Megakaryocytencultuur in 3D-hydrogel op basis van methylcellulose om de celrijping te verbeteren en de impact van stijfheid en opsluiting te bestuderen
Summary
Inmiddels wordt erkend dat de driedimensionale omgeving van cellen een belangrijke rol kan spelen in hun gedrag, rijping en/of differentiatie. Dit protocol beschrijft een driedimensionaal celkweekmodel dat is ontworpen om de impact van fysieke insluiting en mechanische beperkingen op megakaryocyten te bestuderen.
Abstract
De 3D-omgeving die leidt tot zowel opsluiting als mechanische beperkingen wordt steeds meer erkend als een belangrijke determinant van celgedrag. Zo is 3D-cultuur ontwikkeld om de in vivo situatie beter te benaderen. Megakaryocyten onderscheiden zich van hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC’s) in het beenmerg (BM). De BM is een van de zachtste weefsels van het lichaam, opgesloten in het bot. Omdat het bot slecht uitrekbaar is op celschaal, worden megakaryocyten tegelijkertijd onderworpen aan een zwakke stijfheid en hoge opsluiting. Dit protocol presenteert een methode voor het herstel van muizenlijnnegatieve (Lin-) HSPC’s door immunomagnetische sortering en hun differentiatie in volwassen megakaryocyten in een 3D-medium bestaande uit methylcellulose. Methylcellulose is niet-reactief ten opzichte van megakaryocyten en de stijfheid ervan kan worden aangepast aan die van normaal beenmerg of worden verhoogd om een pathologisch fibrotisch merg na te bootsen. Het proces om de megakaryocyten te herstellen voor verdere celanalyses wordt ook gedetailleerd beschreven in het protocol. Hoewel proplateletuitbreiding wordt voorkomen binnen het 3D-milieu, wordt hieronder beschreven hoe de megakaryocyten in vloeibaar medium kunnen worden geresuspendeerd en hun vermogen om proplatelets uit te breiden te kwantificeren. Megakaryocyten gekweekt in 3D-hydrogel hebben een hogere capaciteit om proplatelets te vormen in vergelijking met die gekweekt in een vloeibaar milieu. Deze 3D-cultuur maakt het mogelijk om i) voorlopers te differentiëren naar megakaryocyten die een hogere rijpingstoestand bereiken, ii) om fenotypen te recapileren die in vivo kunnen worden waargenomen maar onopgemerkt blijven in klassieke vloeibare culturen, en iii) om transductieroutes te bestuderen die worden geïnduceerd door de mechanische signalen die door een 3D-omgeving worden geleverd.
Introduction
Cellen in het lichaam ervaren een complexe 3D-micro-omgeving en worden onderworpen aan het samenspel tussen chemische en mechanofysische signalen, waaronder stijfheid van het weefsel en opsluiting als gevolg van naburige cellen en omringende matrix 1,2,3. Het belang van stijfheid en opsluiting voor celgedrag is pas de laatste decennia erkend. In 2006 benadrukte het baanbrekende werk van Engler et al. 4 het belang van de mechanische omgeving voor celdifferentiatie. De auteurs toonden aan dat variatie in celsubstraatstijfheid resulteerde in de oriëntatie van stamcellen op verschillende differentiatielijnen. Sindsdien is de impact van mechanische signalen op het lot en gedrag van cellen steeds meer erkend en bestudeerd. Ondanks dat het een van de zachtste weefsels van het organisme is, heeft het beenmerg een 3D-structurele organisatie die is opgesloten in het bot. De mergstijfheid, hoewel technisch moeilijk precies te meten, wordt geschat tussen 15 en 300 Pa 5,6. In het stroma zijn cellen strak aan elkaar gekluisterd. Bovendien migreren de meesten van hen naar de sinusoïde bloedvaten om de bloedcirculatie binnen te komen. Deze omstandigheden creëren extra mechanische beperkingen op aangrenzende cellen, die zich aan deze krachten moeten aanpassen. Mechanische signalen vertegenwoordigen een belangrijke parameter waarvan de gevolgen voor megakaryocytendifferentiatie en proplateletvorming onlangs zijn onderzocht. Hoewel megakaryocyten in vitro kunnen differentiëren in traditionele vloeibare cultuur, bereiken ze niet de mate van rijping die in vivowordt waargenomen , deels vanwege de afwezigheid van de mechanische signalen uit de 3D-omgeving 7. Groeiende voorlopers ingebed in hydrogel brengt 3D mechanische signalen die ontbreken in een vloeibaar milieu.
Hydrogels worden al tientallen jaren op grote schaal gebruikt op hematologisch gebied, met name om cellen te laten groeien in kolonievormende assays om hematopoëtische voorlopers te kwantificeren. Dergelijke hydrogels zijn echter zelden gebruikt om de biologische impact van de 3D-mechanische omgeving op rijping en differentiatie van hematopoëtische cellen te onderzoeken. In de afgelopen jaren heeft ons laboratorium een 3D-kweekmodel ontwikkeld met behulp van een op methylcellulose gebaseerde hydrogel 8. Deze niet-reactieve fysieke gel is een nuttig hulpmiddel om de fysieke beperkingen van de inheemse megakaryocytenomgeving na te bootsen. Het wordt afgeleid van cellulose door vervanging van hydroxylresiduen (-OH) door methoxidegroepen (-OCH3). Zowel de mate van methylsubstitutie als de methylcelluloseconcentratie bepalen de hydrogelstijfheid zodra deze is vereld. Tijdens de ontwikkelingsfase van deze techniek werd aangetoond dat een Young’s modulus in het bereik van 30 tot 60 Pa de optimale gelstijfheid is voor megakaryocytengroei 9.
Het volgende protocol beschrijft een methode om megakaryocytische voorlopercellen van muizen te laten groeien in een 3D-methylcellulosehydrogel. Het is eerder aangetoond dat in vergelijking met standaard vloeibare cultuur, deze hydrogelcultuur de mate van polyploïdisatie van megakaryocyten verhoogt, de rijping en intracellulaire organisatie verbetert en de capaciteit van megakaryocyten verhoogt om proplatelets uit te breiden zodra ze zijn geresuspendeerd in een vloeibaar medium 9. Dit manuscript beschrijft in detail het protocol voor de isolatie van beenmerg Lin−-cellen van muizen en hun inbedding in een methylcellulosehydrogel voor 3D-cultuur, evenals de kwantificering van hun vermogen om proplatelets te produceren en het herstel van de cellen voor verdere analyses.
Protocol
Representative Results
Discussion
In het afgelopen decennium heeft mechanobiologie steeds meer belangstelling gewekt voor veel gebieden van de biologie. Het wordt nu algemeen erkend dat de mechanische omgeving rond de cellen een rol speelt in hun gedrag, met de nadruk op het belang om te bestuderen hoe megakaryocyten voelen en reageren op extracellulaire mechanische signalen. Het is een uitdaging om de stijfheid van het beenmergweefsel in situnauwkeurig te meten11, vooral als we het hematopoëtische rode merg beschouwen, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Fabien Pertuy en Alicia Aguilar bedanken die deze techniek aanvankelijk in het laboratorium ontwikkelden, evenals Dominique Collin (Institut Charles Sadron – Strasbourg) die de visco-elastische eigenschappen van de methylcellulosehydrogel karakteriseerde. Dit werk werd ondersteund door ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) en door een ARN-subsidie (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher is een ontvanger van de Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-subsidienummer FDT202012010422).
Materials
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
- Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2020).
- Doyle, A. D., Yamada, K. M. Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments. Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
- Shin, J. -. W., et al. Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells. Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).
- Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. Blood platelet formation at a glance. Journal of cell science. 133 (20), (2020).
- Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation. Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128, 2022-2032 (2016).
- Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. Thrombopoietin from beginning to end. British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).
- Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function. American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).
- Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. Mechanics of intact bone marrow. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
