Summary
El protocolo presentado aquí permite la fabricación automatizada de micropatrones que estandariza la forma celular para estudiar las estructuras citoesqueléticos dentro de las células de mamíferos. Esta técnica fácil de usar se puede configurar con sistemas de imágenes disponibles en el comercio y no requiere equipos especializados inaccesibles a los laboratorios de biología celular estándar.
Abstract
Micropatterning es una técnica establecida en la comunidad de la biología celular usada para estudiar las conexiones entre la morfología y la función de compartimientos celulares mientras que evita las complicaciones que se presentan de variaciones naturales de la célula-a-célula. Para estandarizar la forma de las células, las células se confinan en moldes 3D o se controlan para la geometría adhesiva a través de islas adhesivas. Sin embargo, las técnicas tradicionales de micropatterning basadas en la fotolitografía y el grabado UV profundo dependen en gran medida de salas limpias o equipos especializados. Aquí presentamos una técnica de micropatterning asistida por láser infrarrojo (microphotopatterning) modificada de Doyle et al. En este protocolo, utilizamos un sistema de imágenes Nikon A1R MP + para generar micropatrones con precisión de micras a través de un láser infrarrojo (IR) que ablaciona regiones preestablecidas en cubiertas recubiertas de alcohol poli-vinílico. Empleamos un script personalizado para permitir la fabricación automatizada de patrones con alta eficiencia y precisión en sistemas no equipados con un enfoque automático de hardware. Mostramos que este ir láser asistido micropatterning (microphotopatterning) protocolos de protocolo da como resultado patrones definidos a los que las células se unen exclusivamente y tomar la forma deseada. Además, los datos de un gran número de celdas se pueden promediar debido a la estandarización de la forma de la celda. Los patrones generados con este protocolo, combinados con imágenes de alta resolución y análisis cuantitativo, se pueden utilizar para pantallas de rendimiento relativamente alto para identificar reproductores moleculares que median el vínculo entre la forma y la función.
Introduction
La forma celular es un determinante clave de procesos biológicos fundamentales como la morfogénesis tisular1,la migración celular2,la proliferación celular3y la expresióngénica 4. Los cambios en la forma celular son impulsados por un intrincado equilibrio entre los reordenamientos dinámicos del citoesqueleto que deforma la membrana plasmática y factores extrínsecos como las fuerzas externas ejercidas sobre la célula y la geometría de las adherencias célula-célula y célula-matriz5. La migración de células mesenquimales, por ejemplo, polimeriza una densa red de actina en el borde de ataque que empuja la membrana plasmática hacia adelante y crea una amplia lamellipodia6,mientras que la contractilidad de actomiosina retrae el estrecho borde final de la célula para separar la célula de su posición actual7,8. La interrupción de los eventos de señalización que dan lugar a tales estructuras citoesqueletas especializadas perturba la forma y la polaridad y ralentiza la migración celular9. Además, la flexión de la lámina epitelial durante la gastrulación requiere una constricción apical basada en actomiosina que hace que las células y sus vecinos se conviertan en forma de cuña10. Aunque estos estudios destacan la importancia de la forma celular, la heterogeneidad inherente en la forma celular ha obstaculizado los esfuerzos para identificar mecanismos que conectan la morfología con la función.
Con este fin, en las últimas tres décadas se han desarrollado numerosos enfoques para manipular la forma celular. Estos enfoques logran su objetivo, ya sea mediante la restricción de la célula con un molde tridimensional o el control de la geometría de adhesión celular a través de la deposición modelada de proteínas de la matriz extracelular (ECM) en una superficie antiincrusta, una técnica denominada micropatterning11. Aquí vamos a revisar una serie de técnicas que han ganado popularidad a lo largo de los años.
Originalmente pionera como un enfoque para aplicaciones microelectrónicas, la impresión de microcontacto basada en litografía suave se ha convertido inequívocamente en una de las favoritas de culto12. Una oblea maestra se fabrica primero exponiendo selectivamente áreas de un sustrato de silicio recubierto de fotorresistencia a la fotorradiación, dejando atrás una superficie estampada13. Un elastómero, como pdms, se vierte entonces sobre la oblea maestra para generar un "sello" suave que transfiere las proteínas ECM a un sustrato deseado11,14. Una vez fabricada, una oblea maestra puede ser utilizada para fundar muchos sellos PDMS que dan lugar a micropatrones altamente reproducibles12. Sin embargo, los patrones no se pueden ajustar fácilmente debido al largo proceso de fotolitografía. Este proceso también requiere equipos altamente especializados y salas blancas que normalmente no están disponibles en los departamentos de Biología.
Más recientemente, la impresión directa usando UV profundo se ha divulgado para eludir las limitaciones planteadas por acercamientos litografía-basados tradicionales. La luz UV profunda se dirige a través de una fotomáscara a áreas selectivas de una cubierta de vidrio recubierta con poli-L-lisina-injertado-polietilenglicol. Los grupos químicos expuestos a los rayos UV profundos son fotoconvertidos sin el uso de enlazantes fotosensibles para permitir la unión de proteínas ECM15. La falta de enlazadores fotosensibles permite que las cubiertas estampadas permanezcan estables a temperatura ambiente durante más de sietemeses 15. Este método evita el uso de salas blancas y equipos de fotolitografía y requiere una capacitación menos especializada. Sin embargo, el requisito de fotomáscaras todavía plantea un obstáculo sustancial para los experimentos que requieren cambios fácilmente disponibles en los patrones.
Además de los métodos que manipulan la geometría celular a través de la deposición controlada de proteínas ECM en una superficie 2D, otros buscan controlar la forma de la célula mediante la confinación de las células en microestructuras 3D. Muchos estudios han adaptado el enfoque basado en litografía blanda descrito anteriormente para generar cámaras PDMS 3D, en lugar de 2D, para investigar procesos biológicos dependientes de la forma en embriones, bacterias, levaduras y plantas16,17,18,19. La polimerización de dos fotones (2PP) también ha tomado la delantera como una técnica de microfabricación que puede crear complejos andamios de hidrogel 3D con resolución nanométrica20. 2PP se basa en los principios de la adsorción de dos fotones, donde dos fotones entregados en pulsos de femtosegundo son absorbidos simultáneamente por una molécula - fotoiniciador en este caso - que permite la polimerización local de fotopolímeros21. Esta técnica ha sido muy empleada para imprimir andamios 3D que imitan las estructuras nativas de ECM del tejido humano y se ha demostrado que induce un bajo daño fotoquímico a las células22.
El debut del microfotopatterning hace 10 años dio a los investigadores la oportunidad de fabricar micropatrones evitando equipos inaccesibles y especializados. Microphotopatterning crea patrones en la escala de micras mediante la eliminación térmica de regiones selectivas de alcohol poli-vinílico (PVA) recubierto en superficies de vidrio activadas utilizando un láser infrarrojo23,24. Las proteínas ECM que se unen solo a la superficie de vidrio subyacente y no a PVA sirven como señales bioquímicas para permitir la dinámica de propagación controlada y la forma celular. Este método también ofrece una flexibilidad superior, ya que los patrones se pueden cambiar fácilmente en tiempo real. Aquí, proporcionamos un protocolo paso a paso de microfotopatterning mediante el uso de un sistema comercial de imágenes multi-fotón. El protocolo descrito está diseñado para la fabricación rápida y automatizada de patrones grandes. Hemos demostrado que estos patrones controlan eficientemente la forma de la célula mediante la restricción de la geometría de las adherencias célula-ECM. Finalmente, se demuestra que la técnica de patroneo descrita modula la organización y dinámica del citoesqueleto de actina.
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Protocol
1. Preprocesamiento de coverslip
- Prepare squeaky-clean coverslips como se describe en Waterman-Storer, 199825.
- Preparar la solución de trimetoxisilano al 1% (3-aminopropil) (APTMS) e incubar las tapas en la solución durante 10 min con agitación suave. Asegúrese de que los cubrebocas se muevan libremente en la solución.
- Lave las cubiertas dos veces con dH2O durante 5 min cada una.
- Prepare la solución de glutaraldehído (GA) al 0,5% e incube los cubrebocas en la solución durante 30 min en una coctelera. Para 25 cubrebocas, use 50 mL de solución de glutaraldehído. Asegúrese de que los cubrebocas se muevan libremente en la solución.
- Lave las cubrebocas tres veces con dH2O durante 10 min cada una.
- Gire los cubrebocas secas durante 30 s utilizando un spinner de cubrebocas hecho a medida. Se ha publicado una descripción detallada de la hilandera de cubrebocas26 y está disponible en línea (https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/). Las tapas activadas se pueden almacenar hasta un mes a +4 °C en una caja con divisores para que se dispongan entre sí.
2. Recubrimiento de PVA
- Mezcle PVA (98% PVA hidrolizado, MW 98000) con dH2O para hacer una solución al 5,6%.
- Solubilice la mezcla en un baño de agua de 90 °C y filtre inmediatamente a través de un filtro de 0,2 μm en un gabinete de bioseguridad mientras está caliente. Filtre la solución común de nuevo si precipita. La solución de PVA se puede almacenar a temperatura ambiente durante 3 meses.
- En un tubo de 15 mL, agregue una parte de HCl a ocho partes de PVA. Invierta el tubo cuidadosamente unas cuantas veces para mezclar.
- Vierta 2 mL de la solución mixta en una placa de Petri de 35 mm y sumerja una cubierta limpia y preprocesada en el líquido, teniendo cuidado de que las tapas no se peguen al fondo. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min en una coctelera.
- Retire cuidadosamente los cubrebocas de la solución. Utilice el spinner coverslip para girar la capa durante 40 s. Mientras tanto, limpie las pinzas. Transfiera el cubrebocas a una caja y seque a +4 °C durante la noche. Las cubiertas recubiertas de PVA se pueden almacenar a +4 °C durante un hasta dos semanas.
3. Configuración del microscopio multifotón
NOTA: El protocolo descrito está afinado para crear micropatrones adhesivos celulares de la forma y el tamaño deseados en sistemas de imágenes de múltiples fotones verticales o invertidos, especialmente los que no están equipados con un enfoque automático de hardware. Por lo tanto, para cada campo de visión (FOV), el script de modelado ablates un área pequeña para crear un marcador fiduciario en el cubrebocas, utiliza un enfoque automático de software para enfocar el microscopio en la superficie del cubrebocas y ablaciona el patrón deseado. La ejecución de este script en un bucle para FOVs adyacentes crea robustamente una gran variedad de micropatrones (5 x 5 mm o más) que restringen la forma de la célula y modulan la actividad de los procesos biológicos intracelulares. El protocolo descrito fue desarrollado para el sistema de imágenes Nikon A1R MP+ controlado por el software NIS-Elements. Si se utiliza un sistema de imágenes de otro proveedor para el modelado, las configuraciones ópticas y el script de modelado deben ajustarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Encienda el software del microscopio. Asegúrese de que el objetivo "Apo LWD 25X/1.10W DIC N2" esté montado en el microscopio.
NOTA: El protocolo descrito aquí está optimizado para un objetivo de inmersión en agua 25x/1.1 NA, pero también se pueden usar otros objetivos para el modelado. Los lectores deben ser conscientes de que palmaditas con un objetivo de alta magnificación(por ejemplo,40x y 60x) toma más tiempo, ya que disminuye significativamente el número de patrones ablacionados en cada campo de estudios. Los objetivos de bajo aumento se pueden utilizar para el modelado, siempre y cuando proporcionen una iluminación uniforme en todo el campo de trabajo y una potencia láser suficiente para ablacionar la capa de PVA. - En la ventana gui de A1plus MP, fije la línea laser a 750 nanómetro.
- Configuración de la configuración óptica "Imagen"
NOTA: NIS-Elements proporciona a los usuarios varias herramientas (interfaz gráfica, un generador de flujo de trabajo de adquisición JOBS, configuraciones ópticas y macros) para controlar el hardware del microscopio. En este protocolo, la mayor parte del control de hardware se logra a través de varias configuraciones ópticas, así como módulos de adquisición de ND y estimulación de ND.- En la pestaña Calibración, haga clic en Nueva configuración óptica. Nombre de la configuración óptica "Imagen". Esta es la configuración óptica de línea base que permite la obtención de imágenes de la cubierta a través de la reflectancia. Deje todas las demás opciones como predeterminadas y seleccione el objetivo adecuado.
- En la ventana A1plus MP GUI, haga clic en el botón Settings Button para configurar las configuraciones de hardware bajo esta configuración óptica. Establezca el láser de estimulación en IR stim,coloque el divisor de haz (BS 20/80) en la ruta de luz, configure la unidad de escáner en Galvano y seleccione el detector descascarado apropiado.
- En la ventana A1plus Compact GUI, seleccione un tamaño de escaneo y tiempo de permanencia que sea suficiente para capturar pequeñas características en la cubierta (1.1 ms y 1024 píxeles en nuestro sistema, respectivamente). Haga clic en el botón Normal para que no se realice ningún promedio de línea o integración de línea. Asegúrese de que la casilla Usar láser IR esté marcada. Configure el escaneo unidireccional para simplificar.
NOTA: Si la velocidad de escaneo es preocupante, se puede utilizar el escaneo bidireccional. - En la misma ventana, ajuste la potencia del láser y la sensibilidad del detector para obtener una imagen brillante pero no saturada de la superficie de la cubierta. Establecer la potencia del láser en 3 - 5% de la potencia máxima y la sensibilidad del detector ("HV" slider) a 15 V es un buen punto de partida.
- En la ventana Área de escaneo A1plus, establezca Zoom en 1 para capturar todo el fov.
- Guarde la configuración óptica.
- Configuración de la configuración óptica "Print_Fudiciary_Marker"
- Duplique la configuración óptica "Imagen" y cámbiele el nombre a "Print_Fudiciary_Marker".
- En la ventana A1plus Compact GUI, seleccione el tamaño de escaneo y el tiempo de permanencia más pequeños (64 píxeles y 80.2 ms en nuestro sistema, respectivamente).
- Dado que no se requiere ninguna imagen en este paso, establezca la sensibilidad del detector en 0 y aumente la potencia del láser al 30%. Una mayor potencia del láser eliminará térmicamente la capa de PVA en el cubrebocas en las regiones deseadas.
- En la ventana A1plus Scan Area , establezca Zoom en máximo (15.87 para nuestro sistema) y coloque el área de escaneo en el centro del campo de trabajo.
- En la ventana Adquisición de ND, configure un experimento de pila Z. Establezca el movimiento en la posición Z en Relativo y seleccione el dispositivo Z apropiado. Establezca el tamaño del paso en 2 μm y la profundidad de la pila en 10 μm por encima y por debajo para tener en cuenta cualquier irregularidad en la etapa del microscopio o la superficie de PVA entre los FOV adyacentes.
- Configuración de la configuración óptica "Autofocus"
- Duplique la configuración óptica "Imagen" y cámbiele el nombre a "Enfoque automático".
- En la ventana Área de escaneo A1plus, disminuya el factor de zoom para que el fov sea ligeramente mayor que el marcador fiduciario. Esto garantiza que otras entidades pequeñas en el cubrebocas no interfieran con el enfoque automático.
- En el menú Dispositivos, seleccione Configuración de enfoque automático. Establezca el grosor de escaneo en el de la pila Z en el experimento de la pila Z (consulte el paso 3.5.5). El microscopio escaneará a través de este rango y encontrará el mejor plano focal utilizando el marcador fiduciario. Deje el tamaño del paso como predeterminado.
- Configuración de la configuración óptica "Load_ROI"
- Duplique la configuración óptica "Imagen" y cámbiele el nombre a "Load_ROI".
- En la ventana A1plus Compact GUI, establezca un tamaño de escaneo idéntico al de la máscara roi. Esta configuración óptica se utilizará para capturar una imagen en la que se cargará la máscara roi. Utilizamos 2048 píxeles para lograr un equilibrio óptimo entre resolución y velocidad.
NOTA: Es esencial que esta imagen capturada sea idéntica en tamaño a la máscara roi.
- Configuración de la configuración óptica "Micropattern"
- Duplique la configuración óptica "Print_Fiduciary_Marker" y cámbiele el nombre a "Micropattern".
- Establezca el Factor de zoom en uno.
- En la ventana guia de A1plus MP, aumente la potencia del láser de estimulación para ablar el PVA y seleccione una velocidad de escaneo adecuada (40% y 32 s/ marco en nuestros experimentos, respectivamente).
- En la ventana de estimulación de ND, configure un experimento de estimulación de ND. Agregue algunas fases al horario y establezca cada una como Estimulación. Asegúrese de que el área de estimulación y la duración sean correctas.
NOTA: El número de fases se puede ajustar de acuerdo con el grosor y la suavidad de la capa PVA, así como la potencia del láser utilizada en esta configuración óptica. - En la misma ventana, habilite la función StgMoveMainZ(-1.000,1) antes de cada fase. Esto nuevamente explica cualquier desviación en la dirección Z.
NOTA: La distancia y la dirección en la que se mueve el objetivo se pueden ajustar de acuerdo con el grosor y la suavidad de la capa PVA.
- Configuración de la configuración óptica "Label_Surface"
- Duplique la configuración óptica "Print_Fudiciary_Marker" y cámbiele el nombre a "Label_Surface".
- En la ventana A1plus Compact GUI, aumente significativamente la potencia del láser y establezca Zoom en uno. La alta potencia láser utilizada aquí dañará físicamente la cubierta de vidrio y producirá una etiqueta visible a simple vista. Esto ayuda a localizar los patrones en experimentos posteriores.
4. Generar la máscara de ROI y configurar la macro
- Generación de la máscara de ROI
- Utilice Adobe Photoshop u otro software disponible para generar una imagen RGB de 2048 × 2048. La imagen corresponde a un campo de estudio bajo el microscopio(es decir, 532,48 × 532,48 μm, 0,26 μm por píxel). La imagen debe tener un fondo negro (0, 0, 0).
NOTA: Se pueden utilizar varios editores de imágenes comerciales y gratuitos para generar máscaras de ROI para micropatterning asistido por láser. Aunque usamos Adobe Photoshop para generar las máscaras, GIMP e ImageJ / Fiji también están disponibles como opciones gratuitas alternativas. - Dibuje de 8 a 12 patrones blancos (255,255,255) sobre el fondo negro. El tamaño del patrón varía en función del tipo de celda (~200 píxeles de diámetro). Deje un área en blanco de 500 × 500 en el centro de la imagen para el enfoque automático. Deje suficiente espacio entre los patrones adyacentes (>200 píxeles) y en la placa del fov para una ablación óptima y la unión celular. Los patrones presentados en este protocolo están disponibles en Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning).
- Utilice Adobe Photoshop u otro software disponible para generar una imagen RGB de 2048 × 2048. La imagen corresponde a un campo de estudio bajo el microscopio(es decir, 532,48 × 532,48 μm, 0,26 μm por píxel). La imagen debe tener un fondo negro (0, 0, 0).
- Configuración de la macro
- Haga clic en el menú Macro y seleccione Nueva macro.
- Importe el código "Pattern_Stimulation" disponible en Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) en la ventana Nueva macro. Guarde este fragmento de código en una carpeta adecuada.
- Abra otra ventana nueva macro e importe el código "Stage_Movement" disponible en Github (http://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning). Asegúrese de que el directorio de trabajo "Stage_Movement" en este código es idéntico al del paso 4.2.2. Guarde el código "Stage_Movement" en la misma carpeta en el paso 4.2.2.
5. Generación de micropatrones usando fotoablación
- Encienda el microscopio y sus accesorios. Asegúrese de que el láser IR se haya calentado lo suficiente antes de esto.
- Transfiera el cubrebocas recubierto de PVA a un soporte. Para un microscopio vertical, asegúrese de que la superficie de PVA esté ablación boca abajo.
- Agregue agua a las esquinas para estabilizar el cubrebocas y monte el soporte en la etapa del microscopio.
- Baje el objetivo y agregue agua en el cubrebocas.
NOTA: El protocolo descrito aquí está optimizado para un objetivo de inmersión en agua 25x/1.1 NA. Si se utiliza un objetivo de inmersión en seco o en aceite, el agua debe reemplazarse por un medio de inmersión adecuado. Cuando se utiliza un objetivo de inmersión en agua para generar una gran matriz de micropatrones, la evaporación podría convertirse en un problema. Si este es el caso, el agua debe reemplazarse con GenTeal, un lubricante para los ojos de venta libre disponible en las farmacias. - En el software del microscopio, encienda el obturador láser IR en la ventana A1plus MP GUI. Haga clic en el botón Autolineación para alinear el láser antes del modelado.
NOTA: Es crucial realizar la autoordenación láser al principio de cada sesión de modelado, ya que pequeñas desviaciones en la ruta del láser afectarán significativamente la calidad de los patrones. - Cambie a la configuración óptica "Imagen". En la ventana A1plus Compact GUI, haga clic en Scan (Escanear) para escanear el FOV mientras mueve lentamente el objetivo más cerca de la cubierta.
- Supervise cuidadosamente la imagen. Al principio, la imagen aparecerá extremadamente tenue. Mueva el objetivo más cerca del cubrebocas hasta que el brillo de la imagen aumente. Esta es la superficie de la cubierta que se enfrenta al objetivo. Continúe moviendo el objetivo hasta que el brillo disminuya y aumente de nuevo. Esta es la superficie PVA que se va a modelar. Concéntrese en cualquier característica pequeña (imperfecciones del cubrebocas, polvo, etc.)en esta superficie y establezca cero en la unidad Z. Siempre establezca cero después de enfocar.
NOTA: Aunque ambas superficies del cubrebocas están recubiertas con PVA, las propiedades ópticas del vidrio no se alteran significativamente por el recubrimiento de PVA. Vemos rutinariamente tales cubrebocas con objetivos secos, de agua y de inmersión en aceite y no encontramos la superficie de PVA no modelada para interferir con las imágenes. - Cambie a la configuración óptica "Label_Surface". Haga clic en Capturar. Vuelva a la configuración óptica de "imágenes" y a la exploración. La superficie de vidrio debe dañarse y aparecer amorfa. El área dañada es visible a simple vista, lo que indica la ubicación de los patrones en experimentos posteriores.
Nota : para aumentar el tamaño de la etiqueta visible, repita el paso 5.8 en varios FOV adyacentes. - Compruebe de nuevo que el objetivo está aproximadamente en el centro de la cubierta. Asegúrese de que haya suficiente agua entre el objetivo y el cubrebocas. Mueva el escenario de 1 a 2 FOVs para evitar partículas de vidrio y escanee para confirmar.
- En el menú Dispositivos, abra la macro Stage_Movement. Compruebe que el directorio de trabajo Pattern_Stimulation es correcto; si no, la estimulación no ocurrirá. Establezca las variables "PatternLength" y "PatternHeight" en el número deseado de FOVs que se modelarán. Guarde y ejecute la macro.
- Una vez completado el modelado, cambie a la configuración óptica "Imaging". Una vez más, compruebe que el obturador láser IR está abierto en la ventana de la GUI de A1plus MP.
- Mueva el escenario para ver los patrones. Escanee a través de los patrones para comprobar su calidad.
- Transfiera el cubrebocas al cuadro de cuadrícula, con los patrones hacia arriba.
- Guarde las cubiertas estampadas a +4 °C hasta una semana antes de su uso.
6. Adsorción de fibronectina
- Hacer solución naOH fresca de 1 M NaBH4 en 1 M. Añadir en una proporción de 1:100 a pH 8.0 tampón de fosfato que contiene 0.2 M etanolamina.
- Transfiera los cubrebocas modelados a un plato de cultivo de tejidos de 35 mm. Incubar cada cubrebocas con 1 mL de la solución anterior durante 8 min para apagar la autofluorescencia, y luego enjuague 3 veces con PBS.
- Diluir la fibronectina (FN) en PBS a una concentración final de 10 μg/mL. Incubar el cubrebocas en FN durante 1 h a +37 °C.
NOTA: Si se observa una unión sustancial inespecífica de la proteína ECM al sustrato, el FN puede diluirse en PBS que contiene 0,1% Pluronic F-12724. - Lave la cubierta 2 veces con PBS. Si no se usa inmediatamente, almacenar en PBS a +4 °C durante la noche.
7. Accesorio de la célula
NOTA: El siguiente protocolo está optimizado para los fibroblastos gingivales humanos primarios.
- Cultivo de un plato de 10 cm de células al 70% de confluencia.
- Calentar medios de cultivo celular, PBS y 0.05% tripsina en un baño de agua de +37 °C.
NOTA: Para las células que se adhieren débilmente al sustrato, la disociación no proteolítica con verseno (0,48 mM EDTA) o un tampón libre de enzimas patentado puede aumentar la unión celular a los patrones y debe considerarse. - Antes de sembrar las células, reubique el cubrebocas estampado a un plato limpio de cultivo de tejidos de 35 mm que contenga PBS caliente de 1 mL.
- Aspirar el medio de cultivo celular del plato de cultivo de tejidos de 10 cm y lavar una vez con PBS.
- Añadir 700 μL de tripsina/EDTA al plato al 0,05% e incubar las células en una incubadora de +37 °C, 5% deCO2 durante 1 min.
- Mientras tanto, aspirar el PBS que cubre el cubrebocas estampado y añadir 1 mL de medios de cultivo celular.
- Confirme que las celdas se han desasociado. Luego resuspend las células tripsinizadas con 10 mL de medios de cultivo celular y agregue 1 mL al cubrebocas estampado.
- Cultivar células en la incubadora durante 2 - 3 h y comprobar si un número suficiente de células se han unido a los patrones. Si es así, cambie el medio una vez para eliminar las celdas no adjuntas. Esto minimiza la posibilidad de que varias células aterrice en el mismo patrón.
Nota : tiempo de datos adjuntos puede variar dependiendo del tipo de celda. - Después de otras 3-4 h, o cuando un número suficiente de células se han diseminado en patrones, las células están listas para experimentos adicionales. No espere demasiado tiempo para evitar la división celular.
8. Adquisición de datos
- Fijar las células con 4% de PFA en el tampón citoesqueleto27 durante 10 min a temperatura ambiente.
- Seguir los protocolos de inmunofluorescencia establecidos para las proteínas de interés. Las cubiertas recubiertas con PVA funcionan bien con cualquier protocolo de inmunofluorescencia.
- Adquirir imágenes de células usando un microscopio apropiado. Dependiendo del objetivo del experimento, imagen de una o varias células por campo de trabajo.
9. Análisis de imágenes
NOTA: El siguiente protocolo permite a los usuarios obtener la señal de fluorescencia promedio de la proteína de interés sobre un gran número de células a partir de pilas Z de imágenes de microscopio.
- Abra las imágenes adquiridas en NIS Elements y recorte las imágenes. Asegúrese de que cada imagen contiene sólo una celda bien extendida. Las instrucciones detalladas sobre el procesamiento de imágenes se pueden encontrar en el siguiente script.
- Instale Anaconda y ejecute Spyder a través de Anaconda Navigator.
Nota : las secuencias de comandos .py se pueden ejecutar en cualquier entorno con los paquetes adecuados identificados en los requisitos.txt. Recomendamos Anaconda porque contiene la mayoría de los paquetes requeridos para los códigos a continuación. - Descargue el script de Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) y ábralo en Spyder("Pattern_Averaging_3Channels.py" o "Pattern_Averaging_4Channels.py" para imágenes con 3 canales o 4 canales, respectivamente).
- Establezca parámetros basados en las imágenes adquiridas. Consulte el script para obtener descripciones detalladas.
- Presione F5 para ejecutar el script. Se puede realizar un seguimiento del progreso en el panel Consola.
- Recuperar los archivos de salida guardados en la misma carpeta. Las imágenes de salida son el promedio de cada canal para todas las muestras. La hoja de Excel muestra la intensidad media de cada canal dentro de una celda de muestra, lo que permite un análisis cuantitativo adicional.
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Representative Results
La calidad de los datos experimentales obtenidos a través de micropatterning depende en gran medida de la calidad de los patrones. Para determinar la calidad de los patrones generados con el método anterior, primero se utilizó la microscopía de reflectancia para evaluar la forma y el tamaño de las áreas foto-ablated de la cubierta. Encontramos que cada patrón individual se veía muy similar a la máscara de ablación y mostraba juntas claras y una superficie que reflejaba la luz uniformemente (Figura 2B). Se puede imprimir una variedad de formas y tamaños dependiendo de la arquitectura del citoesqueleto deseada, pero usamos la forma de ballesta que mejor se adapte a nuestros propósitos. La microscopía de fuerza atómica (AFM) reveló que tales patrones tenían aproximadamente 140 nm de altura y tenían una superficie lisa con una variación topológica mínima en todo (Figura 2F). Los ajustes de patrones subóptimos, como la baja potencia del láser y el plano focal incorrecto, dieron como resultado la eliminación incompleta de la superficie de PVA que se manifiesta como patrones parciales más oscuros con topología desigual (Figura 2C). El ajuste de la potencia del láser demasiado alta dio lugar a PVA "burbujeo" y cuando es extremo, cubre el daño de la superficie que también es indeseable (Figura 2D).
En experimentos preliminares intentamos aumentar el área de modelado disminuyendo múltiples FOVs en un solo cubrebocas. Encontramos que este enfoque, aunque funciona en principio, es poco fiable y tedioso debido a la Z-deriva del soporte del microscopio y la ligera inclinación de la tapa. Para lograr patrones de alta calidad en un gran número de FOVs de manera automatizada, implementamos una macro personalizada que mejoró la precisión del enfoque del microscopio durante el proceso de modelado. El microscopio multifotón emplea un láser de pulso que degrada eficientemente el PVA con alta potencia en un plano focal estrecho, lo que hace que el proceso de modelado sea sensible a cualquier desnivel o inclinación en la muestra. Como resultado, es importante identificar el plano focal preciso en cada campo de trabajo. Esto es aún más problemático para los sistemas que carecen de un módulo de enfoque perfecto, ya que las desviaciones de tan solo una a dos micras pueden hacer que el proceso de modelado sea infructuoso. Para solucionar este problema, el script de macro personalizado primero patrones de un pequeño cuadrado en el centro de cada nuevo fov que sólo necesita ser aproximadamente en el foco mediante el escaneo a través de una pila Z relativamente gruesa (≈20 μm). El microscopio luego escanea rápidamente a través de la pila de imágenes y utiliza la función de enfoque automático de NIS Elements para identificar el plano focal óptimo. La máscara de patrón se carga y se establece como roi de estimulación para que se produzca la estimulación ir. La etapa posteriormente se mueve al siguiente fov y repite este proceso. Además, la trayectoria en forma de onda cuadrada del movimiento de la etapa del microscopio aseguró una acumulación mínima de errores entre los FOVs secuenciales. Mediante el uso de este protocolo, fabricamos rutinariamente patrones compuestos por 49 FOVs microscopio que cubren 3,5 x 3,5 mm de área de la cubierta en menos de 3 H.
Para probar si las áreas modeladas, no el PVA imperturbable, podrían adsorber las proteínas ecm, cubrimos los cubrebocas modelados con 10 μg/mL FN y los manchamos con el anticuerpo anti-FN. Utilizando microscopía fluorescente de amplio campo, encontramos que FN se adsorbió uniformemente a las áreas modeladas donde el PVA había sido eliminado por ablación con láser(Figura 2E).
Para determinar si la arquitectura del citoesqueleto y la distribución de la tensión se podrían modificar como se esperaba en los patrones, sembramos las células en los coverslips modelados y visualizamos la distribución de la cadena ligera de la miosina, un marcador de la contractilidad, con microscopia de la fluorescencia. Después de la siembra inicial, las células gravitaron gradualmente hacia el cubrebocas. Los que aterrizaron en áreas modeladas se unieron y se extendieron en la forma del patrón con el tiempo. Los que aterrizaron en PVA sólo se unieron libremente y se retiraron después de varios lavados y cambios en los medios. Se encontró que las células diseminadas en patrones de estructuras de fibroblastos fenotípicos, incluyendo un borde denso de actina de lamellipodia, fibras de tensión ventral gruesa a lo largo de los dos lados, y fibras de tensión dorsal que emanan de los lamellipodia conectados por arcos transversales (Figura 3A). La cadena ligera de la miosina (MLC) se sentó detrás del borde denso del lamellipodia y exhibió un patrón estriado a lo largo de paquetes de la actinia. Como lo indican las imágenes promediadas de muchas células, este fenotipo fue consistente a través de un gran número de patrones (Figura 3B).
Figura 1. Esquema de micropatterning asistido por láser IR (microphotopatterning). (A) Las cubiertas de vidrio se conjugan químicamente con APTMS, GA y PVA, en el orden respectivo. La superficie de PVA no es adhesiva para las células y proteínas. (B)El PVA se elimina en patrones preestablecidos mediante un láser IR. (C) Las cubiertas estampadas están recubiertas con una proteína ECM que solo se adsorberá a áreas estampadas. (D) Las células se platean en cubrebocas, se fijan, y immunostained para las proteínas del interés. Las células que aterrizan en islas modeladas se extienden en la forma del patrón que da lugar a estructuras citoesqueléticos características, mientras que las que aterrizan en PVA permanecen esféricas. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2. Validación y caracterización de micropatrones. (A)Configuración de micropatterning asistido por láser IR (microphotopatterning) en una etapa de microscopio. El láser IR ablaciona térmicamente el PVA en múltiples FOVs. (B) Una imagen de microscopía de reflectancia de micropatrones que tienen tableros claros y son idénticos a las máscaras roi. (C) Una imagen de microscopía de reflectancia de eliminación incompleta de PVA resultante de la potencia láser subóptima. (D) Una imagen de microscopía de reflectancia de burbujeo de PVA resultante del exceso de potencia del láser. (E)Imágenes de inmunofluorescencia de cubiertas estampadas recubiertas de FN teñidas con anticuerpos primarios anti-FN y anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos. (F) Una línea de escaneo de topología AFM y una imagen AFM representativa de un patrón de ballesta. Para medir la topología del micropatrón, la proyección de imagen del modo de contacto fue realizada usando una punta de prueba bruker AFM (MLCT-B) montada en un microscopio de la fuerza atómica de NanoWizard 4. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3. Imágenes representativas de células chapadas en micropatrones. (a)imágenes representativas de un fibroblasto gingival humano primario plateado en los patrones de la ballesta immunostained para la actinina y MLC. Las imágenes fueron adquiridas con un microscopio confocal equipado de un objetivo de 100x. (B)Imágenes de inmunofluorescencia promediadas de actina y MLC en células plateadas en patrones de ballesta generados por una escritura de Python personalizada. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Discussion
Los resultados anteriores demuestran que el protocolo descrito de micropatterning asistido por láser IR (microphotopatterning) proporciona patrones adherentes reproducibles de varias formas que permite la manipulación de la forma celular y la arquitectura citoesquelético. Aunque se han desarrollado numerosos métodos de micropatterning tanto antes como después del debut del microfotopatterning, este método posee varias ventajas. En primer lugar, no requiere equipos especializados y salas blancas que generalmente solo se encuentran dentro de los departamentos de ingeniería. De hecho, a medida que los microscopios multifotón se están convirtiendo en una vista más común en los departamentos de Biología, el microfotopatterning expande las aplicaciones del microscopio multifotón y se suma al grupo potencial de usuarios. Los patrones también se pueden cambiar bajo demanda e imprimir inmediatamente, en lugar de tener que fabricar una nueva oblea maestra que implique un largo proceso de litografía.
En comparación con el protocolo de microfotopatterning preexistente, una mejora en nuestro protocolo es la eliminación de varios pasos de curado que consumen mucho tiempo durante la preparación de coverslip. Mostramos que la calidad del accesorio de PVA-coverslip sigue siendo imperturbable pues los patrones todavía estaban intactos y podrían atar las células incluso dos semanas después de la fabricación. Más importante aún, mejoramos la automatización del proceso de modelado al eliminar la necesidad de preestablecer la posición de cada FOV24. En su lugar, implementamos una macro comprensible que permite el modelado de un área grande mientras identificamos con precisión el plano focal óptimo de cada campo de estudio.
Aunque las macros en el protocolo permiten la automatización de patrones en nuestro sistema, entendemos que cada microscopio de barrido láser comercial viene con su propio software propietario que rara vez es compatible con otros, lo que dificulta la implementación de nuestro protocolo exacto en otros sistemas. Sin embargo, el flujo de trabajo general se puede adaptar bien a otros sistemas comerciales para facilitar el micropatterning automatizado, es decir, el proceso de centrarse en cada campo de visión individual, cargar la máscara, ablación PVA y mover la etapa del microscopio a un nuevo campo de visión.
Varios pasos en el protocolo de modelado deben llevarse a cabo con gran cuidado para garantizar un modelado eficiente. El paso más crítico es optimizar las condiciones de estimulación antes de generar patrones. En microscopía multi-fotón, dos o más fotones deben llegar casi simultáneamente a una molécula fluorescente y combinar su energía para excitar la fluorescencia. Este evento de baja probabilidad crea una sección óptica extremadamente delgada que aumenta la relación señal/ruido28. Aunque es beneficiosa para la obtención de imágenes, esta característica hace que la eliminación del recubrimiento delgado de PVA sea extremadamente sensible a la posición Z de la muestra. Se pueden aplicar varias medidas para contrarrestar esto. En primer lugar, la potencia del láser debe ajustarse para garantizar la eliminación completa de la PVA sin "hervir" el polímero o dañar la cubierta del vidrio. Si la eliminación de PVA es consistentemente incompleta, recomendamos verificar la alineación del láser, ya que esto generalmente aumenta la potencia del láser. En segundo lugar, la etapa del microscopio debe nivelarse para evitar la inclinación de la muestra, que podría resultar en patrones incompletos. Las estimulaciones IR en múltiples posiciones Z también deben configurarse para garantizar que la capa PVA esté dirigida. Alternativamente, si el microscopio está equipado con un módulo de enfoque perfecto, se pueden realizar pruebas preliminares para determinar el desplazamiento óptimo en la posición Z para la orientación de PVA. Otro paso crítico es establecer un microscopio macro que permita la estimulación de patrones de manera automatizada. La macro debe encontrar el plano focal de cada nuevo fov para evitar complicaciones por la inclinación de la muestra o la irregularidad de la superficie. También debe permitir que el escenario se mueva en forma de S de fila a fila, análoga a la ruta tomada en el escaneo bidireccional, para minimizar las desviaciones en Z entre FOVs consecutivos.
Una limitación al protocolo descrito es el tiempo necesario para producir un gran número de cubrebocas estampadas, una ventaja sin precedentes que ofrece la impresión de microcontacto basada en litografía29,30. Como resultado, este protocolo es el más adecuado para experimentos en los que se requiere un número limitado de condiciones, o aquellos que requieren ajustes fácilmente disponibles en la forma y el tamaño del patrón. Además, para los sistemas que carecen de un módulo de enfoque automático de hardware, integramos una serie de eventos de estimulación en diferentes planos Z para garantizar la eliminación automatizada y efectiva de PVA. Dado que la estimulación ir es el paso que más tiempo consume, la adición de cada evento de estimulación (~ 30 seg) alarga significativamente el proceso de modelado. Si el tiempo es motivo de preocupación, sugerimos ajustar el enfoque automático disminuyendo el tamaño del paso. Esto facilita la identificación del mejor plano focal que disminuirá el número de eventos de estimulación IR requeridos. En nuestros experimentos, la disminución del número de eventos de estimulación de cinco a dos reduce el tiempo a la mitad (1,5 h).
En conclusión, el protocolo de micropatterning asistido por láser IR (microphotopatterning) que describimos se puede utilizar en cualquier laboratorio que tenga acceso a un microscopio ir equipado con láser. Además de estudiar la arquitectura citoesquelérea y las vías de señalización que conectan la forma con la función, esta técnica también se puede aplicar a la detección de fármacos y otras aplicaciones que son sensibles a la variabilidad de célula a célula.
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Disclosures
Los autores no revelan ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Premio al Nuevo Investigador del Fondo Connaught a S.P., la Fundación Canadiense para la Innovación, el Programa de Subvenciones Discovery de NSERC (subvenciones RGPIN-2015-05114 y RGPIN-2020-05881), el Fondo conjunto de investigación de la Universidad de Manchester y la Universidad de Toronto, y el Programa XSeed de la Universidad de Toronto. C.T. recibió el apoyo de la beca NSERC USRA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane | Aldrich | 281778 | |
| 10 cm Cell Culture Dish | VWR | 10062-880 | Polysterene, TC treated, vented |
| 25X Apo LWD Water Dipping Objective | Nikon | MRD77225 | |
| 3.5 cm Cell Culture Dish | VWR | 10861-586 | Polysterene, TC treated, vented |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | Thermo | 62248 | 1mg/mL dihydrochloride solution |
| Bovine Serine Albumin | BioShop | ALB005 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Wisent | 311-425-CL | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | FC010 | 1mg/mL in pH 7.5 buffer |
| Fibronectin Antibody | BD | 610077 | Mouse |
| Fiji | ImageJ | Version 1.53c | |
| Fluorescent Phalloidin | Invitrogen | A12380 | 568nm |
| Glass Coverslip | VWR | 16004-302 | 22 × 22 mm |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16220 | 25% aqueous solution |
| Hydrochloric Acid | Caledon | 6025-1-29 | 37% aqueous solution |
| IR Laser | Coherent | Chameleon Vision | |
| Minimal Essential Medium α | Gibco | 12561-056 | |
| Mounting Medium | Sigma | F4680 | |
| Mouse Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Goat, 488nm |
| Multi-Photon Microscope | Nikon | A1R MP+ | |
| Myosin Light Chain Antibody | Cell Signaling Technology | 3672S | Rabbit |
| NIS Elements | Nikon | Version 5.21.03 | |
| Nitric Acid | Caledon | 7525-1-29 | 70% aqueous solution |
| Photoshop | Adobe | Version 21.2.1 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Powder |
| Poly(vinyl alchohol) | Aldrich | 341584 | MW 89000-98000, 98% hydrolyzed |
| Rabbit Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4412S | Goat, 488nm |
| Shaker | VWR | 10127-876 | Alsoknown as analog rocker |
| Sodium Borohydride | Aldrich | 452882 | Powder |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | Powder |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S5011 | Powder |
| Spyder | Anaconda | 4.1.4 | |
| Trypsin | Wisent | 325-042-CL | 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA |
References
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