Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

In Vivo Imagem de dois fótons de megacariócitos e proplatelets na medula óssea do crânio do rato

Published: July 28, 2021 doi: 10.3791/62515
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1INSERM, EFS Grand Est, Université de Strasbourg

Summary

Descrevemos aqui o método para imagem de megacaiócitos e proplatelets na medula do osso do crânio de ratos vivos usando microscopia de dois fótons.

Abstract

As plaquetas são produzidas por megacaiócitos, células especializadas localizadas na medula óssea. A possibilidade de imagem de megacaiócitos em tempo real e seu ambiente nativo foi descrita há mais de 10 anos e lança uma nova luz sobre o processo de formação de plaquetas. Os megacariócitos estendem as saliências alongadas, chamadas proplatelets, através do revestimento endotelial dos vasos sinusoides. Este artigo apresenta um protocolo para imagem simultânea em tempo real fluorescentemente rotulado megacariócitos na medula óssea do crânio e vasos sinusoides. Esta técnica conta com uma pequena cirurgia que mantém o crânio intacto para limitar as reações inflamatórias. A cabeça do rato é imobilizada com um anel colado no crânio para evitar que os movimentos respirem.

Usando microscopia de dois fótons, megacariócitos podem ser visualizados por até algumas horas, permitindo a observação de saliências celulares e proplatelets no processo de alongamento dentro de vasos sinusoides. Isso permite a quantificação de vários parâmetros relacionados à morfologia das protrusões (largura, comprimento, presença de áreas de constrição) e seu comportamento de alongamento (velocidade, regularidade ou presença de pausas ou fases de retração). Esta técnica também permite o registro simultâneo de plaquetas circulantes em vasos sinusoides para determinar a velocidade plaqueta e a direção do fluxo sanguíneo. Este método é particularmente útil para estudar o papel dos genes de interesse na formação de plaquetas usando camundongos geneticamente modificados e também é favorável aos testes farmacológicos (estudar os mecanismos, avaliando drogas no tratamento de distúrbios de produção de plaquetas). Tornou-se uma ferramenta inestimável, especialmente para complementar estudos in vitro, pois agora se sabe que a formação in vivo e in vitro proplatelet depende de diferentes mecanismos. Foi demonstrado, por exemplo, que microtúbulos in vitro são necessários para alongamento proplatelet por si só. No entanto, in vivo, eles preferem servir como um andaime, o alongamento sendo promovido principalmente por forças de fluxo sanguíneo.

Introduction

As plaquetas são produzidas por células especializadas em megacaiócitos localizadas na medula óssea. A maneira precisa como os megacaiócitos liberam plaquetas na circulação há muito tempo não ficou clara devido ao desafio técnico em observar eventos em tempo real através do osso. A microscopia de dois fótons ajudou a superar esse desafio e levou a grandes avanços na compreensão do processo de formação de plaquetas. As primeiras observações in vivo de megacaito foram feitas por von Andrian e colegas em 2007, com a visualização de megacaiócitos fluorescentes através do crânio1. Isso foi possível porque a camada óssea no crânio frontoparietal de camundongos adultos jovens tem uma espessura de algumas dezenas de mícrons e é suficientemente transparente para permitir a visualização de células fluorescentes na medula óssea subjacente2.

Estudos subsequentes aplicaram este procedimento para avaliar a formação de proplatos em várias condições e decifrar os mecanismos subjacentes3,4,5,6. Esses estudos forneceram evidências definitivas de que os megacaiócitos ampliam dinamicamente as saliências, chamadas proplatelets, através da barreira endotelial dos vasos sinusoides(Figura 1). Essas propuladas são então liberadas como fragmentos longos que representam várias centenas de plaquetas em volume. As plaquetas serão formadas após a remodelação das propuladas na microcirculação de órgãos a jusante, notadamente nos pulmões7. Até o momento, no entanto, o processo preciso e os mecanismos moleculares permanecem sujeitos a debate. Por exemplo, o papel proposto das proteínas citoesqueletal no alongamento das proplatelets difere entre as condições in vitro e in vivo 3, e as diferenças na formação de proplatelets têm sido demonstradas sob condições inflamatórias6. Complicando ainda mais as coisas, um estudo recente contestou o conceito orientado por proplatelet e propôs que in vivo, plaquetas são essencialmente formadas através de um mecanismo de brotação de membrana no megacaiócito nível8.

Este artigo apresenta um protocolo para a observação de megacaiócitos e proplatelets na medula óssea do osso do crânio em camundongos vivos, usando um procedimento minimamente invasivo. Abordagens semelhantes foram descritas anteriormente para visualizar outras células de medula, notadamente células hematopoiéticas e progenitoras9. O foco aqui está na observação de megacaiócitos e plaquetas para detalhar alguns parâmetros que podem ser medidos, notadamente morfologias proplatelet e velocidade plaqueta. Este protocolo apresenta como inserir um cateter na veia jugular para injetar traços fluorescentes e drogas e observar através do osso do crânio. O osso calvário é exposto usando uma pequena cirurgia para que um anel seja colado ao osso. Este anel serve para imobilizar a cabeça e evitar movimentos devido à respiração e formar um copo cheio de soro fisiológico como o meio de imersão da lente. Esta técnica é bem adequada para i) observar em tempo real a geometria sinusoide e megacariócitos interagindo com a parede do vaso; ii) seguir os megacaitos no processo de formação de proplatelet, alongamento e liberação; e iii) medir os movimentos das plaquetas para monitorar o complexo fluxo sanguíneo sinusoide. Os dados obtidos usando este protocolo foram publicados recentemente3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as normas europeias 2010/63/UE e o Comitê de Ética em Experimentos Animais da Universidade de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg, Acordo de Instalações Animais N°: G67-482-10, acordo de projeto N°: 2018061211274514).

1. Preparação de camundongos e inserção de cateter na veia jugular

NOTA: Aqui, foram utilizados ratos repórteres mTmG de 5-7 semanas de idade (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10) cruzados com ratos Pf4-cre11, permitindo rotulagem intensa de fluorescência verde em megacariócitos e plaquetas12. Antes de começar o experimento, pré-aqueça a câmara de aquecimento do microscópio por algumas horas.

  1. Transporte o rato para a sala de imagens e prossiga para anestesia.
    1. Anestesiar o camundongo por injeção intraperitoneal (i.p.) de uma solução de cetamina (cetamina (100 μg/g) e xilazina (10 μg/g) (5 μL/g).
      NOTA: A administração repetida de cetamina/xilazina é usada aqui e funciona bem, mas requer a interrupção da gravação para reinjeção regular. Alternativamente, se uma máquina de anestesia estiver disponível, a indução da anestesia pode ser realizada com cetamina/xilazina e, posteriormente, mantida sob inalação de gases (mistura de isoflurano, ar e oxigênio).
    2. Substitua o animal em sua gaiola até atingir anestesia profunda. Coloque o mouse em uma placa aquecida a 37 °C para todas as manipulações subsequentes.
      NOTA: Enquanto o animal atinge anestesia profunda, ligue o microscópio e todos os equipamentos (ver seção 4.1) e configure os diferentes parâmetros necessários (ver seção 4.2) para iniciar o experimento assim que a cirurgia for feita. Aqui, o procedimento dura apenas 3h e é terminal. O rato é eutanizado após o experimento sem acordar. Assim, a desinfecção do etanol para pele e instrumentos é suficiente. No entanto, dependendo das diretrizes institucionais, ou se o procedimento durar mais tempo, devem ser utilizados métodos mais completos de desinfecção, como três esfregões alternados com betadina/povidona e álcool.
  2. Instale um cateter na veia jugular.
    NOTA: É importante evitar a contaminação microbiana durante a cirurgia na medida do possível. Tome cuidado para desinfetar cuidadosamente a pele com 70% de etanol (EtOH) antes de prosseguir com a cirurgia. Use sempre tesouras e pinças esterilizadas e enxágue-as regularmente em 70% de EtOH. Trabalhe em um lugar limpo, e use uma máscara facial. Um cateter "over-the needle" de 22 G, composto por uma agulha dentro de um tubo plástico, é usado para injeção intravenosa (ver a Tabela de Materiais).
    1. Coloque o mouse nas costas e conserte as pernas anteriores com fita cirúrgica para esticar a garganta(Figura 2A). Desinfete a garganta com 70% de etanol.
      NOTA: Por conveniência, a garganta pode ser raspada antes da cirurgia. Se o procedimento durar mais tempo, deve ser realizada uma barba cuidadosa para uma técnica asséptica adequada.
    2. Faça uma incisão de 0,7-1 cm sobre a veia jugular direita ou esquerda usando uma tesoura estéril. Estique o tecido conjuntivo adjacente para expor a veia jugular externa e a parte superior do músculo peitoral(Figura 2A).
    3. Encha o cateter com soro fisiológico quente e estéril. Insira o cateter na veia após penetrar através do músculo peitoral(Figura 2B).
      NOTA: Tome cuidado para evitar bolhas de ar dentro do cateter. É importante inserir o cateter através do músculo para evitar hemorragia, pois o músculo formará um ponto de compressão. Mesmo camundongos com defeitos de hemostase, como Itgb3-/- ratos, não sangram na inserção do cateter com essa abordagem.
    4. Retire suavemente a agulha e, se necessário, mova cuidadosamente o cateter para dentro da veia. Conecte a seringa e estabilize o cateter adicionando uma gota de cola cirúrgica(Tabela de Materiais).
      NOTA: É possível inserir um cateter dentro da veia traseira, embora exija alguma prática porque a veia tem um calibre menor. Isso é especialmente difícil quando se usa ratos com cabelos escuros, cuja veia traseira é pouco visível. Devido ao seu maior calibre, o posicionamento do cateter dentro da veia jugular pode permitir que volumes maiores ou tratamentos repetidos sejam injetados de forma mais confiável. Observe que a seringa é preenchida pela primeira vez com soro fisiológico quente, e não se esqueça de injetar o volume morto antes de injetar a solução da droga.
    5. Retorne cuidadosamente o mouse para uma posição propensa(Figura 2C). Aplique gel (Tabela de Materiais) nos olhos para evitar o ressecamento.

2. Cirurgia e instalação do anel craniano

NOTA: O suporte completo para instalação do mouse compreende 4 peças, um bloco e uma placa, o anel para segurar a cabeça do mouse e um parafuso para fixar o anel ao bloco(Figura 3A). Todos os elementos do suporte foram obtidos a partir de i.materialise.com por impressão 3D. A placa é feita de polímero de estireno butadieno de acrilonitrilo (ABS), o bloco e o parafuso de aço inoxidável, e o anel de aço inoxidável de alto grau (aço inoxidável de alto detalhado) (Ver Figura Suplementar S1 para dimensões e Materiais Suplementares para os arquivos de impressão 3D). O bloco é fixado permanentemente ao suporte, seja parafusado ou colado. Uma vez fixado o anel no crânio do mouse, ele deve ser aparafusado ao suporte do bloco(Figura 3A).

  1. Umedeça o cabelo no couro cabeludo com uma toalha de papel molhada com 70% de etanol para desinfecção. Remova todo o cabelo solto com uma toalha de papel molhada.
    NOTA: Por conveniência, o couro cabeludo pode ser raspado antes da cirurgia.
  2. Incisar o couro cabeludo formando um T na linha média até 1 cm e entre as orelhas para expor o calvarium usando tesouras finas estéreis e pinças.
    NOTA: O anel será posicionado para sobrepor os ossos frontal e parietal(Figura 3B).
  3. Use pinças estéreis para expor o crânio. Remova cuidadosamente o periósteo com tesouras e pinças. Use um cotonete estéril encharcado com soro fisiológico para remover todo o periosteum e quaisquer detritos ou cabelos, que possam alterar a imagem.
    NOTA: Para limitar as reações inflamatórias, tome muito cuidado para não danificar o osso.
  4. Remova qualquer traço sanguíneo enxaguando com soro fisiológico, e seque rapidamente o osso com um cotonete seco. Aplique o gel de cola no anel, posicione-o sobre o osso exposto e mantenha-o por alguns segundos para que o anel fique firmemente preso ao crânio.
    NOTA: Nenhuma cola deve entrar no campo de observação, pois pode levar a uma autofluorescência indesejável.
  5. Umedeça levemente o crânio com um cotonete imerso em soro fisiológico.
  6. Prepare a pasta dentária de silício misturando cuidadosamente os componentes azul e amarelo 1:1. Aplique pasta dentária em todo o anel para vedação para evitar vazamentos durante a imagem. Remova cuidadosamente qualquer pasta dentária ou cola que possa ter entrado no anel.
  7. Encha o anel com soro fisiológico e verifique se há vazamento.
    NOTA: O soro fisiológico serve como meio de imersão para o objetivo do microscópio. O sangramento pode ser mais crítico ao usar camundongos com defeitos relacionados à hemostasia. É essencial evitar que o sangue entre no anel, pois pode desfocar mais imagens.
  8. Coloque o mouse no suporte e enrosque o anel no suporte do bloco(Figura 3C). Coloque compressas dobradas sob a cabeça do animal para levantar a cabeça e evitar o descolamento do anel do crânio.
    NOTA: A cabeça é diretamente fixada para evitar movimentos de imagem devido à respiração.
  9. Posicione o suporte e a montagem do mouse na câmara de microscópio aquecido(Figura 3D).
    NOTA: Tenha cuidado para não desalojar o cateter inserido a qualquer momento.

3. Acompanhamento dos camundongos anestesiados até o final do experimento

NOTA: A anestesia é reinduzida a cada 35 minutos por alternar injeções subcutâneas (s.c.) de cetamina (25 μg/g) em um volume de 5 μL/g de peso corporal e uma mistura de cetamina (50 μg/g) e xilazina (5 μg/g) (1,2 μL/g). Como não é possível abrir a câmara de microscópio aquecido durante a aquisição, o monitoramento anestésico é realizado antes e depois da regeração do anestésico por beliscar o dedo do dedo do dedo. Da mesma forma, o toe pinch é realizado antes de iniciar cada nova gravação de vídeo.

  1. Se necessário, pare de aquisição e reinduza a anestesia por injeção de s.c.
    1. Tomando cuidado para não mover a cabeça do rato, beliscar a pele da parte de trás entre o polegar e o dedo indicador da mão esquerda. Injete subcutâneamente o anestésico na dobra da pele traseira usando a mão direita (ou vice-versa para pessoas canhotas).
  2. Verifique se há presença de soro fisiológico no anel e, se necessário, preencha com soro fisiológico fresco. Continue gravando pelos próximos 35 minutos, e prossiga da mesma forma para a duração da gravação.
  3. No final do experimento, eutanize o rato por luxação cervical antes que ele acorde.
    NOTA: O mouse é mantido anestesiado por uma duração máxima de 3h, de acordo com o comitê local de ética e bem-estar animal.

4. Imagem de dois fótons

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre o microscópio e equipamentos relacionados. As imagens foram gravadas com um scanner ressonante (12 ou 8 kHz). O modo bidirecional foi criado para aumentar a aquisição de velocidade à medida que os pixels são registrados em ambas as direções; portanto, qualquer incompatibilidade na fase deve ser corrigida com a "correção de fase" do painel de controle. Finalmente, uma média adaptada foi configurada como um compromisso entre a velocidade de aquisição e a relação sinal-ruído.

  1. Ligue o microscópio de dois fótons, incluindo o laser e o scanner ressonante (potência laser de saída geralmente ~1,8-2,5 W dependendo do laser).
  2. Defina o comprimento de onda laser apropriado para os fluoroforos escolhidos. Defina o comprimento de onda apropriado para a recuperação de luzes emitidas.
    NOTA: Aqui, um comprimento de onda de 913 nm e detectores híbridos (500-550 nm e 575-625 nm) foram usados para simultaneamente excitar e detectar AlexaFluor-488 e Qtracker-655, respectivamente.
  3. Utilizando o cateter intrajugular, injete o rastreador fluorescente para rotular a vasculatura (Qtracker-655; Tabela de Materiais). Injete 50 μL/mouse de uma solução a 0,2 μM, renovada uma vez a cada hora para um máximo de 150 μL/experimento.
    NOTA: Outros rastreadores podem ser usados, como dextran de alto peso molecular1. Nesse caso, considere que a viscosidade sanguínea pode ser alterada pelo Dextran e modificar alguns parâmetros hemorheológicos.
  4. Coloque o estágio do microscópio com o suporte e o mouse sob o objetivo do microscópio. Verifique se o anel está sempre cheio de soro fisiológico e mergulhe no objetivo. Use epifluorescência para localizar os vasos de medula óssea (vermelho) e a presença de megacaiócitos (verde) alinhados ao longo de vasos sinusoides.
    NOTA: O osso do crânio tem uma espessura inferior a 100 μm2. A medula está localizada sob o osso e é facilmente reconhecida pelos megacariócitos verdes fluorescentes e pelos densos vasos sinusoides vermelhos rotulados por Qtracker-655.
  5. Aquisições longas (megacaiócitos, proplatelets)
    1. Procure a região de interesse. Aplique parâmetros de aquisição de imagem como mencionado acima.
    2. Para aquisições longas (por exemplo, visualização de formação de proplatelet ou alongamento), adquira imagens de pilha z com intervalos otimizados (geralmente entre 0,85 e 1,34 μm) usando um scanner ressonante de 8 kHz.
      NOTA: Um scanner ressonante de 12 kHz pode aumentar a velocidade de aquisição.
    3. Adquira imagens de 384 x 384 pixels para visualizar todo o megacaiócito e o vaso. Use a média da linha, conforme desejado, para aquisição rápida com boa resolução. Determine o intervalo de tempo da aquisição da pilha de imagens, geralmente de 10 ou 30 s para visualização proplatelet.
      NOTA: Aqui, uma média de linha de 8 foi usada para obter uma maior relação sinal-ruído, o que permitiu a aquisição de 1 imagem/10 s com um scanner ressonante de 8 kHz. Certifique-se de que a média da linha durante a aquisição ao vivo é permitida.
  6. Aquisição curta e rápida (plaquetas)
    NOTA: Para a aquisição mais curta de eventos rápidos, como a velocidade plaqueta, é essencial maximizar a taxa de aquisição de quadros. A seleção do tipo de aquisição adequada otimizará a taxa de aquisição de quadros (ou seja, um tipo de aquisição de espaço-tempo "xyt").
    1. Minimize (por exemplo, 256 x 90 pixels) e ajuste o tamanho da imagem para o vaso girando o campo de imagem, se necessário.
    2. Use a maior velocidade de varredura disponível.
    3. Use digitalização bidirecional.
      NOTA: Para digitalização bidirecional, certifique-se de que a fase esteja bem ajustada.
    4. Minimize a média da linha para encontrar o compromisso ideal entre definição de imagem e rapidez de aquisição.
      NOTA: Para medições de velocidade plaqueta, uma imagem pixelizada pode ser suficiente se ajudar a aumentar a rapidez da aquisição.
    5. Minimize a pilha z para aumentar a rapidez de aquisição. Adquirir apenas 1 z-stack é suficiente para quantificar a velocidade plaqueta. Adquira por 10-20 s para medir a velocidade da plaqueta.
      NOTA: Um máximo de 133 quadros/s pode ser obtido usando estas condições com um scanner ressonante de 12 kHz. Os parâmetros devem ser adaptados às condições. Em alguns vasos, a velocidade da plaqueta é, no entanto, muito alta para quantificar a velocidade plaqueta com essas configurações de forma confiável.
  7. Medida de largura e comprimento do proplato
    NOTA: Para carregar arquivos LIF obtidos no software Leica com ImageJ, primeiro baixe e instale o plug-in LOCI no ImageJ para usar o Importador de Formatos Biológicos.
    1. Largura do propulato
      1. Abra o filme com ImageJ. Para realizar a medição da largura, use apenas o filme das propulações sem o vaso. Para separar os diferentes canais, clique em Imagem| Colora e selecione Canais divididos.
      2. Para um filme de pilha z, faça uma projeção z média para cada ponto de tempo clicando em Imagem| Empilhe e selecione Projeto Z. Para o tipo de projeção,digite intensidade média.
      3. Trate a imagem para remover o ruído. Subtraia o plano de fundo clicando em Process| Subtraia o plano de fundo e aplique raio de bola rolando: 50,0 pixels. Suavizar a imagem clicando em Process and Smooth.
      4. Trace uma linha perto da base da propulato (perto do megacaiócito, evitando qualquer outro objeto).
        NOTA: Não se esqueça de definir a escala da imagem para obter o valor na unidade desejada clicando em Analisar e Definir escala. Por padrão, a unidade da imagem está em pixels.
      5. Plote o perfil de intensidade, encaixe uma curva gaussiana e calcule a Largura Total na Metade Máxima (FWHM). Para isso, escreva o seguinte script em uma macro clicando em Plugins| Novo e selecione Macro e execute-o clicando em Macro| Executar macro: y=getProfile(); x=Array.getSequence(y.length); Fit.doFit ("Gaussian", x,y); Fit.plot(); sigma=Fit.p(3); FWHM = (2 * sqrt( 2 * log(2) ) * sigma; impressão (FWHM).
        NOTA: Certifique-se de que há apenas um único pico na varredura de linha, correspondendo à intensidade proplatelet.
      6. Execute as ações descritas na etapa 4.7.5 em 1 fatia ou repetidas ao longo do tempo para obter a largura média do proplatelet
    2. Comprimento de propulato
      1. Trace uma linha ao longo da proplatelet, da base perto do megacaiócito até o topo. Use uma linha segmentada para seguir a forma proplatelet. Repita para cada ponto de tempo.
      2. Lembre-se de salvar cada linha usando o Gerenciador de ROI: clique em Analisar | Ferramentas e selecione ROI Manager. Clique em Adicionar na janela Gerenciador de ROI para adicionar cada linha ao gerenciador como for selecionado. Para salvar todas as linhas em uma pasta, clique no Gerenciador de ROI em Desmarcar | Mais e clique em Salvar. Do Roi Manager, extraia o valor de comprimento de cada linha(Medida)da tabela de resultados.
        NOTA: Não se esqueça de definir a escala da imagem para obter o valor nas unidades desejadas clicando em Analisar e Definir escala. Por padrão, a unidade da imagem está em pixels.
  8. Medição da velocidade plaqueta
    NOTA: A velocidade plaqueta é calculada a partir da gravação de vídeo de plaquetas fluorescentes que fluem dentro do vaso acima de 10-20 s. Um tratamento de primeira imagem é realizado para obter dados de varredura de linha ciclicamente repetidos. O movimento leva a listras cujo ângulo depende da velocidade, permitindo seu cálculo. Aqui, a velocidade foi calculada com um método que utiliza a transformação Radon, que é mais robusta do que o método clássico de decomposição de valor singular (SVD)15.
    1. Tratamento de imagem com ImageJ
      1. Abra o filme com ImageJ. Aplique um filtro gaussian Blur clicando em Process | Filtros, selecione Desfoque gaussianoe aplique Sigma (Raio): 2.00. Escolha uma pequena região para medir o fluxo e rastreie 3 linhas adjacentes seguindo a direção de fluxo.
        NOTA: Não se esqueça de salvar cada linha usando o Gerenciador de ROI clicando em Analisar | Ferramentas | Gerente do ROI. Clique em Adicionar na janela Gerenciador de ROI para adicionar cada linha e salvá-las; clique primeiro em Desmarque | Mais e, em seguida, clique em Salvar.
      2. Usando o software de varredura de linha ImageJ, construa um kymograph para cada linha clicando em Image | Pilhas; selecionar Reslice e aplicar os seguintes parâmetros: Espaçamento de saída (mícrons): 1.000 / Contagem de fatias: 1 / Evitar interpolação. Salve as imagens de espaço-tempo resultantes.
        NOTA: A imagem resultante mostra listras correspondentes ao movimento linear das plaquetas no fluxo sanguíneo ao longo do tempo. O ângulo de uma raia é uma função da velocidade.
    2. Medição de velocidade usando software Matlab ou GNU Octave
      NOTA: A velocidade das plaquetas no fluxo sanguíneo é estimada a partir das imagens espaço-tempo usando um método de análise computacional baseado na transformação radon descrita por Drew e colaboradores15. A descrição deste método matemático está além do escopo desta revisão, e o leitor é encaminhado à publicação por Drew et al. para detalhes sobre o cálculo15. Tanto o código Matlab quanto mais informações estão disponíveis em seu site https://www.drew-lab.org/code.
      1. Abra o código usando o software Matlab ou GNU Octave.
        NOTA: O código pode exigir adaptação de acordo com o estudo desejado.
      2. Extrair o valor das 3 imagens espaço-tempo, correspondentes às linhas adjacentes desenhadas na mesma porção da nave. Calcule o valor médio da velocidade do fluxo plaqueta para esta parte do vaso.
        NOTA: Não se esqueça de converter o resultado na unidade correta de medida (por exemplo, μm/s).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Usando este protocolo, o rastreador fluorescente, Qtracker-655, foi administrado por via intravenosa a vasos sinusoides de medula anastomosa na medula óssea do crânio e na direção de fluxo, como retratado pelas setas(Figura 4A, à esquerda). Utilizando camundongos mTmG, as plaquetas fluorescentes eGFP foram registradas acima de 20 s em cada ramo do navio, e sua velocidade foi medida usando o software ImageJ e GNU Octave(Figura 4A, à direita). Note a heterogeneidade na velocidade e direção do fluxo. Os vasos sinusoides apresentam fluxos complexos devido aos anastomoses, com a presença de fluxo de fluxo e até estase, como mostra a bifurcação registrada no Vídeo 1. A mesma bifurcação é mostrada na Figura 4B (esquerda), com as setas vermelha e azul destacando fluxos opostos. A velocidade plaqueta nesta bifurcação foi medida e relatada no gráfico (Figura 4B, à direita). O rastreamento vermelho corresponde à velocidade no ramo da nave esquerda e ao rastreamento azul ao do ramo da embarcação direita. Isso mostra irregularidade ao longo do tempo em cada ramo de embarcação, com fases de aceleração, estase e desaceleração. É importante notar que, em alguns vasos, o fluxo sanguíneo era muito rápido para análise confiável nas atuais condições de aquisição.

A gravação de alongamento proplato permite a visualização de suas várias morfologias ao longo do tempo(Figura 5). Alguns proplatelets alongam com morfologias irregulares(Figura 5Ai e Vídeo 2). Outros, geralmente mais finos, podem se estender por longas distâncias, exigindo o movimento da janela de aquisição para seguir sua extensão (Figura 5Aii e Vídeo Suplementar 1). Outros são mais curtos e mais grossos e geralmente alongam lentamente(Figura 5Aiii e Vídeo Suplementar 2). Quando os megacaitos estendem as propulações em áreas de fluxos complexos, como a bifurcação mostrada na Figura 4B,as propuladas são lançadas de um ramo de navio para o outro de acordo com a direção de fluxo(Figura 5B e Vídeo 3). A importância das forças hemodinâmicas para o alongamento proplatelet na direção do fluxo foi evidenciada quando o rato inesperadamente sofreu parada cardíaca. Parar o fluxo sanguíneo relaxou as propuladas estendidas pelo megacaiócito (Figura 5C e Vídeo 4).

Quando a qualidade/resolução da aquisição é apropriada, parâmetros morfológicos podem ser medidos, como o comprimento das proplatas até o descolamento, sua largura na base da propulação ou qualquer outro local definido, ou o tamanho dos botões(Figura 6A). Foi calculada uma largura de proplatelet máxima média de ~185 μm (faixa 41,5-518,5 μm) e uma largura de proplato média de 5,2 μm (faixa de 2,8-8 μm)(Figura 6A). A traçação do comprimento do proplato em função do tempo permite a visualização do comportamento dos proplatelets durante fases de alongamento, estase ou até mesmo retração(Figura 6B). A medição da velocidade de alongamento do proplato é um parâmetro importante, que reflete diretamente o comportamento de alongamento, estase ou retração dos proplatelets3.

A velocidade de alongamento do proplato pode ser medida se a propolatoleta permanecer presa à sua célula mãe; uma vez separado, ele será imediatamente levado pelo fluxo e desaparecerá da janela de visualização. Em camundongos do tipo selvagem (WT), a velocidade média de alongamento proplatelet foi de ~10 μm/min(Figura 6C),de acordo com as publicações anteriores1. Por fim, é possível injetar drogas através do cateter inserido na veia jugular. Por exemplo, observou-se que a administração intravenosa da vincristina, uma droga que despomaliza microtúbulos, levou à retração de proplatelets de camundongos WT, mas não teve efeito sobre proplatelets de camundongos deficientes de myosinaIIA(Myh9-/-)(Vídeo 5 e Vídeo 6)3.

Figure 1
Figura 1: Representação esquemática da formação de proplatelet na medula óssea. Após a diferenciação das células-tronco hematopoiéticas, grandes megacaiócitos se alinham ao longo de vasos sinusoides e estendem projeções citoplasmáticas, chamadas proplatelets, através da barreira endotelial. Os propulados alongam e se desprendem sob a influência das forças hemodinâmicas para remodelar ainda mais em plaquetas na microcirculação a jusante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Inserção do cateter. (A) Uma incisão é feita para expor a veia jugular e a parte superior do músculo peitoral. (B) O cateter preenchido com soro fisiológico é inserido na veia jugular através do músculo, criando um ponto de compressão. (C) O mouse é cuidadosamente virado para que ele fique a superfície ventral para baixo com o cateter bem posicionado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Configuração experimental usada para imagens de dois fótons através do osso do crânio. (A) O bloco de aço inoxidável impresso em 3D é fixado no suporte ao polímero ABS (ver Figura Suplementar S1 e Materiais Suplementares para os desenhos 3D). O bloco e o anel do crânio são projetados para que o anel possa ser aparafusado ao bloco. Note que, para facilitar o uso, a cabeça do parafuso foi embutida em Epon. (B) Esquema mostrando o posicionamento do anel no osso do crânio exposto. (C) Fotografias ilustrando o mouse com o anel colado ao crânio, a cabeça em uma almofada de tecido e (D) o posicionamento sob o objetivo do microscópio. Abreviaturas: 3D = tridimensional; ABS = estireno de butadieno de acrilonitrilo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Medida da velocidade plaqueta no crânio vasos sinusoides anastomose de medula óssea. (A) Imagem esquerda, dois fótons de vasos sinusoides rotulados pela injeção Q-Dot. z-projeção mostrando a anastomose dos vasos sinusoides na medula óssea do crânio. As setas indicam a direção do fluxo, ilustrando a complexidade dos fluxos em sinusoides. Certo, velocidade média de fluxo estimada pela medição da velocidade plaqueta em cada ramo do navio. Os números no eixo x correspondem aos números de seta na imagem à esquerda. (B) Bifurcação esquerda, sinusoide delineada por linhas pontilhadas, mostrando plaquetas fluindo em direções opostas (setas vermelhas e azuis) (correspondente ao Vídeo 1). Imagem de avião único de dois fótons. À direita, um gráfico mostrando a velocidade de fluxo em cada porção do vaso em função do tempo (linha vermelha, lado esquerdo; linha azul, lado direito), mostrando fases de estase, aceleração e desaceleração. Barras de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Várias morfotologias proplatelet observadas na medula do crânio por microscopia de dois fótons. (A) Três proplatelets in vivo representativas: imagens de projeção z de experimentos de lapso de tempo (mostrados no Vídeo 2, Vídeo Suplementar 1e Vídeo Suplementar 2) mostrando as várias morfologias de proplatelets (setas) estendendo-se dentro dos sinusoides de medula óssea. Propulatos e megacariócitos estão em verde; vasos sinusoides estão em vermelho. (B) Imagens de lapso de tempo de uma propulação na mesma bifurcação da Figura 4B,oscilando de acordo com a direção do fluxo (também mostrada no Vídeo 3). (C) z-projeção imagens de lapso de tempo mostrando relaxamento de 3 proplatelets após a cessação do fluxo sanguíneo devido à parada cardíaca do mouse (mostrado no Vídeo 4), anteriormente alinhadas na mesma linha de fluxo (indicada pelas setas branca, amarela e azul). Barras de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Análises morfológicas proplaletas. (A) Imagem superior e z-projeção representando o local onde a largura proplatelet foi medida juntamente com o comprimento máximo; abaixo estão gráficos representando o comprimento máximo de 25 proplatelets individuais e a largura média proplatelet dos mesmos proplatelets (mesmo código cinza) ao longo do alongamento. i) A largura de proplatelet foi medida desenhando uma linha perpendicular em uma posição fixa próxima à base do proplatelet, e a intensidade do perfil foi registrada nesta posição a cada minuto. Uma curva gaussiana foi encaixada a este perfil, e o FWHM foi considerado para representar a largura da propulação. A largura média foi então calculada pela média das larguras do proplatelet medido em cada ponto de tempo na posição fixa. As barras são médias ± sem da largura medida a cada minuto durante a aquisição; ii) também foi determinado o comprimento máximo do proplatelet, desde a base do proplatelet até a ponta. (B) Traçados individuais mostrando o comportamento de alongamento das proplatelets WT, alguns deles apresentando fases de pausa e retração. Para melhor destacar as pausas e retrações no processo de crescimento proplatelet, o comprimento medido a cada 10 s foi representado como uma porcentagem do comprimento máximo de cada proplatelet. (C) Dispersar o enredo representando a velocidade de alongamento proplatelet. A velocidade de alongamento da propulação média líquida (incluindo pausas e retrações) foi calculada como a mudança no comprimento do proplatelet em intervalos de 1 min, em média durante toda a sequência de tempo. Valores individuais e média ± sem. Abreviaturas: FWHM = Largura Total a Metade Máxima; sem = erro padrão da média; WT = tipo selvagem.

Vídeo 1: Fluxo reverso dentro de vasos sinusoides. Plaquetas circulantes (verde) dentro dos vasos sinusoides (vermelho, Qtracker) (único plano z confocal). Um vaso sinusoide anastomos é mostrado apresentando bifurcações onde o fluxo é instável e exibe fases de estase, aceleração e desaceleração. Adquirido com um microscópio Leica SP5 equipado com um scanner ressonante de 12 kHz e um objetivo de água de 25x com uma abertura numérica de 0,95 (Leica), um plano, 256 x 90 pixels, aquisição bidirecional, linha média de 2.133 quadros/s. Clique aqui para baixar este Vídeo.

Vídeo 2: Proplatelets alongadoras exibem várias morfologias. Gravação de vídeo de lapso de tempo representativo (z-projeção) em um mouse WT com megacariócitos estendendo proplatelets com várias morfologias (verde) dentro de sinusoides de medula óssea (vermelho, Qtracker). Adquirido com um microscópio Leica SP5 equipado com um scanner ressonante de 12 kHz e um objetivo de água de 25x com uma abertura numérica de 0,95 (Leica), aquisição de pilha de z em intervalos de 10 s, profundidade z de 4 μm, resolução x-y 384 x 384 pixels, linha média 8. Sempre que necessário, os perfis foram alinhados usando o plug-in de correspondência do modelo ImageJ para obter uma projeção z média. Dependendo da qualidade da imagem, o fundo foi subtraído, a imagem foi suavizada, e o brilho e contraste ajustados. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 3: As propostas são tossidas por alterações na direção do fluxo. Vídeo de lapso de tempo mostrando um megacariócito tipo selvagem na bifurcação sinusoide mostrado no Vídeo 1, no processo de estender uma proplatelet que oscila em um ramo de vaso, dependendo da direção do fluxo (z-projeção). Adquirido com um microscópio Leica SP5 equipado com um scanner ressonante de 12 kHz e um objetivo de água de 25x com uma abertura numérica de 0,95 (Leica), aquisição de pilha de z em intervalos de 10 s, profundidade z de 4 μm, resolução x-y 384 x 384 pixels, linha média 8. Os perfis foram alinhados usando o plug-in do modelo ImageJ, e uma projeção z média foi obtida. O fundo foi subtraído, a imagem foi suavizada, e o brilho e contraste ajustados. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 4: Impacto do fluxo no alinhamento e tensão proplato. Gravação de vídeo de um proplatelet antes e depois de parada cardíaca. O vídeo mostra três proplatelets (verde, rotulados com derivado de anticorpos ANTI-GPIX AF-488) na mesma linha de fluxo antes da parada cardíaca, assim mal individualizadas na resolução da microscopia de dois fótons. Após parada cardíaca, as três proplatelets se separam e ficam relaxadas na ausência de fluxo sanguíneo. Vídeo adquirido com um microscópio confocal Leica SP8 equipado com um scanner ressonante de 8 kHz, imagem com um objetivo de água de 25x com abertura numérica de 0,95 (Leica). Os perfis foram alinhados usando o plug-in do modelo ImageJ, e uma projeção z média foi obtida. O fundo foi subtraído, a imagem foi suavizada, e o brilho e contraste ajustados. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 5: Impacto da injeção de drogas de vincristina no comportamento proplatelet dos camundongos WT. Gravação de vídeo de lapso de tempo de uma proplatelet antes e depois da administração de vincristina (1 mg/kg) (z-projeção). A propulalet alongadora (verde) dentro dos vasos sinusoides (vermelho) começa a se retrair após a administração intravenosa da vincristina. O vídeo foi adquirido com um microscópio confocal Leica SP8 equipado com um scanner ressonante de 8 kHz, imagem com objetivo de água de 25x com abertura numérica de 0,95 (Leica). O perfil foi alinhado usando o modelo ImageJ que corresponde ao plug-in, e uma projeção z média foi obtida. O fundo foi subtraído, a imagem foi suavizada, e o brilho e contraste ajustados. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 6: Impacto da injeção de drogas de vincristina no comportamento proplatelet de camundongos deficientes de miosina. Gravação de vídeo de lapso de tempo de uma proplatelet antes e depois da administração de vincristina (1 mg/kg) (z-projeção). A proplatelet alongadora (verde) dentro dos vasos sinusoides (vermelho) continua a alongar-se nos ratos Myh9-/- . O vídeo foi adquirido com um microscópio confocal Leica SP8 equipado com um scanner ressonante de 8 kHz, imagem com objetivo de água de 25x com abertura numérica de 0,95 (Leica). O perfil foi alinhado usando o modelo ImageJ que corresponde ao plug-in, e uma projeção z média foi obtida. O fundo foi subtraído, a imagem foi suavizada, e o brilho e contraste ajustados. Clique aqui para baixar este vídeo.

Figura suplementar S1: Projeto para a impressão 3D do anel e suporte do crânio. Este design foi usado para imprimir em 3D(A)o anel do crânio em aço inoxidável de alta qualidade,(B) o parafuso, (C) o bloco em aço inoxidável, e(D) o suporte no polímero ABS. Abreviaturas: 3D = tridimensional; ABS = ABS = estireno de butadieno de acrilonitrilo. Clique aqui para baixar esta Figura.

Vídeos suplementares:

Vídeo suplementar 1: Gravação de vídeo de lapso de tempo representativo (z-projeção) em um rato tipo selvagem com megacariócitos estendendo proplatelet (verde) dentro de sinusoides de medula óssea (vermelho, Qtracker). Adquirido com um microscópio Leica SP5 equipado com um scanner ressonante de 12 kHz e um objetivo de água de 25x com uma abertura numérica de 0,95 (Leica), aquisição de z-stack em intervalos de 10 s, profundidade z de 1,34 μm, resolução x-y 384 x 384 pixels, linha média de 8. Sempre que necessário, o perfil foi alinhado usando o plug-in de correspondência do modelo ImageJ para obter uma projeção z média. Dependendo da qualidade da imagem, o fundo foi subtraído, a imagem foi suavizada, e o brilho e contraste ajustados. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo suplementar 2: Gravação de vídeo de lapso de tempo representativo (z-projeção) em um rato tipo selvagem com megacariócitos estendendo proplatelet (verde) dentro de sinusoides de medula óssea (vermelho, Qtracker). Adquirido com um microscópio Leica SP5 equipado com um scanner ressonante de 12 kHz e um objetivo de água de 25x com uma abertura numérica de 0,95 (Leica), aquisição de z-stack em intervalos de 10 s, profundidade z de 1,34 μm, resolução x-y 384 x 384 pixels, linha média de 8. Sempre que necessário, o perfil foi alinhado usando o plug-in de correspondência do modelo ImageJ para obter uma projeção z média. Dependendo da qualidade da imagem, o fundo foi subtraído, a imagem foi suavizada, e o brilho e contraste ajustados. Clique aqui para baixar este vídeo.

Materiais Suplementares:

Arquivo de codificação 1: bloco de impressão 3D. Arquivo de objeto 3D para a impressão do bloco. Clique aqui para baixar este arquivo de codificação.

Arquivo de codificação 2: anel de crânio de impressão 3D. Arquivo de objeto 3D para a impressão do anel do crânio. Clique aqui para baixar este arquivo de codificação.

Arquivo de codificação 3: suporte à impressão 3D. Arquivo de objeto 3D para a impressão do suporte. Clique aqui para baixar este arquivo de codificação.

Arquivo de codificação 4: anel de parafuso de impressão 3D. Arquivo de objeto 3D para a impressão do parafuso. Clique aqui para baixar este arquivo de codificação.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Os mecanismos de formação de plaquetas são altamente dependentes do ambiente de medula óssea. Assim, a microscopia intravital tornou-se uma ferramenta importante no campo para visualizar o processo em tempo real. Camundongos com megacaiócitos fluorescentes podem ser obtidos cruzando camundongos expressando a recombinase cre em megacaiócitos com qualquer rato repórter floxed contendo um de expressão genética fluorescente condicional. Aqui, foram utilizados ratos repórteres mTmG (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10) cruzados com ratos Pf4-cre11,permitindo rotulagem intensa de fluorescência verde em megacariócitos e plaquetas12. É importante notar que alguns vazamentos foram relatados com camundongos Pf4-cre em leucócitos, incluindo monócitos/macrófagos e fibroblastos12,13.

No entanto, os megacaiócitos são facilmente reconhecidos pelo seu grande tamanho e núcleo. Experimentadores novos no campo poderiam comparar observações em [mTmG; Pf4-cre] ratos com aqueles obtidos após rotulagem específica de megacaiócito. Isso é possível através da administração intravenosa de um anticorpo com rótulo Alexa-fluor direcionado contra a proteína específica da plaqueta, GPIX (CD42a)3,14. Esta última abordagem também é benéfica para a imagem de megacariócitos fluorescentes de qualquer rato geneticamente modificado sem realizar travessias tediosas e demoradas de ratos com ratos repórteres fluorescentes. Aqui, camundongos de 5 a 7 semanas foram usados como camundongos mais jovens presentes com um osso mais fino que é mais translúcido e facilita a imagem em comparação com camundongos mais velhos. No entanto, camundongos muito jovens podem apresentar dificuldades na instalação do anel craniano sem vazamento.

Neste estudo, a imagem intravital foi realizada utilizando-se um microscópio leica equipado com um objetivo de água de 25x com abertura numérica de 0,95 (Tabela de Materiais). O objetivo deve ser cônico para que possa entrar no copo formado pelo anel craniano com uma distância de trabalho ideal. As imagens foram gravadas com um scanner ressonante (12 ou 8 kHz). As configurações gerais dependerão do tipo de questão científica a ser respondida e devem ser otimizadas dependendo da ampliação, resolução e velocidade de aquisição necessárias. Por exemplo, com um scanner ressonante de 12 kHz, um objetivo de 25x seria mais adequado para medir a velocidade plaquetária, enquanto um scanner de 8 kHz e uma ampliação mais baixa poderiam ser suficientes para registrar o alongamento proplatelet.

O passo mais crítico do protocolo é a fixação correta do anel ao osso do crânio para que não ocorra vazamento, e para que ele não se desprende durante a gravação. Para isso, é essencial que o osso do crânio seque pouco antes de aplicar o anel. Uma vez que o anel esteja colado, re-umidificar rapidamente o osso. Além disso, devido à força exercida pelo peso da cabeça no anel, o anel é submetido a uma tensão que pode fazê-lo se desprender parcialmente durante a gravação. Isso pode causar vazamento e, portanto, ressecamento do osso, levando tanto a imagens de má qualidade quanto a reações inflamatórias indesejáveis. Este problema pode ser facilmente evitado adicionando uma compressa dobrada sob o nariz do mouse para suportar a cabeça (Figura 3C). Outro ponto crítico é minimizar o sangramento e a presença de sangue dentro do anel, pois pode levar a imagens borradas. Isso deve ser mantido em mente ao estudar camundongos que apresentam hemostasia defeituosa e são propensos a sangramento. Alguns rastreadores, como o dextran, podem apresentar vazamento na cavidade da medula óssea se injetados de forma concentrada, o que piora a imagem do vaso, embora não a fluorescência verde de megacaiócitos. O Qtracker-655 não vaza muito, mas é liberado da circulação dentro de 30 minutos para que novas injeções do rastreador sejam necessárias para visualizar os vasos por períodos mais longos.

Uma limitação deste método descrito aqui é a necessidade de parar a aquisição a cada 35 minutos para reinjetar anestésicos. Essa limitação pode ser superada se uma máquina de anestesia estiver disponível. Nesse caso, a anestesia pode ser induzida da mesma forma pela injeção i.p. de uma mistura de cetamina e xilazina, que é a maneira mais fácil de realizar a inserção do cateter e da pequena cirurgia. Uma vez posicionada abaixo do objetivo do microscópio, a anestesia é então mantida por inalação de gases (mistura de oxigênio, anestésicos como isoflurano e ar ambiente). Desta forma, observações podem ser feitas ao longo de várias horas sem interrupção. No entanto, por razões éticas, as observações foram limitadas a 3 h neste estudo. Outra limitação no uso da mistura cetamina/xilazina pode ser seu potencial impacto deletério nas funçõesplaquetas 16 que poderiam exigir esquemas alternativos de anestesia.

No geral, o principal mérito deste protocolo bem estabelecido é seu aspecto não invasivo com apenas uma cirurgia mínima. Outros protocolos foram desenvolvidos para realizar imagens intravitais de lapso de tempo em ossos longos. Estes dependem de cirurgia invasiva que requer remoção de tecido muscular e abrasão óssea17,18, sondas endoscópicas implantadas perto da cabeça do fêmur19,20, ou a instalação de uma câmara de janela no fêmur21. Todos esses procedimentos resultam em trauma severo e diferentes graus de inflamação. A inflamação não é apenas prejudicial ao camundongo, mas também foi relatada para modificar o processo de formação de plaquetas6 para que condições inflamatórias descontroladas possam levar a discrepâncias e má interpretação dos dados. É por isso que este procedimento foi escolhido para evitar reações inflamatórias. No entanto, dependendo da questão científica, os experimentadores podem preferir ter um campo de observação mais profundo e maior resolução (menos dispersão), o que é possível usando uma abordagem baseada em desbaste do crânio em detrimento de um baixo grau de reação inflamatória.

Devido à sua natureza não invasiva, a maior limitação deste método é a profundidade máxima que pode ser alcançada. Devido à densidade do osso e suas propriedades de dispersão, é possível imaginar regiões dentro de uma profundidade de apenas algumas centenas de micrômetros, impedindo observações de toda a medula calvária. O desenvolvimento de microscopia de três fótons, que se baseia em comprimentos de onda de excitação infravermelha ainda maiores, parece ser uma abordagem promissora com resolução superior de tecido profundo. Ele já foi usado com sucesso para imaginar profundamente no cérebro mesmo através do osso22,23, abrindo a possibilidade emocionante de imagem de medula óssea dentro de ossos longos sem ter que afinar o osso ou implantar uma janela cirúrgica.

Em resumo, este método é cada vez mais utilizado para estudar o comportamento de megacaiócitos na medula óssea e visualizar a extensão dos proplatelets. Além disso, ao permitir a visualização do osso compacto calvarial externo, bem como parte da medula subjacente, este método já foi utilizado em muitas aplicações fora do campo de plaquetas. Tem sido utilizado para o estudo da dinâmica das células ósseas e medularas em seu ambiente, incluindo osteoblastos e osteoclaros, tráfico de leucócitos e saída de medula, células endoteliais e arquitetura de microvasculatura, dinâmica do fluxo sanguíneo em microvexes de medula ou homing celular24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a Florian Gaertner (Instituto de Ciência e Tecnologia da Áustria, Klosterneuburg, Áustria) por seu conselho de especialistas em experimentos de microscopia de dois fótons na época em que estabelecemos a técnica no laboratório, e Yves Lutz no Centro de Imagens IGBMC /CBI (Illkirch, França) por sua experiência e ajuda com o microscópio de dois fótons. Agradecemos também a Jean-Yves Rinkel por sua ajuda técnica e Inês Guinard pelo desenho do esquema na Figura 1. Agradecemos à ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) pelo apoio na aquisição do microscópio de dois fótons. A AB foi apoiada por bolsas de pós-doutorado da Etablissement Français du Sang (APR2016) e da Agence Nationale de la Recherche (ANR-18-CE14-0037-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GNU Octave software GNU Project https://www.gnu.org/software/octave/
 Histoacryl 5 x 0, 5 mL Braun 1050052 injectable solution of surgical glue
HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes Leica Microsystems
ImageJ GNU project Minimum version required
Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL Boehring 03661103003199 eye protection
Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95 Leica Microsystems simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655
Matlab MathWorks https://www.mathworks.com/
Ocrygel 10 g Laboratoires T.V.M. 03700454505621 Silicon dental paste blue and yellow
Picodent twinsin speed Rotec 13001002
Qtracker 655 vascular label Invitrogen Q21021MP injectable solution
Resonant scanner, 8 or 12 kHz
Rompun Xylazine 2% fl/25 mL Bayer 04007221032311
Superglue gel to glue the ring to the bone
Surflo IV catheter - Blue 22 G Terumo SR-OX2225C1
Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond) Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
  2. Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).
  3. Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
  4. Zhang, L., et al. Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P). Blood. 122 (5), 791-802 (2013).
  5. Kowata, S., et al. Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow. Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).
  6. Nishimura, S., et al. IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs. Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
  7. Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
  8. Potts, K. S., et al. Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206 (2020).
  9. Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683 (2014).
  10. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  11. Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo. Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).
  12. Pertuy, F., et al. Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).
  13. Calaminus, S. D., et al. Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny. PLoS One. 7 (12), 51361 (2012).
  14. Stegner, D., et al. Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 127 (2017).
  15. Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
  16. Nakagawa, T., et al. Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase. Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).
  17. Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment. Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).
  18. Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).
  19. Lewandowski, D., et al. In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
  20. Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 2153 (2017).
  21. Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205 (2016).
  22. Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light Science & Applications. 7, 12 (2018).
  23. Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
  24. Kim, J., Bixel, M. G. Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment. Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).

Tags

Biologia Edição 173 Microscopia de dois fótons observação intravital medula óssea do crânio megacariócitos proplatelets
<em>In Vivo</em> Imagem de dois fótons de megacariócitos e proplatelets na medula óssea do crânio do rato
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bornert, A., Pertuy, F., Lanza, F.,… More

Bornert, A., Pertuy, F., Lanza, F., Gachet, C., Léon, C. In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow. J. Vis. Exp. (173), e62515, doi:10.3791/62515 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter