Summary
O protocolo aqui apresentado permite a fabricação automatizada de micropatterns que padronizam a forma celular para estudar estruturas citoesquelletais dentro de células de mamíferos. Esta técnica fácil de usar pode ser configurada com sistemas de imagem disponíveis comercialmente e não requer equipamentos especializados inacessíveis aos laboratórios de biologia celular padrão.
Abstract
O micropatterning é uma técnica estabelecida na comunidade de biologia celular usada para estudar conexões entre a morfologia e a função dos compartimentos celulares, contornando complicações decorrentes de variações naturais célula-célula. Para padronizar a forma celular, as células são confinadas em moldes 3D ou controladas para geometria adesiva através de ilhas adesivas. No entanto, técnicas tradicionais de micropattering baseadas na fotolitografia e gravura UV profunda dependem fortemente de salas limpas ou equipamentos especializados. Aqui apresentamos uma técnica de micropatterning assistida por laser infravermelho (microfotopatterning) modificada a partir de Doyle et al. que pode ser convenientemente configurada com sistemas de imagem disponíveis comercialmente. Neste protocolo, usamos um sistema de imagem Nikon A1R MP+ para gerar micropatterns com precisão de mícula através de um laser infravermelho (IR) que abla regiões predefinidas em tampas revestidas de álcool poli-vinil. Empregamos um script personalizado para permitir a fabricação automatizada de padrões com alta eficiência e precisão em sistemas não equipados com um foco automático de hardware. Mostramos que este protocolo de micropatterning assistido a laser IR (microfotopatterning) resulta em padrões definidos aos quais as células se conectam exclusivamente e assumem a forma desejada. Além disso, dados de um grande número de células podem ser mediados devido à padronização da forma celular. Padrões gerados com este protocolo, combinados com imagens de alta resolução e análise quantitativa, podem ser usados para telas de rendimento relativamente altas para identificar jogadores moleculares mediando a ligação entre forma e função.
Introduction
A forma celular é um determinante fundamental de processos biológicos fundamentais, como morfogênesetecidual 1,migração celular2,proliferação celular3e expressão genética4. As mudanças na forma celular são impulsionadas por um intrincado equilíbrio entre rearranjos dinâmicos do citoesqueleto que deforma a membrana plasmática e fatores extrínsecos, como forças externas exercidas sobre a célula e a geometria das aderências celular-célula e matriz celular5. Migrando células mesenquimais, por exemplo, polimeriza uma densa rede de actina na borda principal que empurra a membrana plasmática para a frente e cria uma lamellipodialarga 6, enquanto a contratilidade da actomyosina retrai a estreita borda de arrasto da célula para desprender a célula de sua posição atual7,8. Eventos de sinalização disruptor que dão origem a tais estruturas citoesqueletal especializadas perturbam a forma e a polaridade e retardam a migração celular9. Além disso, a dobra da folha epitelial durante a gastrição requer constrição apical baseada em atomyosina que faz com que as células e seus vizinhos se tornem em forma de cunha10. Embora esses estudos destaquem a importância da forma celular, a heterogeneidade inerente na forma celular tem sobrecarregado os esforços para identificar mecanismos que conectam a morfologia ao funcionamento.
Para isso, inúmeras abordagens para manipular a forma celular foram desenvolvidas nas últimas três décadas. Essas abordagens atingem seu objetivo, restringindo a célula com um molde tridimensional ou controlando a geometria de adesão celular através da deposição padronizada de proteínas de matriz extracelular (ECM) em uma superfície anti-envelhecimento, uma técnica chamada micropatterning11. Aqui vamos rever uma série de técnicas que ganharam popularidade ao longo dos anos.
Originalmente pioneira como uma abordagem para aplicações microeletrônicas, a impressão de microcontatos baseada em litografia macia tornou-se inequivocamente uma12favorita do culto . Um wafer mestre é fabricado pela primeira vez expondo seletivamente áreas de um substrato de silício revestido de fotoresistista à fotoirradição, deixando para trás uma superfície padronizada13. Um elastômero, como o PDMS, é então derramado no wafer mestre para gerar um "carimbo" macio que transfere proteínas ECM para um substrato desejado11,14. Uma vez fabricado, um wafer mestre pode ser usado para lançar muitos selos PDMS que dão origem a micropatters altamente reprodutíveis12. No entanto, os padrões não podem ser facilmente ajustados devido ao longo processo de fotolitografia. Esse processo também requer equipamentos altamente especializados e salas de limpeza que não estão tipicamente disponíveis nos departamentos de Biologia.
Mais recentemente, a impressão direta usando UV profundo tem sido relatada para contornar limitações impostas por abordagens tradicionais baseadas em litografia. A luz UV profunda é direcionada através de uma máscara fotográfica para áreas seletivas de um deslizamento de vidro revestido com poli-L-lisina-enxerto-polietileno glicol. Grupos químicos expostos a UV profundo são fotoconvertidos sem o uso de linkers fotosensíveis para permitir a vinculação de proteínas ECM15. A falta de linkers fotosensíveis permite que as tampas padronizadas permaneçam estáveis à temperatura ambiente por mais de setemeses 15. Este método evita o uso de salas de limpeza e equipamentos fotolitografia e requer treinamento menos especializado. No entanto, a exigência de fotomasks ainda representa um obstáculo substancial para experimentos que requerem mudanças prontamente disponíveis nos padrões.
Além de métodos que manipulam a geometria celular através da deposição controlada de proteínas ECM em uma superfície 2D, outros buscam controlar a forma celular confinando células em microestruturas 3D. Muitos estudos adaptaram a abordagem à base de litografia macia descrita acima para gerar câmaras PDM 3D, em vez de 2D, para investigar processos biológicos dependentes da forma em embriões, bactérias, leveduras e plantas16,17,18,19. A polimerização de dois fótons (2PP) também assumiu a liderança como uma técnica de microfabização que pode criar andaimes complexos de hidrogel 3D com resolução de nanômetros20. O 2PP baseia-se nos princípios da adsorção de dois fótons, onde dois fótons entregues em pulsos femtosegundos são absorvidos simultaneamente por uma molécula - fotoinitidora neste caso - que permite a polimerização local dos fotopolímeros21. Esta técnica tem sido fortemente empregada para imprimir andaimes 3D que imitam as estruturas nativas de ECM do tecido humano e tem sido mostrado para induzir baixo dano fotoquímico às células22.
A estreia da microfotopattering há 10 anos deu aos pesquisadores a oportunidade de fabricar micropatterns, evitando equipamentos inacessíveis e especializados. A microfotopattering cria padrões na escala de mícrons removendo termicamente regiões seletivas de álcool poli-vinil (PVA) revestidos em superfícies de vidro ativadas usando um laser infravermelho23,24. As proteínas ECM que anexam apenas a superfície de vidro subjacente e não o PVA servem como pistas bioquímicas para permitir a dinâmica de propagação controlada e a forma celular. Este método também oferece flexibilidade superior, uma vez que os padrões podem ser facilmente alterados em tempo real. Aqui, fornecemos um protocolo passo-a-passo de microfotopatterning usando um sistema comercial de imagem multifótons. O protocolo descrito foi projetado para fabricação rápida e automatizada de grandes padrões. Demonstramos que esses padrões controlam eficientemente a forma celular, restringindo a geometria das aderências célula-ECM. Por fim, demonstramos que a técnica de padronização descrita modula a organização e a dinâmica do citoesqueleto actin.
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Protocol
1. Pré-processamento de clipes de cobertura
- Prepare tampas limpas como descrito em Waterman-Storer, 199825.
- Prepare 1% (3-aminopropil)trimethoxysilane (APTMS) solução e incubar as tampas na solução por 10 minutos com agitação suave. Certifique-se de que as tampas se movam livremente na solução.
- Lavar tampas duas vezes com dH2O por 5 min cada.
- Prepare a solução de glutaraldeído (GA) de 0,5% e incubar as tampas na solução por 30 min em um shaker. Para 25 tampas, use 50 mL de solução de glutaraldeído. Certifique-se de que as tampas se movam livremente na solução.
- Lavar tampas três vezes com dH2O por 10 min cada.
- Gire tampas secas para 30 s usando um spinner de deslizamento de cobertura personalizado. Uma descrição detalhada do coverlip spinner foi publicada26 e está disponível online (https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/). As tampas ativadas podem ser armazenadas por até um mês a +4 °C em uma caixa com divisores para que se afastem um do outro.
2. Revestimento PVA
- Mix PVA (98% de PVA hidrolisado, MW 98000) com dH2O para fazer uma solução de 5,6%.
- Solubilize a mistura em um banho de água de 90 °C e filtre imediatamente através de um filtro de 0,2 μm em um armário de biossegurança enquanto estiver quente. Filtre a solução de estoque novamente se precipitar. A solução PVA pode ser armazenada à temperatura ambiente por 3 meses.
- Em um tubo de 15 mL, adicione uma parte HCl a oito partes PVA. Inverta o tubo cuidadosamente algumas vezes para misturar.
- Despeje 2 mL da solução mista em uma placa de Petri de 35 mm e submerse uma tampa limpa e pré-processada no líquido, tomando cuidado para que as tampas não grudem no fundo. Incubar em temperatura ambiente por 5 minutos em um shaker.
- Remova cuidadosamente as tampas da solução. Use o girador de tampas para girar o casaco para 40 s. Enquanto isso, limpe a pinça. Transfira o deslizamento para uma caixa e seque a +4 °C durante a noite. As tampas revestidas de PVA podem ser armazenadas a +4 °C por até duas semanas.
3. Configurando o microscópio multifotônio
NOTA: O protocolo descrito é ajustado para criar micropatters adesivos de células de forma e tamanho desejados em sistemas de imagem multifótons eretos ou invertidos, especialmente aqueles que não estão equipados com um foco automático de hardware. Assim, para cada campo de visão (FOV), o script de padronização abla uma pequena área para criar um marcador fiduciário no deslizamento de tampas, usa um foco automático de software para focar o microscópio na superfície do deslizamento de cobertura, e abla o padrão desejado. Executar este script em um loop para FOVs adjacentes cria robustamente uma grande variedade de micropatterns (5 x 5 mm ou maior) que restringem a forma celular e modulam a atividade de processos biológicos intracelulares. O protocolo descrito foi desenvolvido para o sistema de imagem Nikon A1R MP+ controlado pelo software NIS-Elements. Se um sistema de imagem de outro fornecedor for usado para padronização, as configurações ópticas e o script de padronização devem ser ajustados de acordo com as instruções do fabricante.
- Ligue o software do microscópio. Certifique-se de que o objetivo "Apo LWD 25X/1.10W DIC N2" esteja montado no microscópio.
NOTA: O protocolo descrito aqui é otimizado para um objetivo de imersão de água 25x/1.1 NA, mas outros objetivos também podem ser usados para padronização. Os leitores devem estar cientes de que o pattering com um objetivo de alta ampliação (por exemplo,40x e 60x) leva mais tempo, pois diminui significativamente o número de padrões em chamas em cada FOV. Objetivos de baixa ampliação podem ser usados para padronização, desde que forneçam iluminação uniforme em todo o FOV e energia laser suficientes para ablatar a camada PVA. - Na janela GUI A1plus MP, defina a linha laser para 750 nm.
- Configuração da configuração óptica "Imagem"
NOTA: O NIS-Elements fornece aos usuários várias ferramentas (interface gráfica, um construtor de fluxo de trabalho de aquisição JOBS, configurações ópticas e macros) para controlar o hardware do microscópio. Neste protocolo, a maior parte do controle de hardware é alcançado através de várias configurações ópticas, bem como módulos de Aquisição ND e Estimulação ND.- Na guia Calibração, clique em Nova Configuração Óptica. Nomeie a configuração óptica "Imagem". Esta é a configuração óptica de linha de base que permite a imagem do deslizamento de cobertura através da reflectância. Deixe todas as outras opções como padrão e selecione o objetivo apropriado.
- Na janela GUI A1plus MP, clique no botão Configurações para configurar as configurações de hardware sob esta configuração óptica. Coloque o laser de estimulação em ir stim,coloque o divisor de feixe (BS 20/80) no caminho da luz, defina a Unidade de Scanner para Galvano e selecione o detector descanado apropriado.
- Na janela GUI compacta A1plus, selecione um tamanho de varredura e tempo de moradia suficientes para capturar pequenos recursos no deslizamento de tampas (1,1 ms e 1024 pixels em nosso sistema, respectivamente). Clique no botão Normal para que nenhuma média de linha ou integração de linha seja realizada. Certifique-se de que a caixa laser Use IR está verificada. Configure a digitalização unidirecional para simplificar.
NOTA: Se a velocidade de varredura for preocupante, a varredura bidirecional pode ser usada. - Na mesma janela, ajuste a potência do laser e a sensibilidade do detector para obter imagem brilhante, mas não saturada da superfície do deslizamento de tampas. A fixação da potência laser para 3 - 5% da potência máxima e sensibilidade do detector (controle deslizante "HV") a 15 V é um bom ponto de partida.
- Na janela A1plus Scan Area, defina Zoom para 1 para capturar todo o FOV.
- Salve a configuração óptica.
- Configuração da configuração óptica "Print_Fudiciary_Marker"
- Duplique a configuração óptica "Imagem" e renomeie-a como "Print_Fudiciary_Marker".
- Na janela GUI compacta A1plus, selecione o menor tamanho de varredura e tempo de moradia (64 pixels e 80,2 ms em nosso sistema, respectivamente).
- Como não é necessária uma imagem nesta etapa, ajuste a sensibilidade do detector para 0 e aumente a potência do laser para 30%. Maior potência laser removerá termicamente a camada PVA na tampa nas regiões desejadas.
- Na janela A1plus Scan Area, defina Zoom para o máximo (15,87 para o nosso sistema) e coloque a área de varredura no meio do FOV.
- Na janela ND Acquisition, configure um experimento de pilha Z. Defina o movimento na posição Z para Relativo e selecione o dispositivo Z apropriado. Defina o tamanho da etapa para 2 μm e a profundidade da pilha para 10 μm acima e abaixo para explicar qualquer irregularidade no estágio do microscópio ou na superfície PVA entre os FOVs adjacentes.
- Configuração da configuração óptica "Foco automático"
- Duplique a configuração óptica "Imagem" e renomeie-a como "Foco automático".
- Na janela A1plus Scan Area, diminua o fator Zoom para que o FOV seja ligeiramente maior que o marcador fiduciário. Isso garante que outras pequenas características no deslizamento de cobertura não interfiram com o foco automático.
- No menu Dispositivos, selecione Configuração de foco automático. Defina a espessura do scan à da pilha Z no experimento Z-stack (ver passo 3.5.5). O microscópio irá escanear através deste intervalo e encontrar o melhor plano focal usando o marcador fiduciário. Deixe o tamanho da etapa como padrão.
- Configuração da configuração óptica "Load_ROI"
- Duplique a configuração óptica "Imagem" e renomeie-a como "Load_ROI".
- Na janela GUI compacta A1plus, ajuste o tamanho da varredura idêntico ao da máscara roi. Esta configuração óptica será usada para capturar uma imagem na qual a máscara roi será carregada. Usamos 2048 pixels para alcançar um equilíbrio ideal entre resolução e velocidade.
NOTA: É essencial que esta imagem capturada seja idêntica em tamanho à máscara roi.
- Configuração da configuração óptica "Micropattern"
- Duplique a configuração óptica "Print_Fiduciary_Marker" e renomeie-a como "Micropattern".
- Defina o fator Zoom como um.
- Na janela GUI A1plus MP, aumente a potência laser de estimulação para ablatar PVA e selecione uma velocidade de varredura apropriada (40% e 32 s/frame em nossos experimentos, respectivamente).
- Na janela de estimulação nd, configure um experimento de estimulação ND. Adicione algumas fases ao Cronograma de Tempo e defina cada uma como Estimulação. Certifique-se de que a área de estimulação e a duração estão corretas.
NOTA: O número de fases pode ser ajustado de acordo com a espessura e suavidade da camada PVA, bem como a potência laser usada nesta configuração óptica. - Na mesma janela, habilite a função StgMoveMainZ(-1.000,1) antes de cada fase. Isso explica novamente quaisquer desvios na direção Z.
NOTA: A distância e a direção em que os movimentos objetivos podem ser ajustados de acordo com a espessura e suavidade da camada PVA.
- Configuração da configuração óptica "Label_Surface"
- Duplique a configuração óptica "Print_Fudiciary_Marker" e renomeie-a como "Label_Surface".
- Na janela GUI compacta A1plus, aumente significativamente a potência do laser e defina o Zoom para um. A alta potência laser usada aqui danificará fisicamente a tampa do vidro e produzirá uma etiqueta visível a olho nu. Isso ajuda na localização dos padrões em outros experimentos.
4. Gerando a máscara do ROI e configurando a macro
- Gerando a máscara do ROI
- Use o Adobe Photoshop ou outro software disponível para gerar uma imagem de RGB de 2048 × 2048. A imagem corresponde a um FOV sob o microscópio (ou seja, 532,48 × 532,48 μm, 0,26 μm por pixel). A imagem deve ter um fundo preto (0, 0,0).
NOTA: Vários editores de imagens comerciais e gratuitos podem ser usados para gerar máscaras ROI para micropatters assistidos a laser. Embora usemos o Adobe Photoshop para gerar as máscaras, GIMP e ImageJ/Fiji também estão disponíveis como opções gratuitas alternativas. - Empate 8 - 12 branco (255.255.255) padrões no fundo preto. O tamanho do padrão varia dependendo do tipo de célula (~200 pixels de diâmetro). Deixe uma área de 500 × 500 em branco no centro da imagem para foco automático. Deixe espaço suficiente entre padrões adjacentes (>200 pixels) e no pensionista do FOV para a ablação ideal e fixação celular. Os padrões apresentados neste protocolo estão disponíveis no Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning).
- Use o Adobe Photoshop ou outro software disponível para gerar uma imagem de RGB de 2048 × 2048. A imagem corresponde a um FOV sob o microscópio (ou seja, 532,48 × 532,48 μm, 0,26 μm por pixel). A imagem deve ter um fundo preto (0, 0,0).
- Configuração da macro
- Clique no menu Macro e selecione Nova Macro.
- Importe o código "Pattern_Stimulation" disponível no Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) para a janela New Macro. Salve este pedaço de código em uma pasta apropriada.
- Abra outra janela New Macro e importe o código "Stage_Movement" disponível no Github (http://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning). Certifique-se de que o diretório de trabalho "Stage_Movement" neste código é idêntico ao da etapa 4.2.2. Salve o código "Stage_Movement" para a mesma pasta na etapa 4.2.2.
5. Gerando micropatterns usando ablação fotográfica
- Ligue o microscópio e seus acessórios. Certifique-se de que o laser IR aqueceu o suficiente antes disso.
- Transfira o deslizamento revestido de PVA para um suporte. Para um microscópio vertical, certifique-se de que a superfície PVA fique ablada de frentes para baixo.
- Adicione água aos cantos para estabilizar o deslizamento de tampas e montar o suporte no estágio do microscópio.
- Abaixe o objetivo e adicione água na tampa.
NOTA: O protocolo descrito aqui é otimizado para um objetivo de imersão de água 25x/1.1 NA. Se for utilizado um objetivo de imersão a seco ou de óleo, a água deve ser substituída por um meio de imersão adequado. Quando um objetivo de imersão em água é usado para gerar uma grande matriz de micropattern, a evaporação pode se tornar um problema. Se esse for o caso, a água deve ser substituída pelo GenTeal, um lubrificante de olho disponível nas farmácias. - No software do microscópio, ligue o obturador a laser IR na janela GUI A1plus MP. Clique no botão Autoalinhamento para alinhar o laser antes da padronização.
NOTA: É crucial realizar o autoalinhamento a laser no início de cada sessão de padronização, pois pequenos desvios no caminho do laser afetarão significativamente a qualidade dos padrões. - Mude para a configuração óptica "Imagem". Na janela GUI compacta A1plus, clique em Digitalizar para digitalizar o FOV enquanto move lentamente o objetivo mais perto do deslizamento de tampas.
- Monitore cuidadosamente a imagem. No início, a imagem aparecerá extremamente fraca. Mova o objetivo para mais perto do deslizamento de cobertura até que o brilho da imagem aumente. Esta é a superfície de deslizamento que está voltada para o objetivo. Continue a mover o objetivo até que o brilho diminua e aumente novamente. Esta é a superfície PVA a ser padronizada. Concentre-se em qualquer pequeno recurso (lacunas, poeira, etc.) nesta superfície e coloque zero na unidade Z. Sempre defina zero após o foco.
NOTA: Embora ambas as superfícies do deslizamento sejam revestidas com PVA, as propriedades ópticas do vidro não são significativamente alteradas pelo revestimento PVA. Rotineiramente, nós rotineiramente imagem tais manchas com objetivos secos, água e imersão de óleo e não encontramos a superfície PVA não padronizada para interferir com a imagem. - Mude para a configuração óptica "Label_Surface". Clique em Capturar. Retorne à configuração óptica de "imagem" e digitalize. A superfície de vidro deve ser danificada e parecer amorfa. A área danificada é visível a olho nu, indicando a localização de padrões em outros experimentos.
NOTA: Para aumentar o tamanho da etiqueta visível, repita o passo 5.8 em vários FOVs adjacentes. - Verifique novamente se o objetivo está aproximadamente no centro do deslizamento de cobertura. Certifique-se de que há água suficiente entre o objetivo e o deslizamento de tampa. Mova o estágio por 1 a 2 FOVs para evitar partículas de vidro e escaneie para confirmar.
- No menu Dispositivos, abra a macro Stage_Movement. Verifique se o diretório de trabalho Pattern_Stimulation está correto; se não, a estimulação não ocorrerá. Defina as variáveis "PatternLength" e "PatternHeight" ao número desejado de FOVs que serão padronizadas. Salve e execute a macro.
- Após a padronização ser concluída, mude para a configuração óptica "Imagem". Novamente, verifique se o obturador a laser IR está aberto na janela GUI A1plus MP.
- Mova o palco para ver os padrões. Escaneie os padrões para verificar sua qualidade.
- Transfira o deslizamento de tampas para a caixa de grade, com padrões voltados para cima.
- Armazene tampas padronizadas a +4 °C por até uma semana antes do uso.
6. Adsorção de fibronectina
- Faça uma solução fresca de 1 M NaBH4 em 1 M NaOH. Adicione a uma proporção de 1:100 para pH 8,0 tampão fosfato contendo 0,2 M etanolamina.
- Transfira tampas padronizadas para um prato de cultura de tecido de 35 mm. Incubar cada tampa com 1 mL da solução acima por 8 min para saciar a autofluorescência e, em seguida, enxágüe 3 vezes com PBS.
- Fibronectina diluída (FN) em PBS para uma concentração final de 10 μg/mL. Incubar o deslizamento de cobertura em FN por 1 h a +37 °C.
NOTA: Se for observada a vinculação substancial e inespecífica da proteína ECM ao substrato, a FN poderá ser diluída em PBS contendo 0,1% plurônico F-12724. - Lave o deslizamento 2 vezes com PBS. Se não for usado imediatamente, armazene em PBS a +4 °C durante a noite.
7. Anexo celular
NOTA: O protocolo a seguir é otimizado para fibroblastos gengival humanos primários.
- Cultura um prato de 10 cm de células a 70% de confluência.
- Aqueça a mídia de cultura celular, PBS e 0,05% de trippsina em um banho de água de +37 °C.
NOTA: Para células que aderem fracamente ao substrato, a dissociação não proteolítica com verseno (0,48 mM EDTA) ou um buffer proprietário sem enzimas pode aumentar o apego celular aos padrões e deve ser considerada. - Antes de semear células, realoque o deslizamento de cobertura padronizado para um prato de cultura de tecido limpo de 35 mm contendo PBS quente de 1 mL.
- Aspire a mídia de cultura celular a partir do prato de cultura de tecido de 10 cm e lave uma vez com PBS.
- Adicione 700 μL de 0,05% de trippsina/EDTA ao prato e incuba as células em uma incubadora de +37 °C, 5% de CO2 por 1 min.
- Enquanto isso, aspire o PBS cobrindo o deslizamento de cobertura padronizado e adicione 1 mL de mídia de cultura celular.
- Confirme se as células se separaram. Em seguida, resuspenque as células experimentpsinizadas com 10 mL de mídia de cultura celular e adicione 1 mL ao deslizamento de cobertura padronizado.
- Células de cultura na incubadora por 2 - 3 h e verificar se um número suficiente de células se anexaram aos padrões. Se assim for, mude a mídia uma vez para remover células nãoectadas. Isso minimiza a chance de várias células aterrissar no mesmo padrão.
NOTA: O tempo de fixação pode variar dependendo do tipo de célula. - Depois de mais 3-4 h, ou quando um número suficiente de células se espalharam em padrões, as células estão prontas para novos experimentos. Não espere muito tempo para evitar a divisão celular.
8. Aquisição de dados
- Fixar células com 4% de PFA no tampão de citoesqueleto27 por 10 minutos à temperatura ambiente.
- Siga os protocolos de imunofluorescência estabelecidos para as proteínas de interesse. As tampas revestidas de PVA funcionam bem com qualquer protocolo de imunofluorescência.
- Adquira imagens de células usando um microscópio apropriado. Dependendo do objetivo do experimento, imagem uma ou várias células por FOV.
9. Análise de imagem
NOTA: O protocolo a seguir permite que os usuários obtenham o sinal médio de fluorescência da proteína de interesse sobre um grande número de células de z-stacks de imagens de microscópio.
- Abra as imagens adquiridas em NIS Elements e corte as imagens. Certifique-se de que cada imagem contém apenas uma célula bem espalhada. Instruções detalhadas sobre processamento de imagens podem ser encontradas no script abaixo.
- Instale a Anaconda e inicie o Spyder através do Anaconda Navigator.
NOTA: Os scripts .py podem ser executados em qualquer ambiente com os pacotes apropriados identificados nos requisitos.txt. Recomendamos a Anaconda porque contém a maioria dos pacotes necessários para os códigos abaixo. - Baixe o script do Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) e abra em Spyder ("Pattern_Averaging_3Channels.py" ou "Pattern_Averaging_4Channels.py" para imagens com 3 Canais ou 4 Canais, respectivamente).
- Definir parâmetros com base nas imagens adquiridas. Consulte o roteiro para obter descrições detalhadas.
- Pressione f5 para executar o script. O progresso pode ser acompanhado no painel Console.
- Recuperar os arquivos de saída salvos na mesma pasta. As imagens de saída são a média de cada canal para todas as amostras. A folha de excel mostra a intensidade média de cada canal dentro de uma célula amostral, o que permite uma análise quantitativa mais aprofundada.
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Representative Results
A qualidade dos dados experimentais obtidos através da micropattersão depende em grande parte da qualidade dos padrões. Para determinar a qualidade dos padrões gerados com o método acima, primeiro usamos microscopia de reflectância para avaliar a forma e o tamanho das áreas abladas da foto do deslizamento de tampas. Descobrimos que cada padrão individual era muito semelhante à máscara de ablação e exibia pensionistas claros e uma superfície que refletia a luz uniformemente(Figura 2B). Uma variedade de formas e tamanhos pode ser impressa dependendo da arquitetura de citoesqueleto desejada, mas usamos a forma da besta que melhor se adequa aos nossos propósitos. A microscopia de força atômica (AFM) revelou que tais padrões tinham aproximadamente 140 nm de altura e tinham uma superfície lisa com variação topológica mínima ao longo(Figura 2F). Configurações de padronização subótima, como baixa potência a laser e plano focal incorreto, resultaram na remoção incompleta da superfície PVA que se manifesta como padrões parciais mais escuros com topologia desigual(Figura 2C). A configuração da potência do laser muito alta resultou em PVA "borbulhando" e, quando extremo, cobre danos à superfície de deslizamento que também é indesejável(Figura 2D).
Em experimentos preliminares, tentamos aumentar a área de padronização, abating múltiplos FOVs em um único coverlip. Descobrimos que essa abordagem, embora funcione em princípio, não é confiável e tediosa devido à deriva Z do suporte do microscópio e à ligeira inclinação do deslizamento de tampas. Para alcançar padrões de alta qualidade sobre um grande número de FOVs de forma automatizada, implementamos uma macro personalizada que melhorou a precisão do foco do microscópio durante o processo de padronização. O microscópio multifotono emprega um laser de pulso que degrada eficientemente o PVA com alta potência em um plano focal estreito, tornando o processo de padronização sensível a qualquer irregularidade ou inclinação na amostra. Como resultado, é importante identificar o plano focal preciso em cada FOV. Isso é ainda mais problemático para sistemas sem um módulo de foco perfeito, pois desvios de apenas um a dois mícrons podem tornar o processo de padronização infrutífero. Para resolver esse problema, o script macro personalizado primeiro padrões um pequeno quadrado no centro de cada novo FOV que só precisa estar aproximadamente em foco, escaneando através de uma pilha Z relativamente grossa (≈20 μm). O microscópio então escaneia rapidamente através da pilha de imagens e usa a função de foco automático NIS Elements para identificar o plano focal ideal. A máscara padrão é então carregada e definida como ROI de estimulação para que a estimulação de IR ocorra. A etapa segue posteriormente para o próximo FOV e repete esse processo. Além disso, o caminho em forma de onda quadrada do movimento do estágio do microscópio garantiu o acúmulo mínimo de erros entre FOVs sequenciais. Usando este protocolo, fabricamos rotineiramente padrões compostos de 49 FOVs de microscópio cobrindo área de 3,5 x 3,5 mm do deslizamento de tampas em menos de 3 h.
Para testar se as áreas padronizadas, não pva não perturbadas, poderiam adsorb proteínas ECM, revestidos de tampas padronizadas com 10 μg/mL FN e manchados com anticorpo anti-FN. Utilizando microscopia fluorescente de campo largo, descobrimos que a FN se adsorve uniformemente às áreas padronizadas onde o PVA havia sido removido por ablação a laser(Figura 2E).
Para determinar se a arquitetura do citoesqueleto e a distribuição de tensão poderiam ser modificadas como esperado nos padrões, semeamos células em deslizamentos de cobertura padronizados e visualizamos a distribuição da cadeia de luz da miosina, um marcador de contração, através da microscopia de fluorescência. Após a semeadura inicial, as células gradualmente gravitavam em direção ao deslizamento de cobertura. Aqueles que pousaram em áreas padronizadas anexadas e se espalharam na forma do padrão ao longo do tempo. Aqueles que pousaram no PVA só foram vagamente ligados e foram removidos após várias lavagens e alterações de mídia. Descobrimos que as células espalhadas em padrões apresentavam estruturas fibroblastos fenotípicas, incluindo uma borda densa de actin-densa de lamellipodia, fibras de estresse ventral espessas ao longo dos dois lados, e fibras de estresse dorsal emanando da lamellipodia conectada por arcos transversais(Figura 3A). A corrente de luz de miosina (MLC) sentou-se atrás da densa borda lamellipodia e exibiu um padrão estriado ao longo de feixes de actina. Como indicado por imagens médias de muitas células, este fenótipo foi consistente em um grande número de padrões(Figura 3B).
Figura 1. Esquema de laser IR assistido micropatterning (microfotopatterning). (A) As tampas de vidro são quimicamente conjugadas com APTMS, GA e PVA, na respectiva ordem. A superfície PVA não é adesiva às células e proteínas. (B) O PVA é removido em padrões predefinidos por um laser IR. (C) As tampas padronizadas são revestidas com uma proteína ECM que só adsorb para áreas padronizadas. (D) As células são banhadas em tampas, fixas e imunos detidas para proteínas de interesse. Células que pousam em ilhas padronizadas se espalham na forma do padrão que dá origem a estruturas citoesqueléticas características, enquanto aquelas que pousam em PVA permanecem esféricas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Validação e caracterização de micropattern. (A) Instalação de micropatterning assistido por laser IR (microfotopatterning) em um estágio de microscópio. O laser IR abla termicamente PVA em vários FOVs. (B) Uma imagem de microscopia de reflectância de micropatterns que têm pensionistas claros e são idênticos às máscaras roi. (C) Uma imagem de microscopia de reflectância da remoção incompleta do PVA resultante da potência do laser subótimo. (D) Uma imagem de microscopia de reflectância de PVA borbulhando resultante do excesso de potência laser. (E) Imagens de imunofluorescência de tampas padronizadas com FN manchadas com anticorpos primários anti-FN e anticorpos secundários conjugados fluoróvocos. (F) Uma linha de tomografia computadorizada AFM e uma imagem AFM representativa de um padrão de besta. Para medir a topologia do micropattern, a imagem do modo de contato foi realizada usando uma sonda Bruker AFM (MLCT-B) montada em um microscópio de força atômica NanoWizard 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Imagens representativas de células banhadas em micropatters. (A) Imagens representativas de um fibroblasto gengival humano primário banhado em padrões de besta imunostidos para actin e MLC. As imagens foram adquiridas com um microscópio confocal equipado com um objetivo de 100x. (B) Imagens médias de imunofluorescência de actin e MLC em células banhadas em padrões de besta geradas por um script Python personalizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os resultados acima demonstram que o protocolo de micropatterse assistida por laser IR (microfotopatterning) fornece padrões aderentes reprodutíveis de várias formas que permitem a manipulação da forma celular e da arquitetura citoesquelletal. Embora inúmeros métodos de micropatterning tenham sido desenvolvidos antes e depois da estreia da microfotopatterning, este método possui várias vantagens. Em primeiro lugar, não requer equipamentos especializados e salas de limpeza que geralmente são encontradas apenas dentro dos departamentos de Engenharia. De fato, à medida que os microscópios multifotol estão se tornando uma visão mais comum nos departamentos de Biologia, a microfotopação expande as aplicações do microscópio multifotônio e adiciona ao potencial pool de usuários. Os padrões também podem ser alterados sob demanda e impressos imediatamente, em vez de ter que fabricar um novo wafer mestre que implica um longo processo de litografia.
Em comparação com o protocolo de microfotagem pré-existente, uma melhoria em nosso protocolo é a eliminação de várias etapas de cura demoradas durante a preparação do coverlip. Mostramos que a qualidade do acessório de clipe de cobertura de PVA permanece imperturbável, pois os padrões ainda estavam intactos e poderiam ligar as células mesmo duas semanas após a fabricação. Mais importante, melhoramos a automação do processo de padronização, eliminando a necessidade de predefinir a posição de cada FOV24. Em vez disso, implementamos uma macro compreensível que permite a padronização de uma grande área, ao mesmo tempo em que identificamos precisamente o plano focal ideal de cada FOV.
Embora as macros do protocolo permitam a automação da padronização em nosso sistema, entendemos que cada microscópio comercial de varredura a laser vem com seu próprio software proprietário que raramente é compatível com outros, dificultando a implementação de nosso protocolo exato em outros sistemas. No entanto, o fluxo de trabalho global pode ser bem adaptado a outros sistemas comerciais para facilitar o micropattering automatizado, ou seja, o processo de foco em cada FOV individual, carregar a máscara, ablating PVA e mover o estágio do microscópio para um novo FOV.
Várias etapas do protocolo de padronização devem ser realizadas com muito cuidado para garantir uma padronização eficiente. O passo mais crítico é otimizar as condições de estimulação antes de gerar padrões. Na microscopia multifótons, dois ou mais fótons devem chegar quase simultaneamente a uma molécula fluorescente e combinar sua energia para excitar a fluorescência. Este evento de baixa probabilidade cria uma seção óptica extremamente fina que aumenta a relação sinal-ruído28. Embora benéfico para a imagem, este recurso torna a remoção do revestimento PVA fino extremamente sensível à posição Z da amostra. Várias medidas podem ser implementadas para combater isso. Em primeiro lugar, a potência do laser deve ser ajustada para garantir a remoção completa do PVA sem "ferver" o polímero ou danificar a tampa do vidro. Se a remoção do PVA estiver consistentemente incompleta, recomendamos verificar o alinhamento do laser, pois isso geralmente aumenta a potência do laser. Em segundo lugar, o estágio do microscópio deve ser nivelado para evitar inclinação amostral, o que pode resultar em padrões incompletos. As estimulações de RI em várias posições Z também devem ser configuradas para garantir que a camada PVA seja alvo. Alternativamente, se o microscópio estiver equipado com um módulo de foco perfeito, testes preliminares podem ser realizados para determinar o deslocamento ideal na posição Z para a segmentação de PVA. Outro passo crítico é configurar uma macro de microscópio que permite a estimulação de padrões de forma automatizada. A macro deve encontrar o plano focal de cada novo FOV para evitar complicações da inclinação da amostra ou irregularidades na superfície. Também deve permitir que o palco se mova em forma de S de linha em fileira, análogo ao caminho tomado na varredura bidirecional, para minimizar desvios em Z entre FOVs consecutivos.
Uma limitação ao protocolo descrito é o tempo necessário para produzir um grande número de deslizamentos de cobertura padronizados, uma vantagem incomparável oferecida pela impressão de microcontato à base de litografia29,30. Como resultado, este protocolo é mais adequado para experimentos nos quais um número limitado de condições são necessárias, ou aqueles que requerem ajustes prontamente disponíveis na forma e tamanho do padrão. Além disso, para sistemas sem um módulo de foco automático de hardware, integramos uma série de eventos de estimulação em diferentes planos Z para garantir a remoção automatizada e eficaz do PVA. Uma vez que a estimulação do RI é a etapa mais demorada, a adição de cada evento de estimulação (~30 seg) alonga significativamente o processo de padronização. Se o tempo é preocupante, sugerimos ajuste fino autofoco diminuindo o tamanho do passo. Isso facilita a identificação do melhor plano focal que diminuirá o número de eventos de estimulação de IR necessários. Em nossos experimentos, a diminuição do número de eventos de estimulação de cinco para dois reduz o tempo pela metade (1,5 h).
Em conclusão, o protocolo de micropatters de micropatterning assistido por laser ir (microfotopatterning) que descrevemos pode ser usado em qualquer laboratório que tenha acesso a um microscópio equipado com laser ir. Além de estudar a arquitetura citoesqueléltica e as vias de sinalização que conectam a forma à função, essa técnica também pode ser aplicada à triagem de medicamentos e outras aplicações sensíveis à variabilidade celular-célula.
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Disclosures
Os autores não revelam conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Connaught Fund New Investigator Award to S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (bolsas RGPIN-2015-05114 e RGPIN-2020-05881), University of Manchester and University of Toronto Joint Research Fund e University of Toronto XSeed Program. C.T. foi apoiado pela bolsa NSERC USRA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane | Aldrich | 281778 | |
| 10 cm Cell Culture Dish | VWR | 10062-880 | Polysterene, TC treated, vented |
| 25X Apo LWD Water Dipping Objective | Nikon | MRD77225 | |
| 3.5 cm Cell Culture Dish | VWR | 10861-586 | Polysterene, TC treated, vented |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | Thermo | 62248 | 1mg/mL dihydrochloride solution |
| Bovine Serine Albumin | BioShop | ALB005 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Wisent | 311-425-CL | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | FC010 | 1mg/mL in pH 7.5 buffer |
| Fibronectin Antibody | BD | 610077 | Mouse |
| Fiji | ImageJ | Version 1.53c | |
| Fluorescent Phalloidin | Invitrogen | A12380 | 568nm |
| Glass Coverslip | VWR | 16004-302 | 22 × 22 mm |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16220 | 25% aqueous solution |
| Hydrochloric Acid | Caledon | 6025-1-29 | 37% aqueous solution |
| IR Laser | Coherent | Chameleon Vision | |
| Minimal Essential Medium α | Gibco | 12561-056 | |
| Mounting Medium | Sigma | F4680 | |
| Mouse Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Goat, 488nm |
| Multi-Photon Microscope | Nikon | A1R MP+ | |
| Myosin Light Chain Antibody | Cell Signaling Technology | 3672S | Rabbit |
| NIS Elements | Nikon | Version 5.21.03 | |
| Nitric Acid | Caledon | 7525-1-29 | 70% aqueous solution |
| Photoshop | Adobe | Version 21.2.1 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Powder |
| Poly(vinyl alchohol) | Aldrich | 341584 | MW 89000-98000, 98% hydrolyzed |
| Rabbit Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4412S | Goat, 488nm |
| Shaker | VWR | 10127-876 | Alsoknown as analog rocker |
| Sodium Borohydride | Aldrich | 452882 | Powder |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | Powder |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S5011 | Powder |
| Spyder | Anaconda | 4.1.4 | |
| Trypsin | Wisent | 325-042-CL | 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA |
References
- Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).
- Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).
- Castor, L. N. Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells. Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).
- Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).
- Paluch, E., Heisenberg, C. -P. Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development. Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ridley, A. J., et al. Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Cramer, L. P. Mechanism of cell rear retraction in migrating cells. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).
- Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels. Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).
- Leptin, M. Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts. Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing. Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).
- Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions. Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).
- Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers. Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).
- Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli. Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).
- Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Mechanical Forces of Fission Yeast Growth. Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).
- Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., Jönsson, H. Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).
- Haske, W., et al. 65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf. Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).
- Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization. Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217 (2020).
- Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix. Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
- Doyle, A. D. Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning. Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).
- Waterman-Storer, C. M. Microtubule/Organelle Motility Assays. Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).
- Inoué, S., Spring, K. R. Video Microscopy: The Fundamentals. , Springer. US. (1997).
- Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion. Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (µP-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening. Scientific Reports. 7 (1), 8491 (2017).
- Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment. Organogenesis. 9 (3), 0-14 (2013).
