Summary
Burada, aşağıdakiler hakkında ayrıntılı bilgi içeren optimize edilmiş bir filtre sindirim protokolü sunuyoruz: protein sindirimi, peptit saflaştırma ve veri bağımsız edinme analizi. Bu strateji, eksprese edilen prostat salgıları-idrar örneklerinin analizine uygulanır ve üriner proteomların yüksek proteom kapsama alanına ve düşük eksik değer etiketsiz profillemesine izin verir.
Abstract
Filtre destekli numune protokolü (FASP), seyreltilmiş numunelerin konsantre olmasına izin verdiği ve çok çeşitli deterjanlarla uyumlu olduğu için proteomik numune hazırlama için yaygın olarak kullanılmaktadır. FASP gibi aşağıdan yukarıya proteomik iş akışları, derin proteom kapsama alanına ve eksik değerlerin düşük insidansına izin veren bir tarama yöntemi olan veriden bağımsız analiz (DIA) modunda gerçekleştirilen LC-MS/MS yöntemlerine giderek daha fazla güveniyor.
Bu raporda, idrar proteom haritalaması için DIA modunda bir FASP protokolü, çift StageTip temizleme adımı ve LC-MS/MS'i birleştiren bir iş akışının ayrıntılarını sağlayacağız. Örnek bir örnek olarak, prostat kanseri biyobelirteç keşif çalışmalarında ilgi gören dijital rektal muayeneden (DRE) sonra toplanan bir örnek olan eksprese prostat salgılarını (EPS) analiz ettik.
Introduction
Proteomik teknolojilerin sürekli evrimi, dokular ve biyofluidler gibi çok çeşitli örneklerde bulunan önemli moleküler efektörlerin yüksek çözünürlüklü haritalarını sağlayarak hastalık teşhisine ve tedaviye yanıt öngörüsünde önemli bir etkiye sahip olmayı vaat ediyor. Analitik bir bakış açısıyla, idrar toplama kolaylığı ve diğer biyofluidlere göre proteonun büyük stabilitesi gibi çeşitli avantajlar sunar1. İdrarın proteomik analizi, ürolojik kanserler üzerindeki biyobelirteç keşif çalışmalarına özel olarak ilgi çekmektedir, çünkü ilgi çekici dokulara yakın noninvaziv örneklemeye izin verir2. Özellikle, prostatla ilgili patolojileri incelemek için umut verici görünen bir örnek EPS-idrar3,4 'dür (yani, dijital rektal muayeneden (DRE) sonra toplanan idrar örneği). Örnek toplamadan önceki bu ikinci operasyon idrarı prostat spesifik proteinlerle zenginleştirir. EPS-idrar, prostat kanseri (PCa) dahil olmak üzere prostat bezi5 ile ilgili bozuklukları araştırmak için iyi bir adaydır, çünkü DRE aracılığıyla tümör tarafından salgılanan proteinler idrar örneğine dökülebilir ve kanser dokusuna özgü proteinleri tespit etme şansını arttırır.
Potansiyel protein biyobelirteçlerinin tespiti ve nicelleştirilmesine izin verilmesinde önemli bir rol kütle spektrometresi (MS) oynanır. Son yirmi yılda, proteomik analiz için MS tabanlı protokoller, MS enstrümantasyonunda ve veri analizi yazılımında sürekli iyileştirmeler sayesinde tek bir LC-MS / MS çalışmasında sürekli artan sayıda protein tespit edilmesine izin verdi6.
MS tabanlı proteomik numune hazırlama genellikle protein karışımının enzymatic sindirimini içerir, bu da aşağıdakiler gibi çok çeşitli protokollerle elde edilebilir: çözelti içi sindirim, MStern blotting7, süspansiyon bindirme (S-trap)8, katı fazlı geliştirilmiş numune hazırlama (SP3)9, Aşama İçi Sindirim10 ve filtre destekli numune hazırlama (FASP)11. Tüm protokoller üriner proteomik için kullanılabilir, ancak sonuçlar tanımlanan protein ve peptit sayısına göre ve tekrarlanabilirlik açısından değişebilir12.
Bu çalışmada dikkatimiz FASP protokolü tarafından EPS-idrar analizine odaklanmıştır. FASP protokolü başlangıçta dokulardan ve hücre kültürlerinden çıkarılan proteinleri analiz etmek için tasarlanmıştır, ancak kullanımı daha sonra idrar13gibi diğer örnek türlerinin analizine genişletildi. Basit çözelti içi sindirim ile ilgili olarak FASP daha esnek bir proteomik yaklaşım14, çünkü enzimatik sindirimden önce protein karışımından deterjanların ve tuzlar gibi diğer kirleticilerin etkili bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlamak15, optimal protein çözünürlüğü koşullarının seçimine izin verir. Ayrıca, FASP'nin ek bir özelliği, numune konsantrasyonu için bir araç sağlamasıdır. Bu, idrar proteomik analizi için özel bir ilgi alanıdır, çünkü nispeten büyük numune hacimlerinden (yüzlerce mikrolitre) başlamaya izin verir. FASP protokolünün potansiyeli ışığında, deneysel değişkenliği azaltmak ve paralel olarak yüksek sayıda numuneyi işlemek amacıyla çeşitli çalışmalar dikkatleri iş akışı otomasyonu üzerine yoğunlaştırmamıştır16.
İş akışımızda FASP'ı, yüksek proteom kapsamı, iyi nicel hassasiyet ve eksik değerlerin düşük insidansını sağlayan veriden bağımsız analizde (DIA) LC-MS/MS alımı takip etmektedir. DIA yaklaşımı, yalnızca en yüksek yoğunluğa sahip iyonların parçalandığı veriye bağımlı analizde (DDA) olanların aksine, MS/MS olayları için tüm iyonların seçildiği hassas bir yöntemdir. DIA modunda çalışan kütle spektrometresi, tüm m/z öncü aralığını kapsayan farklı izolasyon genişliğine sahip tarama döngüleri gerçekleştirir. Bu yaklaşım, birim zaman başına yüksek sayıda peptidi tekrar tekrar tespit etmeyi sağlar ve numunenin proteomik anlık görüntüsünü sağlar17. Dahası, DIA tarafından oluşturulan verilerin başka bir ilginç özelliği daha vardır: posteriori analizi olasılığı18. DIA verileri DDA tarafından elde edilenlerden daha karmaşıktır, çünkü DIA'daki MS/MS spektrumu, her m/z penceresindeki birkaç öncü iyonun birlikte yalıtıldığı19 . Kompozit MS/MS spektrumunu farklı ve spesifik peptit sinyallerine dağıtmak iki temel unsur kullanılarak elde edilir: spektral kütüphane ve veri analizi için özel bir yazılım. Spektral kütüphane, genellikle proteom kapsamını en üst düzeye çıkarmak için peptit fraksiyonasyonunu içeren veriye bağımlı bir deney tarafından oluşturulur, bu da incelenen örnekte tespit edilebilen binlerce deneysel olarak belirlenmiş öncü iyonların ve MS / MS peptit spektrumlarının bir listesini sağlar. Bunun yerine veri analizi yazılımı, peptit tespiti ve nicelleştirilmesine izin veren belirli ayıklanmış iyon kromatogramları oluşturarak DIA verilerini yorumlamak için spektral kütüphanede bulunan bilgileri kullanır. Kitaplık içermeyen DIA veri analizi artık mümkün olsa da, kütüphane tabanlı DIA hala proteom kapsamı açısından daha iyi sonuçlar sağlar20.
Burada açıklanan örnek hazırlama protokolü (Şekil 1) aşağıdaki adımlardan oluşur: bir santrifüjleme adımı (hücre kalıntılarını gidermek için), FASP sindirimi, StageTip saflaştırma21, proteinlerin nicelleştirilmesi ve DIA analizi. Bu protokol prostat kanseri biyobelirteç keşfi bağlamında EPS-idrar analizi için tasarlanmıştır, ancak herhangi bir idrar örneğinin proteomik analizine uygulanabilir.
Protocol
Çalışma, Catanzaro Magna Graecia Üniversitesi Kurumsal Etik Komitesi tarafından RP 41/2018 tarafından onaylandı. Çalışmaya kayıtlı tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı.
1. Numune hazırlama
- Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 2.100 x g'da 2 saat içinde eps-idrar örnekleri santrifüj. Süpernatant kullanılana kadar -80 °C'de saklayın.
2. Örnek çözülme
- Numuneyi sindirimden bir gün önce -80 °C'den -20 °C'ye aktarın.
- Numune işlemeden önce, numuneyi 4 °C'de 15-20 dakika ve ardından RT'de aktarın.
3. FASP için reaktif hazırlığı
- Aynı gün, aşağıdaki çözümleri hazırlayın: üre tamponu, üre tamponunda 50 mM iodoasetamid (IAA), 50 mM trietilammonyum bikarbonat ve 500 mM dithiothreitol (DTT).
- Üre tamponu hazırlayın (üre 8 M, 100 mM Tris-HCl pH 8): 10 mL için 4.800 mg üre ağırlığında ve 1 mL 1 M Tris pH 8 ekledikten sonra uygun miktarda HPLC suyunda çözün. Her numune için 800 μL üre hacmi gereklidir.
- 500 mM dithiothreitol (DTT) hazırlayın: 500 μL HPLC suda 38,5 mg DTT çözün. Her numune için 66,7 μL DTT gereklidir.
- Üre Tamponunda 50 mM IAA hazırlayın: 1 mL üre tamponunda 9,25 mg IAA çözün. Her numune için 50 μL IAA gereklidir.
- 50 mM trietilammonyum bikarbonat (TEAB) hazırlayın. 2,85 mL HPLC suya 150 μL 1 M TEAB ekleyin. Her numune için 460 μL TEAB gereklidir.
- HPLC suyunda bir tripsin çözeltisi (100 ng/μL) hazırlayın. Bu çözelti -80 °C'de saklanabilir ve kullanımdan hemen önce çözülebilir. Her numune için 2 μL (200 ng) gereklidir.
4. FASP tarafından protein sindirimi
- Proteinleri yatıştırmak ve disülfit bağlarını azaltmak için her EPS-idrar örneğinin 500 μL'sini %10 'luk (w/v) sodyum dodecyl sülfat (SDS) 66,7 μL ve 1 M Tris pH 8'in 33,3 μL'si ile seyreltin. Hafifçe sallanarak 95 °C'de 10 dakika kuluçkaya yaslayın.
- Filtre ünitesine (10 kDa) 300 μL seyreltilmiş EPS-idrar örneği ve 20 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj ekleyin.
- Filtreye 200 μL üre tamponu ekleyin ve 15 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj ekleyin. Bu adımı yineleyin ve akışa atın.
- 25 dakika boyunca 6.000 x g'da 50 μL IAA çözeltisi ve santrifüj ekleyin.
- 200 dakika boyunca 14.000 x g'da 200 μL üre tamponu ve santrifüj ekleyin. Bu adımı yineleyin ve akışa atın.
- 200 μL 50 mM trietilamonyum bikarbonat tampon (TEAB) ve 20 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj ekleyin. Bu adımı yineleyin.
- Filtre ünitesini yeni bir toplama tüpüne aktarın.
- 60 μL 50 mM TEAB tampon ve 200 ng tripsin ekleyin ve numuneyi bir gecede 37 °C'de bir termo-karıştırıcıda kuluçkaya yatırın.
NOT: Gece kuluçka sırasında numune buharlaşmasını önlemek için, her filtre ünitesini bir alüminyum folyo tabakası ve ardından bir parafilm tabakası ile sarın. - Tripsin inkübasyonundan sonra, 140 μL su ekleyin ve hazne hacmini (180-200 μL) toplamak için şişeyi 25 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin.
5. SCX saflaştırması için reaktif hazırlığı
- Aşağıdaki gibi 1 mL yıkama 1 (%0,5 formik asit (FA) ve %20 asetonitril (ACN)) hazırlayın: 750 μL HLPC suya %10 FA'nın 50 μL'sini ve %100 ACN'nin 200 μL'sini ekleyin. Her numune için 100 μL yıkama 1 gereklidir.
- 1,5 mL yıkama 2 (%0,5 FA ve %80 ACN) hazırlayın: 225 μL HPLC suya %10 FA 75 μL ve %100 ACN'nin 1,2 mL'sini ekleyin. Her numune için 190 μL yıkama 2 gereklidir.
- 100 μL eluting çözeltisi (500 mM amonyum asetat (AA) ve ACN'nin% 20'si hazırlayın: 25 μL 2 M AA ve 20 μL% 100 ACN ila 55 μL HPLC suyu ekleyin.
- Sahne İpuçlarını aşağıdaki gibi hazırlayın.
- 200 μL pipet ucunu künt uçlu bir şırınga iğnesi (gösterge 16) kullanarak scx reçine tabakası ile paketleyin. StageTip'i, mikrokolumu yerleştirmek için daha önce delinmiş bir mikrosantrifüj kapağına yerleştirin.
- Kapağı, orijinal kapağın çıkarıldığı 2 mL'lik bir mikrosantrifüje monte edin. Yeni monte edilen mikro SPE santrifüj cihazı tezgah üstü santrifüje sığmalıdır. Delikli kapakların hazırlanması sıkıcı olduğundan, birden fazla kez kullanılabilirler.
6. SCX saflaştırma
- Yıkama 2 kullanarak her numunenin 30 μL'sini 120 μL'ye seyreltin.
- Ekstraksiyon reçinesinin üzerine 50 μL yıkama 1 ekleyerek StageTip'i şart koşun ve 2 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj yapın. Akış direnci, ekstraksiyon reçinesinin pipet ucuna ne kadar güçlü bir şekilde paketlediğine bağlı olduğundan, 20-30 μL / dk akış hızı elde etmek için santrifüj hızının ayarlanması gerekebilir. Numune yükleme ve yıkama sırasında ucu kuru bırakmamaya çalışın.
- StageTip'i 50 μL yıkama 2 ve santrifüj 400 x g'da 2 dakika boyunca aşındırın.
- Seyreltilmiş numuneyi (120 μL) daha düşük bir dönüş hızı kullanarak yükleyin.
- StageTip'i 50 μL yıkama 2 ve santrifüj ile 400 x g'da 2 dakika yıkayın. 50 μL yıkama 1 ile tekrarlayın.
NOT: Bu yıkamadan sonra reçine tamamen kuru olmalıdır. - 7 μL elüat çözeltisi (500 mM amonyum asetat (AA) ve ACN'nin% 20'si) ile elute peptit karışımı yavaşça daha düşük bir dönüş hızı kullanarak.
- AA'yı seyreltmek ve LC-MS/MS ön enjeksiyonu için bir örnek elde etmek için 27 μL% 0.1 FA ekleyin. 34 μL'ye son seyreltme, idrar ve peptit çözeltisi arasında 1:1 hacimsel bir orana neden olacaktır (1 μL saflaştırılmış sindirim, 1 μL orijinal idrar örneğine karşılık gelecektir).
7. DDA analizi kullanılarak dış standarda göre protein nicelemesi (Şekil 2)
- Elde edilen peptit sindirmenin 2 μL'lik kısmını LC-MS/MS'e enjekte ederek ve elde edilen toplam peptit alanını aşağıdaki gibi oluşturulmuş bir kalibrasyon eğrisiyle enterpolasyonlayarak numunelerdeki protein miktarını belirleyin:
- HeLa sindirme stoğu (100 μg/μL) kullanarak beş farklı HeLa sindirme çözeltisi (1 ng/μL, 2,5 ng/μL, 7,5 ng/μL, 75 ng/μL) hazırlayın.
- Her Hela çözeltisi içine yinelenen (2 μL) enjekte edin.
- LC-MS/MS yöntemini ayarlayın.
- Beş HeLa peptit karışımından 2 μL enjekte edin ve peptitleri 3 μm C18 silika parçacıkları ile dolu 15 cm, 75 μm i.d sütun üzerinde 230 nL / dakika akış hızında 75 dakikalık doğrusal bir degradeden geçirin. Mobil faz A (%0,1 FA, %2 ACN) ve mobil B aşaması (%0,1 FA ve %80 ACN) tarafından oluşturulmuş ikili gradyan kullanın.
- Mobil faz B içeriğini 60 dakikada %6'dan %42'ye, ek 8 dakikada %42'den %100'e yükselterek degrade emisyon gerçekleştirin. 5 dakika boyunca %100 B'yi koruyun ve iki dakika içinde %0 B'ye geri dönün.
- En iyi 12 yöntemini kullanarak DDA modunda çalıştırın ve MS tam tarama aralığını 350-1800 m/z,çözünürlük 70.000, ACG hedef 1e6 ve maksimum enjeksiyon süresi 50 ms olarak ayarlayın. Öncü iyon yalıtımı için kütle penceresini 1,6 m/z, çözünürlük 35.000, ACG hedefi 1e5, maksimum enjeksiyon süresi 120 ms, HCD parçalanması 25 NCE (normalleştirilmiş çarpışma enerjisi) ve dinamik dışlama 15 saniye olarak ayarlayın.
- Arama motoru olarak Sequest ve veritabanı olarak HUMAN Uniprot Complete protein dizisini kullanarak ham dosyaları analiz edin. Burada sunulan deneylerde, veritabanı Mart 2016'da indirildi ve 42.013 dizi içeriyordu.
- Aşağıdaki ayarları kullanın: MS toleransı 15 ppm, MS/MS toleransı 0.02 Da, iki kaçırılan bölünme bölgesi ayarlayarak enzim olarak tripsin. Lizin, serine, threonine, tirozin (+57.021) ve metiyoninlerin oksidasyonunun dinamik modifikasyonlar ve sisteinlerin karbamidometilasyonu (+57.021) karbamidometilasyonunu statik değişiklikler olarak ayarlayın. Peptitler ve proteinlerin 0,01'e tanımlanması için yanlış keşif oranının (FDR) kesilmesini kullanın ve perkolatör tarafından filtreleyin.
- Tüm MS1 peptit sinyalleri için tepe alanını hesaplayın. Peptitlerin toplam alanını hesaplayın.
- HeLa örnekleri için kullanılan aynı LC-MS/MS yöntemini kullanarak EPS-idrar örneklerinden elde edilen 2 μL peptit karışımlarını enjekte edin ve HeLa veri işleme için kullanılan parametreleri kullanarak ham dosyayı analiz edin.
- Tanımlanan tüm peptitlerin alan değerlerini özetleyerek peptit sinyallerinin toplam yoğunluğunu hesaplayın ve dış standart eğriyi enterpolasyonlayın. Bu, EPS-idrar proteini sindirmesinde bulunan peptit miktarının kabul edilebilir bir tahminini sağlayacaktır.
8. C18 StageTip protokolü için reaktif hazırlığı
- 500 μL çözelti A (%0,1 Trifluoroasetik asit (TFA), %50 ACN hazırlayın): 240 μL HPLC suya %100 ACN 250 μL ve %5 TFA'nın 10 μL'sini ekleyin.
- 2 mL çözelti B (%0,1 TFA) hazırlayın: 1960 μL HPLC suya %5 TFA'nın 40 μL'sini ekleyin.
- 100 μL eluting çözeltisi hazırlayın (%0,1 FA, %50 ACN): 49 μL HPLC suya %10 FA'nın 1 μL'sini ve %100 ACN'nin 50 μL'sini ekleyin.
- Sahne İpuçlarını daha önce açıklandığı gibi hazırlayın. Bu durumda, C18 ayıklama diskleri kullanılır.
9. SCX/C18 Aşama İpucu protokolü
NOT: Tuzları çıkarmak için EPS-idrar sindirmelerini C18 StageTip protokolü ile arındırin.
- 2 μg peptitten başlayın (ön enjeksiyonla ölçtülmüş olarak). Yıkama 2 SCX'te sindirme çözeltisini 4 kat seyreltin ve yukarıda açıklandığı gibi devam edin (bölüm "SCX saflaştırma"). Peptit karışımını 7 μL elüat çözeltisi (500 mM amonyum asetat (AA) ve ACN'nin% 20'si) ile yavaşça daha düşük bir dönüş hızı (5 μL / dk akış hızı) kullanarak elute edin.
- SCX eluatını 3'ten düşük bir pH ve% 5'in altında bir organik çözücü konsantrasyonu elde etmek için trifluoroasetik asidin (TFA)% 0.1'inin 150 μL'si ile asitleştirin.
- C18 StageTip'i 50 μL çözelti A ve santrifüj 400 x g'da 2 dakika boyunca koşullandırılmıştır. 50 μL çözelti B ve santrifüj ile 2 dakika boyunca 400 x g'da C18 StageTip'i dengeleyin.
- Numuneyi daha düşük bir dönüş hızı kullanarak sahne ucuna yavaşça yükleyin.
- C18 StageTip'i 50 μL çözelti B ve santrifüj ile yıkayın.
- Peptit karışımını daha düşük bir dönüş hızı kullanarak 10 μL elution çözeltisi ile yavaşça elüte edin.
- Eluat'ı (10 μL) 30 °C'de vakumlu santrifüjde 3 dakika kurutun. 47 μL% 0.1 FA ekleyin. Beklenen peptit konsantrasyonu 40 ng / μL olacaktır.
10. DIA Analizi (Şekil 3)
- nanoLC ayrımı: Peptit karışımını, 3 μm C18 silika parçacıkları ile dolu 15 cm, 75 μm ID sütununda 230 nL/dk akış hızında 140 dakikalık doğrusal bir gradyan kullanarak ayırın.
- 230 nL/dakika akış hızında degrade elüasyon gerçekleştirin ve mobil faz B içeriğini 90 dakikada %3'ten %25'e, ardından 30 dakikada %25'ten %40'a ve son olarak 8 dakikada %40'tan %100'e çıkarın.
- %100 B'de 10 dakika sonra, sütunu 15 dakika boyunca mobil faz A ile aşındırın.
- Kütle spektrometrik parametreleri: aşağıdaki tarama döngüsünü kullanan bir yöntem kullanarak DIA analizi yapın: (i) 17.500 çözünürlükte tam tarama MS olayı (AGC hedef 1e6, maksimum enjeksiyon süresi 50 ms) ardından (ii) 20 m/z izolasyon genişliğinde 20 pencere, m/z 350'den başlayarak,(ii) 50 m/z izolasyon genişliğinde 5 pencere ve (iv) 200 m/z izolasyon genişliğinde 1 pencere, DIA tarama aralığını 1200 m/z'desona erdirin. DIA taramalarını 35.000 çözünürlükte gerçekleştirin (AGC hedef 5e5, maksimum enjeksiyon süresi 120 ms ve 25 NCE).
11. Kütüphane üretimi için yüksek pH ters faz C18 fraksiyonasyonu
NOT: Aşağıdaki prosedürle DIA analizi için veriye bağımlı bir kitaplık oluşturmak için 10 μg'den daha yüksek bir miktarda havuz EPS-idrar temsilcisi örnekleri:
- Peptit karışımını (11 μg) TFA'nın % 0,2'si kadar asitleştirin ve elde edilen çözeltiyi daha yüksek kapasiteye izin vermek için iki kat ekstraksiyon diski ile dolu bir C18 StageTip'e yükleyin. Tek bir mikro diskin (16 kalibrelik şırınga iğnesinden) yükleme kapasitesinin 5-10 μg aralığında olduğunu tahmin ettik.
- C18 saflaştırma için daha önce açıklandığı gibi koşul ve denge sabit fazı.
- Amonyum hidroksitin %0,2'sini içeren elütasyon çözeltileri kullanarak yüksek pH ters faz C18'den adım adım elüsiyon (n=10) ile peptit fraksiyonasyonu yapmak, 10 mM TEAB ve acn v/v konsantrasyonları artan (4%, 8%, 12%, 16%, 20%, 24%, 28%, 32%, 40%, 80%).
- DIA yönteminin aynı kromatografik parametrelerini kullanarak 10 kesir analiz edin. Ön analiz için daha önce benimsenen ayarları kullanarak kütle spektrometresini DDA modunda çalıştırın (bkz. "DDA analizi kullanılarak harici standarda göre protein nicelemesi").
12. Veri analizi
- DIA analizine adanmış bir yazılımda yüksek ters faz C18 fraksiyonasyonunun DDA LC-MS/MS deneylerinden elde edilen protein tanımlama sonuçlarını içe aktararak spektral kütüphaneyi oluşturun.
- Tanımlama ve niceleme için kullanılan parça iyonlarının minimum ve maksimum sayısını sırasıyla 3 ve 6 olarak ayarlayın. Elde edilen sonuçları 0,01 Q değerine göre filtreleyin.
- DIA ham dosyalarını içe aktarın ve her ham dosyayla spektral kitaplığı oluşturmak için kullanılan aynı FASTA dosyasını ilişkilendirin.
- Protein nicelemesi için kullanılan minimum ve maksimum benzersiz peptit sayısını sırasıyla 1 ve 10 olarak ayarlayın.
- Parça iyon tepe alanını özetleyerek her proteinin yoğunluğunu hesaplayın.
- Her numunedeki nicel proteinlerin yoğunluğuna sahip bir matris oluşturun.
Representative Results
İdrar proteomik analizi için bu protokol aşağıdaki adımları içerir: FASP sindirimi, harici standart kalibrasyon yoluyla protein miktarının tahmini, çift StageTip saflaştırma (SCX ve C18)ve DIA modunda LC-MS/MS analizi.
Protein sindirimi sonrası, elde edilen peptitlerin StageTip SCX saflaştırılmasından sonra ön enjeksiyonlar yapılır. LC-MS/MS ham dosyaları, tanımlanan peptitlerin sayısını, tanımlanan proteinlerin sayısını ve tespit edilen peptitlerin alanını elde etmek için işlenir. Tanımlanan tüm peptitlerin özetlenerek elde edilen toplam alan, protein içeriğini dış standarda enterpolasyon yoluyla tahmin etmek için kullanılır: beş farklı miktarda enjekte edilen bir HeLa protein sindirimi (sırasıyla 2, 5, 15, 50, 150 ng). Bu çalışmada analiz edilen altı numunenin protein miktarı numuneden örneğe değişerek ortalama 78 ng/μL değerini gösterdi.
Protein tahmininden sonra, dia analizinden önce her numuneden 2 μg sindirilmiş protein sıralı SCX ve C18 StageTip ile saflaştırılır. DIA verilerini aramak için spektral kitaplık, temsili bir örneğin (örneğin, örnek havuzu) yüksek pH ters faz fraksiyonasyonu ve DDA LC-MS/MS analizinden sonra oluşturulur. Yukarıda açıklanan parametreleri kullanarak, incelenen altı EPS-idrar örneğinde 2387 protein grubu belirledik ve ölçtük(Ek Tablo 1 ve Şekil 4).
Nitel bir bakış açısıyla tanımlanan ve nicel proteinler listesinin alaka düzeyini değerlendirmek için, elde edilen matris daha önce doğrudan tanımlanan 624 protein listesi ile karşılaştırıldı- EPS22, ilginç aday prostat kanseri biyobelirteçleri kaynağı olduğu kanıtlanmış daha invaziv bir prosedürde toplanan bir örnek. Toplamda 624 proteinden 508'i EPS-idrar üzerinde FASP/DIA protokolümüz tarafından başarıyla tespit edildi.
Şekil 1: Proteomik iş akışı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Dış standarda (HeLa digest) dayalı protein nicelemesi için deneysel tasarımımızın temsili). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: DIA analizinin temel adımları: (i) spektral kütüphanenin yüksek pH ters faz fraksiyonasyonu ve DDA analizi yoluyla detaylandırılması, (ii) DIA yaklaşımını kullanarak örnek analizi, (iii) Spectronaut tarafından veri analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Tespit edilen EPS-üriner proteinler için dereceli arsa. Seçilen birkaç isabet etiketlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Spektronaut'ta altı EPS-idrar örneğinde nicel proteinlerin temsili tablosu. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Bu çalışmada EPS-idrar örneklerini analiz etmek için bir strateji sunulmuştur. FASP protokolü üriner proteomik için ideal bir seçimdir, çünkü enzimamatik sindirimden önce numune konsantrasyonuna izin verir. Aslında, bu iş akışı kullanılarak, birkaç yüzlerce mikrolitre idrar tek bir filtreye yüklenebilir ve işlenebilir. Ayrıca, filtre üzerinde sindirim, denatürasyon koşulları seçiminde göreceli özgürlük sunar. Çalışmalarımızda protein denatürasyonu, idrar örneklerinin Tris, SDS ve DTT içeren bir tamponda seyreltilerek elde edilir (son konsantrasyon: 50 mM Tris, % 1 SDS, 50 mM DTT). Proteinler, numuneyi çözdükten hemen sonra, aktif proteazlar tarafından istenmeyen bozulmayı önlemek için verimli bir şekilde denatüre edilir. Orijinal FASP protokolü, yıkama hacminin 100 μL'den 200 μL'ye yükseltilmesiyle geliştirilmiştir. Bu şekilde, kalıntıların, özellikle de deterjanların filtreden daha iyi uzaklaştırılması sağlanır.
Enzimmatik sindirimden sonra, hızlı bir LC-MS/MS kullanılarak dış standartla protein tahmini, dia modunda çift StageTip saflaştırma ve LC-MS/MS analizini içeren protokolün son adımlarından önce, tüm numuneler için eşit başlangıç malzemesi (2 μg) üzerinde veriye bağımlı yöntem gerçekleştirilir.
FASP'nin çok yönlülüğü, düşük sayıda eksik değer sağlayan hassas bir yöntem olan DIA yaklaşımı ile ilişkilidir17. Çalışmalarımızda, 2387 protein tespit edildi ve ölçülerek EPS-idrarın ayrıntılı bir proteomik profilinin çizilmesi sağlandı. 2387 proteinin tanımlanması ve nicelleştirilmesi, peptitlerin yüksek pH ters fraksiyonasyonu ile elde edilen zengin bir spektral kütüphanenin üretilmesi ve geniş bir m/z öncül aralığına yönelik DIA yöntemimiz ile mümkün oldu. Bu iş akışı, daha önce doğrudan EPS analizinde bulunan proteinlerin% 80'inden fazlasını tanımladı ve EPS-üriner proteomların önemli bir kısmının gerçekten ifade edilen prostat salgılarından elde edildiğini gösterdi, bu nedenle prostat dokusuna özgü proteinlerin zengin bir kaynağı26.
Sonuç olarak, deneysel tasarımımız, idrar proteomunun zengin bir haritasını elde etmek için FASP'nin çok yönlülüğünü DIA hassasiyeti ile bire birler. Bu strateji EPS-idrar örneklerini analiz etmek için önerilir, ancak kullanımı genel olarak idrar proteomiklerine, hatta diğer örnek türlerine kadar genişletilebilir.
Disclosures
Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma MIUR (Ministero Università Ricerca, PRIN 2017 to MG) ve POR Calabria FESR 2014-2020, eylem 1.2.2, "INNOPROST" tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris HCL pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
| 2-iodoacetamide for synthesis | Merck | 8047440100 | |
| Acetonitrile for HPLC LC-MS grade | VWR | 83640.290 | |
| Ammonium acetate | Fluka | 9690 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma | 30501 | |
| ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water | Merck | 318612-500ML | |
| Dithiothreitol | Amresco | 0281-25G | |
| Empore Cation 47mm Extraction Disks | Microcolumn | 2251 | |
| Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
| Formic acid optima | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Hela Protein Digest Standard | Fisher Scientific | 88329 | |
| Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | MERCK | MRCPRT010 | |
| sodium dodecyl sulfate solution | Merck | 71736-500ML | |
| Thiethylammonium bicarbonate buffer | Merck | T7408-100ML | |
| trifluoroacetic acid | Riedel-de Haën | 34957 | |
| Trypsin from porcine pancreas | Merck | T6567-1MG | |
| Urea | Merck | U6504-500G | |
| Water HPLC gradient grade | Fisher Scientific | W/0106/17 | |
| Proteome Discoverer 1,4 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Spectronaut 14.0 | Biognosys |
References
- Hüttenhain, R., Soste, M., Selevsek, N., et al. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics. Sci Transl Med. 4 (142), 10 (2013).
- Roobol, M. J., Carlsson, S. V. Risk stratification in prostate cancer screening. Nature Reviews Urology. 10 (1), 38-48 (2013).
- Principe, S., et al. Identification of prostate-enriched proteins by in-depth proteomic analyses of expressed prostatic secretions in urine. Journal of Proteome Research. 11 (4), 2386-2396 (2012).
- Kim, Y., et al. Targeted proteomics identifies liquid-biopsy signatures for extracapsular prostate cancer. Nature Communications. 7, 1-10 (2016).
- Drake, R. R., et al. Clinical collection and protein properties of expressed prostatic secretions as a source for biomarkers of prostatic disease. Journal of Proteomics. 72 (6), 907-917 (2009).
- Macklin, A., Khan, S., Kislinger, T. Recent advances in mass spectrometry based clinical proteomics: Applications to cancer research. Clinical Proteomics. 17 (1), 1-25 (2020).
- Berger, S. T., et al. MStern blotting-high throughput polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane-based proteomic sample preparation for 96-well plates. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (10), 2814-2823 (2015).
- Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. Proteomics. 14 (9), 1006 (2014).
- Hughes, C. S., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).
- Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells. Nature Methods. 11 (3), 319-324 (2014).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Ding, H., et al. Urine Proteomics: Evaluation of Different Sample Preparation Workflows for Quantitative, Reproducible, and Improved Depth of Analysis. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1857-1862 (2020).
- Zhao, M., et al. A comprehensive analysis and annotation of human normal urinary proteome. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Wiśniewski, J. R. Quantitative Evaluation of Filter Aided Sample Preparation (FASP) and Multienzyme Digestion FASP Protocols. Analytical Chemistry. 88 (10), 5438-5443 (2016).
- Wiśniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method. Analytical Biochemistry. 410 (2), 307-309 (2011).
- Yu, Y., et al. Urine sample preparation in 96-well filter plates for quantitative clinical proteomics. Analytical Chemistry. 86 (11), (2014).
- Gillet, L. C., et al. Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: A new concept for consistent and accurate proteome analysis. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (6), 1-17 (2012).
- Liu, Y., Hüttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. Mass spectrometric protein maps for biomarker discovery and clinical research. Expert Review of Molecular Diagnostics. 13 (8), 811-825 (2013).
- Gallien, S., Duriez, E., Demeure, K., Domon, B. Selectivity of LC-MS/MS analysis: Implication for proteomics experiments. Journal of Proteomics. 81, 148-158 (2013).
- Muntel, J., et al. Advancing Urinary Protein Biomarker Discovery by Data-Independent Acquisition on a Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer. Journal of Proteome Research. 14 (11), 4752-4762 (2015).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Kim, Y., et al. Identification of Differentially Expressed Proteins in Direct Expressed Prostatic Secretions of Men with Organ-confined Versus Extracapsular Prostate Cancer. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1870-1884 (2012).
- Decramer, S., et al. Urine in clinical proteomics. Molecular and Cellular Proteomics. 7 (10), 1850-1862 (2008).
- Thongboonkerd, V. Practical points in urinary proteomics. Journal of Proteome Research. 6 (10), 3881-3890 (2007).
- Konvalinka, A., Scholey, J. W., Diamandis, E. P. Searching for new biomarkers of renal diseases through proteomics. Clinical Chemistry. 58 (2), 353-365 (2012).
- Drake, R. R., et al. In-Depth Proteomic Analyses of Direct Expressed Prostatic Secretions. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2109-2116 (2010).
