В настоящее время признано, что трехмерная среда клеток может играть важную роль в их поведении, созревании и / или дифференцировки. Этот протокол описывает трехмерную модель клеточной культуры, предназначенную для изучения влияния физической локализации и механических ограничений на мегакариоциты.
3D-среда, приводящая как к ограничению, так и к механическим ограничениям, все чаще признается в качестве важного детерминанта поведения клеток. Таким образом, 3D-культура была разработана для лучшего подхода к ситуации in vivo. Мегакариоциты дифференцируются от гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPC) в костном мозге (BM). БМ является одной из самых мягких тканей тела, заключенной внутри кости. Поскольку кость плохо растяжима в клеточном масштабе, мегакариоциты одновременно подвергаются слабой жесткости и высокой конфайнментности. В этом протоколе представлен метод восстановления отрицательных (Lin-) HSPC линии мыши путем иммуномагнитной сортировки и их дифференцировки в зрелые мегакариоциты в 3D-среде, состоящей из метилцеллюлозы. Метилцеллюлоза не реагирует по отношению к мегакариоцитам, и ее жесткость может быть скорректирована до нормального костного мозга или увеличена, чтобы имитировать патологический фиброзный костный мозг. Процесс восстановления мегакариоцитов для дальнейших клеточных анализов также подробно описан в протоколе. Хотя расширение проплатлетов предотвращается в 3D-среде, ниже описано, как повторно суспендировать мегакариоциты в жидкой среде и количественно оценить их способность расширять проplatelets. Мегакариоциты, выращенные в 3D-гидрогеле, обладают более высокой способностью к образованию проплацетов по сравнению с теми, которые выращиваются в жидкой среде. Эта 3D-культура позволяет i) дифференцировать прародителей в сторону мегакариоцитов, достигающих более высокого состояния созревания, ii) рекапитулировать фенотипы, которые могут наблюдаться in vivo, но оставить незамеченными в классических жидких культурах, и iii) изучать пути трансдукции, индуцированные механическими сигналами, предоставляемыми 3D-средой.
Клетки в организме испытывают сложную 3D-микросреду и подвергаются взаимодействию между химическими и механофизическими сигналами, включая жесткость из ткани и ограничение из-за соседних клеток и окружающих матриц 1,2,3. Важность жесткости и удержания для поведения клеток была признана только в последние десятилетия. В 2006 году основополагающая работа Engler et al. 4 подчеркнула важность механической среды для дифференцировки клеток. Авторы продемонстрировали, что изменение жесткости клеточного субстрата привело к ориентации стволовых клеток на различные линии дифференцировки. С тех пор влияние механических сигналов на судьбу и поведение клеток становится все более признанным иизученным. Несмотря на то, что это одна из самых мягких тканей организма, костный мозг имеет 3D-структурную организацию, которая ограничена внутри кости. Жесткость костного мозга, хотя технически трудно измерить точно, по оценкам, лежит между 15 и 300 Па 5,6. Внутри стромы клетки плотно ограничены друг другом. Кроме того, большинство из них мигрируют в сторону синусоидальных сосудов, чтобы войти в кровообращение. Эти условия создают дополнительные механические ограничения на соседние клетки, которые должны приспосабливаться к этим силам. Механические сигналы представляют собой важный параметр, последствия которого для дифференцировки мегакариоцитов и образования проплатлетов были изучены совсем недавно. Хотя мегакариоциты могут дифференцироваться in vitro в традиционной жидкой культуре, они не достигают степени созревания, наблюдаемой in vivo,отчасти из-за отсутствия механических сигналов из 3D-среды 7. Выращивание прародителей, встроенных в гидрогель, приносит 3D-механические сигналы, которых не хватает в жидкой среде.
Гидрогели широко используются в течение нескольких десятилетий в гематологической области, в частности, для выращивания клеток в колониеобразующих анализах для количественной оценки гемопоэтических прародителей. Однако такие гидрогели редко использовались для изучения биологического воздействия 3D-механической среды на созревание и дифференцировку кроветворных клеток. За последние несколько лет наша лаборатория разработала 3D-модель культуры с использованием гидрогеля 8 на основеметилцеллюлозы. Этот нереактивный физический гель является полезным инструментом для имитации физических ограничений нативной среды мегакариоцитов. Его получают из целлюлозы путем замены гидроксильных остатков (-OH) метоксидными группами (-OCH3). Как степень метилозамещения, так и концентрация метилцеллюлозы определяют жесткость гидрогеля после его желляции. На этапе разработки данной методики было продемонстрировано, что модуль Юнга в диапазоне от 30 до 60 Па является оптимальной жесткостью геля для роста мегакариоцитов 9.
Следующий протокол описывает метод выращивания мышиных мегакариоцитарных прародителей в 3D-гидрогеле метилцеллюлозы. Ранее было показано, что по сравнению со стандартной жидкой культурой эта гидрогелевая культура повышает степень полиплоидизации мегакариоцитов, улучшает созревание и внутриклеточную организацию, а также увеличивает способность мегакариоцитов к продлению проплацирования после повторного суспендирования в жидкой среде 9. В данной рукописи подробно описан протокол выделения Lin− клеток костного мозга мыши и их встраивания в гидрогель метилцеллюлозы для 3D-культуры, а также количественная оценка их способности производить проплацелеты и восстановление клеток для дальнейших анализов.
В предыдущее десятилетие механобиология вызывала все больший интерес ко многим областям биологии. В настоящее время общепризнано, что механическая среда, окружающая клетки, играет определенную роль в их поведении, подчеркивая важность изучения того, как мегакариоциты чувствуют и реа?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Фабьена Пертюя и Алисию Агилар, которые изначально разработали эту методику в лаборатории, а также Доминика Коллина (Institut Charles Sadron – Страсбург), который охарактеризовал вязкоупругие свойства гидрогеля метилцеллюлозы. Эта работа была поддержана ARMESA (Ассоциация исследований и развития в медицине и санте-публике) и грантом ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Жюли Бошер является получателем гранта ФДТ2020120104222).
18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
Dakopen | Dako | ||
DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |