Summary
Il protocollo qui presentato consente la fabbricazione automatizzata di micropattern che standardizzano la forma cellulare per studiare le strutture citoscheletriche all'interno delle cellule di mammifero. Questa tecnica di facile utilizzo può essere impostata con sistemi di imaging disponibili in commercio e non richiede apparecchiature specializzate inaccessibili ai laboratori standard di biologia cellulare.
Abstract
Il micropatterning è una tecnica consolidata nella comunità della biologia cellulare utilizzata per studiare le connessioni tra la morfologia e la funzione dei compartimenti cellulari, aggirando al contempo le complicazioni derivanti dalle variazioni naturali da cellula a cellula. Per standardizzare la forma delle celle, le celle sono confinate in stampi 3D o controllate per la geometria adesiva attraverso isole adesive. Tuttavia, le tradizionali tecniche di micropatterning basate sulla fotolitografia e sull'incisione UV profonda dipendono fortemente da camere pulite o attrezzature specializzate. Qui presentiamo una tecnica di micropatterning assistita da laser a infrarossi (microfotomodellazione) modificata da Doyle et al. In questo protocollo, utilizziamo un sistema di imaging Nikon A1R MP+ per generare micropattern con precisione micron attraverso un laser a infrarossi (IR) che abla regioni preimpostate su coverlip rivestite in poli vinile alcool. Utilizziamo uno script personalizzato per consentire la fabbricazione automatizzata di pattern con alta efficienza e precisione in sistemi non dotati di autofocus hardware. Mostriamo che questo protocollo di micropatterning assistito da laser IR (microfotomodellazione) si traduce in modelli definiti a cui le cellule si attaccano esclusivamente e prendono la forma desiderata. Inoltre, i dati provenienti da un gran numero di celle possono essere mediati a causa della standardizzazione della forma cellulare. I modelli generati con questo protocollo, combinati con l'imaging ad alta risoluzione e l'analisi quantitativa, possono essere utilizzati per schermi di velocità effettiva relativamente elevati per identificare i lettori molecolari che mediano il legame tra forma e funzione.
Introduction
La forma cellulare è un fattore determinante dei processi biologici fondamentali come la morfogenesi tissutale1,la migrazionecellulare 2,la proliferazionecellulare 3e l'espressione genica4. I cambiamenti nella forma cellulare sono guidati da un intricato equilibrio tra riarrangiamenti dinamici del citoscheletro che deforma la membrana plasmatica e fattori estrinseci come le forze esterne esercitate sulla cellula e la geometria delle aderenze cellulare-cella e matrice cellulare5. La migrazione delle cellule mesenchimali, ad esempio, polimerizza una fitta rete di actina sul bordo anteriore che spinge la membrana plasmatica in avanti e crea un'ampia lamellipodia 6 ,mentrela contrattilità dell'actomiosina ritrae lo stretto bordo finale della cellula per staccare la cellula dalla sua posizioneattuale 7,8. Interrompere gli eventi di segnalazione che danno origine a strutture citoscheletriche così specializzate perturbano forma e polarità e rallenta la migrazione cellulare9. Inoltre, la flessione epiteliale del foglio durante la gastrulazione richiede una costrizione apicale a base di actomiosina che fa sì che le cellule e i loro vicini diventino a forma dicuneo 10. Sebbene questi studi evidenzino l'importanza della forma cellulare, l'eterogeneità intrinseca nella forma cellulare ha gravato sugli sforzi per identificare meccanismi che collegano la morfologia al funzionamento.
A tal fine, negli ultimi trent'anni sono stati sviluppati numerosi approcci per manipolare la forma cellulare. Questi approcci raggiungono il loro obiettivo vincolando la cellula con uno stampo tridimensionale o controllando la geometria dell'adesione cellulare attraverso la deposizione modellata di proteine a matrice extracellulare (ECM) su una superficie antivegetativa, una tecnica chiamata micropatterning11. Qui 60 riesamineremo una serie di tecniche che hanno guadagnato popolarità nel corso degli anni.
Originariamente pioniere come approccio per applicazioni microelettroniche, la stampa di microcontatti a base di litografia morbida è diventata inequivocabilmente unadelle 12 preferite diculto. Un wafer principale viene prima fabbricato esponendo selettivamente le aree di un substrato di silicio rivestito di fotoresiste alla fotoirradiazione, lasciando dietro di sé una superficie modellata13. Un elastomero, come il PDMS, viene quindi versato sul wafer principale per generare un "timbro" morbido che trasferisce le proteine ECM a un substratodesiderato 11,14. Una volta fabbricato, un wafer master può essere utilizzato per lanciare molti francobolli PDMS che danno origine a micropattern altamente riproducibili12. Tuttavia, i modelli non possono essere facilmente regolati a causa del lungo processo di fotolitografia. Questo processo richiede anche attrezzature altamente specializzate e camere pulite che in genere non sono disponibili nei dipartimenti di biologia.
Più recentemente, è stato riferito che la stampa diretta con raggi UV profondi elude le limitazioni poste dai tradizionali approcci basati sulla litografia. La luce UV profonda viene diretta attraverso una maschera fotografica verso aree selettive di un copripicchieri rivestito con poli-L-lisina-innestato-polietilene glicole. I gruppi chimici esposti ai raggi UV profondi vengono fotoconvertiti senza l'uso di linker fotosensibili per consentire il legame delle proteine ECM15. La mancanza di linker fotosensibili consente ai coprispavimenti modellati di rimanere stabili a temperatura ambiente per oltre settemesi 15. Questo metodo evita l'uso di camere pulite e attrezzature fotolitografiche e richiede una formazione meno specializzata. Tuttavia, il requisito delle maschere fotografiche pone ancora un ostacolo sostanziale per gli esperimenti che richiedono cambiamenti prontamente disponibili nei modelli.
Oltre ai metodi che manipolano la geometria cellulare attraverso la deposizione controllata di proteine ECM su una superficie 2D, altri cercano di controllare la forma cellulare confinando le cellule in microstrutture 3D. Molti studi hanno adattato l'approccio morbido basato sulla litografia sopra descritto per generare camere 3D, piuttosto che 2D, PDMS per indagare i processi biologici dipendenti dalla forma in embrioni, batteri, lieviti e piante16,17,18,19. La polimerizzazione a due fotoni (2PP) ha anche preso il comando come tecnica di microfabbricazione in grado di creare complesse impalcature idrogel 3D con risoluzione nanometrica20. 2PP si basa sui principi dell'adsorbimento a due fotoni, in cui due fotoni consegnati in impulsi di femtosecondo vengono assorbiti simultaneamente da una molecola - fotoiniziatore in questo caso - che consente la polimerizzazione locale dei fotopolimeri21. Questa tecnica è stata fortemente utilizzata per stampare impalcature 3D che imitano le strutture native ECM del tessuto umano ed è stato dimostrato che inducono bassi danni fotochimicialle cellule 22.
Il debutto della microfotofoto 10 anni fa ha dato ai ricercatori l'opportunità di fabbricare micropattern evitando attrezzature inaccessibili e specializzate. La microfotofoto crea modelli sulla scala micron rimuovendo termicamente le regioni selettive di alcol poli vinilico (PVA) rivestite su superfici di vetro attivate utilizzando un laser ainfrarossi 23,24. Le proteine ECM che attaccano solo la superficie di vetro sottostante e non la PVA servono quindi come segnali biochimici per consentire dinamiche di diffusione controllate e forma cellulare. Questo metodo offre anche una flessibilità superiore poiché i modelli possono essere facilmente modificati in tempo reale. Qui, forniamo un protocollo passo-passo di microfotomodello utilizzando un sistema di imaging multi-fotone commerciale. Il protocollo descritto è progettato per la fabbricazione rapida e automatizzata di modelli di grandi dimensioni. Abbiamo dimostrato che questi modelli controllano in modo efficiente la forma delle celle vincolando la geometria delle aderenze cell-ECM. Infine, dimostriamo che la tecnica di patterning descritta modula l'organizzazione e la dinamica del citoscheletro actina.
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Protocol
1. Pre-elaborazione delle labbra
- Preparare coverlips puliti come descritto in Waterman-Storer, 199825.
- Preparare l'1% (3-amminopropil)soluzione di trimetossisilano (APTMS) e incubare i coprispavimenti nella soluzione per 10 minuti con agitazione delicata. Assicurarsi che le coverlips si muovano liberamente nella soluzione.
- Lavare le copertine due volte con dH2O per 5 minuti ciascuna.
- Preparare la soluzione di glutaraldeide (GA) allo 0,5% e incubare i coprispacchi nella soluzione per 30 minuti su uno shaker. Per 25 coverlips, utilizzare 50 mL di soluzione di glutaraldeide. Assicurarsi che le coverlips si muovano liberamente nella soluzione.
- Lavare le copertine tre volte con dH2O per 10 minuti ciascuna.
- Gira le copertine asciutte per 30 s utilizzando uno spinner coverslip personalizzato. Una descrizione dettagliata dello spinner coverslip è stata pubblicata26 ed è disponibile online (https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/). Le copertine attivate possono essere conservate fino a un mese a +4 °C in una scatola con divisori in modo che si distortino l'una dall'altra.
2. Rivestimento PVA
- Mescolare PVA (98% PVA idrolizzato, MW 98000) con dH2O per fare una soluzione al 5,6%.
- Solubilizzare la miscela in un bagno d'acqua a 90 °C e filtrare immediatamente attraverso un filtro da 0,2 μm in un armadio di biosicurezza mentre è caldo. Filtrare nuovamente la soluzione stock se precipita. La soluzione di PVA può essere conservata a temperatura ambiente per 3 mesi.
- In un tubo da 15 mL, aggiungere una parte HCl a otto parti di PVA. Invertire attentamente il tubo alcune volte per mescolare.
- Versare 2 mL della soluzione mista in una piastra di Petri da 35 mm e immergere una coverlip pulita e pre-lavorata nel liquido, facendo attenzione che le coverlips non si attacchino al fondo. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti su uno shaker.
- Rimuovere con cura i copriparsi dalla soluzione. Utilizzare lo spinner coverslip per girare il cappotto per 40 s. Nel frattempo, pulisci le pinzette. Trasferire il coverslip in una scatola e asciugare a +4 °C durante la notte. Le coverlip rivestite in PVA possono essere conservate a +4 °C per un massimo di due settimane.
3. Configurazione del microscopio multifotono
NOTA: Il protocollo descritto è ottimizzato per creare micropattern adesivi cellulari della forma e delle dimensioni desiderate su sistemi di imaging multi-fotoni eretti o invertiti, in particolare quelli che non sono dotati di un autofocus hardware. Pertanto, per ogni campo visivo (FOV), lo script di patterning riattiva una piccola area per creare un marcatore fiduciario sul coverslip, utilizza un autofocus software per focalizzare il microscopio sulla superficie del coverslip e abla il modello desiderato. L'esecuzione di questo script in un ciclo per i DOM adiacenti crea in modo robusto una vasta gamma di micropattern (5 x 5 mm o più) che limitano la forma cellulare e modulano l'attività dei processi biologici intracellulari. Il protocollo descritto è stato sviluppato per il sistema di imaging Nikon A1R MP+ controllato dal software NIS-Elements. Se per la creazione di modelli viene utilizzato un sistema di imaging di un altro fornitore, le configurazioni ottiche e lo script di patterning devono essere regolati in base alle istruzioni del produttore.
- Attivare il software per microscopio. Assicurarsi che l'obiettivo "Apo LWD 25X/1.10W DIC N2" sia montato al microscopio.
NOTA: Il protocollo qui descritto è ottimizzato per un obiettivo di immersione in acqua 25x/1.1 NA, ma altri obiettivi possono anche essere utilizzati per la creazione di modelli. I lettori devono essere consapevoli del fatto che il battito con un obiettivo ad alto ingrandimento(ad esempio,40x e 60x) richiede più tempo in quanto riduce significativamente il numero di modelli ablati in ogni FOV. Gli obiettivi a basso ingrandimento possono essere utilizzati per la creazione di modelli purché forniscano un'illuminazione uniforme attraverso il FOV e una potenza laser sufficiente per ablare lo strato di PVA. - Nella finestra della GUI A1plus MP impostare la linea laser su 750 nm.
- Configurazione della configurazione ottica "Immagine"
NOTA: NIS-Elements fornisce agli utenti diversi strumenti (interfaccia grafica, un generatore di flussi di lavoro di acquisizione JOBS, configurazioni ottiche e macro) per controllare l'hardware del microscopio. In questo protocollo, la maggior parte del controllo hardware è ottenuto attraverso varie configurazioni ottiche, nonché moduli di acquisizione ND e stimolazione ND.- Nella scheda Calibrazione fare clic su Nuova configurazione ottica. Assegnare alla configurazione ottica il nome "Image". Questa è la configurazione ottica di base che consente l'imaging del coverslip attraverso la riflettanza. Lasciare tutte le altre opzioni come predefinite e selezionare l'obiettivo appropriato.
- Nella finestra A1plus MP GUI fare clic sul pulsante Impostazioni per configurare le impostazioni hardware in questa configurazione ottica. Impostare il laser di stimolazione su IR stim, posizionare beam splitter (BS 20/80) nel percorso della luce, impostare l'unità scanner su Galvano e selezionare il rilevatore descanned appropriato.
- Nella finestra A1plus Compact GUI selezionare una dimensione di scansione e un tempo di soffermazione sufficiente per acquisire piccole funzionalità sul coverslip (rispettivamente 1,1 ms e 1024 pixel sul nostro sistema). Fare clic sul pulsante Normale in modo che non viene eseguita alcuna media di linea o integrazione della linea. Verificare che la casella Usa laser a infrarossi sia selezionata. Configurare la scansione unidirezionale per semplicità.
NOTA: Se la velocità di scansione è preoccupante, è possibile utilizzare la scansione bidirezionale. - Nella stessa finestra, regolare la potenza del laser e la sensibilità del rivelatore per ottenere un'immagine luminosa ma non satura della superficie del coverslip. Impostare la potenza laser sul 3-5% della potenza massima e della sensibilità del rivelatore ("cursore HV") su 15 V è un buon punto di partenza.
- Nella finestra Area di scansione A1plus impostare Zoom su 1 per acquisire l'intero FOV.
- Salvare la configurazione ottica.
- Configurazione della configurazione ottica "Print_Fudiciary_Marker"
- Duplicare la configurazione ottica "Immagine" e rinominarla "Print_Fudiciary_Marker".
- Nella finestra A1plus Compact GUI selezionare le dimensioni di scansione più piccole e il tempo di soffermarsi (rispettivamente 64 pixel e 80,2 ms sul nostro sistema).
- Poiché non è richiesta alcuna immagine in questo passaggio, impostare la sensibilità del rivelatore su 0 e aumentare la potenza del laser al 30%. Una maggiore potenza laser rimuoverà termicamente lo strato di PVA sul coverslip nelle regioni desiderate.
- Nella finestra Area di scansione A1plus, impostare Zoom al massimo (15,87 per il nostro sistema) e posizionare l'area di scansione al centro del FOV.
- Nella finestra Acquisizione ND impostare un esperimento Z-stack. Impostate il movimento nella posizione Z su Relativo (Relative) e selezionate il dispositivo Z appropriato. Impostare la dimensione del passo su 2 μm e la profondità della pila su 10 μm sopra e sotto per tenere conto di eventuali irregolarità nello stadio del microscopio o nella superficie del PVA tra i PV adiacenti.
- Configurazione della configurazione ottica "Autofocus"
- Duplicare la configurazione ottica "Immagine" e rinominarla "Autofocus".
- Nella finestra Area di scansione A1plus, diminuire il fattore zoom in modo che il FOV sia leggermente più grande del marcatore fiduciario. Ciò garantisce che altre piccole feature sul coverslip non interferiscano con l'autofocus.
- Nel menu Dispositivi selezionare Configurazione messa a fuoco automatica. Impostate lo spessore della scansione su quello dello Z-stack nell'esperimento Z-stack (vedere il passaggio 3.5.5). Il microscopio eseguirà la scansione di questa gamma e troverà il miglior piano focale utilizzando il marcatore fiduciario. Lasciare le dimensioni del passo come predefinite.
- Configurazione della configurazione ottica "Load_ROI"
- Duplicare la configurazione ottica "Immagine" e rinominarla "Load_ROI".
- Nella finestra A1plus Compact GUI impostare la dimensione di scansione identica a quella della maschera ROI. Questa configurazione ottica verrà utilizzata per acquisire un'immagine in cui verrà caricata la maschera ROI. Abbiamo usato i pixel 2048 per raggiungere un equilibrio ottimale tra risoluzione e velocità.
NOTA: è essenziale che questa immagine acquisita sia di dimensioni identiche a quelle della maschera ROI.
- Configurazione della configurazione ottica "Micropattern"
- Duplicare la configurazione ottica "Print_Fiduciary_Marker" e rinominarla "Micropattern".
- Impostare il fattore Zoom su uno.
- Nella finestra GUI A1plus MP, aumentare la potenza del laser di stimolazione per abiurare il PVA e selezionare una velocità di scansione appropriata (rispettivamente 40% e 32 s / frame nei nostri esperimenti).
- Nella finestra Stimolazione ND, impostare un esperimento di stimolazione ND. Aggiungere alcune fasi al programma di tempo e impostarli come stimolazione. Assicurarsi che l'area di stimolazione e la durata siano corrette.
NOTA: Il numero di fasi può essere regolato in base allo spessore e alla scorrevolezza dello strato di PVA, nonché alla potenza laser utilizzata in questa configurazione ottica. - Nella stessa finestra attivare la funzione StgMoveMainZ(-1.000,1) prima di ogni fase. Anche in questo caso si spiegano eventuali deviazioni nella direzione Z.
NOTA: La distanza e la direzione in cui l'obiettivo si muove possono essere regolate in base allo spessore e alla levigamento dello strato di PVA.
- Configurazione della configurazione ottica "Label_Surface"
- Duplicare la configurazione ottica "Print_Fudiciary_Marker" e rinominarla "Label_Surface".
- Nella finestra A1plus Compact GUI, aumenta significativamente la potenza del laser e imposta Zoom su uno. L'elevata potenza laser utilizzata qui danneggerà fisicamente il coperchio del vetro e produrrà un'etichetta visibile ad occhio nudo. Ciò aiuta a localizzare i modelli in ulteriori esperimenti.
4. Generazione della maschera ROI e configurazione della macro
- Generazione della maschera ROI
- Usa Adobe Photoshop o altri software disponibili per generare un'immagine RGB 2048 × 2048. L'immagine corrisponde a un FOV almicroscopio (cioè 532,48 × 532,48 μm, 0,26 μm per pixel). L'immagine deve avere uno sfondo nero (0, 0, 0).
NOTA: una serie di editor di immagini commerciali e gratuiti può essere utilizzata per generare maschere ROI per il micropatterning assistito da laser. Anche se usiamo Adobe Photoshop per generare le maschere, GIMP e ImageJ/Fiji sono disponibili anche come opzioni gratuite alternative. - Disegna 8 - 12 motivi bianchi (255.255.255) sullo sfondo nero. La dimensione del motivo varia a seconda del tipo di cella (~200 pixel di diametro). Lasciare un'area vuota di 500 × 500 al centro dell'immagine per l'autofocus. Lasciare spazio sufficiente tra i motivi adiacenti (>200 pixel) e al boarder dell'UV per un'ablazione e un attacco cellulare ottimali. I modelli presentati in questo protocollo sono disponibili su Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning).
- Usa Adobe Photoshop o altri software disponibili per generare un'immagine RGB 2048 × 2048. L'immagine corrisponde a un FOV almicroscopio (cioè 532,48 × 532,48 μm, 0,26 μm per pixel). L'immagine deve avere uno sfondo nero (0, 0, 0).
- Impostazione della macro
- Scegliere Nuova macro dal menu Macro.
- Importare il codice "Pattern_Stimulation" disponibile su Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) nella finestra Nuova macro. Salvare questa parte di codice in una cartella appropriata.
- Aprire un'altra finestra Nuova macro e importare il codice "Stage_Movement" disponibile su Github (http://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning). Assicurarsi che la directory di lavoro "Stage_Movement" in questo codice sia identica a quella del passaggio 4.2.2. Salvare il codice "Stage_Movement" nella stessa cartella nel passaggio 4.2.2.
5. Generazione di micropattern usando l'ablazione fotografica
- Accendi il microscopio e i suoi accessori. Assicurarsi che il laser IR si sia riscaldato a sufficienza prima di questo.
- Trasferire la coverslip rivestita in PVA su un supporto. Per un microscopio verticale, assicurarsi che la superficie del PVA sia abilata verso il basso.
- Aggiungere acqua agli angoli per stabilizzare il coverslip e montare il supporto sullo stadio del microscopio.
- Abbassare l'obiettivo e aggiungere acqua sul coverslip.
NOTA: Il protocollo qui descritto è ottimizzato per un obiettivo di immersione in acqua 25x / 1.1 NA. Se si utilizza un obiettivo di immersione a secco o ad olio, l'acqua deve essere sostituita con un mezzo di immersione appropriato. Quando si utilizza un obiettivo di immersione in acqua per generare un array di micropattern di grandi dimensioni, l'evaporazione potrebbe diventare un problema. In tal caso, l'acqua deve essere sostituita con GenTeal, un lubrificante per gli occhi da banco disponibile presso le farmacie. - Nel software al microscopio, accendere l'otturatore laser a infrarossi nella finestra della GUI A1plus MP. Fate clic sul pulsante Allineamento automatico (Autoalignment) per allineare il laser prima della creazione di serie.
NOTA: È fondamentale eseguire l'autolineamento laser all'inizio di ogni sessione di patterning poiché piccole deviazioni nel percorso laser influenzeranno significativamente la qualità dei modelli. - Passare alla configurazione ottica "Immagine". Nella finestra A1plus Compact GUI fare clic su Scansione per scansionare il FOV mentre si avvicina lentamente l'obiettivo al coverslip.
- Monitorare attentamente l'immagine. All'inizio, l'immagine apparirà estremamente fioca. Avvicina l'obiettivo al coverslip fino a quando la luminosità dell'immagine non aumenta. Questa è la superficie di coverlip che si affaccia sull'obiettivo. Continuare a spostare l'obiettivo fino a quando la luminosità diminuisce e aumenta di nuovo. Questa è la superficie PVA da modellare. Concentrati su qualsiasi piccola caratteristica (imperfezioni delle labbra, polvere, ecc.)su questa superficie e imposta zero sull'unità Z. Impostare sempre zero dopo la messa a fuoco.
NOTA: Sebbene entrambe le superfici del coverslip siano rivestite con PVA, le proprietà ottiche del vetro non sono significativamente alterate dal rivestimento PVA. Immaginiamo regolarmente tali coverlips con obiettivi asciutti, ad acqua e ad immersione dell'olio e non abbiamo trovato la superficie PVA non modellata per interferire con l'imaging. - Passare alla configurazione ottica "Label_Surface". Fare clic su Capture. Tornare alla configurazione ottica "imaging" e alla scansione. La superficie del vetro deve essere danneggiata e apparire amorfa. L'area danneggiata è visibile ad occhio nudo, indicando la posizione dei modelli in ulteriori esperimenti.
NOTA: per aumentare le dimensioni dell'etichetta visibile, ripetere il passaggio 5.8 in più FOV adiacenti. - Controllare di nuovo che l'obiettivo sia approssimativamente al centro della coverslip. Assicurarsi che vi sia acqua sufficiente tra l'obiettivo e la coverlip. Spostare lo stadio da 1 a 2 PV per evitare particelle di vetro e scansionare per confermare.
- Nel menu Dispositivi aprire la macro Stage_Movement dispositivo. Verificare che la directory Pattern_Stimulation di lavoro sia corretta; in caso di no, la stimolazione non si verificherà. Impostare le variabili "PatternLength" e "PatternHeight" sul numero desiderato di PV che verranno modellati. Salvare ed eseguire la macro.
- Al termine della creazione di modelli, passare alla configurazione ottica "Imaging". Ancora una volta, verificare che l'otturatore laser a infrarossi sia aperto nella finestra della GUI A1plus MP.
- Spostare lo stage per visualizzare i motivi. Scansiona i modelli per verificarne la qualità.
- Trasferire il coverslip nella casella della griglia, con motivi rivolti verso l'alto.
- Conservare i copripazzi fantasia a +4 °C per un massimo di una settimana prima dell'uso.
6. Adsorbimento della fibronectina
- Preparare una soluzione NaOH frescada 1 M NaBH 4 in 1 M. Aggiungere con un rapporto 1:100 a pH 8.0 tampone fosfato contenente 0,2 M di etanolammina.
- Trasferire le copertine fantasia in un piatto di coltura tissutale da 35 mm. Incubare ogni coverlip con 1 mL della soluzione sopra per 8 minuti per spegnere l'autofluorescenza, quindi risciacquare 3 volte con PBS.
- Diluire la fibronectina (FN) nel PBS ad una concentrazione finale di 10 μg/mL. Incubare il coverslip in FN per 1 h a +37 °C.
NOTA: Se si osserva un legame sostanziale non specifico della proteina ECM al substrato, fn può essere diluito in PBS contenente lo 0,1% di Pluronico F-12724. - Lavare la coverlip 2 volte con PBS. Se non immediatamente utilizzato, conservare in PBS a +4 °C durante la notte.
7. Attacco cellulare
NOTA: Il seguente protocollo è ottimizzato per i fibroblasti gengivali umani primari.
- Coltura un piatto di cellule da 10 cm al 70% di confluenza.
- Riscaldare i mezzi di coltura cellulare, PBS e 0,05% di tripside in un bagno d'acqua a +37 °C.
NOTA: Per le cellule che aderiscono debolmente al substrato, la dissociazione non proteolitica con versene (0,48 mM EDTA) o un tampone proprietario privo di enzimi può aumentare l'attaccamento cellulare ai modelli e deve essere considerato. - Prima di seminare le cellule, spostare il coverslip modellato in un piatto pulito di coltura tissutale da 35 mm contenente 1 PBS caldo di mL.
- Aspirare il supporto di coltura cellulare dal piatto di coltura tissutale di 10 cm e lavare una volta con PBS.
- Aggiungere 700 μL di 0,05% di tripside/EDTA al piatto e incubare le cellule in un incubatore di +37 °C, 5% di CO2 per 1 min.
- Nel frattempo, aspirare il PBS che copre il coverslip modellato e aggiungere 1 mL di mezzi di coltura cellulare.
- Verificare che le celle si siano staccate. Quindi rimorsiva le cellule tripsinziate con 10 mL di mezzi di coltura cellulare e aggiungere 1 mL al coverslip modellato.
- Le cellule di coltura nell'incubatrice per 2 - 3 ore e verificare se un numero sufficiente di cellule si è attaccato ai modelli. In tal caso, modificare i supporti una volta per rimuovere le celle non attaccate. Ciò riduce al minimo la possibilità che più celle aronono sullo stesso modello.
NOTA: il tempo di attacco può variare a seconda del tipo di cella. - Dopo altri 3-4 ore, o quando un numero sufficiente di cellule si è diffuso su modelli, le cellule sono pronte per ulteriori esperimenti. Non aspettare troppo a lungo per evitare la divisione cellulare.
8. Acquisizione dei dati
- Fissare le cellule con 4% di PFA nel buffer di citoscheletro27 per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Seguire i protocolli di immunofluorescenza stabiliti per le proteine di interesse. I copripasto rivestiti in PVA funzionano bene con qualsiasi protocollo di immunofluorescenza.
- Acquisire immagini di celle utilizzando un microscopio appropriato. A seconda dell'obiettivo dell'esperimento, immagini una o più celle per FOV.
9. Analisi delle immagini
NOTA: Il seguente protocollo consente agli utenti di ottenere il segnale medio di fluorescenza della proteina di interesse su un gran numero di cellule da Z-stack di immagini al microscopio.
- Apri le immagini acquisite in NIS Elements e ritaglia le immagini. Assicurarsi che ogni immagine contenga una sola cella ben distribuita. Istruzioni dettagliate sull'elaborazione delle immagini sono disponibili nello script seguente.
- Installa Anaconda e lancia Spyder tramite Anaconda Navigator.
NOTA: gli .py script possono essere eseguiti in qualsiasi ambiente con i pacchetti appropriati identificati nei requisiti.txt. Consigliamo Anaconda perché contiene la maggior parte dei pacchetti richiesti per i codici qui sotto. - Scarica lo script da Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) e apri in Spyder ("Pattern_Averaging_3Channels.py" o "Pattern_Averaging_4Channels.py "per immagini con 3 canali o 4 canali, rispettivamente).
- Impostare i parametri in base alle immagini acquisite. Vedi lo script per le descrizioni dettagliate.
- Premere F5 per eseguire lo script. Lo stato può essere monitorato nel pannello Console.
- Recuperare i file di output salvati nella stessa cartella. Le immagini di output sono la media di ogni canale per tutti i campioni. Il foglio excel mostra l'intensità media di ogni canale all'interno di una cella campione, che consente un'ulteriore analisi quantitativa.
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Representative Results
La qualità dei dati sperimentali ottenuti attraverso il micropatterning dipende in larga misura dalla qualità dei modelli. Per determinare la qualità dei modelli generati con il metodo precedente, abbiamo usato per la prima volta la microscopia a riflettanza per valutare la forma e le dimensioni delle aree foto ablate del coverslip. Abbiamo scoperto che ogni singolo modello sembrava molto simile alla maschera di ablazione e mostrava le bacheche chiare e una superficie che rifletteva la luce uniformemente (Figura 2B). Una varietà di forme e dimensioni può essere stampata a seconda dell'architettura del citoscheletro desiderata, ma abbiamo usato la forma a balestra più adatta ai nostri scopi. La microscopia a forza atomica (AFM) ha rivelato che tali modelli erano di circa 140 nm di altezza e avevano una superficie liscia con una variazione topologica minima in tutto(Figura 2F). Le impostazioni di patterning non ottimale, come la bassa potenza del laser e il piano focale errato, hanno portato alla rimozione incompleta della superficie del PVA che si manifesta come modelli parziali più scuri con topologia irregolare (Figura 2C). L'impostazione di potenza laser troppo elevata ha comportato il "gorgogliamento" della PVA e, quando estremo, copre danni superficiali che sono anche indesiderati (Figura 2D).
Negli esperimenti preliminari abbiamo cercato di aumentare l'area di patterning abando più FOV su un singolo coverslip. Abbiamo scoperto che questo approccio, sebbene funzioni in linea di principio, è inaffidabile e noioso a causa della deriva Z del supporto del microscopio e della leggera inclinazione del copripavimentato. Per ottenere modelli di alta qualità su un gran numero di PV in modo automatizzato, abbiamo implementato una macro personalizzata che ha migliorato la precisione della messa a fuoco del microscopio durante il processo di creazione di modelli. Il microscopio multifotono utilizza un laser a impulsi che degrada in modo efficiente il PVA con un'elevata potenza in un piano focale stretto, rendendo il processo di patterning sensibile a qualsiasi irregolarità o inclinazione nel campione. Di conseguenza, è importante identificare il piano focale preciso in ogni FOV. Questo è ancora più problematico per i sistemi privi di un modulo di messa a fuoco perfetto, in quanto deviazioni fino a uno o due micron possono rendere infruttuoso il processo di creazione di modelli. Per risolvere questo problema, lo script macro personalizzato innanzitutto applica un piccolo quadrato al centro di ogni nuovo FOV che deve essere messa a fuoco solo approssimativamente scansionando attraverso una pila Z relativamente spessa (≈20 μm). Il microscopio esegue quindi rapidamente la scansione attraverso la pila di immagini e utilizza la funzione di autofocus NIS Elements per identificare il piano focale ottimale. La maschera modello viene quindi caricata e impostata come ROI di stimolazione per la stimolazione IR. La fase passa successivamente al FOV successivo e ripete questo processo. Inoltre, il percorso a forma di onda quadrata del movimento dello stadio del microscopio ha garantito un minimo accumulo di errori tra i PV sequenziali. Utilizzando questo protocollo, fabbricamo regolarmente modelli composti da 49 PV al microscopio che coprono un'area di 3,5 x 3,5 mm del coverslip in meno di 3 ore.
Per verificare se le aree modellate, non il PVA non perturbato, potessero adsorbire le proteine ECM, abbiamo rivestito le copertine a motivi geometrici con 10 μg / mL FN e le abbiamo macchiate con anticorpi anti-FN. Utilizzando la microscopia fluorescente a campo largo, la Corte ha riscontrato che FN si adsorbì uniformemente alle aree modellate in cui il PVA era stato rimosso mediante ablazione laser (Figura 2E).
Per determinare se l'architettura del citoscheletro e la distribuzione della tensione potessero essere modificate come previsto sui modelli, abbiamo seminato cellule su coverlips modellate e visualizzato la distribuzione della catena di luce della miosina, un marcatore di contrattilità, attraverso la microscopia a fluorescenza. Dopo la semina iniziale, le cellule gravitavano gradualmente verso il copripavo. Quelli che sono atterrati su aree modellate attaccate e distribuite nella forma del modello nel tempo. Quelli che sono atterrati su PVA solo liberamente attaccati e sono stati rimossi dopo diversi lavaggi e cambiamenti multimediali. La Corte ha riscontrato che le cellule diffuse su motivi mostravano strutture fibroblattiche fenotipiche tra cui un bordo ad azione densa di lamellipodia, spesse fibre di stress ventrale lungo i due lati e fibre di stress dorsale che emanano dalla lamellipodia collegate da archi trasversali (Figura 3A). La catena luminosa myosin (MLC) sedeva dietro il denso bordo lamellipodia e mostrava un motivo striato lungo fasci di actin. Come indicato dalle immagini medie di molte celle, questo fenotipo era coerente in un gran numero di modelli (Figura 3B).
Figura 1. Schema del micropatterning assistito da laser IR (microfotomodellazione). (A) Le coverlips in vetro sono coniugate chimicamente con APTMS, GA e PVA, nel rispettivo ordine. La superficie del PVA non è adesiva per cellule e proteine. (B) Il PVA viene rimosso in modelli preimpostati da un laser IR. (C) Le copertine modellate sono rivestite con una proteina ECM che adsorbe solo le aree modellate. (D) Le cellule sono placcate su coverlips, fisse e immunostained per proteine di interesse. Le cellule che atterrano su isole a motivi geometrici si diffondono nella forma del modello che dà origine a caratteristiche strutture citoscheletriche, mentre quelle che atterrano sul PVA rimangono sferiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Convalida e caratterizzazione di micropattern. (A) Micropatterning assistito da laser IR (microfotomodellazione) impostato su uno stadio di microscopio. Il laser IR abla termicamente PVA in più FOV. (B) Immagine di microscopia riflettente di micropattern che hanno boarder chiari e sono identici alle maschere ROI. (C) Immagine della microscopia a riflettanza della rimozione incompleta del PVA risultante dalla potenza laser non ottimale. (D) Immagine di microscopia riflettente del gorgogliamento PVA derivante dall'eccesso di potenza laser. (E) Immagini di immunofluorescenza di coverlips a motivi geometrici rivestiti in FN macchiati con anticorpi primari anti-FN e anticorpi secondari coniugati con fluorofori. (F) Una linea di scansione della topologia AFM e un'immagine AFM rappresentativa di un motivo balestra. Per misurare la topologia del micropattern, l'imaging in modalità contatto è stato eseguito utilizzando una sonda AFM Bruker (MLCT-B) montata su un microscopio a forza atomica NanoWizard 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Immagini rappresentative di cellule placcate su micropattern. (A) Immagini rappresentative di un fibroblasto gengivale umano primario placcato su schemi di balestra immunosostenibili per actina e MLC. Le immagini sono state acquisite con un microscopio confocale dotato di un obiettivo 100x. (B) Immagini medie di immunofluorescenza di actina e MLC in cellule placcate su motivi di balestra generate da uno script Python personalizzato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I risultati di cui sopra dimostrano che il protocollo di micropatterning assistito da laser a infrarossi (microfotopatterning) descritto fornisce modelli aderenti riproducibili di varie forme che consentono la manipolazione della forma cellulare e dell'architettura citoscheletricha. Sebbene siano stati sviluppati numerosi metodi di micropatterning sia prima che dopo il debutto del microfotomodello, questo metodo possiede diversi vantaggi. In primo luogo, non richiede attrezzature specializzate e camere pulite che di solito si trovano solo all'interno dei dipartimenti di ingegneria. Infatti, mentre i microscopi multifotobi stanno diventando uno spettacolo più comune nei dipartimenti di Biologia, il microfotomodello espande le applicazioni del microscopio multifotono e aumenta il potenziale pool di utenti. I modelli possono anche essere modificati su richiesta e stampati immediatamente, invece di dover fabbricare un nuovo wafer master che comporta un lungo processo di litografia.
Rispetto al protocollo di microfotomodello preesiste, un miglioramento del nostro protocollo è l'eliminazione di diverse fasi di polimerizzazione che richiedono molto tempo durante la preparazione delle copertine. Mostriamo che la qualità dell'attacco PVA-coverslip rimane imperturbabile in quanto i motivi erano ancora intatti e potevano legare le cellule anche due settimane dopo la fabbricazione. Ancora più importante, abbiamo migliorato l'automazione del processo di patterning eliminando la necessità di preimpostare la posizione di ogni FOV24. Invece, implementiamo una macro comprensibile che consente la creazione di modelli di una vasta area identificando con precisione il piano focale ottimale di ogni FOV.
Sebbene le macro nel protocollo consentano l'automazione del patterning sul nostro sistema, comprendiamo che ogni microscopio a scansione laser commerciale viene fornito con il proprio software proprietario che raramente è compatibile con altri, rendendo difficile implementare il nostro protocollo esatto su altri sistemi. Tuttavia, il flusso di lavoro complessivo può essere ben adattato ad altri sistemi commerciali per facilitare la micropatterning automatizzata, vale a dire il processo di messa a fuoco su ogni singolo FOV, il caricamento della maschera, l'ablazione del PVA e lo spostamento dello stadio del microscopio su un nuovo FOV.
Diversi passaggi del protocollo di patterning dovrebbero essere intrapresi con grande cura per garantire un modello efficiente. Il passaggio più critico è ottimizzare le condizioni di stimolazione prima di generare modelli. Nella microscopia multi-fotonica, due o più fotoni devono arrivare quasi simultaneamente a una molecola fluorescente e combinare la loro energia per eccitare la fluorescenza. Questo evento a bassa probabilità crea una sezione ottica estremamente sottile che aumenta il rapporto segnale-rumore28. Sebbene utile per l'imaging, questa funzione rende la rimozione del sottile rivestimento PVA estremamente sensibile alla posizione Z del campione. Per contrastare questo problema possono essere attuate diverse misure. In primo luogo, la potenza del laser deve essere messa a punto per garantire una rimozione completa del PVA senza "bollire" il polimero o danneggiare il coperchio del vetro. Se la rimozione della PVA è costantemente incompleta, si consiglia di controllare l'allineamento laser in quanto questo di solito aumenta la potenza del laser. In secondo luogo, lo stadio del microscopio dovrebbe essere livellato per evitare l'inclinazione del campione, che potrebbe causare modelli incompleti. Le stimolazioni IR in più posizioni Z dovrebbero anche essere impostate per garantire che lo strato di PVA sia mirato. In alternativa, se il microscopio è dotato di un modulo di messa a fuoco perfetto, è possibile eseguire test preliminari per determinare l'offset ottimale in posizione Z per il targeting PVA. Un altro passo fondamentale è quello di impostare una macro al microscopio che consenta la stimolazione del modello in modo automatizzato. La macro dovrebbe trovare il piano focale di ogni nuovo FOV per evitare complicazioni dovute all'inclinazione del campione o alle irregolarità superficiali. Dovrebbe anche consentire allo stadio di muoversi a forma di S da fila a riga, analogo al percorso intrapreso nella scansione bidirezionale, per ridurre al minimo le deviazioni in Z tra i FOV consecutivi.
Una limitazione al protocollo descritto è il tempo necessario per produrre un gran numero di coverlips modellati, un vantaggio senza pari offerto dalla stampa di microcontatti basata sulla litografia29,30. Di conseguenza, questo protocollo è più adatto per esperimenti in cui è richiesto un numero limitato di condizioni o per quelli che richiedono regolazioni prontamente disponibili nella forma e nelle dimensioni del modello. Inoltre, per i sistemi privi di un modulo di autofocus hardware, integriamo una serie di eventi di stimolazione in diversi piani Z per garantire la rimozione automatica ed efficace della PVA. Poiché la stimolazione IR è il passaggio più dispendioso in termini di tempo, l'aggiunta di ogni evento di stimolazione (~ 30 secondi) allunga significativamente il processo di patterning. Se il tempo è preoccupante, suggeriamo di ottimizzare l'autofocus riducendo le dimensioni del passo. Ciò facilita l'identificazione del miglior piano focale che ridurrà il numero di eventi di stimolazione IR richiesti. Nei nostri esperimenti, la diminuzione del numero di eventi di stimolazione da cinque a due riduce il tempo della metà (1,5 ore).
In conclusione, il protocollo ir laser assisted micropatterning (microphotopatterning) che descriviamo può essere utilizzato in qualsiasi laboratorio che abbia accesso a un microscopio dotato di laser a infrarossi. Oltre a studiare l'architettura citoscheletricha e i percorsi di segnalazione che collegano la forma alla funzione, questa tecnica può essere applicata anche allo screening farmacologico e ad altre applicazioni sensibili alla variabilità da cellula a cellula.
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Disclosures
Gli autori non rivelano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da Connaught Fund New Investigator Award a S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (sovvenzioni RGPIN-2015-05114 e RGPIN-2020-05881), University of Manchester and University of Toronto Joint Research Fund e University of Toronto XSeed Program. C.T. è stato supportato dalla borsa di studio NSERC USRA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane | Aldrich | 281778 | |
| 10 cm Cell Culture Dish | VWR | 10062-880 | Polysterene, TC treated, vented |
| 25X Apo LWD Water Dipping Objective | Nikon | MRD77225 | |
| 3.5 cm Cell Culture Dish | VWR | 10861-586 | Polysterene, TC treated, vented |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | Thermo | 62248 | 1mg/mL dihydrochloride solution |
| Bovine Serine Albumin | BioShop | ALB005 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Wisent | 311-425-CL | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | FC010 | 1mg/mL in pH 7.5 buffer |
| Fibronectin Antibody | BD | 610077 | Mouse |
| Fiji | ImageJ | Version 1.53c | |
| Fluorescent Phalloidin | Invitrogen | A12380 | 568nm |
| Glass Coverslip | VWR | 16004-302 | 22 × 22 mm |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16220 | 25% aqueous solution |
| Hydrochloric Acid | Caledon | 6025-1-29 | 37% aqueous solution |
| IR Laser | Coherent | Chameleon Vision | |
| Minimal Essential Medium α | Gibco | 12561-056 | |
| Mounting Medium | Sigma | F4680 | |
| Mouse Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Goat, 488nm |
| Multi-Photon Microscope | Nikon | A1R MP+ | |
| Myosin Light Chain Antibody | Cell Signaling Technology | 3672S | Rabbit |
| NIS Elements | Nikon | Version 5.21.03 | |
| Nitric Acid | Caledon | 7525-1-29 | 70% aqueous solution |
| Photoshop | Adobe | Version 21.2.1 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Powder |
| Poly(vinyl alchohol) | Aldrich | 341584 | MW 89000-98000, 98% hydrolyzed |
| Rabbit Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4412S | Goat, 488nm |
| Shaker | VWR | 10127-876 | Alsoknown as analog rocker |
| Sodium Borohydride | Aldrich | 452882 | Powder |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | Powder |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S5011 | Powder |
| Spyder | Anaconda | 4.1.4 | |
| Trypsin | Wisent | 325-042-CL | 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA |
References
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