Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

פרופיל פרוטאומי של EPS-שתן באמצעות עיכול FASP וניתוח נתונים עצמאיים

Published: May 8, 2021 doi: 10.3791/62512
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 1, 4, 1
1Research Centre for Advanced Biochemistry and Molecular Biology, Department of Experimental and Clinical Medicine, Magna Graecia University of Catanzaro, 2Department of Health Science, Magna Graecia University of Catanzaro, 3Romolo Hospital, 4Department of Experimental and Clinical Medicine, Magna Graecia University of Catanzaro

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עיכול מותאם על המסנן עם מידע מפורט על הדברים הבאים: עיכול חלבונים, טיהור פפטיד וניתוח רכישה עצמאית של נתונים. אסטרטגיה זו מיושמת על ניתוח של הפרשות הערמונית המובעות דגימות שתן ומאפשר כיסוי פרוטאום גבוה פרופיל חסר נמוך תווית של פרוטאום השתן.

Abstract

פרוטוקול מדגם בסיוע מסנן (FASP) נמצא בשימוש נרחב להכנת מדגם פרוטאומיקה מכיוון שהוא מאפשר לרכז דגימות מדוללות והוא תואם למגוון רחב של חומרי ניקוי. זרימות עבודה פרוטאומיות מלמטה למעלה כמו FASP מסתמכות יותר ויותר על שיטות LC-MS/MS המבוצעות במצב ניתוח (DIA) שאינו תלוי בנתונים, שיטת סריקה המאפשרת כיסוי פרוטאום עמוק ושכיחות נמוכה של ערכים חסרים.

בדוח זה, אנו נספק את הפרטים של זרימת עבודה המשלבת פרוטוקול FASP, שלב טיהור תיאור שלב כפול ו- LC-MS/MS במצב DIA עבור מיפוי פרוטאום בדרכי השתן. כדוגמת מודל, ניתחנו הפרשות הערמונית מבוטא (EPS)-שתן, מדגם שנאסף לאחר בדיקה רקטלית דיגיטלית (DRE), אשר עניין במחקרים גילוי סמן ביולוגי סרטן הערמונית.

Introduction

האבולוציה המתמדת של טכנולוגיות פרוטאומיות מבטיחה להיות בעלת השפעה ניכרת בסיוע לאבחון מחלות וחיזוי התגובה לטיפול על ידי מתן מפות ברזולוציה גבוהה של משפיעים מולקולריים מרכזיים הנמצאים במגוון רחב של דגימות כגון רקמות וביופלואידים. מנקודת מבט אנליטית, שתן מציע מספר יתרונות כגון קלות האיסוף ויציבות עיקרית של הפרוטום ביחס לאחרים biofluids1. ניתוח פרוטאומי של שתן הוא עניין מיוחד במחקרים גילוי סמן ביולוגי על סרטן אורולוגי, שכן הוא מאפשר דגימה פולשנית בסמיכות לרקמות שלעניין 2. בפרט, מדגם שנראה מבטיח לחקר פתולוגיות הקשורות לערמונית הוא EPS-שתן3,4 (כלומר, דגימת שתן שנאסף לאחר בדיקה רקטלית דיגיטלית (DRE)). פעולה זו לפני איסוף מדגם מעשיר שתן עם חלבונים ספציפיים הערמונית. EPS-שתן הוא מועמד טוב לחקור הפרעות הקשורות בלוטת הערמונית5 כולל סרטן הערמונית (PCa), שכן באמצעות DRE, חלבונים המופרשים על ידי הגידול ניתן לשפוך לתוך דגימת השתן, להגדיל את הסיכוי לגילוי חלבונים ספציפיים לרקמות סרטן.

תפקיד מכריע במתן אפשרות לגילוי וכימות של סמנים ביולוגיים פוטנציאליים של חלבונים הוא שיחק על ידי ספקטרומטריית מסה (MS). במהלך שני העשורים האחרונים, פרוטוקולים מבוססי MS לניתוח פרוטאומי אפשרו למספר הולך וגדל של חלבונים להתגלות בריצת LC-MS/MS אחת הודות לשיפורים מתמשכים במכשור MS ובתוכנה לניתוח נתונים6.

הכנת מדגם פרוטאומי מבוסס MS בדרך כלל כרוך עיכול אנזימטי שלתערובתהחלבון, אשר ניתן להשיג באמצעות מגוון רחב של פרוטוקולים כגון: עיכול בתמיסה, MStern סופג7, לכידת השעיה (S-trap) 8 , הכנת מדגם מוצק פאזה משופרת (SP3)9, in-StageTip digestion10 וסיוע להכנת מדגם מסונן (FASP)11. כל הפרוטוקולים יכולים לשמש פרוטאומיקה בדרכי השתן, למרות התוצאות עשויות להשתנות ביחס למספר חלבונים ופפטידים מזוהים במונחים של רבייה12.

בעבודה זו, תשומת הלב שלנו התמקדה בניתוח של שתן EPS על ידי פרוטוקול FASP. פרוטוקול FASP תוכנן במקור לנתח חלבונים שחולצו מרקמות ותרביות תאים, אך השימוש בו הורחב לאחר מכן לניתוח של סוגי מדגם אחרים, כגון שתן13. לגבי פשוט בפתרון עיכול FASP היא גישה פרוטאומית גמישה יותר14, שכן על ידי השגת הסרה יעילה של חומרי ניקוי ומזהמים אחרים כגון מלחים מתערובת החלבון לפני עיכול אנזימטי15, זה מאפשר את הבחירה של תנאי solubilization חלבון אופטימלי. יתר על כן, מאפיין נוסף של FASP הוא שהוא מספק אמצעי לריכוז מדגם. זה מעניין במיוחד עבור ניתוח פרוטאומי בדרכי השתן, כי זה מאפשר להתחיל מנפחי מדגם גדולים יחסית (מאות microliters). לאור הפוטנציאל של פרוטוקול FASP, מספר מחקרים מיקדו את תשומת הלב באוטומציה של זרימת עבודה, במטרה להפחית את השונות הניסיונית ועיבוד מספר גבוה של דגימות במקביל16.

בזרימת העבודה שלנו, FASP מלווה ברכישת LC-MS/MS בניתוח שאינו תלוי בנתונים (DIA), המספק כיסוי פרוטאום גבוה, דיוק כמותי טוב ושכיחות נמוכה של ערכים חסרים. גישת DIA היא שיטה רגישה שבה כל היונים נבחרים עבור אירועי MS/MS, בניגוד למה שקורה בניתוח תלוי נתונים (DDA) שבו רק יונים בעוצמה הגבוהה ביותר מפוצלים. ספקטרומטר המסה, הפועל במצב DIA, מבצע מחזורי סריקה עם רוחב בידוד שונה המכסה את כל טווח המבשר m/z. גישה זו מאפשרת לזהות מספר גבוה של פפטידים ליחידת זמן, מתן תמונת מצב proteomics של המדגם17. יתר על כן, נתונים שנוצרו על ידי DIA יש מאפיין מעניין נוסף: האפשרות של ניתוח אחורי 18. נתוני DIA מורכבים יותר מאלה המתקבלים על ידי DDA, מכיוון שספקטרום MS/MS ב- DIA נובע מבידוד משותף של מספר יוני קודמן בתוך כל חלון m/z 19. פירוק ספקטרום MS/MS המשולב לאותות פפטיד ברורים וספציפיות מושג באמצעות שני אלמנטים בסיסיים: ספריה ספקטרלית ותוכנה ייעודית לניתוח נתונים. הספרייה הספקטרלית נוצרת על ידי ניסוי תלוי נתונים, בדרך כלל מעורבים שבר פפטיד כדי למקסם את כיסוי פרוטאום, אשר מספק רשימה של אלפי יונים מבשר שנקבעו בניסוי ספקטרום MS / MS של פפטידים לזיהוי במדגם תחת שיקול. התוכנה לניתוח נתונים, במקום זאת, משתמשת במידע הכלול בספריה הספקטרלית כדי לפרש את נתוני ה- DIA על ידי יצירת כרומטוגרמות יון שחולצו ספציפיות המאפשרות זיהוי וכימות פפטיד. בעוד שניתוח נתוני DIA ללא ספריה אפשרי כעת, DIA מבוסס ספריה עדיין מספק תוצאות טובות יותר במונחים של כיסוי פרוטאום20.

פרוטוקול ההכנה לדוגמה המתואר כאן (איור 1) מורכב מהשלבים הבאים: שלב צנטריפוגה (להסרת פסולת תאים), עיכול FASP, טיהור StageTip21, כימות חלבונים וניתוח DIA. פרוטוקול זה תוכנן לניתוח של EPS-שתן בהקשר של גילוי סמן ביולוגי סרטן הערמונית, אבל זה יכול להיות מיושם על ניתוח פרוטאומי של כל דגימת שתן.

Protocol

המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של אוניברסיטת מגנה גרציה בקטנזרו, RP 41/2018. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המטופלים שנרשמו למחקר.

1. הכנה לדוגמה

  1. דגימות שתן EPS צנטריפוגה בתוך 2 שעות של איסוף ב 2,100 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). אחסן את supernatant ב -80 מעלות צלזיוס עד השימוש.

2. הפשרה לדוגמה

  1. מעבירים את הדגימה מ-80°C ל-20°C יום לפני העיכול.
  2. לפני עיבוד מדגם, להעביר את המדגם במשך 15-20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן ב RT.

3. הכנה ריאגנטית ל- FASP

  1. באותו יום, להכין את הפתרונות הבאים: מאגר אוריאה, 50 mM iodoacetamide (IAA) במאגר אוריאה, 50 mM טריאתילמוניום ביקרבונט ו 500 מ"מ דיתיוטריטול (DTT).
  2. הכן חיץ אוריאה (אוריאה 8 M, 100 mM Tris-HCl pH 8): עבור 10 מ"ל, לשקול 4,800 מ"ג של אוריאה ולהמיס אותו בכמות המתאימה של מים HPLC לאחר הוספת 1 מ"ל של 1 M Tris pH 8. נפח של 800 μL של אוריאה יש צורך עבור כל מדגם.
  3. הכן 500 מ"מ dithiothreitol (DTT): להמיס 38.5 מ"ג של DTT ב 500 μL של מים HPLC. עבור כל מדגם, 66.7 μL של DTT נדרשים.
  4. הכן 50 מ"מ IAA במאגר אוריאה: להמיס 9.25 מ"ג של IAA ב 1 מ"ל של מאגר אוריאה. עבור כל מדגם יש צורך ב-50 μL של רשות העתיקות.
  5. הכן 50 מ"מ טריאתילמוניום ביקרבונט (TEAB). הוסף 150 μL של 1 M TEAB ל 2.85 מ"ל של מים HPLC. עבור כל מדגם 460 μL של TEAB נדרשים.
  6. הכן פתרון של טריפסין (100 ng/μL) במים HPLC. פתרון זה יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס ומופשר מיד לפני השימוש. עבור כל מדגם, 2 μL (200 ng) יש צורך.

4. עיכול חלבונים על ידי FASP

  1. לדלל 500 μL של כל דגימת שתן EPS עם 66.7 μL של 10% (w / v) נתרן דודקיל סולפט (SDS), 66.7 μL של 500 מ"מ DTT ו 33.3 μL של 1 M Tris pH 8 כדי לסלוביל חלבונים ולהפחית אג"ח דיסולפיד. דגירה 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס עם טלטול עדין.
  2. הוסף 300 μL של דגימת שתן EPS מדולל על יחידת המסנן (10 kDa) וצנטריפוגה ב 14,000 x g במשך 20 דקות.
  3. הוסף 200 μL של מאגר אוריאה למסנן וצנטריפוגה ב 14,000 x g במשך 15 דקות. חזור על שלב זה ולאחר מכן בטל את הזרימה.
  4. הוסף 50 μL של פתרון IAA וצנטריפוגה ב 6,000 x g במשך 25 דקות.
  5. הוסף 200 μL של מאגר אוריאה וצנטריפוגה ב 14,000 x g במשך 20 דקות. חזור על שלב זה ולאחר מכן בטל את הזרימה.
  6. הוסף 200 μL של 50 מ"מ טריאתילמוניום ביקרבונט מאגר (TEAB) וצנטריפוגה ב 14,000 x גרם במשך 20 דקות. חזור על שלב זה.
  7. העבר את יחידת הסינון לצינור איסוף חדש.
  8. הוסף 60 μL של חיץ 50 מ"מ TEAB ו 200 ng של טריפסין ולהדגיר את המדגם תרמו-מערבל ב 37 °C (67 °F) לילה.
    הערה: כדי למנוע אידוי מדגם במהלך הדגירה בלילה, לעטוף כל יחידת מסנן עם שכבה של רדיד אלומיניום ולאחר מכן שכבה של parafilm.
  9. לאחר הדגירה טריפסין, להוסיף 140 μL של מים צנטריפוגה הבקבוקון ב 14,000 x g במשך 25 דקות כדי לאסוף את נפח העיכול (180-200 μL).

5. הכנה ריאגנטית לטיהור SCX

  1. הכן 1 מ"ל של לשטוף 1 (0.5% חומצה פורמית (FA) ו 20% אצטוניטריל (ACN)) כדלקמן: להוסיף 50 μL של 10% FA ו 200 μL של 100% ACN ל 750 μL של מי HLPC. עבור כל מדגם, 100 μL של לשטוף 1 נדרשים.
  2. הכן 1.5 מ"ל של לשטוף 2 (0.5% FA ו 80% של ACN) כדלקמן: להוסיף 75 μL של 10 % FA ו 1.2 מ"ל של 100% ACN ל 225 μL של מים HPLC. עבור כל מדגם 190 μL של לשטוף 2 יש צורך.
  3. הכן 100 μL של פתרון eluting (500 מ"מ אמוניום אצטט (AA) ו 20% של ACN): להוסיף 25 μL של 2 M AA ו 20 μL של 100% ACN ל 55 μL של מים HPLC.
  4. הכן תיאורי שלב באופן הבא.
    1. לארוז קצה פיפטה 200 μL עם שכבה של שרף SCX באמצעות מחט מזרק קהה הסתיים (מד 16). הכנס את תיאור StageTip למכסה מיקרוצנטריפוגה שנוקב בעבר כדי להתאים למיקרוקולום.
    2. להרכיב את המכסה על microcentrifuge 2 מ"ל שממנו הוסר המכסה המקורי. המכשיר הצנטריפוגלי מיקרו SPE רק התאספו צריך להתאים לתוך צנטריפוגה ספסל. מאז מכסים מחוררים הם מייגעים להכין, הם יכולים להיות מנוצלים מספר פעמים.

6. טיהור SCX

  1. לדלל 30 μL של כל מדגם ל 120 μL באמצעות לשטוף 2.
  2. מצב StageTip על ידי הוספת 50 μL של לשטוף 1 על גבי שרף החילוץ צנטריפוגה ב 400 x g במשך 2 דקות. מאז התנגדות זרימה תלויה כמה חזק את שאריות החילוץ היה ארוז לתוך קצה פיפטה, מהירות צנטריפוגה ייתכן שיהיה צורך להתאים על מנת לקבל קצב זרימה של 20-30 μL / min. נסו לא להשאיר את הקצה יבש במהלך הטעינה והכביסה לדוגמה.
  3. השווה את StageTip עם 50 μL של לשטוף 2 וצנטריפוגה ב 400 x g במשך 2 דקות.
  4. טען את המדגם המדולל (120 μL) באמצעות מהירות סיבוב נמוכה יותר.
  5. לשטוף את StageTip עם 50 μL של לשטוף 2 וצנטריפוגה ב 400 x g במשך 2 דקות. חוזרים על הפעולה עם 50 μL של שטיפה 1.
    הערה: לאחר שטיפה זו, על השפך להיות יבש לחלוטין.
  6. תערובת פפטיד Elute עם 7 μL של פתרון eluate (500 מ"מ אמוניום אצטט (AA) ו 20% של ACN) לאט באמצעות מהירות סיבוב נמוכה יותר.
  7. הוסף 27 μL של 0.1% FA כדי לדלל AA ולקבל מדגם עבור הזרקה ראשונית LC-MS/MS. הדילול הסופי ל 34 μL יגרום יחס נפחי 1:1 בין שתן ותמיסת פפטיד (1 μL של תקציר מטוהר יתאים 1 μL של דגימת שתן מקורית).

7. כימות חלבונים לפי תקן חיצוני באמצעות ניתוח DDA (איור 2)

  1. לקבוע את כמות החלבון בדגימות על ידי הזרקת 2 μL של תקציר פפטיד וכתוצאה מכך LC-MS/ MS ואינטרפולציה של האזור הכולל פפטיד וכתוצאה מכך עם עקומת כיול בנוי כדלקמן:
  2. הכן חמישה פתרונות תקציר HeLa שונים (1 ng / μL, 2.5 ng / μL, 7.5 ng / μL, 25 ng / μL, 75 ng / μL) באמצעות מלאי עיכול HeLa (100 מיקרוגרם / μL).
  3. להזריק כל פתרון הלה כפול (2 μL).
  4. הגדר את פעולת השירות LC-MS/MS.
    1. להזריק 2 μL של חמש תערובות פפטיד HeLa ופפטידים נפרדים דרך שיפוע ליניארי של 75 דקות בקצב זרימה של 230 nL / דקה על 15 ס"מ, 75 מיקרומטר i.d עמודה ארוז עם 3 חלקיקי סיליקה C18 מיקרומטר. השתמש במעבר צבע בינארי המהווה את השלב הנייד A (0.1% FA, 2% ACN) ובשלב B נייד (0.1% FA ו- 80% של ACN).
    2. בצע התרוממות צבע הדרגתית על-ידי הגדלת התוכן של שלב B לנייד מ- 6% ל- 42% ב- 60 דקות ומ- 42% ל- 100% ב- 8 דקות נוספות. לשמור במשך 5 דקות 100% B ולאחר מכן לחזור 0% B בשתי דקות.
    3. לפעול במצב DDA באמצעות שיטת העליון 12 ולהגדיר טווח סריקה מלאה MS ב 350-1800 m/z, רזולוציה 70,000, יעד ACG 1e6 וזמן הזרקה מרבי 50 ms. הגדר את חלון המסה לבידוד יון מבשר ב 1.6 m/z, רזולוציה 35,000, יעד ACG 1e5, זמן הזרקה מרבי 120 ms, פיצול HCD ב 25 NCE (אנרגיית התנגשות מנורמלת) והדרה דינמית 15 שניות.
  5. נתח קבצים גולמיים באמצעות Sequest כמנוע חיפוש, ואת רצף החלבון המלא של UNiprot של האדם כמסד הנתונים. בניסויים שהוצגו כאן, המאגר הורד במרץ 2016 והכיל 42.013 רצפים.
    1. השתמש בהגדרות הבאות: עמידות בפני MS 15 עמודים לדקה, עמידות MS/MS 0.02 Da, טריפסין כאנזים על-ידי הגדרת שני אתרי מחשוף שלא נענו. הגדר את carbamidomethylation של ליצין, סרין, threonine, טירוסין (+57.021) ואת החמצון של מתיונינים כמו שינויים דינמיים קרבמידומתילציה של ציסטאינים (+57.021) כמו שינויים סטטיים. השתמש בחיתוך של שיעור גילוי כוזב (FDR) לזיהוי פפטידים וחלבונים ל- 0.01 וסנן לפי פרקולטור.
    2. חשב את אזור השיא עבור כל אותות הפפטיד של MS1. חשב את האזור הכולל של הפפטידים.
  6. להזריק 2 μL של תערובות פפטיד המתקבל דגימות שתן EPS באמצעות אותה שיטה LC-MS/ MS המשמש עבור דגימות HeLa ולנתח את הקובץ גלם באמצעות אותם פרמטרים המשמשים לעיבוד נתונים HeLa.
  7. חשב את העוצמה הכוללת של אותות פפטיד על-ידי סיכום ערכי האזור של כל הפפטידים שזוהו ואינטרפולציית העקומה הסטנדרטית החיצונית. זה יספק הערכה מקובלת של כמות פפטיד נוכח בעיכול חלבון שתן EPS.

8. הכנה ריאגנטית לפרוטוקול תיאור שלב C18

  1. הכן 500 μL של פתרון A (0.1% חומצה Trifluoroacetic (TFA), 50% ACN): להוסיף 250 μL של 100% ACN ו 10 μL של 5% TFA ל 240 μL של מים HPLC.
  2. הכן 2 מ"ל של פתרון B (0.1 % TFA): להוסיף 40 μL של 5% TFA ל 1960 μL של מים HPLC.
  3. הכן 100 μL של פתרון eluting (0.1% FA, 50% ACN): להוסיף 1 μL של 10% FA ו 50 μL של 100% ACN ל 49 μL של מים HPLC.
  4. הכן תיאורי שלב כמתואר לעיל. במקרה זה, נעשה שימוש בדיסקי חילוץ C18.

9. פרוטוקול תיאור שלב SCX/C18

הערה: לטהר EPS-שתן תקצירים על ידי פרוטוקול C18 StageTip כדי להסיר מלחים.

  1. התחל מ 2 מיקרוגרם של פפטידים (כפי שכמת על ידי הזריקה הראשונית). לדלל את פתרון העיכול פי 4 בכביסה 2 SCX ולהמשיך כמתואר לעיל (בסעיף "SCX טיהור"). אלוט את תערובת פפטיד עם 7 μL של פתרון eluate (500 מ"מ אמוניום אצטט (AA) ו 20% של ACN) לאט באמצעות מהירות סיבוב נמוכה יותר (5 μL / קצב זרימה דקה).
  2. חומצי SCX eluate עם 150 μL של 0.1% של חומצה trifluoroacetic (TFA) על מנת להשיג pH נמוך מ 3 וריכוז של ממס אורגני מתחת 5%.
  3. התנה את תיאור שלב C18 עם 50 μL של פתרון A וצנטריפוגה ב 400 x g במשך 2 דקות. שיווי משקל C18 StageTip עם 50 μL של פתרון B וצנטריפוגה ב 400 x g במשך 2 דקות.
  4. טען את הדגימה על קצה הבמה באיטיות באמצעות מהירות סיבוב נמוכה יותר.
  5. לשטוף C18 שלבTip עם 50 μL של פתרון B וצנטריפוגה.
  6. לאט לאט להפוך את תערובת פפטיד עם 10 μL של פתרון elution באמצעות מהירות סיבוב נמוכה יותר.
  7. יבש את eluate (10 μL) ב 30 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה ואקום במשך 3 דקות. הוסף 47 μL של 0.1% FA. ריכוז פפטיד צפוי יהיה 40 ng / μL. לנתח על ידי LC-MS / MS במצב DIA.

10. ניתוח DIA (איור 3)

  1. הפרדה nanoLC: להפריד את תערובת פפטיד באמצעות שיפוע ליניארי של 140 דקות בקצב זרימה של 230 nL / min על 15 ס"מ, 75 μm מזהה עמודה ארוז עם 3 מיקרומטר C18 חלקיקי סיליקה.
    1. בצע האצה הדרגתית בקצב זרימה של 230 nL/minute והגדל את תוכן שלב B הנייד מ- 3% ל- 25% ב- 90 דקות, לאחר מכן מ- 25% ל- 40% ב- 30 דקות ולבסוף מ- 40% ל- 100% ב- 8 דקות.
    2. לאחר 10 דקות ב- 100% B, השווה את העמודה עם שלב A נייד למשך 15 דקות.
  2. פרמטרים ספקטרומטריים של מסה: בצע ניתוח DIA בשיטה המשתמשת במחזור הסריקה הבא: (i) אירוע סריקה MS מלא ברזולוציה של 17,500 (יעד AGC 1e6, זמן הזרקה מרבי 50 אלפיות השנייה) ואחריו (ii) 20 חלונות ברוחב בידוד של 20 מ"מ/שנייה, החל מ- m/z 350, (ii) 5 חלונות ברוחב בידוד של 50 מ'/ת וחלון אחד ברוחב בידוד של 200 מ'/5, המסיים את טווח הסריקה של DIA ב- 1200 m/z. בצע סריקות DIA ברזולוציה 35,000 (יעד AGC 5e5, זמן הזרקה מרבי 120 אלפיות השנייה ו- 25 NCE).

11. pH גבוה הפוך שלב C18 שבר עבור יצירת ספרייה

הערה: מאגר EPS-שתן נציג דגימות בכמות גבוהה מ 10 מיקרוגרם על מנת לבנות ספריה תלוית נתונים לניתוח DIA על ידי ההליך הבא:

  1. חומצי את תערובת פפטיד (11 מיקרוגרם) על ידי 0.2% של TFA ולטעון את הפתרון וכתוצאה מכך על C18 StageTip ארוז עם שתי שכבות של דיסקים החילוץ כדי לאפשר קיבולת גבוהה יותר. הערכנו את קיבולת הטעינה של דיסק מיקרו יחיד (ממחט מזרק 16 מד) להיות בטווח 5-10 מיקרוגרם.
  2. מצב ושלב נייח שיווי משקל כפי שכבר תואר עבור טיהור C18.
  3. לבצע שבר פפטיד על ידי elution stepwise (n = 10) מ pH גבוה הפוך שלב C18 באמצעות פתרונות elution המכילים 0.2% של אמוניום הידרוקסיד, 10 מ"מ TEAB, והגדלת v / v ריכוזים של ACN (4%, 8%, 12%, 16%, 20%, 24%, 28%, 32%, 40%, 80%).
  4. נתח את 10 השברים באמצעות אותם פרמטרים כרומטוגרפיים של שיטת DIA. הפעל את ספקטרומטר המסה במצב DDA באמצעות ההגדרות שאומצו בעבר לניתוח הראשוני (ראה "כימות חלבונים לפי תקן חיצוני באמצעות ניתוח DDA").

12. ניתוח נתונים

  1. צור את הספרייה הספקטרלית על-ידי ייבוא תוצאות זיהוי החלבון המתקבלות מניסויי DDA LC-MS/MS של שבר שלב C18 הפוך גבוה בתוכנה המוקדשת לניתוח DIA.
  2. הגדר את המספר המינימלי והמקסימלי של יוני שבר המשמשים לזיהוי וכימות ל- 3 ו- 6, בהתאמה. סנן את התוצאות שהתקבלו לפי ערך Q של 0.01.
  3. יבא קבצי DIA גולמיים ושייך לכל קובץ גולמי את אותו קובץ FASTA המשמש ליצירת הספריה הספקטרלית.
  4. הגדר את המספר המינימלי והמקסימלי של פפטידים ייחודיים המשמשים לכימות חלבונים ל- 1 ו- 10, בהתאמה.
  5. חשב את העוצמה עבור כל חלבון על-ידי סיכום אזור שיא יון שבר.
  6. צור מטריצה בעוצמה של החלבונים מכמתים בכל מדגם.

Representative Results

פרוטוקול זה לניתוח פרוטאומי של השתן כולל את השלבים הבאים: עיכול FASP, הערכת כמות החלבון באמצעות כיול סטנדרטי חיצוני, טיהור כפול של StageTip (SCX ו- C18),וניתוח LC-MS/MS במצב DIA.

לאחר עיכול החלבון, זריקות ראשוניות מבוצעות לאחר טיהור StageTip SCX של הפפטידים וכתוצאה מכך. LC-MS / MS קבצים גולמיים מעובדים כדי להשיג את מספר פפטידים מזוהים, מספר החלבונים שזוהו ואת האזור של פפטידים שזוהו. האזור הכולל המתקבל על ידי סיכום כל הפפטידים שזוהו משמש להערכת תכולת החלבון באמצעות אינטרפולציה לסטנדרט חיצוני: תקציר חלבון HeLa מוזרק בחמש כמויות שונות (2, 5, 15, 50, 150 ng, בהתאמה). כמות החלבון עבור שש הדגימות שנותחו במחקר זה השתנתה מדגם לדגימה, והראתה ערך ממוצע של 78 ng/μL.

לאחר הערכת חלבון, 2 מיקרוגרם של חלבונים מתעכלים מכל מדגם מטוהרים על ידי SCX רציף ו- C18 StageTip לפני ניתוח DIA. הספריה הספקטרלית לחיפוש נתוני DIA נוצרת לאחר שבר שלב הפוך ב- PH גבוה וניתוח DDA LC-MS/MS של מדגם מייצג (לדוגמה, מאגר לדוגמה). באמצעות הפרמטרים שתוארו לעיל, זיהינו וכימתנו, במצטבר, 2387 קבוצות חלבון בשש דגימות השתן EPS הנמצאות תחת שיקול(טבלה משלימה 1 ואיור 4).

על מנת להעריך מנקודת מבט איכותית את הרלוונטיות של רשימת החלבונים שזוהו וכומתו, הושווה המטריצה המתקבלת לרשימה של 624 חלבונים שזוהו בעבר ישירות- EPS22, מדגם שנאסף בהליך פולשני יותר, אשר הוכיח להיות מקור של סמנים ביולוגיים מעניינים לסרטן הערמונית מועמד. בסך הכל, 508 מתוך 624 חלבונים זוהו בהצלחה על ידי פרוטוקול FASP / DIA שלנו על שתן EPS.

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה פרוטאומית.

Figure 2
איור 2: ייצוג העיצוב הניסיוני שלנו לכימות חלבונים על בסיס תקן חיצוני (HeLa digest).

Figure 3
איור 3: שלבים מרכזיים בניתוח DIA: (i) פירוט של הספרייה הספקטרלית באמצעות שברים הפוכים של pH וניתוח DDA, (ii) ניתוח מדגם באמצעות גישת DIA, (iii) ניתוח נתונים על ידי ספקטרנוט. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: עלילה מדורגת לחלבוני EPS-שתן שזוהו. כמה להיטים נבחרים מסומנים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה 1: טבלה מייצגת של חלבונים מכמתים בשש דגימות שתן EPS בספקטרונוט. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

בעבודה זו, אסטרטגיה לניתוח דגימות שתן EPS מוצג. פרוטוקול FASP הוא הבחירה האידיאלית עבור פרוטאומיקה בדרכי השתן כי זה מאפשר ריכוז מדגם לפני עיכול אנזימטי. למעשה, באמצעות זרימת עבודה זו, כמה מאות microliters של שתן ניתן לטעון על מסנן אחד מעובד. יתר על כן, עיכול על מסנן מציע חופש יחסי בבחירת תנאי denaturation. בעבודתנו, דנטורציה של חלבונים מושגת על ידי דילול דגימות שתן במאגר המכיל Tris, SDS ו- DTT (ריכוז סופי: 50 mM Tris, 1% SDS, 50 mM DTT). חלבונים מתפרקים ביעילות מיד לאחר הפשרת המדגם, על מנת למנוע השפלה לא רצויה על ידי פרוטאזות פעילות. פרוטוקול FASP המקורי שופר על ידי הגדלת נפח השטיפות מ 100 μL ל 200 μL. בדרך זו, הסרה טובה יותר של שאריות, במיוחד חומרי ניקוי מהמסנן, מושגת.

לאחר עיכול אנזימטי, הערכת חלבון על ידי תקן חיצוני באמצעות LC-MS/MS מהיר, שיטה תלוית נתונים מבוצעת לפני השלבים האחרונים של הפרוטוקול, הכוללים טיהור StageTip כפול וניתוח LC-MS/MS במצב DIA, על חומר התחלה שווה עבור כל הדגימות (2 מיקרוגרם).

הרבגוניות של FASP משויכת לגישת DIA, שיטה רגישה המספקת מספר נמוך של ערכים חסרים17. בעבודתנו, 2387 חלבונים זוהו וכומתו, ובכך אפשרו ציור פרופיל פרוטאומי מפורט של שתן EPS. הזיהוי והכימות של 2387 חלבונים התאפשרו באמצעות יצירת ספרייה ספקטרלית עשירה, שהושגה באמצעות שבר פפטידים הפוך ב- pH גבוה, ועל ידי שיטת ה- DIA שלנו, המכוונת לטווח מבשר m/z רחב. זרימת עבודה זו זיהתה מעל 80% מהחלבונים שנמצאו בעבר בניתוח ישיר-EPS, המוכיחים כי חלק ניכר של פרוטאום EPS-שתן אכן נגזר הפרשות הערמונית לידי ביטוי, ולכן הוא מקור עשיר של חלבונים ספציפיים לרקמת הערמונית26.

לסיכום, העיצוב הניסיוני שלנו משלב את הרבגוניות של FASP עם הרגישות של DIA על מנת להשיג מפה עשירה של פרוטאום השתן. אסטרטגיה זו מומלצת לניתוח דגימות שתן EPS, אך ניתן להרחיב את השימוש בה לפרוטאומיות בדרכי השתן באופן כללי, או אפילו לסוגי מדגם אחרים.

Disclosures

כל המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי MIUR (שר אוניברסיטת רייסרקה, PRIN 2017 ל MG) ועל ידי POR קלבריה FESR 2014-2020, פעולה 1.2.2, "INNOPROST".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M Tris HCL pH 8.0 Lonza 51238
2-iodoacetamide for synthesis Merck 8047440100
Acetonitrile for HPLC LC-MS grade VWR 83640.290
Ammonium acetate Fluka 9690
ammonium hydroxide solution Sigma 30501
ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water Merck 318612-500ML
Dithiothreitol Amresco 0281-25G
Empore Cation 47mm Extraction Disks Microcolumn 2251
Empore Disk C18 Varian 12145004
Formic acid optima Fisher Scientific A117-50
Hela Protein Digest Standard Fisher Scientific 88329
Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane MERCK MRCPRT010
sodium dodecyl sulfate solution Merck 71736-500ML
Thiethylammonium bicarbonate buffer Merck T7408-100ML
trifluoroacetic acid Riedel-de Haën 34957
Trypsin from porcine pancreas Merck T6567-1MG
Urea Merck U6504-500G
Water HPLC gradient grade Fisher Scientific W/0106/17
Proteome Discoverer 1,4 Thermo Fisher Scientific
Spectronaut 14.0 Biognosys

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hüttenhain, R., Soste, M., Selevsek, N., et al. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics. Sci Transl Med. 4 (142), 10 (2013).
  2. Roobol, M. J., Carlsson, S. V. Risk stratification in prostate cancer screening. Nature Reviews Urology. 10 (1), 38-48 (2013).
  3. Principe, S., et al. Identification of prostate-enriched proteins by in-depth proteomic analyses of expressed prostatic secretions in urine. Journal of Proteome Research. 11 (4), 2386-2396 (2012).
  4. Kim, Y., et al. Targeted proteomics identifies liquid-biopsy signatures for extracapsular prostate cancer. Nature Communications. 7, 1-10 (2016).
  5. Drake, R. R., et al. Clinical collection and protein properties of expressed prostatic secretions as a source for biomarkers of prostatic disease. Journal of Proteomics. 72 (6), 907-917 (2009).
  6. Macklin, A., Khan, S., Kislinger, T. Recent advances in mass spectrometry based clinical proteomics: Applications to cancer research. Clinical Proteomics. 17 (1), 1-25 (2020).
  7. Berger, S. T., et al. MStern blotting-high throughput polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane-based proteomic sample preparation for 96-well plates. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (10), 2814-2823 (2015).
  8. Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. Proteomics. 14 (9), 1006 (2014).
  9. Hughes, C. S., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).
  10. Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells. Nature Methods. 11 (3), 319-324 (2014).
  11. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  12. Ding, H., et al. Urine Proteomics: Evaluation of Different Sample Preparation Workflows for Quantitative, Reproducible, and Improved Depth of Analysis. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1857-1862 (2020).
  13. Zhao, M., et al. A comprehensive analysis and annotation of human normal urinary proteome. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  14. Wiśniewski, J. R. Quantitative Evaluation of Filter Aided Sample Preparation (FASP) and Multienzyme Digestion FASP Protocols. Analytical Chemistry. 88 (10), 5438-5443 (2016).
  15. Wiśniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method. Analytical Biochemistry. 410 (2), 307-309 (2011).
  16. Yu, Y., et al. Urine sample preparation in 96-well filter plates for quantitative clinical proteomics. Analytical Chemistry. 86 (11), (2014).
  17. Gillet, L. C., et al. Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: A new concept for consistent and accurate proteome analysis. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (6), 1-17 (2012).
  18. Liu, Y., Hüttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. Mass spectrometric protein maps for biomarker discovery and clinical research. Expert Review of Molecular Diagnostics. 13 (8), 811-825 (2013).
  19. Gallien, S., Duriez, E., Demeure, K., Domon, B. Selectivity of LC-MS/MS analysis: Implication for proteomics experiments. Journal of Proteomics. 81, 148-158 (2013).
  20. Muntel, J., et al. Advancing Urinary Protein Biomarker Discovery by Data-Independent Acquisition on a Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer. Journal of Proteome Research. 14 (11), 4752-4762 (2015).
  21. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  22. Kim, Y., et al. Identification of Differentially Expressed Proteins in Direct Expressed Prostatic Secretions of Men with Organ-confined Versus Extracapsular Prostate Cancer. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1870-1884 (2012).
  23. Decramer, S., et al. Urine in clinical proteomics. Molecular and Cellular Proteomics. 7 (10), 1850-1862 (2008).
  24. Thongboonkerd, V. Practical points in urinary proteomics. Journal of Proteome Research. 6 (10), 3881-3890 (2007).
  25. Konvalinka, A., Scholey, J. W., Diamandis, E. P. Searching for new biomarkers of renal diseases through proteomics. Clinical Chemistry. 58 (2), 353-365 (2012).
  26. Drake, R. R., et al. In-Depth Proteomic Analyses of Direct Expressed Prostatic Secretions. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2109-2116 (2010).

Tags

ביוכימיה גיליון 171
פרופיל פרוטאומי של EPS-שתן באמצעות עיכול FASP וניתוח נתונים עצמאיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prestagiacomo, L. E., Gabriele, C.,… More

Prestagiacomo, L. E., Gabriele, C., Morelli, P., Rota, M. A., Alba, S., Cuda, G., Damiano, R., Gaspari, M. Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis. J. Vis. Exp. (171), e62512, doi:10.3791/62512 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter