Summary

Культура мегакариоцитов в 3D-гидрогеле на основе метилцеллюлозы для улучшения созревания клеток и изучения влияния жесткости и удержания

Published: August 26, 2021
doi:

Summary

В настоящее время признано, что трехмерная среда клеток может играть важную роль в их поведении, созревании и / или дифференцировки. Этот протокол описывает трехмерную модель клеточной культуры, предназначенную для изучения влияния физической локализации и механических ограничений на мегакариоциты.

Abstract

3D-среда, приводящая как к ограничению, так и к механическим ограничениям, все чаще признается в качестве важного детерминанта поведения клеток. Таким образом, 3D-культура была разработана для лучшего подхода к ситуации in vivo. Мегакариоциты дифференцируются от гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPC) в костном мозге (BM). БМ является одной из самых мягких тканей тела, заключенной внутри кости. Поскольку кость плохо растяжима в клеточном масштабе, мегакариоциты одновременно подвергаются слабой жесткости и высокой конфайнментности. В этом протоколе представлен метод восстановления отрицательных (Lin-) HSPC линии мыши путем иммуномагнитной сортировки и их дифференцировки в зрелые мегакариоциты в 3D-среде, состоящей из метилцеллюлозы. Метилцеллюлоза не реагирует по отношению к мегакариоцитам, и ее жесткость может быть скорректирована до нормального костного мозга или увеличена, чтобы имитировать патологический фиброзный костный мозг. Процесс восстановления мегакариоцитов для дальнейших клеточных анализов также подробно описан в протоколе. Хотя расширение проплатлетов предотвращается в 3D-среде, ниже описано, как повторно суспендировать мегакариоциты в жидкой среде и количественно оценить их способность расширять проplatelets. Мегакариоциты, выращенные в 3D-гидрогеле, обладают более высокой способностью к образованию проплацетов по сравнению с теми, которые выращиваются в жидкой среде. Эта 3D-культура позволяет i) дифференцировать прародителей в сторону мегакариоцитов, достигающих более высокого состояния созревания, ii) рекапитулировать фенотипы, которые могут наблюдаться in vivo, но оставить незамеченными в классических жидких культурах, и iii) изучать пути трансдукции, индуцированные механическими сигналами, предоставляемыми 3D-средой.

Introduction

Клетки в организме испытывают сложную 3D-микросреду и подвергаются взаимодействию между химическими и механофизическими сигналами, включая жесткость из ткани и ограничение из-за соседних клеток и окружающих матриц 1,2,3. Важность жесткости и удержания для поведения клеток была признана только в последние десятилетия. В 2006 году основополагающая работа Engler et al. 4 подчеркнула важность механической среды для дифференцировки клеток. Авторы продемонстрировали, что изменение жесткости клеточного субстрата привело к ориентации стволовых клеток на различные линии дифференцировки. С тех пор влияние механических сигналов на судьбу и поведение клеток становится все более признанным иизученным. Несмотря на то, что это одна из самых мягких тканей организма, костный мозг имеет 3D-структурную организацию, которая ограничена внутри кости. Жесткость костного мозга, хотя технически трудно измерить точно, по оценкам, лежит между 15 и 300 Па 5,6. Внутри стромы клетки плотно ограничены друг другом. Кроме того, большинство из них мигрируют в сторону синусоидальных сосудов, чтобы войти в кровообращение. Эти условия создают дополнительные механические ограничения на соседние клетки, которые должны приспосабливаться к этим силам. Механические сигналы представляют собой важный параметр, последствия которого для дифференцировки мегакариоцитов и образования проплатлетов были изучены совсем недавно. Хотя мегакариоциты могут дифференцироваться in vitro в традиционной жидкой культуре, они не достигают степени созревания, наблюдаемой in vivo,отчасти из-за отсутствия механических сигналов из 3D-среды 7. Выращивание прародителей, встроенных в гидрогель, приносит 3D-механические сигналы, которых не хватает в жидкой среде.

Гидрогели широко используются в течение нескольких десятилетий в гематологической области, в частности, для выращивания клеток в колониеобразующих анализах для количественной оценки гемопоэтических прародителей. Однако такие гидрогели редко использовались для изучения биологического воздействия 3D-механической среды на созревание и дифференцировку кроветворных клеток. За последние несколько лет наша лаборатория разработала 3D-модель культуры с использованием гидрогеля 8 на основеметилцеллюлозы. Этот нереактивный физический гель является полезным инструментом для имитации физических ограничений нативной среды мегакариоцитов. Его получают из целлюлозы путем замены гидроксильных остатков (-OH) метоксидными группами (-OCH3). Как степень метилозамещения, так и концентрация метилцеллюлозы определяют жесткость гидрогеля после его желляции. На этапе разработки данной методики было продемонстрировано, что модуль Юнга в диапазоне от 30 до 60 Па является оптимальной жесткостью геля для роста мегакариоцитов 9.

Следующий протокол описывает метод выращивания мышиных мегакариоцитарных прародителей в 3D-гидрогеле метилцеллюлозы. Ранее было показано, что по сравнению со стандартной жидкой культурой эта гидрогелевая культура повышает степень полиплоидизации мегакариоцитов, улучшает созревание и внутриклеточную организацию, а также увеличивает способность мегакариоцитов к продлению проплацирования после повторного суспендирования в жидкой среде 9. В данной рукописи подробно описан протокол выделения Lin− клеток костного мозга мыши и их встраивания в гидрогель метилцеллюлозы для 3D-культуры, а также количественная оценка их способности производить проплацелеты и восстановление клеток для дальнейших анализов.

Protocol

Все эксперименты должны проводиться в соответствии с институциональными руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных. Все протоколы, показанные на видео, были выполнены в строгом соответствии с европейским законодательством и рекомендациями Наблюдательно…

Representative Results

Данные, полученные с помощью этого протокола, были первоначально опубликованы в Blood в 2016году 9. Согласно протоколу, клетки были посеяны либо в жидкой, либо в метилцеллюлозно-гидрогелевую среду. Ячейки в жидкой среде все осаждены на дне скважины, в контакте с же…

Discussion

В предыдущее десятилетие механобиология вызывала все больший интерес ко многим областям биологии. В настоящее время общепризнано, что механическая среда, окружающая клетки, играет определенную роль в их поведении, подчеркивая важность изучения того, как мегакариоциты чувствуют и реа?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Фабьена Пертюя и Алисию Агилар, которые изначально разработали эту методику в лаборатории, а также Доминика Коллина (Institut Charles Sadron – Страсбург), который охарактеризовал вязкоупругие свойства гидрогеля метилцеллюлозы. Эта работа была поддержана ARMESA (Ассоциация исследований и развития в медицине и санте-публике) и грантом ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Жюли Бошер является получателем гранта ФДТ2020120104222).

Materials

18-gauge needles Sigma-Aldrich 1001735825
21-gauge needles BD Microlance 301155
23-gauge needles Terumo AN*2332R1
25-gauge neeldes BD Microlance 300400
4-well culture dishes Thermo Scientific 144444
5 mL syringes Terumo SS+05S1
Cytoclips Microm Microtech F/CLIPSH
Cytofunnels equiped with filter cards Microm Microtech F/JC304
Cytospin centrifuge Thermo Scientific Cytospin 4
Dakopen Dako
DMEM 1x Gibco, Life Technologies 41 966-029
DPBS Life Technologies 14190-094 Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline
EasySep magnets Stem Cell Technologies 18000
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit Stem Cell Technologies 19856A biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads
EDTA Invitrogen 15575-020
Fetal Bovine Serum Healthcare Life Science SH30071.01
Luer lock 1 mL syringes Sigma-Aldrich Z551546-100EA or 309628 syringes from BD MEDICAL
Luer lock syringes connectors Fisher Scientific 11891120
MC 3% R&D systems HSC001
Polylysin coated slides Thermo Scientific J2800AMNZ
PSG 100x Gibco, Life Technologies 1037-016 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine
Rat serum Stem Cell Technologies 13551
Recombinant hirudin Transgène rHV2-Lys47
Recombinant human trombopoietin (rhTPO) Stem Cell Technologies 2822 10,000 units/mL
Round bottomed 10 mL plastique tubes Falcon 352054
Round bottomed 5 mL polystyrene tubes

References

  1. Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
  2. Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2020).
  3. Doyle, A. D., Yamada, K. M. Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments. Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).
  4. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  5. Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
  6. Shin, J. -. W., et al. Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells. Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).
  7. Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. Blood platelet formation at a glance. Journal of cell science. 133 (20), (2020).
  8. Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation. Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).
  9. Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128, 2022-2032 (2016).
  10. Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. Thrombopoietin from beginning to end. British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).
  11. Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function. American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).
  12. Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. Mechanics of intact bone marrow. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).
  13. Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
  14. Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).

Play Video

Cite This Article
Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement. J. Vis. Exp. (174), e62511, doi:10.3791/62511 (2021).

View Video