Summary

In Situ Udforskning af Murine Megakaryopoiesis ved hjælp af Transmission ElektronMikroskopi

Published: September 08, 2021
doi:

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at analysere ultrastruktur af megakaryocytterne in situ ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM). Murin knoglemarv indsamles, fast, indlejret i epoxyharpiks og skæres i ultratynde sektioner. Efter kontrastfarvning observeres knoglemarven under et TEM-mikroskop ved 120 kV.

Abstract

Differentiering og modning af megakaryocytter forekommer i tæt samarbejde med de cellulære og ekstracellulære komponenter i knoglemarven. Disse processer er karakteriseret ved den gradvise forekomst af væsentlige strukturer i megakaryocytcytcytoplasmaet som en polyploid og polylobuleret kerne, et internt membrannetværk kaldet afgrænsning membransystem (DMS) og de tætte og alfagranulat, der vil blive fundet i cirkulerende blodplader. I denne artikel beskriver vi en standardiseret protokol for in situ ultrastrukturelle undersøgelse af murine megakaryocytter ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM), der giver mulighed for identifikation af nøglekarakteristika, der definerer deres modningsstadium og cellulær tæthed i knoglemarven. Knoglemarv er skyllet, fast, dehydreret i ethanol, indlejret i plastharpiks, og monteret til generering af tværsnit. Halvtynde og tynde sektioner er forberedt til henholdsvis histologiske og TEM-observationer. Denne metode kan bruges til enhver knoglemarvscelle, i enhver EM-facilitet og har den fordel at bruge små prøvestørrelser, der giver mulighed for kombinationen af flere billeddannelsesmetoder på den samme mus.

Introduction

Megakaryocytter er specialiserede store polyploidceller, lokaliseret i knoglemarven, der er ansvarlig for blodpladeproduktion1. De stammer fra hæmatoopoietiske stamceller gennem en indviklet modningsproces, hvor megakaryocytprækursorer gradvist øges i størrelse, mens de gennemgår omfattende samtidige morfologiske ændringer i cytoplasmaet og kernen2. Under modning udvikler megakaryocytter en række forskellige strukturelle elementer, herunder: en polylobuleret kerne, invaginationer af overflademembranen, der danner afgrænsningsmembransystemet (DMS), en perifer zone uden organeller omgivet af det actinbaserede cytoskeletale netværk og talrige organeller, herunder α granulater, tætte granulater, lysosomer og flere Golgi-komplekser. På det ultrastrukturelle niveau observeres en væsentlig ændring den cytoplasmatiske opdeling i diskrete regioner afgrænset af DMS3. Denne omfattende forsyning af membraner vil brændstof forlængelsen af lange cytoplasmaiske processer i den indledende fase af blodpladeproduktion, som derefter vil ombygges til blodplader inde i cirkulationen. Enhver defekt under megakaryocytdifferentiering og modning kan påvirke blodpladeproduktionen i form af blodpladeantal og/eller blodpladefunktion.

Tyndt lag transmission elektronmikroskopi (TEM) har været billeddannelse tilgang valg i årtier giver høj kvalitet ultrastruktur af megakaryocytter, der har formet vores forståelse af fysiologi af trombopoiesis4,5. Dette papir fokuserer på en standardiseret TEM metode gør det muligt at fange processen med blodplade biogenese forekommer in situ inden for den indfødte knoglemarvs mikromiljø, som også kunne tjene som grundlag for at analysere enhver knoglemarvscelletype. Vi giver ultrastrukturelle eksempler på udviklingen af megakaryocytter fra umodne til fuldt modne, som udvider cytoplasmaiske processer i mikrocirkulationen af sinusoider6. Vi beskriver også en nem procedure for at kvantificere de forskellige megakaryocyt modning faser, instruere om regenerering og blodplade produktionskapacitet af knoglemarven.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med europæiske standarder 2010/63/EU og CREMEAS’s komité for etik i dyreforsøg ved universitetet i Strasbourg (Comité Régional d’Ethique en Matière d’Expérimentation Animale Strasbourg). Protokollen vises skematisk i figur 1. 1. Indsamling og fiksering af knoglemarv ( figur 1A) FORSIGTIG: Denne procedure omfatter kræftfremkaldende, mutagene og/eller gif…

Representative Results

Knoglemarvs histologiObservation af knoglemarvs toluid blå histologi under et let mikroskop er nøglen til hurtigt at analysere den samlede vævsarkitektur med hensyn til f.eks væv kompakthed, mikrovessel kontinuitet, og størrelsen og formen af megakaryocytter (Figur 1D). Det udføres før ultratynde sektioner for at bestemme behovet for at skære dybere i knoglemarvsblokken. På grund af deres gigantiske størrelse og nukleare lobulation kan de mere …

Discussion

Direkte undersøgelse af megakaryocytter i deres oprindelige miljø er afgørende for at forstå megakaryopoiesis og blodplade dannelse. I dette manuskript leverer vi en transmissionselektronmikroskopimetode, der kombinerer knoglemarvsskylning og fiksering ved nedsænkning, hvilket gør det muligt at dissekere in situ morfologiegenskaberne for hele processen med megakaryocytmorphogenese, der finder sted i knoglemarven.

Skylningen af knoglemarven er et kritisk trin i denne metode, da s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne takke Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund for teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), Den Europæiske Union gennem Den Europæiske Fond for Regionaludvikling (EFRU) og af Grant ANR-17-CE14-0001-01 til H.d.S.

Materials

2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) Ladd Research Industries, USA 21310
Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar Electron Microscopy Sciences, USA 1670-B
CaCl2 Calcium chloride hexahydrate Merck, Germany 2083
Copper grids 200 mesh thin-bar Oxford Instrument, Agar Scientifics, England T200-CU
Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate Merck, Germany 8.20670.0250
Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) Ladd Research Industries, USA 21340
Double Edge Stainless Razor blade Electron Microscopy Sciences-EMS, USA EM-72000
Ethanol absolut VWR International, France 20821296
Filter paper, 90 mm diameter Whatman, England 512-0326
Flat embedding silicone mould Oxford Instrument, Agar Scientific, England G3533
Glutaraldehyde 25% Electron Microscopy Sciences-EMS, USA 16210
Heat plate Leica EMMP Leica Microsystems GmbH, Austria 705402
Histo Diamond Knife 45° Diatome, Switzerland 1044797
JEOL 2100 Plus TEM microscope JEOL, Japan EM-21001BU
Lead citrate – Ultrostain 2 Leica Microsystems GmbH, Austria 70 55 30 22
LX-112 resin Ladd Research Industries, USA 21310
MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate Sigma, France M2393-100g
Mounting medium – Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) Electron Microscopy Sciences-EMS, USA 15320
Nadic Methyl Anhydride (NMA) Ladd Research Industries, USA 21350
Osmium tetroxide 2% Merck, Germany 19172
Propylene oxide (1.2-epoxypropane) Sigma, France 82320-250ML
Saline injectable solution 0.9% NaCl C.D.M Lavoisier, France MA 575 420 6
Scalpel Surgical steel blade Swann-Morton, England .0508
Sodium tetraborate – Borax Sigma, France B-9876
Sucrose Merck, Germany 84100-1KG
Syringe filter 0.2µm Pall Corporation, USA 514-4126
Toluidine blue Ladd Research Industries, USA N10-70975
Trimmer EM TRIM2 Leica Microsystems GmbH, Austria 702801
Ultramicrotome Ultracut UCT Leica Microsystems GmbH, Austria 656201
Uranyl acetate Ladd Research Industries, USA 23620

References

  1. Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
  2. Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1). American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).
  3. Eckly, A., et al. Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
  4. Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. , 1-10 (2020).
  5. Behnke, O., Forer, A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).
  6. Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).
  7. Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels. Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).
  8. Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).
  9. Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
  10. Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules. Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).
  11. Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).
  12. Centurione, L., et al. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice. Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).
  13. Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
  14. Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).

Play Video

Cite This Article
Scandola, C., Lanza, F., Gachet, C., Eckly, A. In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (175), e62494, doi:10.3791/62494 (2021).

View Video