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Biochemistry

FASP पाचन और डेटा-स्वतंत्र विश्लेषण के माध्यम से ईपीएस-मूत्र का प्रोटेओमिक प्रोफाइल

Published: May 8, 2021 doi: 10.3791/62512
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 1, 4, 1
1Research Centre for Advanced Biochemistry and Molecular Biology, Department of Experimental and Clinical Medicine, Magna Graecia University of Catanzaro, 2Department of Health Science, Magna Graecia University of Catanzaro, 3Romolo Hospital, 4Department of Experimental and Clinical Medicine, Magna Graecia University of Catanzaro

Summary

यहां, हम निम्नलिखित के बारे में विस्तृत जानकारी के साथ एक अनुकूलित ऑन-फिल्टर पाचन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं: प्रोटीन पाचन, पेप्टाइड शुद्धिकरण और डेटा स्वतंत्र अधिग्रहण विश्लेषण। यह रणनीति व्यक्त प्रोस्थेटिक स्राव-मूत्र नमूनों के विश्लेषण पर लागू होती है और उच्च प्रोटेम कवरेज और मूत्र प्रोटेम के कम लापता मूल्य लेबल-मुक्त प्रोफाइलिंग की अनुमति देती है।

Abstract

फ़िल्टर-एडेड नमूना प्रोटोकॉल (एफएएसपी) का व्यापक रूप से प्रोटेओमिक्स नमूना तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है क्योंकि यह पतला नमूनों को ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है और यह विभिन्न प्रकार के डिटर्जेंट के साथ संगत है। एफएएसपी जैसे बॉटम-अप प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो तेजी से डेटा-स्वतंत्र विश्लेषण (डीआईए) मोड में किए गए एलसी-एमएस/एमएस तरीकों पर भरोसा करते हैं, एक स्कैनिंग विधि जो डीप प्रोटेम कवरेज और लापता मूल्यों की कम घटनाओं की अनुमति देती है।

इस रिपोर्ट में, हम एक कार्यप्रवाह का विवरण प्रदान करेंगे जो मूत्र प्रोटेम मैपिंग के लिए व्यास मोड में एफएएसपी प्रोटोकॉल, एक डबल स्टेजटिप शुद्धिकरण कदम और एलसी-एमएस/एमएस को जोड़ती है । एक मॉडल नमूने के रूप में, हमने व्यक्त प्रोस्थेटिक स्राव (ईपीएस) का विश्लेषण किया, जो डिजिटल गुदा परीक्षा (डीआरई) के बाद एकत्र किया गया एक नमूना है, जो प्रोस्टेट कैंसर बायोमार्कर खोज अध्ययनों में रुचि रखता है।

Introduction

प्रोटेओमिक प्रौद्योगिकियों के निरंतर विकास के लिए रोग निदान और ऊतकों और biofluids जैसे नमूनों की एक विस्तृत विविधता में मौजूद प्रमुख आणविक प्रभावकों के उच्च संकल्प नक्शे प्रदान करके उपचार के लिए प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी की मदद करने में काफी प्रभाव पड़ने का वादा किया है । विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण से, मूत्र संग्रह में आसानी और दूसरों के संबंध में प्रोटेम की प्रमुख स्थिरता जैसे कई फायदे प्रदान करता है बायोफ्लुइड1। मूत्र का प्रोटेओमिक विश्लेषण मूत्र रोगों के कैंसर पर बायोमार्कर खोज अध्ययन में विशेष रुचि रखता है, क्योंकि यह ब्याज2के ऊतकों के निकट गैर-विकासात्मक नमूने की अनुमति देता है। विशेष रूप से, एक नमूना जो प्रोस्टेट से संबंधित विकृतियों का अध्ययन करने के लिए आशाजनक प्रतीत होता है, ईपीएस-मूत्र3,4 (यानी, एक डिजिटल गुदा परीक्षा (DRE) के बाद एकत्र किया गया मूत्र नमूना है। नमूना संग्रह से पहले यह उत्तरार्द्ध ऑपरेशन प्रोस्टेट विशिष्ट प्रोटीन के साथ मूत्र को समृद्ध करता है। ईपीएस-मूत्र प्रोस्टेट कैंसर (पीसीए) सहित प्रोस्टेट ग्रंथि5 से संबंधित विकारों की जांच करने के लिए एक अच्छा उम्मीदवार है, क्योंकि ड्रे के माध्यम से, ट्यूमर द्वारा स्रावित प्रोटीन मूत्र नमूने में डाला जा सकता है, जिससे कैंसर ऊतक-विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने की संभावना बढ़ जाती है।

संभावित प्रोटीन बायोमार्कर का पता लगाने और मात्राकरण की अनुमति देने में एक महत्वपूर्ण भूमिका मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) द्वारा निभाई जाती है। पिछले दो दशकों में, प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए एमएस आधारित प्रोटोकॉल ने एमएस इंस्ट्रूमेंटेशन में निरंतर सुधार और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर6में निरंतर सुधार के लिए एक एलसी-एमएस/एमएस रन में प्रोटीन की बढ़ती संख्या का पता लगाने की अनुमति दी है ।

एमएस-आधारित प्रोटेओमिक नमूना तैयारी में आम तौर पर प्रोटीन मिश्रण का एंजाइमेटिक पाचन शामिल होता है, जिसे विभिन्न प्रकार के प्रोटोकॉल के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है जैसे: इन-सॉल्यूशन पाचन, एमएसस्टर्न ब्लॉटिंग7,सस्पेंशन ट्रैपिंग (एस-ट्रैप)8,सॉलिड-फेज-एन्हांस्ड सैंपल तैयारी (एसपी 3)9,इन-स्टेजटिप पाचन10 और फ़िल्टर एडेड सैंपल तैयारी (एफएएसपी)11. सभी प्रोटोकॉल मूत्र प्रोटेओमिक्स के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, भले ही परिणाम पहचाने गए प्रोटीन और पेप्टाइड्स की संख्या और प्रजननक्षमता 12के संदर्भ में भिन्न हो सकते हैं।

इस काम में हमारा ध्यान एफएएसपी प्रोटोकॉल द्वारा ईपीएस-यूरिन के विश्लेषण पर केंद्रित था । FASP प्रोटोकॉल मूल रूप से ऊतकों और सेल संस्कृतियों से निकाले गए प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, लेकिन इसके उपयोग को मूत्र13जैसे अन्य नमूना प्रकारों के विश्लेषण में विस्तारित किया गया था। सरल इन-सॉल्यूशन पाचन के संबंध में एफएएसपी एक अधिक लचीला प्रोटेओमिक दृष्टिकोण14है, क्योंकि एंजाइमेटिक पाचन15से पहले प्रोटीन मिश्रण से डिटर्जेंट और अन्य संदूषकों जैसे कि नमकों को प्रभावी ढंग से हटाने के द्वारा, यह इष्टतम प्रोटीन घुलनशीलता स्थितियों के विकल्प की अनुमति देता है। इसके अलावा, FASP की एक अतिरिक्त विशेषता यह है कि यह नमूना एकाग्रता के लिए एक साधन प्रदान करता है। यह मूत्र प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए विशेष रुचि है, क्योंकि यह अपेक्षाकृत बड़े नमूना संस्करणों (सैकड़ों माइक्रोलीटर) से शुरू करने की अनुमति देता है। एफएएसपी प्रोटोकॉल की क्षमता के आलोक में, कई अध्ययनों ने प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करने और समानांतर16में नमूनों की एक ऊंचा संख्या को संसाधित करने के उद्देश्य से कार्यप्रवाह स्वचालन पर ध्यान केंद्रित किया है।

हमारे वर्कफ़्लो में, एफएएसपी के बाद डेटा-स्वतंत्र विश्लेषण (डीआईए) में एलसी-एमएस/एमएस अधिग्रहण किया जाता है, जो उच्च प्रोटेम कवरेज, अच्छी मात्रात्मक परिशुद्धता और लापता मूल्यों की कम घटना प्रदान करता है । व्यास दृष्टिकोण एक संवेदनशील तरीका है जहां सभी आयनों एमएस/एमएस घटनाओं के लिए चुना जाता है, क्या डेटा पर निर्भर विश्लेषण (डीडीए) में होता है के विपरीत जहां केवल उच्चतम तीव्रता के साथ आयनों खंडित हैं । बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर, व्यास मोड में काम कर रहा है, पूरे एम/जेड अग्रदूत रेंज को कवर करने के लिए विभिन्न अलगाव चौड़ाई के साथ स्कैन चक्र करता है । यह दृष्टिकोण प्रति यूनिट समय पेप्टाइड्स की एक उच्च संख्या का पुन: पता लगाने की अनुमति देता है, जो नमूना17का प्रोटेओमिक्स स्नैपशॉट प्रदान करता है। इसके अलावा, डीआईए द्वारा उत्पन्न डेटा में एक और दिलचस्प विशेषता है: एक पोस्टरी विश्लेषण18की संभावना। डीआईए डेटा डीडीए द्वारा प्राप्त उन लोगों की तुलना में अधिक जटिल हैं, क्योंकि एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा व्यास परिणाम में प्रत्येक m/z विंडो19के भीतर कई अग्रदूत आयनों के सह-अलगाव से । एक स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी और डेटा विश्लेषण के लिए एक समर्पित सॉफ्टवेयर: दो मौलिक तत्वों का उपयोग करके समग्र एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा को अलग और विशिष्ट पेप्टाइड संकेतों में अलग-अलग रूप से प्राप्त किया जाता है। स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी एक डेटा-निर्भर प्रयोग द्वारा उत्पन्न होती है, जिसमें आमतौर पर प्रोटेम कवरेज को अधिकतम करने के लिए पेप्टाइड आंशिकता शामिल होती है, जो विचाराधीन नमूने में पेप्टाइड्स का पता लगाने योग्य हजारों प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित अग्रदूत आयनों और पेप्टाइड्स के एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा की एक सूची प्रदान करता है । डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर, इसके बजाय, स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी में निहित जानकारी का उपयोग विशिष्ट निकाले गए आयन क्रोमाटोग्राम उत्पन्न करके व्यास डेटा की व्याख्या करने के लिए करता है जो पेप्टाइड डिटेक्शन और क्वांटिफिकेशन की अनुमति देता है। जबकि पुस्तकालय मुक्त व्यास डेटा विश्लेषण अब संभव है, पुस्तकालय आधारित व्यास अभी भी प्रोटेम कवरेज20के मामले में बेहतर परिणाम प्रदान करता है ।

यहां नमूना तैयारी प्रोटोकॉल(चित्रा 1)में निम्नलिखित चरण शामिल हैं: एक अपकेंद्रित्र चरण (सेल मलबे को हटाने के लिए), एफएएसपी पाचन, स्टेजटिप शुद्धिकरण21,प्रोटीन और डीआईए विश्लेषण का मात्राकरण। इस प्रोटोकॉल को प्रोस्टेट कैंसर बायोमार्कर खोज के संदर्भ में ईपीएस-यूरिन के विश्लेषण के लिए डिजाइन किया गया है, लेकिन इसे किसी भी मूत्र नमूने के प्रोटेओमिक विश्लेषण पर लागू किया जा सकता है।

Protocol

इस अध्ययन को मैग्ना ग्रेसिया यूनिवर्सिटी ऑफ कैटनजारो की इंस्टीट्यूशनल एथिकल कमेटी आरपी 41/2018 ने मंजूरी दी थी । अध्ययन में नामांकित सभी रोगियों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई।

1. नमूना तैयार करना

  1. कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए 2,100 x g पर संग्रह के 2 घंटे के भीतर सेंट्रलाइज ईपीएस-मूत्र के नमूने। उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर सुपरनैंट स्टोर करें।

2. नमूना विगलन

  1. पाचन से एक दिन पहले नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस से -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें।
  2. नमूना प्रसंस्करण से पहले, नमूना को 4 डिग्री सेल्सियस पर 15-20 मिनट के लिए स्थानांतरित करें और फिर आरटी पर।

3. FASP के लिए अभिकर् ता तैयारी

  1. उसी दिन, निम्नलिखित समाधान तैयार करें: यूरिया बफर, यूरिया बफर में 50 एमएल इओडोएस्टाटामाइड (आईएए), 50 एमएम ट्राइथिलम्मोनियम बाइकार्बोनेट और 500 एमएल डिइयोथरेटोल (डीटीटी)।
  2. यूरिया बफर (यूरिया 8 एम, 100 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8): 10 एमएल के लिए 4,800 मिलीग्राम यूरिया का वजन करें और 1 एम ट्रिस पीएच 8 की 1 मिलीलड जोड़ने के बाद एचपीएलसी पानी की उचित मात्रा में घोलें। प्रत्येक नमूने के लिए यूरिया की 800 माइक्रोन की मात्रा की आवश्यकता होती है।
  3. 500 mM dithiothreitol (डीटीटी): एचपीएलसी पानी के 500 माइक्रोन में 38.5 मिलीग्राम डीटीटी घोलें। प्रत्येक नमूने के लिए, डीटीटी के 66.7 माइक्रोन की आवश्यकता है।
  4. यूरिया बफर में 50 mM आईएए तैयार करें: यूरिया बफर के 1 मिलीएल में 9.25 मिलीग्राम आईएए घोलें। प्रत्येक नमूने के लिए आईएए के 50 माइक्रोन की आवश्यकता होती है।
  5. 50 एमएम ट्राइथिलममोनियम बाइकार्बोनेट (टीईबी) तैयार करें। एचपीएलसी पानी के 2.85 एमएल में 1 एम टीईबी के 150 माइक्रोन जोड़ें। प्रत्येक नमूने के लिए टीईबी के 460 माइक्रोन की आवश्यकता है।
  6. एचपीएलसी पानी में ट्राइपसिन (100 एनजी/माइक्रोन) का घोल तैयार करें। इस समाधान को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और उपयोग से तुरंत पहले गल सकता है। प्रत्येक नमूने के लिए, 2 μL (200 एनजी) की आवश्यकता होती है।

4. FASP द्वारा प्रोटीन पाचन

  1. प्रत्येक ईपीएस-यूरिन नमूने का पतला 500 माइक्रोन 10% (w/v) सोडियम डॉडेक्सिल सल्फेट (एसडीएस) के 66.7 माइक्रोन के साथ, 500 एमएएम डीटी के 66.7 माइक्रोन और 1 एम ट्रिस पीएच 8 के 33.3 माइक्रोन प्रोटीन को सोलूबिलाइज करने और डिफ्यूलाइड बांड को कम करने के लिए। कोमल मिलाते हुए 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट इनक्यूबेट करें।
  2. फिल्टर यूनिट (10 केडीए) पर पतला ईपीएस-यूरिन सैंपल का 300 माइक्रोन और 20 मिनट के लिए 14,000 एक्स ग्राम पर सेंट्रलाइज जोड़ें।
  3. फिल्टर और अपकेंद्रित्र के लिए 15 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर यूरिया बफर के 200 μL जोड़ें। इस चरण को दोहराएं और फिर प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  4. 25 मिनट के लिए 6,000 x ग्राम पर आईएए समाधान और अपकेंद्रित्र के 50 माइक्रोल जोड़ें।
  5. 20 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर यूरिया बफर और सेंट्रलाइज के 200 माइक्रोल जोड़ें। इस चरण को दोहराएं और फिर प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  6. 20 मिनट के लिए 50 एमएम ट्राइथिलेलमेमोनियम बाइकार्बोनेट बफर (टीईबी) और सेंट्रलाइज के 200 माइक्रोल को 14,000 x ग्राम पर जोड़ें। इस कदम को दोहराएं।
  7. फिल्टर यूनिट को एक नए संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  8. 50 एमएम टीईबी बफर के 60 माइक्रोन और ट्राइपसिन के 200 एनजी जोड़ें और रात 37 डिग्री सेल्सियस पर थर्मो मिक्सर में सैंपल को इनक्यूबेट करें।
    नोट: रात भर इनक्यूबेशन के दौरान नमूना वाष्पीकरण से बचने के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी की एक परत के साथ प्रत्येक फिल्टर इकाई लपेटें और फिर पैराफिल्म की एक परत ।
  9. ट्रिप्सिन इनक्यूबेशन के बाद, डाइजेस्ट (180-200 माइक्रोन) की मात्रा एकत्र करने के लिए 25 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर 140 माइक्रोन पानी जोड़ें और शीशी को अपकेंद्रित्र करें।

5. एससीएक्स शुद्धिकरण के लिए रीएजेंट तैयारी

  1. वॉश 1 (0.5% फॉर्मिक एसिड (एफए) और 20% एसीटोनिट्रिल (एसीएन) के 1 मिलियन एमएलए तैयार करें) इस प्रकार है: 10% एफए के 50 माइक्रोन और 100% एसीएन के 200 माइक्रोन को एचएलपीसी पानी के 750 माइक्रोन जोड़ें। प्रत्येक नमूने के लिए, धोने 1 के 100 माइक्रोन की आवश्यकता होती है।
  2. वॉश 2 (0.5% एफए और एसीएन का 80%) के 1.5 एमएल तैयार करें: 10% एफए के 75 माइक्रोन और 100% एसीएन के 1.2 एमएल को एचपीएलसी पानी के 225 माइक्रोन जोड़ें। प्रत्येक नमूने के लिए 190 धोने के μL 2 की जरूरत है।
  3. एल्यूटिंग समाधान (500 mm अमोनियम एसीटेट (एए) और एसीएन के 20%) के 100 माइक्रोन तैयार करें: 2 एम एए के 25 माइक्रोन और 100% एसीएन के 20 माइक्रोन को एचपीएलसी पानी के 55 माइक्रोन जोड़ें।
  4. स्टेजटिप्स को इस प्रकार तैयार करें।
    1. कुंद-समाप्त सिरिंज सुई (गेज 16) का उपयोग करके एससीएक्स राल की एक परत के साथ 200 μL पिपेट टिप पैक करें। माइक्रोकॉल्यूमन को समायोजित करने के लिए पहले छेद किया गया है कि एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ढक्कन में StageTip डालें।
    2. ढक्कन को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज पर इकट्ठा करें जिसमें से मूल ढक्कन हटा दिया गया था। माइक्रो-एसपीई सेंट्रलाइज डिवाइस बस इकट्ठा एक बेंचटॉप अपकेंद्रित्र में फिट होना चाहिए । चूंकि छिद्रित ढक्कन तैयार करने के लिए थकाऊ हैं, इसलिए उनका कई बार उपयोग किया जा सकता है।

6. एससीएक्स शुद्धिकरण

  1. वॉश 2 का उपयोग करके प्रत्येक नमूने के 30 माइक्रोन को 120 माइक्रोन तक पतला करें।
  2. 2 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर निष्कर्षण राल और अपकेंद्रित्र के शीर्ष पर धोने 1 के 50 माइक्रोन जोड़कर स्टेजटिप को कंडीशन करें। चूंकि प्रवाह प्रतिरोध इस बात पर निर्भर करता है कि निष्कर्षण राल को पिपेट टिप में कितनी दृढ़ता से पैक किया गया था, इसलिए 20-30 माइक्रोन/मिनट की प्रवाह दर प्राप्त करने के लिए अपकेंद्रित्र गति को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। नमूना लोडिंग और धोने के दौरान टिप को सूखा न छोड़ने की कोशिश करें।
  3. स्टेजटिप को 50 माइक्रोन वॉश 2 और सेंट्रलाइज के साथ 2 मिनट के लिए 400 x g पर इक्विलिब्रेट करें।
  4. कम स्पिन गति का उपयोग करके पतला नमूना (120 माइक्रोल) लोड करें।
  5. स्टेजटिप को 2 मिनट के लिए 400 x g पर वॉश 2 और सेंट्रलाइज के 50 माइक्रोन के साथ धोएं। वॉश 1 के 50 माइक्रोल के साथ दोहराएं।
    नोट: इस धोने के बाद राल पूरी तरह से सूखा होना चाहिए।
  6. एल्यूट पेप्टाइड मिश्रण 7 माइक्रोन के साथ एलुएट समाधान (500 mm अमोनियम एसीटेट (एए) और एसीएन का 20%) धीरे-धीरे कम स्पिन गति का उपयोग करके।
  7. ए.ए. को पतला करने के लिए 0.1% एफए के 27 माइक्रोन जोड़ें और एलसी-एमएस/एमएस प्रारंभिक इंजेक्शन के लिए एक नमूना प्राप्त करने के लिए। 34 माइक्रोन के लिए अंतिम कमजोर पड़ने मूत्र और पेप्टाइड समाधान के बीच एक 1:1 मात्रात्मक अनुपात में परिणाम होगा (शुद्ध डाइजेस्ट के 1 μL मूल मूत्र नमूने के 1 μL के अनुरूप होगा) ।

7. डीडीए विश्लेषण का उपयोग कर बाहरी मानक द्वारा प्रोटीन मात्राकरण(चित्र 2)

  1. एलसी-एमएस/एमएस में परिणामी पेप्टाइड डाइजेस्ट के 2 माइक्रोन इंजेक्शन द्वारा नमूनों में प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करें और परिणामस्वरूप कुल पेप्टाइड क्षेत्र को अंशांकन वक्र के साथ इंटरपोलिंग करें जो इस प्रकार है:
  2. एक हेला डाइजेस्ट स्टॉक (१०० μg/μL) का उपयोग करके पांच अलग-अलग हेला डाइजेस्ट समाधान (1 एनजी/माइक्रोन, 2.5 एनजी/माइक्रोन, 7.5 एनजी/माइक्रोन, 25 एनजी/माइक्रोन, 75 एनजी/माइक्रोन) तैयार करें।
  3. प्रत्येक हेला समाधान को डुप्लिकेट (2 माइक्रोन) में इंजेक्ट करें।
  4. एलसी-एमएस/एमएस विधि निर्धारित करें।
    1. पांच हेला पेप्टाइड मिश्रण के 2 माइक्रोन इंजेक्ट करें और 15 सेमी, 75 माइक्रोन 18 सिलिका कणों से भरे कॉलम पर 230 एनएल/मिनट की प्रवाह दर पर 75 मिनट के रैखिक ढाल के माध्यम से अलग पेप्टाइड्स इंजेक्ट करें। मोबाइल चरण ए (0.1% एफए, 2% एसीएन) और मोबाइल चरण बी (0.1% एफए और 80% एसीएन) द्वारा गठित बाइनरी ग्रेडिएंट का उपयोग करें।
    2. 60 मिनट में मोबाइल फेज बी की सामग्री को 6% से बढ़ाकर 42% और अतिरिक्त 8 मिनट में 42% से 100% तक बढ़ाकर ढाल योग करें। 5 मिनट 100% बी के लिए बनाए रखें और फिर दो मिनट में 0% बी पर वापस चले जाएं।
    3. शीर्ष-12 विधि का उपयोग करके डीडीए मोड में काम करें और 350-1800 मीटर/जेड,संकल्प 70,000, एसीजी लक्ष्य 1e6 और अधिकतम इंजेक्शन समय 50 एमएस पर एमएस पूर्ण स्कैन रेंज निर्धारित करें। 1.6 m/z,संकल्प 35,000, एसीजी लक्ष्य 1e5, अधिकतम इंजेक्शन समय 120 एमएस, 25 NCE (सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा) और गतिशील अपवर्जन 15 सेकंड में HCD विखंडन पर अग्रदूत आयन अलगाव के लिए बड़े पैमाने पर खिड़की निर्धारित करें।
  5. खोज इंजन के रूप में अनुक्रम का उपयोग कर कच्ची फ़ाइलों का विश्लेषण करें, और डेटाबेस के रूप में मानव यूनिप्रॉट पूर्ण प्रोटीन अनुक्रम। यहां प्रस्तुत प्रयोगों में, डेटाबेस मार्च २०१६ को डाउनलोड किया गया था और ४२.०१३ दृश्यों निहित ।
    1. निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: एमएस सहिष्णुता 15 पीपीएम, एमएस/एमएस सहिष्णुता 0.02 डीए, दो छूटे हुए दरार साइटों को स्थापित करके एंजाइम के रूप में ट्राइपसिन। लिसिन, सेरीन, थ्रेन, टायरोसिन (+57.021) के कार्बामिडोमेथाइलेशन और मिथियोनिन के ऑक्सीकरण को गतिशील संशोधनों और सिस्टीन्स के कार्बामिडोमेथाइलेशन (+57.021) को स्थिर संशोधनों के रूप में सेट करें। पेप्टाइड्स और प्रोटीन की पहचान के लिए झूठी खोज दर (एफडीआर) के कट-ऑफ का उपयोग 0.01 तक करें और पर्कोलेटर द्वारा फ़िल्टर करें।
    2. सभी MS1 पेप्टाइड संकेतों के लिए पीक क्षेत्र की गणना करें। पेप्टाइड्स के कुल क्षेत्रफल की गणना करें।
  6. हेला नमूनों के लिए उपयोग किए जाने वाले समान एलसी-एमएस/एमएस विधि का उपयोग करके ईपीएस-मूत्र नमूनों से प्राप्त पेप्टाइड मिश्रण के 2 माइक्रोन इंजेक्ट करें और हेला डेटा प्रसंस्करण के लिए उपयोग किए जाने वाले समान मापदंडों का उपयोग करके कच्ची फाइल का विश्लेषण करें।
  7. सभी पहचाने गए पेप्टाइड्स के क्षेत्र मूल्यों को संक्षेप में और बाहरी मानक वक्र को इंटरपोलेट करके पेप्टाइड संकेतों की कुल तीव्रता की गणना करें। इससे ईपीएस-यूरिन प्रोटीन डाइजेस्ट में मौजूद पेप्टाइड राशि का स्वीकार्य अनुमान मिलेगा।

8. C18 StageTip प्रोटोकॉल के लिए अभिकर् ता तैयारी

  1. समाधान ए (0.1% ट्राइफ्लोरोएकेटिक एसिड (टीएफए), 50% एसीएन) के 500 माइक्रोन तैयार करें: 100% एसीएन के 250 माइक्रोन और 5% टीएफए के 10 माइक्रोन को एचपीएलसी पानी के 240 माइक्रोन जोड़ें।
  2. समाधान बी (0.1% टीएफए) के 2 एमएल तैयार करें: एचपीएलसी पानी के 1960 माइक्रोन में 5% टीएफए के 40 माइक्रोन जोड़ें।
  3. eluting समाधान के 100 μL तैयार (0.1% एफए, 50% एसीएन): 10% एफए के 1 μL और 100% एसीएन के 50 माइक्रोन एचपीएलसी पानी के 49 माइक्रोन जोड़ें।
  4. पहले वर्णित StageTips तैयार करें। इस मामले में, C18 निष्कर्षण डिस्क का उपयोग किया जाता है।

9. SCX/C18 StageTip प्रोटोकॉल

नोट: लवण को हटाने के लिए C18 StageTip प्रोटोकॉल द्वारा ईपीएस-मूत्र डाइजेस्ट को शुद्ध करें।

  1. पेप्टाइड्स के 2 माइक्रोग्राम से शुरू करें (प्रारंभिक इंजेक्शन द्वारा मात्रा के रूप में)। वॉश 2 एससीएक्स में डाइजेस्ट सॉल्यूशन 4-गुना पतला करें और ऊपर वर्णित (सेक्शन "एससीएक्स शुद्धिकरण" में) के रूप में आगे बढ़ें। एल्यूट समाधान (500 mm अमोनियम एसीटेट (एए) और एसीएन के 20% के 7 माइक्रोन के साथ पेप्टाइड मिश्रण को धीरे-धीरे कम स्पिन गति (5 माइक्रोन/न्यूनतम प्रवाह दर) का उपयोग करके एल्यूट करें।
  2. 3 से कम पीएच और 5% से नीचे कार्बनिक सॉल्वेंट की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए ट्राइफ्लोरोएकेटिक एसिड (टीएफए) के 0.1% के 150 माइक्रोन के साथ एससीएक्स को अम्लीय करें।
  3. 2 मिनट के लिए 400 x g पर समाधान ए और अपकेंद्रित्र के 50 माइक्रोन के साथ C18 StageTip स्थिति। 2 मिनट के लिए 400 x g पर समाधान बी और अपकेंद्रित्र के 50 माइक्रोन के साथ C18 StageTip इक्विलिब्रेट करें।
  4. कम स्पिन गति का उपयोग करके धीरे-धीरे स्टेज-टिप पर नमूना लोड करें।
  5. समाधान बी और अपकेंद्रित्र के 50 माइक्रोन के साथ C18 StageTip धोएं।
  6. धीरे-धीरे पेप्टाइड मिश्रण को कम स्पिन गति का उपयोग करके 10 माइक्रोन एल्यूशन समाधान के साथ एल्यूट करें।
  7. 3 मिनट के लिए वैक्यूम सेंट्रलाइज में 30 डिग्री सेल्सियस पर एलुएट (10 माइक्रोल) को सुखा लें। 0.1% एफए के 47 माइक्रोन जोड़ें। 20 मोड में एलसी-एमएस/एमएस द्वारा विश्लेषण करने की उम्मीद पेप्टाइड एकाग्रता 40 एनजी/μL होगी।

10. व्यास विश्लेषण(चित्रा 3)

  1. नैनोएलसी सेपरेशन: पेप्टाइड मिश्रण को 15 सेमी पर 230 एनएल/मिनट की प्रवाह दर पर 140 मिनट के रैखिक ढाल का उपयोग करके अलग करें, 3 माइक्रोन सी 18 सिलिका कणों के साथ पैक 75 माइक्रोन आईडी कॉलम।
    1. 230 एनएल/मिनट फ्लो रेट पर रेडिएंट एल्यूशन करें और 90 मिनट में मोबाइल फेज बी की कंटेंट को 3% से बढ़ाकर 25% करें, फिर 30 मिनट में 25% से 40% और अंत में 8 मिनट में 40% से 100% तक बढ़ाएं।
    2. 100% बी पर 10 मिनट के बाद, 15 मिनट के लिए मोबाइल चरण ए के साथ कॉलम को बराबर करें।
  2. मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक पैरामीटर: निम्नलिखित स्कैन चक्र को नियोजित करने वाली विधि का उपयोग करके व्यास विश्लेषण करें: (i) 17,500 (एजीसी लक्ष्य 1e6) के संकल्प पर एक पूर्ण स्कैन एमएस इवेंट अधिकतम इंजेक्शन समय 50 एमएस) के बाद (ii) 20 खिड़कियां 20 मीटर/जेड आइसोलेशन चौड़ाई, मीटर/जेड 350 से शुरू, (ii) 50 मीटर/z अलगाव चौड़ाई पर 5 खिड़कियां और (iv) 1 खिड़की 200 मीटर/जेड आइसोलेशन चौड़ाई पर, 1200 मीटर/जेडपर व्यास की स्कैन रेंज समाप्त । संकल्प 35,000 (AGC लक्ष्य 5e5, अधिकतम इंजेक्शन समय 120 एमएस और 25 NCE) पर व्यास स्कैन प्रदर्शन करते हैं।

11. पुस्तकालय उत्पादन के लिए उच्च पीएच उलट चरण C18 अंश

नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया द्वारा व्यास विश्लेषण के लिए डेटा-निर्भर पुस्तकालय बनाने के लिए 10 माइक्रोग्राम से अधिक की मात्रा में पूल ईपीएस-मूत्र प्रतिनिधि नमूने:

  1. टीएफए के 0.2% द्वारा पेप्टाइड मिश्रण (11 माइक्रोग्राम) को अम्लीय करें और परिणामस्वरूप समाधान को उच्च क्षमता की अनुमति देने के लिए निष्कर्षण डिस्क की दो परतों के साथ पैक किए गए C18 StageTip पर लोड करें। हमने अनुमान लगाया है कि एक माइक्रो डिस्क (16 गेज सिरिंज सुई से) की लोडिंग क्षमता 5-10 माइक्रोग्राम रेंज में होगी।
  2. सी 18 शुद्धिकरण के लिए पहले से ही वर्णित स्थिति और संतुलन स्थिर चरण।
  3. अमोनियम हाइड्रोक्साइड के 0.2% वाले एल्यूशन समाधानों का उपयोग करके उच्च पीएच उत्क्रमित चरण C18 से स्टेपवाइज एल्यूशन (एन = 10) द्वारा पेप्टाइड अंश को पूरा करें, 10 mM TEAB, और ACN की v/v सांद्रता में वृद्धि (4%, 8%, 12%, 16%, 20%, 24%, 28%, ३२%, ४०%, ८०%)
  4. व्यास विधि के एक ही क्रोमेग्राफिक मापदंडों का उपयोग कर 10 अंशों का विश्लेषण करें। प्रारंभिक विश्लेषण के लिए पहले अपनाई गई सेटिंग्स का उपयोग करके डीडीए मोड में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर संचालित करें (डीडीए विश्लेषण का उपयोग करके बाहरी मानक द्वारा प्रोटीन क्वांटिफिकेशन देखें")।

12. डेटा विश्लेषण

  1. डीआईए विश्लेषण को समर्पित एक सॉफ्टवेयर में उच्च उत्क्रमित चरण C18 अंश के डीडीए एलसी-एमएस/एमएस प्रयोगों से प्राप्त प्रोटीन पहचान परिणामों का आयात करके स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी उत्पन्न करें ।
  2. पहचान और परिमाणीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले खंड आयनों की न्यूनतम और अधिकतम संख्या क्रमशः 3 और 6 निर्धारित करें। प्राप्त परिणामों को 0.01 के क्यू-वैल्यू द्वारा फ़िल्टर करें।
  3. आयात व्यास कच्चे फ़ाइलों और प्रत्येक कच्चे फ़ाइल के लिए संबद्ध एक ही FASTA फ़ाइल वर्णक पुस्तकालय बनाने के लिए इस्तेमाल किया।
  4. प्रोटीन क्वांटिफिकेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले अद्वितीय पेप्टाइड्स की न्यूनतम और अधिकतम संख्या क्रमशः 1 और 10 निर्धारित करें।
  5. प्रत्येक प्रोटीन के लिए मात्रा खंड आयन पीक क्षेत्र को संक्षेप में गणना करें।
  6. प्रत्येक नमूने में मात्रात्मक प्रोटीन की तीव्रता के साथ एक मैट्रिक्स उत्पन्न करें।

Representative Results

मूत्र प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए इस प्रोटोकॉल में निम्नलिखित कदम शामिल हैं: एफएएसपी पाचन, बाहरी मानक अंशांकन के माध्यम से प्रोटीन राशि का अनुमान, डबल स्टेजटिप शुद्धिकरण (एससीएक्स और सी18),और डीआईए मोड में एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण।

प्रोटीन पाचन के बाद, प्रारंभिक इंजेक्शन परिणामी पेप्टाइड्स के StageTip SCX शुद्धिकरण के बाद किया जाता है। एलसी-एमएस/एमएस कच्ची फाइलों को पहचाने गए पेप्टाइड्स की संख्या, चिन्हित प्रोटीन की संख्या और पता किए गए पेप्टाइड्स के क्षेत्र को प्राप्त करने के लिए संसाधित किया जाता है । सभी पहचाने गए पेप्टाइड्स को संक्षेप में प्राप्त कुल क्षेत्र का उपयोग एक बाहरी मानक पर इंटरपोलेशन के माध्यम से प्रोटीन सामग्री का अनुमान लगाने के लिए किया जाता है: एक हेला प्रोटीन डाइजेस्ट क्रमशः पांच अलग-अलग मात्रा (2, 5, 15, 50, 150 एनजी) पर इंजेक्ट किया जाता है। इस अध्ययन में विश्लेषण किए गए छह नमूनों के लिए प्रोटीन की मात्रा नमूने से नमूने तक भिन्न थी, जिसमें औसत मूल्य ७८ एनजी/μL दिखाया गया है ।

प्रोटीन अनुमान के बाद, प्रत्येक नमूने से पचा प्रोटीन के 2 माइक्रोन व्यास विश्लेषण से पहले अनुक्रमिक SCX और C18 StageTip द्वारा शुद्ध कर रहे हैं । डीआईए डेटा खोजने के लिए स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी उच्च पीएच उत्क्रमित-चरण अंश और डीडीए एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण के बाद बनाई गई है जो एक प्रतिनिधि नमूने (उदाहरण के लिए, एक नमूना पूल) का है। ऊपर वर्णित मापदंडों का उपयोग करते हुए, हमने विचाराधीन छह ईपीएस-मूत्र नमूनों(अनुपूरक तालिका 1 और चित्रा 4)में 2387 प्रोटीन समूहों की पहचान और मात्रा निर्धारित की है।

एक गुणात्मक दृष्टिकोण से पहचाने गए और मात्रात्मक प्रोटीन की सूची की प्रासंगिकता का मूल्यांकन करने के लिए, प्राप्त मैट्रिक्स की तुलना पहलेप्रत्यक्ष-ईपीएस22 में पहचाने गए ६२४ प्रोटीन की सूची से की गई थी, जो अधिक आक्रामक प्रक्रिया में एकत्र किया गया एक नमूना है, जो दिलचस्प उम्मीदवार प्रोस्टेट कैंसर बायोमार्कर का स्रोत साबित हुआ है । कुल मिलाकर ईपीएस-यूरिन पर हमारे एफएएसपी/डीआईए प्रोटोकॉल द्वारा ६२४ प्रोटीन में से ५०८ का सफलतापूर्वक पता लगाया गया ।

Figure 1
चित्र 1:प्रोटेओमिक वर्कफ़्लो. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2:बाहरी मानक (HeLa डाइजेस्ट) के आधार पर प्रोटीन मात्राकरण के लिए हमारे प्रयोगात्मक डिजाइन का प्रतिनिधित्व । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:डीआईए विश्लेषण के प्रमुख कदम: (i) उच्च पीएच उलट-चरण विच्छेदन और डीडीए विश्लेषण के माध्यम से स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी का विस्तार, (ii) नमूना विश्लेषण डीआईए दृष्टिकोण का उपयोग करके, (iii) स्पेक्ट्रोनॉट द्वारा डेटा विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:पता चला ईपीएस-मूत्र प्रोटीन के लिए भूखंड रैंक । कुछ चयनित हिट लेबल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक तालिका 1: स्पेक्ट्रोनॉट में छह ईपीएस-मूत्र नमूनों में मात्रात्मक प्रोटीन की प्रतिनिधि तालिका। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

इस काम में ईपीएस-यूरिन सैंपल का विश्लेषण करने की रणनीति पेश की जाती है। एफएएसपी प्रोटोकॉल मूत्र प्रोटेओमिक्स के लिए एक आदर्श विकल्प है क्योंकि यह एंजाइमेटिक पाचन से पहले नमूना एकाग्रता की अनुमति देता है। वास्तव में, इस वर्कफ़्लो का उपयोग करके, मूत्र के कई सैकड़ों माइक्रोलीटर को एक फिल्टर पर लोड किया जा सकता है और संसाधित किया जा सकता है। इसके अलावा, ऑन-फिल्टर पाचन देना विकृति की स्थिति के विकल्प में सापेक्ष स्वतंत्रता प्रदान करता है। हमारे काम में, ट्रिस, एसडीएस और डीटीटी (अंतिम एकाग्रता: 50 mM Tris, 1% SDS, 50 mM DTT) युक्त बफर में मूत्र के नमूनों को कमजोर करके प्रोटीन डेनैचेशन हासिल किया जाता है। सक्रिय प्रोटीज द्वारा अवांछित गिरावट से बचने के लिए, नमूने को विगलन करने के तुरंत बाद प्रोटीन को कुशलतापूर्वक विकृत किया जाता है। 100 माइक्रोन से 200 माइक्रोन तक वॉश की मात्रा बढ़ाकर मूल एफएएसपी प्रोटोकॉल में सुधार किया गया है। इस तरह, अवशेषों को बेहतर तरह से हटाना, विशेष रूप से फिल्टर से डिटर्जेंट, प्राप्त किया जाता है।

एंजाइमेटिक पाचन के बाद, एक तेजी से एलसी-एमएस/एमएस का उपयोग करके बाहरी मानक द्वारा प्रोटीन अनुमान, डेटा-निर्भर विधि प्रोटोकॉल के अंतिम चरणों से पहले की जाती है, जिसमें सभी नमूनों (2 माइक्रोग्राम) के लिए समान प्रारंभिक सामग्री पर, व्यास मोड में डबल स्टेजटिप शुद्धिकरण और एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण शामिल है।

FASP की बहुमुखी प्रतिभा व्यास दृष्टिकोण के साथ जुड़ा हुआ है, एक संवेदनशील विधि लापता मूल्यों की एक कम संख्या प्रदान17। हमारे काम में, 2387 प्रोटीन की पहचान की गई और मात्रा निर्धारित की गई, इस प्रकार ईपीएस-मूत्र की विस्तृत प्रोटेओमिक प्रोफाइल तैयार करने में सक्षम बनाया गया। 2387 प्रोटीन की पहचान और मात्रा एक समृद्ध स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी की पीढ़ी के माध्यम से संभव थी, जो पेप्टाइड्स के उच्च पीएच उलट अंश के माध्यम से प्राप्त की गई थी, और हमारी व्यास विधि द्वारा, एक विस्तृत एम/जेड अग्रदूत रेंज में निर्देशित। इस कार्यप्रवाह ने पहले प्रत्यक्ष-ईपीएस विश्लेषण में पाए जाने वाले 80% से अधिक प्रोटीन की पहचान की, यह प्रदर्शित करता है कि ईपीएस-मूत्र प्रोटेम का एक काफी अंश वास्तव में व्यक्त प्रोस्थेटिक स्राव से प्राप्त होता है, इस प्रकार प्रोस्टेट ऊतक-विशिष्ट प्रोटीन26का एक समृद्ध स्रोत है।

अंत में, हमारे प्रयोगात्मक डिजाइन ने मूत्र प्रोटेम का समृद्ध नक्शा प्राप्त करने के लिए व्यास की संवेदनशीलता के साथ FASP की बहुमुखी प्रतिभा को जोड़ दिया। ईपीएस-मूत्र नमूनों का विश्लेषण करने के लिए इस रणनीति की सिफारिश की जाती है, लेकिन इसके उपयोग को सामान्य रूप से मूत्र प्रोटेओमिक्स या अन्य नमूना प्रकारों तक बढ़ाया जा सकता है।

Disclosures

सभी लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

इस काम को एमआईयूआर (मिनिस्टरो यूनीवर्सिटा राइसर्का, प्रिंस 2017 से एमजी) और पीओआर कैलाब्रिया एफईआर 2014-2020, एक्शन 1.2.2, "इनोप्रोस्ट" द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M Tris HCL pH 8.0 Lonza 51238
2-iodoacetamide for synthesis Merck 8047440100
Acetonitrile for HPLC LC-MS grade VWR 83640.290
Ammonium acetate Fluka 9690
ammonium hydroxide solution Sigma 30501
ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water Merck 318612-500ML
Dithiothreitol Amresco 0281-25G
Empore Cation 47mm Extraction Disks Microcolumn 2251
Empore Disk C18 Varian 12145004
Formic acid optima Fisher Scientific A117-50
Hela Protein Digest Standard Fisher Scientific 88329
Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane MERCK MRCPRT010
sodium dodecyl sulfate solution Merck 71736-500ML
Thiethylammonium bicarbonate buffer Merck T7408-100ML
trifluoroacetic acid Riedel-de Haën 34957
Trypsin from porcine pancreas Merck T6567-1MG
Urea Merck U6504-500G
Water HPLC gradient grade Fisher Scientific W/0106/17
Proteome Discoverer 1,4 Thermo Fisher Scientific
Spectronaut 14.0 Biognosys

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References

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FASP पाचन और डेटा-स्वतंत्र विश्लेषण के माध्यम से ईपीएस-मूत्र का प्रोटेओमिक प्रोफाइल
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Prestagiacomo, L. E., Gabriele, C., Morelli, P., Rota, M. A., Alba, S., Cuda, G., Damiano, R., Gaspari, M. Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis. J. Vis. Exp. (171), e62512, doi:10.3791/62512 (2021).

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