru değerlendirildi. DL 405 muhabir boyası ile konjuge edilen anti-IgM antikoru RP2 kanalında iyi performans göstermemiştir (Şekil 7), bu nedenle SASB'li biotin anti-IgG daha sonra RP2 kanalında tespit için değerlendirildi (Şekil 8). IgG ve IgM nötralize edici antikorların eşzamanlı olarak tespiti için en iyi performans gösteren kombinasyonları belirlemek için çift muhabir nötralizasyon testinde(Tablo 1 ve Şekil 9)RP1 ve RP2 algılama reaktiflerinin üç kombinasyonu karşılaştırıldı. PE-anti IgM kullanan RP1 kanalı ile DL 549 anti-IgM kullanan RP2 kanalı arasındaki sinyal yoğunluğunda önemli farklılıklar olsa da, ACE2 tarafından yüzde bağlayıcı inhibisyonun ölçümünde önemli bir fark yoktu.

Mevcut yöntem ve bu çalışmada çeşitli sınırlamalar kabul edilmektedir. İlk olarak, yöntem geliştirme ve optimizasyonunda test edilen ve kullanılan numuneler 8-11 örnek setleri ile sınırlıydı. Yöntemin tamamen optimize edildiğini doğrulamak için genişletilmiş çalışmalarda daha fazla örnek test edilecektir. İkinci olarak, sınırlı sayıda muhabir floroforu ve muhabir çifti test edildi. Mevcut tüm muhabirlerin olası tüm kombinasyonlarda daha fazla test edilmesi, bu yöntemde hangi reaktiflerin başarıyla kullanılabileceğini belirleyecektir. Biotin'e konjuge edilen anti-IgG antikoru, BV 421 muhabirine konjuge edilen anti-IgG antikorundan farklıydı. Yani, BV 421 anti-IgG için sinyal yoğunluğundaki değişkenlik mevcut olsa da, antikorun özgüllüğünden kaynaklanabilir ve muhabir boyasıyla ilgili olmayabilir. Mevcut diğer BV 421 konjuge antikorların test edilmesi, RP2 kanalında iyi performans gösteren başka bir antikor tanımlayabilir. Gelecekteki çalışmalar ayrıca PE anti-IgM'nin sırasıyla RP1 ve RP2'de tespit için BV 421 anti-insan IgG ile kombinasyonunu değerlendirecektir. Son olarak, cihazın çift muhabir yeteneğine rağmen, tahliller reaksiyon başına iki izotip (iki parametre) ile sınırlıdır. Ek izotipler ölçülecekse veya tam izotiyping isteniyorsa, aynı iki muhabir kanalını kullanan ek reaksiyonların ayrı kuyularda çalıştırılması gerekir.

Boncuk bazlı çoklama teknolojisi, rutin laboratuvar iş akışlarına kolay uygulama ile hızlı ve esnek tahlil tasarımı sağlar3,4,10. Bu çalışma, SARS-CoV-2 için daha önce tanımlanmış 3Flex serolojik ve nötralizasyon testlerinin, IgG'yi tek bir muhabirle veya hafif bir değişiklikle ölçmek için bir akış analiz sistemine aktarılmasındaki kolaylığı gösterdi, aynı anda iki muhabir kullanarak hem IgG hem de IgM yanıtlarını ölçtü. Çift muhabir seçeneği, tek muhabir platformlarına göre net avantajlara sahiptir, çünkü örnek hacminin yarısını ve reaksiyon kuyularının yarısını kullanarak örnek başına iki kat daha fazla veri sağlayabilir. Uygun muhabir boyaları ve algılama antikorları ile çift muhabir akış analiz cihazı üzerinde isotyping tahlilleri kolayca geliştirilebilir ve yapılabilir.

Disclosures

Stephen Angeloni ve Sherry Dunbar, bu çalışmada kullanılan bazı reaktifleri ve enstrümanları üreten Luminex Corporation'ın çalışanlarıdır. Bu makalenin Açık Erişim yayını Luminex Corporation sponsorluğunda yayınlanmıştır.

Acknowledgments

Bu rapor Luminex Corporation (Austin, TX) tarafından finanse edildi. Yazarlar matthew Silverman PhD'ye (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) bilimsel düzenleme yardımı için teşekkür ediyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACE2 (human) (rec.) AdipoGen Life Sciences AG-40B-0192-3050
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-065-098
Bovine Serum Albumin MilliporeSigma A7888 Sigma-Aldrich
Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator Various
Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 709-675-149
Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3650
Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile Corning 6570
DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ fragment specific Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-475-043
DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-506-129 Discontinued but available from multiple vendors
eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate ThermoFisher Scientific 62-4317-82
Fisherbrand Incubating Microplate Shaker ThermoFisher Scientific 02-217-757 Fisher Scientific
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE ThermoFisher Scientific P-2771MP
Luminex Magnetic Plate Separator Luminex Corporation CN-0269-01
MagPlex beads Luminex Corporation MC100XX-ID
PE AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-116-129
Phosphate Buffered Saline MilliporeSigma P3813 Sigma-Aldrich
SARS Nucleocapsid Protein Antibody Novos Biologicals NB100-56683 Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified
SARS Nucleocapsid Protein Antibody Novos Biologicals NB100-56049 Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified
SARS Spike Protein Antibody Novos Biologicals NB100-56047 Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified
SARS Spike Protein Antibody Novos Biologicals NB100-56048 Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb SinoBiological 40150-R007
Sodium Azide MilliporeSigma S2002 Sigma-Aldrich
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) ThermoFisher Scientific S21388 premium grade
Tube Revolver/ Rotator ThermoFisher Scientific 88881001
TWEEN 20 MilliporeSigma P9416 Sigma-Aldrich
xMAP Antibody Couplng Kit Luminex Corporation 40-50016
xMAP INTELLIFLEX DR-SE Luminex Corporation INTELLIFLEX-DRSE-RUO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cameron, A., et al. A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization. Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).
  2. Waterboer, T., et al. Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins. Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).
  3. Pickering, J. W., et al. A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides. American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).
  4. Ayouba, A., et al. Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus. Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).
  5. Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M. Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Vastl, J. 116, 1-7 (2017).
  6. Angeloni, S. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator. , Available from: https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/ (2020).
  7. EUA Authorized Serology Test Performance. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance (2020).
  8. Indirect ELISA protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf (2021).
  9. Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).
  10. Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 170 multipleks mikrokürez boncuk SARS-CoV-2 serolojik tahlil nötralizasyon tahlil
Çok Katlı Boncuk Tabanlı Akış Analiz Sistemi için Hızlı, Çok Katlı Çift Muhabir IgG ve IgM SARS-CoV-2 Nötralizasyon Tahlil
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Angeloni, S., Cameron, A., Pecora,… More

Angeloni, S., Cameron, A., Pecora, N. D., Dunbar, S. A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System. J. Vis. Exp. (170), e62487, doi:10.3791/62487 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter