Summary
여기서, 우리는 단백질 소화, 펩타이드 정제 및 데이터 독립적 인 수집 분석과 같은 상세한 정보와 함께 최적화 된 필터 소화 프로토콜을 제시합니다. 이 전략은 발현 된 전립선 분비 소변 샘플의 분석에 적용되며 높은 프로테아메 커버리지와 오줌 프로테오메의 낮은 누락 된 값 라벨 프리 프로파일링을 허용합니다.
Abstract
필터 보조 시료 프로토콜(FASP)은 희석된 시료를 농축할 수 있고 다양한 세제와 호환되기 때문에 프로테오믹스 시료 제조에 널리 사용된다. FASP와 같은 상향식 프로테오믹스 워크플로우는 데이터 독립적 분석(DIA) 모드에서 수행되는 LC-MS/MS 방법에 점점 더 의존하고 있으며, 이는 깊은 프로테오메 커버리지와 누락된 값의 낮은 발생률을 허용하는 스캐닝 방법입니다.
이 보고서에서는 오줌 프로테오메 매핑을 위해 DIA 모드에서 FASP 프로토콜, 이중 StageTip 정화 단계 및 LC-MS/MS를 결합한 워크플로우의 세부 정보를 제공합니다. 모델 샘플로서, 우리는 전립선암 바이오마커 발견 연구에 관심이 있는 디지털 직장 검사(DRE)를 거쳐 수집된 샘플인 발현 전립선 분비물(EPS)-소변을 분석하였다.
Introduction
프로테오믹 기술의 지속적인 진화는 조직 및 생물유체와 같은 다양한 샘플에 존재하는 주요 분자 효과자의 고해상도 지도를 제공함으로써 질병 진단 및 치료에 대한 반응의 예측을 돕는 데 상당한 영향을 미칠 것을 약속합니다. 분석적 관점에서, 소변은 다른 생물유체1에대하여 프로테오메의 수집용성 및 주요 안정성과 같은 몇 가지 장점을 제공한다. 소변의 프로테오믹 분석은 관심 있는 조직에 근접하여 비침습적 샘플링을 허용하기 때문에 비뇨기과암에 대한 바이오마커 발견 연구에 특별한 관심을 갖는다2. 특히, 전립선 관련 병리를 연구하기 위해 유망한 것으로 보이는 샘플은 EPS-소변3,4(즉, 디지털 직장 검사(DRE)후에 수집된 소변 샘플입니다). 샘플 수집 전에 이 후자의 수술은 전립선 특정 단백질로 소변을 풍부하게 합니다. EPS-소변은 전립선암(PCa)을 포함한전립선5와 관련된 장애를 조사하기에 좋은 후보이며, DRE를 통해 종양에 의해 분비된 단백질을 소변 샘플에 부어 암 조직 별 단백질을 검출할 가능성이 높아지도록 한다.
잠재적인 단백질 바이오마커의 검출 및 정량화를 허용하는 데 있어 중요한 역할은 질량 분석법(MS)에 의해 재생됩니다. 지난 2년 동안, 프로테오믹 분석을 위한 MS 기반 프로토콜은 MS 계측 및 데이터 분석 소프트웨어6의지속적인 개선 덕분에 단일 LC-MS/MS 실행에서 점점 더 많은 단백질을 검출할 수 있게 해 주었다.
MS 기반 프로테오믹 시료 제제는 일반적으로 단백질 혼합물의 효소 소화를 수반하며, 이는 용액 소화, MStern 블로팅7,서스펜션 트래핑(S-trap)8,고체 상 강화 샘플 제제(SP3)9,단계내 정제소화(FAS1) 및 필터 처리 시료 준비(FAS1) 및 필터 처리 시료 준비(FASP1) 및 필터 처리 시료 준비(FASP1) 및 필터 처리 시료 준비(FASP1) 및 필터 처리 시료 준비(FASP1) 및 필터 처리 시료 준비(FASP1) 및 필터 처리 시료 준비(FASP1) 및 필터 처리 시료 준비(FAS1) 및 필터 처리 시료 준비(FASP1) 및 필터 처리 시료 준비(FAS1) 및 필터 처리 시료 준비(FAS1) 및 필터 처리 시료 준비(FASP1) 및 필터 처리 시료 준비(FAS1) 및 필터 처리 시료 준비(FAS1) 및 필터 처리 시료 준비(FAS1) 및 필터 처리 시료 준비(FASP1) 및 필터 처리 시료 준비(FAS1) 및 필터 처리 시료 준비(FAS1) 및 필터 처리 시료 준비(FASP1) 및 필터 처리 시료 준비(FA 모든 프로토콜은 오줌 프로테오믹스에 사용될 수 있으며, 비록 결과가 확인된 단백질 및 펩티드의 수와재현성(12)의수에 따라 달라질 수 있더라도.
이 작품에서, 우리의 관심은 FASP 프로토콜에 의해 EPS 소변의 분석에 집중되었다. FASP 프로토콜은 원래 조직 및 세포 배양에서 추출한 단백질을 분석하도록 설계되었지만, 그 사용은소변(13)과같은 다른 샘플 유형의 분석으로 확대되었다. 간단한 용액 소화에 대하여 FASP는 보다 유연한 프로테오믹접근법(14)이며,효소 소화 전 단백질 혼합물로부터 세제 및 염과 같은 기타 오염물질을효과적으로 제거함으로써 최적의 단백질 용윤성 조건을 선택할 수 있게 한다. 더욱이, FASP의 추가 특징은 시료 농도에 대한 수단을 제공한다는 것이다. 이것은 상대적으로 큰 샘플 볼륨 (마이크로 리터의 수백)에서 시작하는 것을 허용하기 때문에, 오줌 proteomic 분석에 대한 특히 관심이다. FASP 프로토콜의 잠재력에 비추어 볼 때, 여러 연구는 실험적 가변성을 줄이고16개의샘플 수를 병렬로 처리하는 것을 목표로 워크플로 자동화에 주의를 기울였습니다.
워크플로우에서 FASP는 높은 프로테오메 커버리지, 양적 정밀도 및 누락된 값의 낮은 발생률을 제공하는 데이터 독립적 분석(DIA)에서 LC-MS/MS 를 획득합니다. DIA 접근 방식은 MS/MS 이벤트에 대해 모든 이온을 선택하는 민감한 방법입니다. DIA 모드에서 작동하는 질량 분광계는 전체 m/z 전구체 범위를 덮는 서로 다른 격리 폭으로 스캔 주기를 수행합니다. 이러한 접근법은 단위 시간당 많은 펩타이드를 재보적으로 검출하여샘플(17)의프로테오믹스 스냅샷을 제공할 수 있다. 또한 DIA에 의해 생성된 데이터는 또 다른 흥미로운 특징을 가지고 있습니다: 후방분석(18)의가능성. DIA 데이터는 DIA의 MS/MS 스펙트럼이 각 m/z 창(19)내에서 여러 전구체 이온의 공동 격리로 인해 발생하기 때문에 DDA에서 얻은 것보다 더 복잡하다. 복합 MS/MS 스펙트럼을 구별하고 특정 펩타이드 신호로 나누면 스펙트럼 라이브러리와 데이터 분석을 위한 전용 소프트웨어라는 두 가지 기본 요소를 사용하여 달성됩니다. 스펙트럼 라이브러리는 일반적으로 프로테오메 커버리지를 최대화하기 위해 펩티드 분획을 포함하는 데이터 의존실험에 의해 생성되며, 이는 고려 중인 샘플에서 검출 가능한 펩타이드의 수천 개의 실험적으로 결정된 전구체 이온 및 MS/MS 스펙트럼 목록을 제공한다. 대신 데이터 분석 소프트웨어는 스펙트럼 라이브러리에 포함된 정보를 사용하여 펩타이드 검출 및 정량화를 허용하는 특정 추출된 이온 크로마토그램을 생성하여 DIA 데이터를 해석합니다. 라이브러리가 없는 DIA 데이터 분석이 가능하지만 라이브러리 기반 DIA는 프로테오메 커버리지20측면에서 더 나은 결과를 제공합니다.
여기서 설명된 샘플 준비프로토콜(도 1)은원심분리 단계(세포 이물질을 제거하기 위해), FASP 소화, StageTip 정제21,단백질 및 DIA 분석의 정량화 와 같은 단계로 구성된다. 이 프로토콜은 전립선암 바이오마커 발견의 맥락에서 EPS-소변의 분석을 위해 설계되었지만, 임의의 소변 샘플의 프로테오믹 분석에 적용될 수 있다.
Protocol
연구 결과는 카탄자로마그나 Graecia 대학의 기관 윤리 위원회에 의해 승인되었습니다, RP 41/2018. 연구에 등록된 모든 환자로부터 서면 통보 된 동의를 얻었습니다.
1. 샘플 준비
- 원심분리기 EPS-소변 샘플은 실온(RT)에서 10분 동안 2,100 x g의 수집 2시간 이내에 수집됩니다. 사용할 때까지 -80 °C에 상체를 저장합니다.
2. 샘플 해동
- 샘플을 -80°C에서 -20°C로 전해 소화 전날 옮김한다.
- 샘플 처리 전에 샘플을 4°C에서 15-20분 동안 전송한 다음 RT에서 전송합니다.
3. FASP에 대한 시약 준비
- 같은 날, 우레아 버퍼, 50mM 요오도아세타미드(IAA), 50mM 트리에틸라모늄 중탄산염 및 500mM 디티오트레이톨(DTT)을 준비한다.
- 우레아 버퍼(urea 8 M, 100 mM Tris-HCl pH 8)를 준비: 10mL용, 4,800 mg의 우레아의 무게와 1M Tris pH 8의 1mL를 추가한 후 HPLC 수의 적절한 양으로 용해한다. 각 샘플에는 800μL의 우레아부피가 필요합니다.
- 500mM 디티오트리톨(DTT)을 준비하세요: HPLC 수의 500μL에 38.5 mg의 DTT를 용해하십시오. 각 샘플에 대해, DTT의 66.7 μL이 필요합니다.
- 우레아 버퍼에서 50 mM IAA를 준비하십시오: 9.25 mg의 IAA를 1mL의 우레아 버퍼에 녹입니다. 각 샘플에 대해 IAA의 50 μL이 필요합니다.
- 50 mM 트리에틸람모늄 중탄산염(TEAB)을 준비한다. HPLC 물 2.85mL에 1M TEAB의 150 μL을 추가합니다. 각 샘플에 대해 TEAB의 460 μL이 필요합니다.
- HPLC 물에 트립신(100 ng/μL)의 용액을 준비합니다. 이 용액은 -80 °C에 저장하고 사용하기 직전에 해동 할 수 있습니다. 각 샘플마다 2μL(200 ng)이 필요합니다.
4. FASP에 의한 단백질 소화
- 각 EPS-소변 시료의 500 μL을 10%(w/v) 나트륨 도데킬 황산염(SDS), 500mM M M DTT의 66.7 μL, 단백질을 용해시키고 이슬을 줄이기 위해 1M Tris pH 8의 33.3 μL을 희석시 희석시. 부드러운 흔들림으로 95 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.
- 필터 장치(10kDa)와 원심분리기(14,000 x g)에 20분간 희석된 EPS-소변 샘플 300 μL을 추가합니다.
- 필터에 200 μL의 요료 버퍼를 넣고 14,000 x g에서 원심분리기를 15분 간 추가합니다. 이 단계를 반복한 다음 흐름 통과를 삭제합니다.
- IAA 용액 50 μL과 원심분리기를 6,000 x g에 25분간 추가합니다.
- 20분 동안 14,000 x g의 우레아 버퍼와 원심분리기 200 μL을 추가합니다. 이 단계를 반복한 다음 흐름 통과를 삭제합니다.
- 50m 트리에틸람모늄 중탄산염 버퍼(TEAB)의 200 μL과 원심분리기를 14,000 x g에서 20분간 추가합니다. 이 단계를 반복합니다.
- 필터 장치를 새 수집 튜브로 전송합니다.
- 50m TEAB 버퍼60 μL과 트립신 200 ng를 추가하고 밤새 37°C의 열 믹서에 샘플을 배양합니다.
참고: 하룻밤 동안 배양 중에 시료 증발을 방지하려면 각 필터 유닛을 알루미늄 호일 층과 파라필름 층으로 감쌉니다. - 트립신 인큐베이션 후, 140 μL의 물을 추가하고 유리병을 14,000 x g에서 25분 동안 원심분리하여 다이제스트(180-200 μL)를 수집합니다.
5. SCX 정화를 위한 시약 준비
- 다음과 같이 1mL의 워시 1(0.5% 포름산(FA) 및 20% 아세토나이트(ACN)를 준비하십시오: 10% FA의 50μL과 100% ACN의 200μL를 HLPC 물의 750 μL로 추가한다. 각 샘플마다 100 μL의 세척 1이 필요합니다.
- 다음과 같이 1.5mL의 워시 2(0.5% FA 및 ACN80%)를 준비하십시오: HPLC 물의 100% Fa의 75 μL과 1.2mL의 1.2mL를 HPLC 물의 225 μL에 추가하십시오. 각 샘플에 대해 세척 2의 190 μL이 필요합니다.
- 100 μL의 용액(500mM 암모늄 아세테이트(AA) 및 ACN20%를 준비하십시오): 2M AA의 25 μL과 100% ACN의 20 μL에서 HPLC 물의 55μL을 추가합니다.
- 스테이지 팁을 다음과 같이 준비합니다.
- 무딘 말단 주사기 바늘(게이지 16)을 사용하여 200 μL 파이펫 팁을 SCX 수지 층으로 포장합니다. 스테이지팁을 마이크로컬럼을 수용하기 위해 이전에 관통된 미세원심분리기 뚜껑에 삽입합니다.
- 뚜껑을 원래 뚜껑이 제거된 2mL 마이크로센심분리기로 조립합니다. 방금 조립된 마이크로 SPE 원심 장치는 벤치탑 원심분리기에 장착되어야 합니다. 천공 된 뚜껑은 준비하는 데 지루하기 때문에 여러 번 활용할 수 있습니다.
6. SCX 정화
- 세척 2를 사용하여 각 샘플의 30 μL을 120 μL로 희석합니다.
- 2 분 동안 400 x g에서 추출 수지와 원심분리기 위에 50 μL의 워시 1을 추가하여 StageTip을 조건부로 처리하십시오. 유동 저항은 추출 수지가 파이펫 팁에 얼마나 강하게 포장되었는지에 따라 달라지므로, 원심분리기 속도는 20-30 μL/min의 유량을 얻기 위해 조정되어야 할 수도 있습니다. 시료 적재 및 세척 중에 팁을 건조하게 두지 않도록 하십시오.
- 스테이지팁을 20μL의 50μL, 원심분리기는 400 x g로 2분간 계측합니다.
- 희석된 시료(120 μL)를 낮은 스핀 속도를 사용하여 로드합니다.
- 스테이지팁을 워시 2와 원심분리기 50μL로 2분간 400xg으로 씻어내시면 됩니다. 50 μL의 워시 1로 반복하십시오.
참고 : 이 세척 후 수지는 완전히 건조해야합니다. - 엘루테 펩티드 혼합물은 7 μL의 용액(500mM 암모늄 아세테이트(AA) 및 ACN의 20%를 천천히 사용하여 낮은 스핀 속도를 사용합니다.
- AA를 희석하고 LC-MS/MS 예비 주입시 샘플을 얻기 위해 0.1% FA의 27 μL을 추가합니다. 34 μL에 대한 최종 희석은 소변과 펩타이드 용액 사이의 1:1 체피 비율로 생성됩니다 (정제 된 다이제스트의 1 μL은 원래 소변 샘플의 1 μL에 해당합니다).
7. DDA 분석을 사용하여 외부 표준에 의한 단백질 정량화(도 2)
- LC-MS/MS에 생성된 펩타이드 다이제스트의 2μL을 주입하고 다음과 같이 구축된 교정 곡선으로 생성된 총 펩티드 영역을 보간하여 시료의 단백질 양을 결정합니다.
- HeLa 다이제스트 스톡(100 μg/μL)을 사용하여 5가지 다른 HeLa 다이제스트 솔루션(ng/μL 1개, ng/μL 2.5ng/μL, 7.5 ng/μL, 75 ng/μL)을 준비합니다.
- 각 헬라 용액을 복제(2 μL)에 삽입합니다.
- LC-MS/MS 메서드를 설정합니다.
- 3 μm C18 실리카 입자로 포장된 15cm, 75 μm i.d 열에 230 nL/분의 유량으로 75분의 선형 그라데이션을 통해 5개의 HeLa 펩티드 혼합물 및 별도의 펩타이드 의 2μL을 주입한다. 모바일 위상 A(0.1% FA, 2% ACN) 및 모바일 위상 B(0.1% FA 및 ACN80%)에 의해 구성되는 이진 그라데이션을 사용합니다.
- 이동상 B 함량을 60분 에서 42%로, 추가로 8분 만에 42%에서 100%로 늘려 그라데이션 용출을 수행합니다. 5분 100% B로 유지한 다음 2분 만에 다시 0% B로 이동합니다.
- 최고 12 방법을 사용하여 DDA 모드에서 작동하고 350-1800 m / z,해상도 70,000, ACG 목표 1e6 및 최대 주입 시간 50 ms에서 MS 전체 스캔 범위를 설정합니다. 전구체 이온 절연을 위한 질량 창을 1.6m/z,해상도 35,000, ACG 표적 1e5, 최대 사출 시간 120ms, HCD 단편화 25 NCE(정규화된 충돌 에너지) 및 동적 배제 15초로 설정한다.
- Sequest를 검색 엔진으로 사용하여 원시 파일을 분석하고 HUMAN Uniprot 완성 단백질 서열을 데이터베이스로 분석합니다. 여기에 제시된 실험에서 데이터베이스는 2016년 3월에 다운로드되었으며 42.013 시퀀스가 포함되어 있습니다.
- 다음 설정을 사용하십시오: MS 공차 15 ppm, MS/MS 공차 0.02 Da, 트립신을 두 개의 놓친 분열 부위를 설정하여 효소로 사용하십시오. 리신, 세린, 쓰레닌, 티로신(+57.021) 및 메티오닌산화를 동적 변형으로 설정하고 시스테인(+57.021)의 카르바미도메틸레이션을 정적 수정으로 설정합니다. 펩타이드 및 단백질 식별에 대한 거짓 발견율(FDR)을 0.01로 줄이고 퍼콜레이터에 의해 걸이하십시오.
- 모든 MS1 펩티드 신호에 대한 피크 영역을 계산합니다. 펩티드의 총 면적을 계산합니다.
- HeLa 샘플에 사용되는 동일한 LC-MS/MS 방법을 사용하여 EPS-소변 샘플에서 얻은 펩티드 혼합물 2μL을 주입하고 HeLa 데이터 처리에 사용되는 것과 동일한 매개 변수를 사용하여 원시 파일을 분석한다.
- 확인된 모든 펩타이드의 영역 값을 합산하여 펩티드 신호의 총 강도를 계산하고 외부 표준 곡선을 보간합니다. 이것은 EPS-소변 단백질 소화에 존재하는 펩티드 량의 허용 가능한 추정을 제공할 것입니다.
8. C18 StageTip 프로토콜에 대한 시약 준비
- 용액 A(0.1% 트리플루오로아세산(TFA), 50% ACN)의 500 μL을 준비하십시오: 100% ACN의 250 μL과 5% TFA의 10 μL을 HPLC 물의 240μL에 추가합니다.
- 용액 B(0.1% TFA)의 2mL 준비: HPLC 물의 1960μL에 5% TFA의 40 μL을 추가합니다.
- 100 μL의 용출 용액(FA 0.1%, ACN 50%)을 준비하십시오: 1μL 1μL의 FA 10%, 100% ACN의 50 μL을 HPLC 물의 49μL에 추가합니다.
- 이전에 설명한 대로 StageTips를 준비합니다. 이 경우 C18 추출 디스크가 사용됩니다.
9. SCX /C18 스테이지팁 프로토콜
참고: C18 StageTip 프로토콜에 의해 EPS-소변 소화를 정화하여 염을 제거합니다.
- 펩티드 2 μg에서 시작하십시오 (예비 주입에 의해 정량화된). 소화용액을 4배 로 희석하여 세척2 SCX로 희석하고 상술한 바와 같이 진행한다(섹션 "SCX 정제"). 용액 7μL(500mM 암모늄 아세테이트(AA) 및 ACN의 20%를 사용하여 펩타이드 혼합물을 천천히 사용하여 낮은 스핀 속도(5μL/min 유량)를 엘테합니다.
- 3보다 낮은 pH와 5% 미만의 유기 용매의 농도를 달성하기 위해 SCX 용액을 트리플루오로아세트산(TFA)의 0.1%의 150 μL로 산성화한다.
- C18 StageTip를 50 μL의 솔루션 A와 원심분리기를 400 x g로 2분간 조건부로 처리합니다. 용액 B의 50 μL과 원심분리기의 50 μL을 2분 동안 400 x g로 C18 StageTip를 평형화합니다.
- 낮은 스핀 속도를 사용하여 스테이지 팁에 샘플을 천천히 로드합니다.
- C18 StageTip를 50 μL의 용액 B와 원심분리기로 세척합니다.
- 더 낮은 스핀 속도를 사용하여 용액 10 μL로 펩티드 혼합물을 천천히 엘테합니다.
- 진공 원심분리기에서 30°C에서 30°C에서 3분간 용출(10 μL)을 건조시다. 0.1% FA의 47 μL을 추가합니다. 예상 펩타이드 농도는 40 ng/ μL이 될 것입니다.
10. DIA 분석(그림 3)
- 나노LC 분리: 펩티드 혼합물을 15cm, 75 μm ID 컬럼에 230nL/min의 유량으로 140분의 선형 그라데이션을 사용하여 펩티드 혼합물을 분리하여 3 μm C18 실리카 입자로 포장한다.
- 230nL/분 유량으로 그라데이션 용출을 수행하고 이동상 B 함량을 90분 만에 3%에서 25%로, 30분 만에 25%에서 40%로, 8분 만에 40%에서 100%로 증가합니다.
- 100% B에서 10분 후, 15분 동안 이동상 A로 컬럼을 상화합니다.
- 질량 분광 매개변수: 다음 스캔 주기를 사용하는 방법을 사용하여 DIA 분석을 수행합니다: (i) 17,500(AGC 표적 1e6)의 해상도에서 전체 스캔 MS 이벤트, 최대 사출 시간 50 ms) 다음 (ii) 20 m/ z 격리 폭에서 20 m/z 에서 윈도우, m/z 에서 시작 하 고 (ii) 50 m/z 격리 폭에서 5 창 및 (iv) 1 창 에서 200 m/z 격리 폭, 1 200 m/z 격리 폭에서 1 창, 1200 m/z에서DIA의 스캔 범위를 종료. 해상도 35,000 (AGC 표적 5e5, 최대 주입 시간 120 ms 및 25 NCE)에서 DIA 스캔을 수행합니다.
11. 라이브러리 생성을 위한 고-pH 반전 단계 C18 분획
참고: 다음 절차에 의해 DIA 분석을 위한 데이터 종속 라이브러리를 구축하기 위해 10 μg 이상의 양으로 풀 EPS-소변 대표 샘플:
- 펩타이드 혼합물(11 μg)을 TFA의 0.2%로 산성화하고 생성된 용액을 두 층의 추출 디스크로 포장된 C18 StageTip에 로드하여 더 높은 용량을 허용합니다. 우리는 단일 마이크로 디스크의 적재 용량을 추정 (16 게이지 주사기 바늘에서) 5-10 μg 범위에있을 수 있습니다.
- C18 정화에 대해 이미 설명된 바와 같이 고정 위상을 조절하고 평형화한다.
- 수산화암모늄의 0.2%, 10mM TEAB, ACN의 V/v 농도 증가(4%, 12%, 16%, 20%, 24%, 28%, 32%, 32%, 40%, 80%, 80%) 및 높은 pH 반전 단계 C18로부터 펩티드 분획을 수행한다.
- DIA 메서드의 동일한 크로마토그래피 매개 변수를 사용하여 10개의 분수를 분석합니다. 이전에 예비 분석에 채택된 설정을 사용하여 DDA 모드에서 질량 분광계를 작동합니다("DDA 분석을 사용하여 외부 표준에 의한 단백질 정량화"참조).
12. 데이터 분석
- DIA 분석에 전념하는 소프트웨어에서 고반전 상 C18 분획의 DDA LC-MS/MS 실험에서 얻은 단백질 식별 결과를 가져와 스펙트럼 라이브러리를 생성한다.
- 식별 및 정량화에 사용되는 최소 및 최대 조각 이온 수를 각각 3 및 6로 설정합니다. 얻은 결과를 0.01의 Q 값으로 필터링합니다.
- DIA 원시 파일을 가져오고 각 원시 파일에 스펙트럼 라이브러리를 만드는 데 사용되는 동일한 FASTA 파일을 연결합니다.
- 단백질 정량화에 사용되는 최소 및 최대 펩타이드 수를 각각 1및 10으로 설정합니다.
- 단편 이온 피크 영역을 합산하여 각 단백질의 강도를 계산합니다.
- 각 샘플에서 정량화된 단백질의 강도로 매트릭스를 생성한다.
Representative Results
오줌 프로테오믹 분석을 위한 이 프로토콜은 FASP 소화, 외부 표준 교정을 통한 단백질 량 추정, 이중 StageTip 정제(SCX 및 C18),및 DIA 모드에서 LC-MS/MS 분석과 같은 단계를 포함한다.
단백질 소화 후, 단계적 주사는 결과 펩티드의 StageTip SCX 정제 후에 수행됩니다. LC-MS/MS 원시 파일은 확인된 펩타이드의 수, 확인된 단백질의 수 및 검출된 펩티드의 영역을 얻기 위해 처리된다. 확인된 모든 펩타이드를 합산하여 얻은 총 영역은 보간을 통해 단백질 함량을 외부 표준으로 추정하는 데 사용됩니다: 5개의 다른 양(각각 2, 5, 15, 50, 150 ng)에 주입된 HeLa 단백질 다이제스트.. 이 연구에서 분석된 6개의 견본을 위한 단백질 양은 78 ng/μL의 평균 값을 보여주는 견본에서 견본에 변화했습니다.
단백질 추정 후, 각 시료에서 소화된 단백질의 2μg은 DIA 분석 전에 순차적인 SCX 및 C18 StageTip에 의해 정제됩니다. DIA 데이터 검색을 위한 스펙트럼 라이브러리는 대표 샘플(예: 샘플 풀)의 고-pH 반전 위상 분획 및 DDA LC-MS/MS 분석 후에 생성됩니다. 상술한 파라미터를 사용하여, 고려 중인 6개의 EPS-소변 샘플에서 2387개의 단백질 군을 확인하고 정량화하였다(보충표1 및 도 4).
질적 관점에서 평가하기 위해 식별되고 정량화된 단백질 목록의 관련성을 평가하기 위해, 얻어진 매트릭스는 이전에 직접-EPS22에서확인된 624개의 단백질 리스트와 비교되었으며, 보다 침습적인 절차로 수집된 샘플은 흥미로운 후보 전립선암 바이오마커의 원천이 입증되었다. 총, 508 밖으로 624 단백질 EPS-소변에 우리의 FASP/DIA 프로토콜에 의해 성공적으로 발견 되었다.
그림 1: 프로테오믹 워크플로우. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 2: 외부 표준 (HeLa 다이제스트)에 따라 단백질 정량화에 대한 실험 설계의 표현.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: DIA 분석의 주요 단계 : (i) 고-pH 반전 위상 분획 및 DDA 분석을 통해 스펙트럼 라이브러리의 정교화, (ii) DIA 접근법을 이용한 샘플 분석, (iii) Spectronaut에 의한 데이터 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 검출된 EPS-오줌 단백질에 대한 랭크 플롯. 선택한 몇 개의 조회수가 레이블이 지정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: Spectronaut에 있는 6개의 EPS 소변 견본에 있는 정량화된 단백질의 대표표. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 작품에서는 EPS-소변 샘플을 분석하기 위한 전략이 제시됩니다. FASP 프로토콜은 효소 소화 전에 시료 농도를 허용하기 때문에 오줌 프로테오믹스에 이상적인 선택입니다. 사실,이 워크 플로우를 사용하여, 소변의 마이크로 리터의 수백 은 단일 필터에로드 및 처리 될 수 있습니다. 또한, 온 필터 소화는 데스터레이션 조건의 선택에 상대적 자유를 제공합니다. 우리의 작업에서, 단백질 성소는 Tris, SDS 및 DTT를 포함하는 완충제에서 소변 샘플을 희석시킴으로써 달성됩니다 (최종 농도 : 50 mM Tris, 1 % SDS, 50 mM DTT). 단백질은 활성 프로테아제에 의한 원치 않는 분해를 피하기 위해 시료를 해동한 직후 효율적으로 변성됩니다. 원래 FASP 프로토콜은 100 μL에서 200 μL로 세하의 부피를 증가시킴으로써 개선되었습니다. 이러한 방식으로, 필터에서 잔류물, 특히 세제의 더 나은 제거가 달성된다.
효소 소화 후, 빠른 LC-MS/MS를 이용한 외부 표준에 의한 단백질 추정 후, 모든 샘플(2 μg)에 대해 동일한 시동 재질로 DIA 모드에서 이중 StageTip 정제 및 LC-MS/MS 분석을 포함하는 프로토콜의 마지막 단계 전에 데이터 의존적 방법이 수행됩니다.
FASP의 다재다능함은 DIA 접근 방식과 연관되어 있으며, 누락된값(17)의수가 적어지는 민감한 방법입니다. 우리의 일에서, 2387 단백질이 확인되고 정량화되었다, 따라서 EPS 소변의 상세한 proteomic 프로파일을 그릴 수 있게. 2387 단백질의 식별 및 정량화는 풍부한 스펙트럼 라이브러리의 생성을 통해 가능했으며, 펩티드의 고pH 반전 분획을 통해 수득되었으며, 우리의 DIA 방법에 의해 넓은 m/z 전구체 범위를 지향하였다. 이 워크플로우는 이전에 직접 EPS 분석에서 발견된 단백질의 80% 이상을 확인하여 EPS-오줌 프로테오메의 상당 부분이 실제로 발현된 전립선 분비물에서 파생되고, 따라서 전립선 조직 특이적단백질(26)의풍부한 공급원임을 입증한다.
결론적으로, 우리의 실험 디자인은 오줌 proteome의 풍부한지도를 얻기 위해 DIA의 감도와 FASP의 다재 다능함을 결합합니다. 이 전략은 EPS 소변 견본을 분석하기 위하여 추천됩니다, 그러나 그것의 사용은 일반적으로 오줌 proteomics, 또는 그밖 견본 모형으로 확장될 수 있습니다.
Disclosures
모든 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 MIUR (장관 Università Ricerca, PRIN 2017 에서 MG)와 POR 칼라브리아 FESR 2014-2020, 액션 1.2.2, "INNOPROST"에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris HCL pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
| 2-iodoacetamide for synthesis | Merck | 8047440100 | |
| Acetonitrile for HPLC LC-MS grade | VWR | 83640.290 | |
| Ammonium acetate | Fluka | 9690 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma | 30501 | |
| ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water | Merck | 318612-500ML | |
| Dithiothreitol | Amresco | 0281-25G | |
| Empore Cation 47mm Extraction Disks | Microcolumn | 2251 | |
| Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
| Formic acid optima | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Hela Protein Digest Standard | Fisher Scientific | 88329 | |
| Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | MERCK | MRCPRT010 | |
| sodium dodecyl sulfate solution | Merck | 71736-500ML | |
| Thiethylammonium bicarbonate buffer | Merck | T7408-100ML | |
| trifluoroacetic acid | Riedel-de Haën | 34957 | |
| Trypsin from porcine pancreas | Merck | T6567-1MG | |
| Urea | Merck | U6504-500G | |
| Water HPLC gradient grade | Fisher Scientific | W/0106/17 | |
| Proteome Discoverer 1,4 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Spectronaut 14.0 | Biognosys |
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