Summary
Detta protokoll belyser en metod för att snabbt bedöma biokompatibiliteten hos en kristallin nanocellulosa (CNC)/agaroskomposit hydrogel biomaterial bläck med mus benmärg-härledda mastceller när det gäller cell livskraft och fenotypiska uttryck av cellytan receptorer, Kit (CD117) och hög affinitet IgE receptor (FcεRI).
Abstract
Tredimensionell (3D) bioprinting använder hydrogelbaserade kompositer (eller biomaterialfärger) som deponeras i ett mönster och bildar ett substrat på vilket celler deponeras. Eftersom många biomaterialfärger kan vara potentiellt cytotoxiska för primärceller, är det nödvändigt att bestämma biokompatibiliteten hos dessa hydrogelkompositer innan de används i kostsamma 3D-vävnadsteknikprocesser. Vissa 3D-odlingsmetoder, inklusive bioprinting, kräver att celler bäddas in i en 3D-matris, vilket gör det svårt att extrahera och analysera cellerna för förändringar i livskraft och biomarköruttryck utan att framkalla mekanisk skada. Detta protokoll beskriver som proof of concept, en metod för att bedöma biokompatibiliteten hos en kristallin nanocellulosa (CNC) inbäddad agaroskomposit, tillverkad i ett 24-brunnskultursystem, med musbensmärgbaserade mastceller (BMMCs) med hjälp av flödescytometriska analyser för cellviabilitet och biomarköruttryck.
Efter 18 h exponering för CNC/agarose/D-mannitol matrisen, BMMC livskraft var oförändrad mätt med propidium jodid (PI) permeabilitet. BMMCs odlade på CNC/ agarose/ D-mannitol substrat tycktes dock något öka sitt uttryck för hög affinitet IgE-receptorn (FcεRI) och stamcellsfaktorreceptorn (Kit; CD117), även om detta inte verkar vara beroende av mängden CNC i biobläckkompositen. BMMCs livskraft bedömdes också efter en tidskursexponering för hydrogelställningar som tillverkades av ett kommersiellt biomaterialbläck bestående av fibrillärt nanocellulosa (FNC) och natriumalginat med hjälp av en 3D-extruderingsbioprinter. Under en period av 6-48 h påverkade FNC/alginatsubstrat inte BMMC:s livskraft negativt enligt flödescytometri och mikrotiteranalyser (XTT och laktatdehydrogenas). Detta protokoll beskriver en effektiv metod för att snabbt screena den biokemiska kompatibiliteten hos kandidat biomaterialfärger för deras användbarhet som 3D-byggnadsställningar för eftertryck sådd med mastceller.
Introduction
Den senaste tidens intresse för 3D-odlingssystem och 3D-bioprinting har fokuserat uppmärksamheten på hydrogeler och hydrogelkompositer. Dessa kompositer fungerar som trögflytande men porösa biomimetika och kan bestå av upp till 99% vattenhalt i vikt, vilket är jämförbart med biologiska vävnader1,2,3. Dessa egenskaper hos hydrogelkompositer möjliggör därmed tillväxt av celler utan att påverka deras livskraft och funktion. En sådan komposit är kristallin nanocellulosa (CNC), som har använts som ett förstärkande material i hydrogelkompositer, cellställningar i utvecklingen av biomaterialimplantat och i tvådimensionell (2D) och 3D in vitro-cellkultur4,5. För det mesta är matriser som består av CNC inte alltför cytotoxiska för mänskliga hornhinnans epitelceller6, intestinala epitelceller7, humana benmärgsbaserade mesenkymala stamceller8 eller neuronliknande celler9. Metabolisk aktivitet och spridning av humana benmärg-härledda mesenkymala stamceller minskar dock i samband med ökad viskositet av träbaserade nanocellulosa kompositer, vilket tyder på att matrisens sammansättning noggrant måste testas för dess skadliga effekter på cellfunktioner8.
På samma sätt kan CNC inducera inflammatoriska svar i makrofager vid internalisering, vilket kan få allvarliga konsekvenser i 3D-immuncellskultursystem10,11. Faktum är att det finns mycket lite data tillgängliga om hur CNC kan påverka andra immuncellsvar, särskilt allergiska inflammatoriska svar som initieras av mastceller. Mastceller är granulerade leukocyter som uttrycker den hög affinitet IgE-receptorn, FceRI, som ansvarar för att aktivera inflammatoriska reaktioner på allergener. Deras spridning och differentiering är beroende av stamcellsfaktor (SCF), som binder tyrosinreceptorn, Kit. Mastceller härleds från benmärgsprogenitorceller som kommer in i cirkulationen och därefter migrerar perifert för att sprida sig allestädes närvarande i alla mänskliga vävnader12. Eftersom mastceller fungerar i en 3D-vävnadsmiljö är de en idealisk immuncellskandidat för att studera immunologiska processer i in vitro 3D-vävnadsmodeller. Hittills finns det dock ingen livskraftig in vitro 3D-vävnadsmodell som innehåller mastceller.
På grund av mastcellernas mycket känsliga natur och deras benägenhet att framkalla proinflammatoriska svar på yttre stimuli krävs noggrant övervägande av 3D-matrisbeståndsdelarna och bioprintningsmetoden för att införa mastceller i 3D-ställningen, som diskuterats vidare. Vävnadskonstruktioner kan biofabriceras från två breda kategorier av biomaterial, det vill säga biobläck och biomaterialfärger. Skillnaden ligger i det faktum att biobläck är cellbelastade hydrogelkompositer, medan biomaterialfärger är hydrogelkompositer som saknar celler, enligt definitionen i Groll et al.13,14. Därför innehåller 3D-konstruktioner tryckta med biobläck celler förinbäddade i hydrogelmatrisen, medan 3D-konstruktioner tryckta med biomaterialfärger måste sås med celler efter utskrift. Biofabriceringen av odlingsställningar från hydrogelbaserade biobläck/biomaterialfärger utförs oftast med hjälp av extruderings-3D-bioprinters, som extruderar biobläcket/biomaterialet genom ett mikroskalemunstycke under tryck via antingen en pneumatiskt eller mekaniskt driven kolv14. Extruderingsbioprinters tillverkar 3D-byggnadsställningar genom att deponera biobläcket i 2D-tvärsnittsmönster som är sekventiellt staplade på varandra i en "bottom-up" -metod.
För att vara kompatibel med extruderingsbioprinting måste det hydrogelbaserade biobläcket ha tixotropa (skjuvningsgallring), varigenom biobläckets ingående hydrogelpolymerer flödar som en vätska genom ett mikrokanalmunstycke när det utsätts för skjuvningsstress, men återgår till ett visköst, gelliknande tillstånd vid avlägsnande av skjuvspänningen15 . På grund av deras höga vattenhalt måste polymererna i hydrogelbaserade biobläck/biomaterialfärger korsas, antingen fysiskt eller kovalent, för att upprätthålla arkitekturen och den strukturella integriteten hos den biotryckta 3D-strukturen. När det gäller cellbelastade biobläck utsätts cellerna direkt för kemiska påfrestningar under tvärbindningsprocessen. Processen med extruderande celler inkapslade i bioink hydrogel matrisen utsätter också cellerna för skjuvning stress, vilket kan leda till minskad livskraft och/eller celldöd. När 3D-vävnadsmodellen har bioprintats är det svårt att skilja mellan nivåerna av cytotoxicitet som framkallas av hydrogelmatrisen själv respektive extruderings- respektive tvärbindningsprocesserna. Detta är särskilt utmanande i samband med 3D-ställningar där cellerna är förinbäddade i hydrogelmatrisen, vilket gör det svårt att ta bort cellerna för efterföljande analyser, vilket skulle vara skadligt för mastcellernas livskraft.
Ett skonsammare tillvägagångssätt för att generera 3D-vävnadskonstruktioner som innehåller mastceller innebär att cellerna sås till förtryckta, porösa biomaterialbläck 3D-byggnadsställningar från en cellodlingsfjädring, vilket utnyttjar mastcellernas medfödda förmåga att migrera från cirkulationen till perifera vävnader. Fördelarna med denna cellsåddsmetod är tvåfaldiga: i) mastcellerna inte utsätts för skjuvning och kemiska påfrestningar från extruderings- respektive tvärbindningsprocesserna, och ii) cellerna kan lätt avlägsnas från 3D-ställningen efter exponering genom skonsam tvättning för analys utan att deras livskraft påverkas negativt. Den ytterligare fördelen med sådd och analys av cell livskraften hos mastceller på 3D bioprintade, porösa hydrogelställningar i motsats till 2D-hydrogelskivor är att 3D bioprintade hydrogelställningar rekapitulerar mikroskala topografiska egenskaper hos in vivo-vävnader , som inte finns i bulk, 2D planar hydrogelskivor. Detta tillvägagångssätt är ett lämpligt, snabbt och kostnadseffektivt tillvägagångssätt för att bestämma de potentiellt katastrofala cytotoxiska effekterna av kandidat bioink hydrogel matriser på mastceller, liksom andra immunologiska celler, före investeringar i kostsamma 3D vävnadstekniska experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta protokoll består av fem avsnitt: (1) isolering av musbensmärg och differentiering av musbens-härledda mastceller (BMMCs), (2) tillverkning av CNC/ agaros/D-mannitol hydrogel substrat i ett 24-brunnssystem och kultur av BMMCs på substrat, (3) avlägsnande av BMMCs från CNC/ agarose/D-mannitol hydrogel substrat och analys av livskraft och biomarkör uttryck, (3) avlägsnande av BMMCs från CNC / agarose / D-mannitol hydrogel substrat och analys av livskraft och biomarkör uttryck, (3) avlägsnande av BMMCs från CNC / agarose / D-mannitol hydrogel substrat och analys av livskraft och biomarkör uttryck med hjälp av flödes-cytometri, (4) 3D-bioprintning av hydrogelställningar från en kommersiellt tillgänglig fibrillär nanocellulosa (FNC)/natriumalginatkompositbiomaterialbläck och 5) odling av BMMCs på FNC/natriumalginathygelställningar och analys av livskraften med hjälp av flödescytometri, XTT och laktatdehydrogenas (LDH) mikrotiter assays.
1. Generering av BMMC-kulturen
OBS: Möss avlivades av CO2 kvävning efter isofluran anestesi. Skenbenet och lårbenet isolerades och hela benmärgen skördades. Alla djurstudier genomfördes i enlighet med Canadian Council on Animal Care Guidelines and Policies med godkännande från Health Science Animal Care and Use Committee för University of Alberta.
- Förbered fullständigt odlingsmedium rpmi-1640 genom att lägga till de kosttillskott som anges i tabell 1 i de angivna slutliga koncentrationerna. Justera pH-värdet på mediet till 7,4-7,6 med NaOH, filtrera sterilisera med ett engångsfilter på flaska (0,2 μm porstorlek) och förvara vid 4 °C i mörker i upp till 2 månader.
- Få lårben från möss i enlighet med de lokala protokollen och förfarandena från University Animal Care Committee.
OBS: I denna studie isolerades lårben från C57BL/6 möss, men alla stammar kan användas om det är relevant för studien. - Använd sax, ta bort hud och muskler från höftleden och dra sedan försiktigt lårbenet genom att vrida något ur höftuttaget (bild 1). Var försiktig så att du inte bryter av lårbenshuvudet. Skär skenbenet bort från lårbenet vid den mediala fabellan med hjälp av sax. Ta bort tassen genom att skära precis ovanför calcaneum och kassera.
- Använd en skalpell och ta bort hud och brosk från lårbens- och skenbenet. Använd sax, gör ett rent snitt på varje ände av lårbenet och skenbenet och exponera den röda benmärgen inuti. Vid behov, ta bort vadbenet vid denna tidpunkt, men observera att det kan bidra till manipulering av skenbenet under benmärgsspolning.
- Förbered en 26 G nål med en 5 ml luerlåsspruta och fyll med cirka 5 ml komplett medium som beretts enligt beskrivningen ovan.
OBS: Vid denna tidpunkt kan ofullständig RPMI utan tillsatser också användas för att spara på reagenser. - Håll lårbenet eller skenbenet med tång, för in nålen i ena änden av benet och tryck försiktigt sprutan. Håll benet över ett 50 ml sterilt koniskt rör och injicera försiktigt cirka 5 ml medium i benet och applicera lite tryck. Observera bitar av benmärgen falla ut i andra änden av benet som tunna röda band och i koniska röret.
- Snurra ner aspiraterna och resuspend i komplett medium, eller överför direkt till en T175 cm2 steril vävnadsodlingskolv som innehåller 50 ml komplett RPMI-1640-medium. Håll aspirationerna i komplett RPMI-1640 medium med 30 ng/mL mus rekombinant interleukin (IL)-3.
- Efter 1 dag observera kulturerna under ett ljusmikroskop. Kulturen kommer att bestå av en heterogen population av celler av olika former och storlekar och ännu större bitar av benmärg. Mata cellkulturer genom att tillsätta 15 ml färskt medium var 3-5 dag med hela RPMI-1640-mediet enligt beskrivningen ovan, och se till att celltätheten aldrig överstiger 1 × 106 celler/ml. En gång i veckan, snurra ner celler vid 200 × g i 5 min vid rumstemperatur, återanvänds i färskt komplett RPMI-1640-medium och dela 1:4 i 50 ml medium i färska T175-flaskor.
- Efter 4 veckor, bestäm cellrenhet genom att mäta ytuttrycket av CD117 (Kit) och FceRI-receptorer efter flödescytometri enligt beskrivningen nedan (avsnitt 3.2).
OBS: Efter 4 veckor bör 99% av cellerna vara dubbelpositiva för CD117 (Kit) och FcεRI. - Vid 4 veckor och framåt, underhåll BMMCs med 20 ng /mL IL-3 i komplett RPMI-1640 medium. Vid ungefär 6 veckor kommer cellerna att sluta dela sig och kommer inte längre att kräva delning. Mata kulturerna var 3-5 dag, pellet cellerna genom centrifugering en gång i veckan och återanvänd i färskt komplett RPMI-1640-medium.
2. Tillverkning av CNC/ agarose / D-mannitol hydrogel substrat och BMMC-kultur
- Tillsätt 0,2 g agarospulver i en glasflaska till fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (2% w/v) till en slutlig volym på 10 ml och koka i 1 min vid 100 °C för att lösas upp.
- Lös upp 2,5 g CNC-pulver i PBS till en slutlig volym på 10 ml för att förbereda en 25% w/v-blandning.
- Lös upp 2 g CNC-pulver i PBS till en slutlig volym på 10 ml för att förbereda en 20% w/v-blandning och späd 20% w/v-blandningen för att förbereda 10, 5 och 2% w / v CNC-blandningar.
- Värm CNC-blandningarna 25, 20, 10, 5 och 2 % till 37 °C i 10 minuter (figur 2A).
- Tillsätt 0,46 g D-mannitol till den heta agaroslösningen (4,6% w/v) och lös upp.
- Blanda de förvärmda 25, 20, 10, 5 och 2% w/v CNC-PBS-blandningarna med den heta agaros/D-mannitollösningen i separata koniska rör i ett 1:1-förhållande för att ge slutliga CNC-koncentrationer på 12,5, 10, 5, 2,5 och 1% w/v i hydrogelblandningarna.
- Arbeta snabbt, tillsätt 500 μL/brunn av ovanstående lösningar som bereds i steg 2.6 i fyrdubbelt till en 24-väl odlingsplatta och låt stå i 30 min vid rumstemperatur för att underlätta polymerisation (figur 2B).
- Skikta försiktigt 1000 μL av BMMC-suspensionen med en densitet av 1,1 × 106 celler/ml ovanpå hydrogelsubstraten med en mikropipettor och undvik att vidröra gelén med pipettspetsen eftersom detta kommer att skada gelytan och generera partiklar.
- Inkubera BMMCs på hydrogelsubstraten i en steril inkubator (5% CO2, fuktad atmosfär) vid 37 °C i 18 timmar.
3. Flödescytometriska analyser
- Flödescytometrisk analys av BMMC-livskraft via PI-uteslutning
- Ta försiktigt bort odlingsmediet som innehåller BMMCs från toppen av CNC / agarose / D-mannitol, undvik gelén och överför cellerna till ett 1,5 mL mikrofugerör.
- Tvätta BMMCs två gånger med PBS (pH 7.4) som innehåller 0,5% w/v bovin serumalbumin vid 300 × g i 5 min vid rumstemperatur och återanvänds i 180 μL PBS-0,5% w/v BSA till en slutlig densitet på 1,5 × 106 celler/ml. Överför cellerna till en 96 väl rund bottenplatta.
OBS: Filtrera-sterilisera alla PBS-0,5% w/v BSA-lösningar två gånger med ett 0,2 μm porstorlekssprutfilter och förvara vid 4 °C. - Tillsätt 20 μL PBS-0,5% w/v BSA, eller 10x PI (100 μg/mL) beredda i PBS-0,5% w/v BSA, till cellerna till en slutlig koncentration av 10 μg/ml och inkubera i antingen 1 h vid 4 °C eller 15 min vid rumstemperatur i mörkret. Skaffa fluorescensdata med hjälp av en flödescytometer utrustad med en Argonjonlaser (488-514 nm) och bandpassfilter för att möjliggöra detektion av fluorescensutsläpp vid 578 nm. Få 20 000 händelser per prov med en flödeshastighet på 30 μL/min vid rumstemperatur. Analysera data enligt beskrivningen nedan (avsnitten 3.2.7-3.2.10).
- Flödescytometrisk analys av BMMCs för Kit (CD117) och FcεRI ytreceptoruttryck
- Ta försiktigt bort odlingsmediet som innehåller BMMCs från toppen av CNC / agarose / D-mannitol, undvik gelén och överför cellerna till ett 1,5 mL mikrofugerör.
- Tvätta BMMCs två gånger med filtrerad PBS-0,5% BSA vid 300 × g i 5 min vid rumstemperatur och återanvänd i 180 μL PBS innehållande 0,5% w/v BSA (1,5 × 106 celler/ml). Överför de återsuspenderade cellerna till en 96-väl rundbottenplatta.
- Tillsätt 20 μL 10x antikroppsarbetslösningar till cellerna för att uppnå en slutlig koncentration på 0, 06 μg/ml CD117 (c-Kit)-fycoerythrin (PE) respektive 0, 06 μg/ml FcεRIα-allophycocyanin (APC).
OBS: 10x antikroppsarbetslösningar måste beredas i filtersteriliserad PBS-0,5% med v BSA. - Tillsätt 20 μL av 10x isotypkontrollarbetslösningar som innehåller antingen råtta IgG2b κ isotyp control-PE eller armenisk hamster IgG isotyp control-APC för att separera brunnar som innehåller celler som inte har färgats med någon av antikroppsfluoforkonjugerna i steg 3.2.3.
OBS: Isotypkontrollerna, råtta IgG2b κ isotyp control-PE och armeniska hamster IgG isotyp kontroll-APC tjänar till att kontrollera för icke-specifik fastsättning av antikroppar till BMMC. Eftersom BMMCs inte uttrycker höga nivåer av FcR, det finns sällan hög bakgrund fluorescens upptäckt med isotyp kontroll antikroppar. Förbered arbetslösningarna för 10x isotypkontroll i filtersteriliserade PBS-0,5% med BSA. - Inkubera 96-brunnsplattan med rund botten i 1 h vid 4 °C i mörker.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 200 μL färsk PBS-0,5% w/v BSA-buffert till varje brunn och centrifugera vid 300 × g i 5 min vid rumstemperatur. Upprepa tvättsteget en gång till. Ta försiktigt bort supernatanten utan att röra cellpelleten; lämna efter sig lite supernatant för att säkerställa att cellpelleten förblir ostört.
- Efter tvätt, återanvänd celler i 100 μL 0,5% w/v BSA, 0,05% w/v natriumazid i PBS (pH 7.4) som har sterilt filtrerats två gånger med ett 0,2 μm porstorlek spruta filter. Skaffa fluorescensdata i PE- och APC-detektorkanalerna med hjälp av en flödescytometer, enligt ovan i steg 3.1.3.
- Analysera data med hjälp av programvara som kan visa och analysera flödescytometriska datafiler med tillägget ".fcs".
- Börja analysen genom att plotta framåtspridning (FSC) längs x-axeln och sidospridningen (SSC) längs y-axeln och grinden för den bevarade cellpopulationen med ett FSC-intervall på log10 1,5-5.0 och ett SSC-intervall av log10 0,75-3.25 i obehandlade och oförstörda celler enligt figur 3A(i),ii.
OBS: Detta säkerställer att cellskrot med låga FSC- och SSC-värden elimineras från analysen. Mastceller är normalt mycket granulära (höga SSC) celler och stora (hög FSC) jämfört med andra immunologiska celltyper, såsom monocyter och lymfocyter. - Generera sedan FSC vs. SSC punktdiagram och histogramprofiler för obehandlade prover som har färgats med färgämnet, antikropparna eller isotypkontrollerna och få genomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) i PE- eller APC-kanalerna enligt emissionsspektrumet för den specifika antikroppsfluoforkonjugat eller färgämne som används. Applicera samma uppsättning grindar och parametrar på alla BMMC-prover inkuberade med olika CNC/ agarose/ D-mannitolsubstrat och färgade med motsvarande isotypkontroller, antikroppar eller färgämnen. erhålla MFI.
ANMÄRKNING: I huvudsak bör de obehandlade färgade provernas FSC vs SSC-punktområden vara oskiljbara från obehandlade/oförstudlade prover, erhållna i steg 3.2.9, för att säkerställa att färgningsförfarandet inte ändrar cellstorleken (mätt med FSC) eller granulariteten (mätt med SSC) (figur 3A i,ii). - Beräkna genomsnittliga MFI och standardfel i medelvärde (SEM) för varje prov från 4 oberoende experiment följt av generering av grafer med hjälp av ett programpaket för statistisk analys.
- Förbereda histogramöverlägg i programvaran för flödescytometrisk dataanalys (figur 3B, 4A ii), B(ii).
4.3D Bioprintning av FNC/natriumalginathydrogelsubstrat
OBS: 3D-bioprintern som används i denna studie är ett pneumatiskt extruderingssystem utrustat med två oberoende, temperaturstyrda skrivhuvuden. Det biomaterialbläck som används för att 3D-bioprint hydrogelställningarna är formulerat av a) höghydratiserad fibrillär nanocellulosa (FNC), som är morfologiskt lik kollagen, b) natriumalginat och c) D-mannitol. Den levereras som en steril hydrogelupphängning i 3 ml-patroner till vilka sterila luerlåskoniska bioprintmunstycken (22, 25 eller 27 G) kan fästas.
- Använd detta protokoll med skrivhuvudena och tryckbäddar vid rumstemperatur, där rumstemperaturen är 20-25 °C.
- Förvara biomaterialbläckpatronerna vid 4 °C för att bibehålla hydrogelkompositens stabilitet. Innan du påbörjar 3D-bioprinting, ta ut en patron (3 ml) från kylskåpet och låt den balansera till rumstemperatur.
- Installation av en Bioink-patron på INKREDIBLE+ 3D Bioprinter
- Ta bort de blå ändlocken från 3 ml biomaterialbläckpatronen (bild 5B i) och fäst ett sterilt 22 G (blått) koniskt bioprintmunstycke på biobläckpatronens luerlåsände.
OBS: Det är viktigt att fästa önskat koniskt bioprintningsmunstycke på biobläckpatronen innan du installerar patronen och utför efterföljande kalibreringssteg, eftersom underlåtenhet att göra det kommer att resultera i felaktig kalibrering av 3D-bioprinterns z-axel. - Anslut lufttrycksrören för skrivhuvud 1 (PH1, vänster) till den motsatta änden av patronen och sätt in patronen med dess bifogade koniska bioprintmunstycke i det vertikala spåret på PH1 (figur 5A ii).
- Placera patronen ordentligt i PH1 med det koniska bioprintmunstycket som sträcker sig under skrivhuvudet. Dra åt skruven på PH1 medurs tills den sitter fast med fingret för att låsa Bioink-patronen på plats. Observera att 3D-bioprinting kan utföras med PH2 tom.
- Ta bort de blå ändlocken från 3 ml biomaterialbläckpatronen (bild 5B i) och fäst ett sterilt 22 G (blått) koniskt bioprintmunstycke på biobläckpatronens luerlåsände.
- Kalibrera x-y-z-axlarna på 3D-bioprintern
- Slå på 3D-bioprintern och starta bioprinterprogramvaran på en dator som är ansluten till 3D-bioprintern via en USB 2.0-kabel.
- I programvaran klickar du på CONNECT-knappen för att synkronisera programvaran med 3D-bioprintern.
OBS: Synkroniseringen lyckas när tryckhuvudets ultravioletta lysdioder tänds och släcks och HEPA-filterfläkten cyklar av och på igen. Programvaran måste synkroniseras med 3D-bioprintern innan bioprinteraxlarna och startpunktskalibreringen, enligt de efterföljande stegen, placeras. - Observera fyra alternativ i huvudkontrollmenyn på 3D-bioprintern: i) PREPARERA BIOPRINT, (ii) BIOPRINT, iii) UTILITIES MENU och (iv) STATUS SCREEN. Välj alternativet FÖRBERED BIOPRINT och rulla sedan nedåt till och välj alternativet HEMAXLAR .
OBS: 3D-bioprintern flyttar sedan skrivhuvudets enhet bakåt och åt vänster för att kalibrera y- respektive x-axlarna. Därefter, med skrivhuvudena pausade längst till vänster, kommer bioprintern att höja utskriftsbädden tills z-axelns kalibreringsbrytare (placerad på utskriftsbädden) kommer i kontakt med det koniska bioprintingmunstycket installerat på skrivhuvudet 1 - Efter en lyckad kalibrering av x-y-z-axlarna, observera den lilla sänkningen av tryckbädden och omlokaliseringen av skrivhuvudena ovanför utskriftsbäddens mittpunkt (figur 5A i).
- Startpunktskalibrering av bioprintern för bioprintning i 24-brunnsplattor
- Ta bort en steril 24-väl kulturplatta från dess förseglade plastfolie och markera en punkt i mitten av brunn D1 på undersidan av plattan med en permanent markör. Ta bort plåtskyddet och placera 24-brunnsodlingsplattan på tryckbädden med väl D1 placerad längst fram till vänster på tryckbädden.
- Välj VERKTYGSMENY PÅ huvudkontrollmenyn och välj sedan FLYTTA AXEL. Flytta skrivhuvudena i steg om 1 mm längs x- och y-axlarna tills ph1:s koniska bioprintmunstycke är direkt över pricken märkt under brunnen D1. Finjustera vid behov det koniska bioprintningsmunstyckets läge över pricken genom att flytta skrivhuvudena i steg om 0,1 mm.
- Registrera x- och y-koordinaterna för det koniska bioprintingmunstycket direkt över mitten av brunnen D1, som anges på kontrollpanelen på 3D-bioprintern.
OBS: När det gäller inkredible+ 3D-bioprintern som används här är x- och y-koordinaterna följande: x : -46,5 och y : -27,5. Dessa koordinater fungerar som utgångspunkt i mitten av brunnen D1 för bioprinting i en 24-brunnsplatta. - Höj sedan tryckbädden i steg om 1 mm tills botten av brunnen D1 nästan vidrör det koniska bioprintingmunstycket som är installerat i skrivhuvudet 1. Finjustera tryckbäddens rörelse i steg om 0,1 mm vid behov (figur 5A ii). Välj sedan alternativet Z-AXIS KALIBRERING från MENYN VERKTYG OCH välj och bekräfta alternativet STORE Z-KALIBRERING ytterligare.
- Gå tillbaka till huvudmenyn och välj alternativet FÖRBERED BIOPRINT . Rulla nedåt till och välj alternativet KALIBRERA Z .
OBS: 3D-bioprintern sänker nu utskriftsbädden när z-axelkalibreringen har utförts (figur 5A iii).
- Uppdaterar G-kodfilen med 24-brunnsplatta med korrekta startpunktskoordinater
- Öppna den medföljande 24-brunnsplattan geometrisk kod (G-kod) fil i bioprinter programvara (Kompletterande fil 1).
OBS: Denna 24-brunns G-kodfil kodar utskriften av 2-lager 5 x 5 x 1 mm rätlinjära konstruktioner i varje brunn (figur 5C(i),(iii)). De medföljande G-kodfilerna kan användas med alla 3D-bioprinting-program. - Observera att rad 1 i G-kodfilen läser G0 X-50.0 Y-33.5 ; Mittposition för D1 brunn. Uppdatera x- och y-koordinaterna på linje 1 med de värden som erhålls i steg 4.5.3, dvs. rad 1 bör nu läsa G0 X-46,5 Y-27,5 ; Mittposition för D1 brunn. Spara filen under ett nytt namn.
OBS: Denna procedur tjänar till att kalibrera G-kodfilen så att utskriften börjar i mitten av brunn D1 baserat på x,y-koordinaterna för den specifika 3D-bioprinter som används. Detta tillvägagångssätt kan användas för att kalibrera G-kodfilen med 24-brunnsplattan för utskrift med alla extruderings 3D-bioprinter. I denna studie trycktes endast den vänstra halvan av 24-brunnsplattan, dvs. brunnarna A1-3, B1-3, C1-3 och D1-3. En separat G-kodfil som kodar utskriften av 2-lagers 5 x 5 x 1 mm rätlinjiga konstruktioner i ett 3 x 4-rutnät tillhandahålls också (Kompletterande fil 2, figur 5C(ii)).
- Öppna den medföljande 24-brunnsplattan geometrisk kod (G-kod) fil i bioprinter programvara (Kompletterande fil 1).
- Justering av extruderingstrycket för skrivhuvud 1 (PH1)
- Se till att den pneumatiska pumpen är ordentligt ansluten till den bakre luftintagsporten i INKREDIBLE+ 3D-bioprintern och slå på den pneumatiska pumpen.
- Dra ut den främre styrratten på höger sida av INKREDIBLE+ 3D-bioprintern.
OBS: Den främre styrratten justerar trycket för PH1, medan den bakre styrknappen justerar trycket för PH2. - Observera de digitala tryckmätare för PH1 och PH2 som finns på framsidan av bioprintern som var och en läser nära 0 kPa. Vrid långsamt den främre kontrollvredet medurs tills trycket på den vänstra mätaren för PH1 når 12 kPa (figur 5A iii).
- Placera ett vikt vävnadspapper eller en bit vattentät tätningsfilm under den installerade patronens tryckmunstycke och var försiktig så att du inte rör vid skrivarmunstycket.
- Välj FÖRBERED BIOPRINT på huvudkontrollmenyn på 3D-bioprintern.
- Navigera till och välj AKTIVERA PH1. Observera att biomaterialbläcket börjar extrudera från skrivarmunstycket. Öka vid behov extruderingstrycket genom att vrida kontrollvredet medurs tills biomaterialbläcket extruderas i en kontinuerlig glödtråd och registrera den nya tryckinställningen. Arbeta snabbt för att undvika slöseri med biomaterialbläck.
- Välj STÄNG AV PH1 för att stoppa extrudering av biomaterialbläcket, ta bort vävnadspapperet eller filmen som innehåller det extruderade biomaterialbläcket från tryckbädden och stäng bioprinterdörren.
OBS: 3D-bioprintern slår automatiskt på lufttryckstillförseln till PH1 under utskriften enligt G-kodfilens anvisningar.
- 3D-bioprintning av rätliniska hydrogelsubstrat i ett 24-well plate format
- Välj VERKTYGSMENY på huvudkontrollmenyn på 3D-bioprintern. Navigera till och välj DISABLE SD PRINT, som gör det möjligt för bioprinter-programvaran att överföra G-kodfiler till 3D-bioprintern för utskrift.
- Klicka på LOAD-knappen i bioprinterprogramvaran och välj den uppdaterade 24-brunnsplattan G-kodfil som sparats i steg 4.6.2.
- På den högra kontrollpanelen i programvaran väljer du fliken FÖRHANDSGRANSKA OCH klickar på printknappen för att påbörja bioprinting i brunn D1.
OBS: Om du använder 3 x 4 gallerbrunn G-kodfilen, kommer bioprintingen att avslutas i brunn A3 på 24-brunnsplattan (figur 5C (ii), D), i motsats till väl A6 om en hel 24-brunnsplatta skrivs ut. - När bioprintningen av de rätlinjiga konstruktionerna är klar, täck 24-brunnsplattan med locket och flytta den till ett klass II-biosäkerhetsskåp.
- Sänk ned varje rätlinjlig konstruktion i två droppar steril cacl2-lösning på 50 mM (figur 5B ii) och inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter.
OBS: Detta tjänar till att joniskt korsa alginatpolymerkedjorna med Ca2 + -jonerna och göra det möjligt för de rätlintiga konstruktionerna att bibehålla sin strukturella integritet. - Aspirera försiktigt CaCl2-lösningen från varje konstruktion och skölj en gång i 1 ml 1x PBS (pH 7.4) för att avlägsna överflödig CaCl2 (figur 5D).
- För att förhindra uttorkning av de biotryckta hydrogelkonstruktionerna, behåll de biotryckta rätlinliniska konstruktionerna i färsk 1x PBS tills BMMCs är redo att sås på konstruktionerna (figur 5D).
5. Inkubation av BMMCs på 3D bioprintade rätlinjära ställningar och lönsamhetstestning
- Inkubation av BMMCs på 3D bioprintade rätliniska hydrogelställningar
- Frö alikvoter av BMMCs på 3D bioprinted rätliniska byggnadsställningar i tre exemplar under fyra olika varaktigheter, t.ex. 6, 18, 24 och 48 h, så att alla behandlingar avslutas samtidigt. Använd BMMCs sådda i tomma brunnar i tre exemplar under samma varaktigheter som obehandlade kontroller.
- Överför aseptiskt BMMCs från en T175 cm2-odlingskolv till ett sterilt koniskt rör på 50 ml och pelletera BMMCs vid 200 × g i 5 min vid rumstemperatur.
- Återanvänd pelleten i 50 ml färskt komplett RPMI-medium som innehåller 20 ng/ml IL-3 och beräkna den levande celltätheten genom att räkna en alikvot trypan blåbetsade BMMCs med hjälp av en hemacytometer.
- Baserat på celltätheten beräknad i steg 5.1.3, förbered en 6 mL alikvot av BMMC-suspensionen med en slutlig densitet på 1 × 106 celler/ml.
- För inkubationsinställningen på 48 h, aspirera PBS från brunnarna A1-3 som innehåller 3D bioprintade rätliniska hydrogelställningar och pipetter 1 ml BMMC (1 × 106 celler/ ml) suspension i varje brunn. Pipette 1 mL BMMC (1 × 106 celler/ ml) suspension i brunnar A4-6 utan bioprintade konstruktioner för att fungera som obehandlad kontroll. Inkubera de återstående brunnarna som innehåller bioprintade byggnadsställningar (B1-3, C1-3, D1-3) i RPMI utan tillsatser för att förhindra uttorkning tills lämplig tid har uppnåtts för sådd med BMMC under behandlingstiden 24, 18 och 6 timmar. Fyll brunnarna utan bioprintade byggnadsställningar (B4-6, C4-6, D4-6) med 1 ml PBS tills lämplig tid har uppnåtts för sådd med BMMCs för 24, 18 och 6 h tidspunkterna.
- Inkubera 24-brunnsplattan vid 37 °C i en 5% CO2 fuktad atmosfär.
- För 24 timmars inkubationsinställning, aspirera redan existerande odlingsmedium / buffert från brunnar B1-6 och frö 1 ml BMMC (1 × 106 celler / ml) suspension i dessa brunnar. Sätt tillbaka plattan till inkubatorn.
- För 18 timmars inkubationsinställning, aspirera redan existerande odlingsmedium / buffert från brunnar C1-6 och frö 1 ml BMMC (1 × 106 celler / ml) suspension i dessa brunnar. Sätt tillbaka plattan till inkubatorn.
- För 6 h inkubationsinställningen, aspirera redan existerande odlingsmedium / buffert från brunnar D1-6 och frö 1 ml BMMC (1 × 106 celler / ml) suspension i dessa brunnar. Sätt tillbaka plattan till inkubatorn.
- För inkubationsavslutning, dispensera prover från varje brunn på 24-brunnsplattan för i) PI-färgning och analys genom flödescytometri, ii) XTT-cellsviabilitetsanalys och iii) LDH-frisättningsanalys. Se därför till att en rundbottnad 96-brunnsplatta och de nödvändiga 1,5 mL mikrofugerören märks i god tid före inkubationsmåttet.
- Cellprovtagning för XTT metabolisk analys
- Återanvänd BMMCs i odlingsmediet noggrant i varje brunn, var noga med att inte skada och fragmentera de 3D bioprintade hydrogelställningarna.
- Överför aseptiskt 40 μL av den homogena BMMC-suspensionen från varje brunn till sterila 1,5 ml mikrofugerör som innehåller 760 μL färskt komplett RPMI-medium (slutlig volym = 800 μL) och virvel kort att blanda.
- Dispensera 100 μL av de utspädda BMMC-suspensionerna i tre exemplar till en platt botten 96-brunns microtiterplatta som är lämplig för registrering av absorbansmätningar (se materialtabellen) på en mikroplattaspektrofotometer.
- Dispensera 50 μL XTT-arbetslösning till varje brunn som innehåller BMMC-cellfjädringen med en flerkanalig mikropipett.
OBS: Förbered XTT-arbetslösningen genom att blanda 5 ml XTT-reagens med 100 μL elektronkopplingsreagens. Tina dessa komponenter från -20 °C i ett 37 °C vattenbad omedelbart före användning. - Inkubera 96-brunnsplattan vid 37 °C i en 5% CO2 fuktad atmosfär i 24 timmar.
- I slutet av inkubationen, ta bort 96-brunnsplattan från inkubatorn och låt svalna till rumstemperatur. Registrera absorbansvärden på en mikroplattaspektrofotometer vid 450 nm med bakgrunds subtraktion vid 650 nm.
- Supernatantprovtagning för laktatdehydrogenas (LDH) analys
- Överför de återstående BMMC-suspensionerna (960 μL) från varje brunn på 24-brunnsplattan till mikrofugerör och pellet cellerna vid 200 × g i 5 min vid rumstemperatur.
- Pipettera tre 100 μL alikvoter av cellodlingsfanten från varje mikrofugerör till en 96-well microtiter platt bottenplatta. Kassera de överblivna supernatanterna från varje mikrofugerör och behåll BMMC-pelletsen för ytterligare färgning med PI i avsnitten 5.4.1-5.4.8.
- Pipett 50 μL av LDH-arbetslösningen i varje 100 μL alikvot supernatant.
OBS: Se kompletterande fil 3 för beredning av LDH-testreagenser. - Inkubera i 1 h i mörkret vid rumstemperatur.
- Pipett 50 μL 1 M ättiksyra till varje brunn för att stoppa reaktionen.
- Registrera absorbansvärden på en mikroplattaspektrofotometer vid 490 nm med bakgrunds subtraktion vid 680 nm.
- Flödescytometrisk analys av BMMC-livskraft via propidiumjodid (PI) uteslutning
- Återanvänd BMMC-pelletsen i flödestvättbufferten (PBS [pH 7.4] innehållande 0,5% w/v BSA) och pellet cellerna vid 300 × g i 5 min vid rumstemperatur.
- Upprepa tvättsteget med flödestvättbufferten en gång till.
- Återanvänd varje BMMC-pellet i 400 μL flödestvättbuffert.
OBS: Det kommer att finnas totalt 24 översusplade BMMC-prover: 12 BMMC-prover inkuberade på bioprintade hydrogelsubstrat (4 tidpunkter i tre exemplar) och 12 BMMC-prover inkuberade i brunnar utan bioprintade konstruktioner (4 tidpunkter i tre exemplar). - I en rundbottnad 96-brunnsmikriterplatta, pipetter 20 μL flödestvättbuffert i brunnarna A1-12 och B1-12. I samma mikrotiterplatta, pipetter 20 μL 10x PI färgning lösning (100 μg/mL PI i flödestvättbuffert) i brunnarna C1-12 och D1-12.
- Dispensera 180 μL av de 12 BMMC-proverna som inkuberats på biotryckta hydrogelsubstrat i brunnarna A1-12 (ett prov per brunn). Dispensera 180 μL av de 12 BMMC-proverna inkuberade utan biotryckta hydrogelsubstrat i brunnarna B1-12 (ett prov per brunn). Använd BMMC-proverna som delas ut i brunnarna A1-12 och B1-12 som oförstådda kontroller för varje behandlingstillstånd (totalt 24 kontroller).
- Dispensera 180 μL av de 12 BMMC-proverna som inkuberats på bioprintade konstruktioner i brunnarna C1-12 (ett prov per brunn). Dispensera 180 μL av de 12 BMMC-proverna som inkuberats utan bioprintade konstruktioner i brunnarna D1-12 (ett prov per brunn).
OBS: BMMC-proverna i brunnarna C1-12 och D1-12 kommer att färgas vid en slutlig effektiv PI-koncentration på 10 μg/ml (totalt 24 färgade prover). - Inkubera plattan antingen i 1 h vid 4 °C eller 15 min vid rumstemperatur i mörker.
- I slutet av inkubationsperioden, analysera proverna direkt från mikrotiterplattan på en flödescytometer som tidigare beskrivits i avsnitt 3.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En av de viktigaste egenskaperna hos ett framgångsrikt biomaterialbläck eller odlingssubstrat är biokompatibilitet. I första hand får substratet inte inducera cellulär död. Det finns flera mikrotiterbaserade och flödescytometriska metoder för kvantifiering av cellens livskraft och nekros; Dessa metoder är dock inte mottagliga för att analysera celler som är inbäddade i en hydrogelmatris. I detta protokoll kringgås ovannämnda begränsning genom sådd av BMMCs på hydrogelsubstratet eller den biotryckta ställningen. Efter en specifik inkubationstid (6-48 h i denna studie) skördas BMMCs lätt genom mikropipetting utan behov av mekanisk störning eller hydrolys av hydrogelsubstratet eller bioprintade byggnadsställningar, vilket annars skulle orsaka fysisk skada på cellerna. BMMCs livskraft analyseras sedan snabbt med hjälp av PI-permeabilitetsmetoden via flödescytometri. PI är ett membranimpermeantfärgämne som är uteslutet från livskraftiga celler med intakta cellmembran och fluorescering endast vid intercalating mellan basparen dna16.
Som sådan är endast celler med komprometterade cellmembran genomsläppliga för PI och kommer därför att fluorescera. PI permeabilitet analys visade inga förändringar i BMMC livskraft när de odlas på CNC/agarose/D-mannitol substrat. Faktum är att ingen av de CNC-koncentrationer som testades (upp till 12,5% w/v) framkallade några negativa effekter på BMMC-livskraften jämfört med BMMCs odlade i avsaknad av CNC/ agarose/ D-mannitol hydrogel substrat (figur 3B, C). Det är också viktigt att biobläcket eller odlingssubstratet inte förändrar cellernas morfologi. Baserat på flödescytometriska FSC kontra SSC-tomter ändrade hydrogelsubstratet med den högsta CNC-koncentrationen (12,5% w/v) inte BMMCs ursprungliga storlek (FSC) eller granularitet (SSC) jämfört med BMMCs odlade i avsaknad av CNC/agarose/D-mannitol hydrogelsubstrat (figur 3A i, ii)).
En annan viktig egenskap hos ett biomaterialbläck eller odlingssubstrat är att det måste ha förmågan att upprätthålla differentiering och fenotyp av de celler som det stöder. Två av de mest väsentliga biomarkörerna för mastceller är den hög affinitet IgE-receptorn, FcεRI, som underlättar BMMC-svar på antigener och stamcellsfaktorreceptorn Kit (CD117), som krävs för mastcellsöverlevnad och differentiering. Mogna mastceller definieras av uttrycket av dessa två ytreceptorer, och för att ett bioinksubstrat ska upprätthålla dem i kulturen får det inte väsentligt ändra uttrycket för dessa två receptorer. CNC/agarose/D-mannitolsubstrat tycktes öka FcεRI- och Kit-uttrycket vid CNC-koncentrationer ≥ 2,5% (figur 4A(iii), B(iii)). Intressant nog förblev de förhöjda FcεRI- och Kit-uttrycksnivåerna relativt konsekventa mellan 2,5% och 12,5% CNC, vilket indikerar en platåeffekt och föreslår en effekt som inte är beroende av koncentrationen av CNC, men på någon annan parameter i hydrogelkompositen.
De 3D bioprintade hydrogelbiomaterialbläckställningar som genereras i denna studie består av fibrillär nanocellulosa (FNC), istället för kristallin nanocellulosa, och natriumalginat som gelator, istället för agaros. Fibrillär nanocellulosa uppvisar distinkta topografiska egenskaper i nanoskala jämfört med CNC17 som, förutom mikroskalaarkitekturen hos 3D-bioprintade FNC-hydrogelbiotänkande substrat, potentiellt kan påverka BMMCs livskraft. Efter 3D-bioprinting och jonisk korslänkning av FNC/alginat/D-mannitol biobläckställningar (figur 6) odlades BMMCs antingen ensamma eller på 3D bioprintade hydrogelställningar i 6, 18, 24 respektive 48 h, för att bedöma de dynamiska förändringarna i BMMCs livskraft som svar på FNC/alginat/D-mannitat-ställningar, för att bedöma de dynamiska förändringarna i BMC:ernas livskraft som svar på FNC/alginat/D-mannitat-ställningar, för att bedöma de dynamiska förändringarna i BMC:ernas livskraft som svar på FNC/alginat/D-manrvlar, för att bedöma de dynamiska förändringarna i BMC:ernas livskraft som svar på FNC/alginat-ställningarna/D-manginatet/D-manginatställningarna, för att bedöma de dynamiska förändringarna i BMMCs livskraft som svar på FNC/alginat-ställningar, för att bedöma de dynamiska förändringarna i BMMCs livskraft som svar på FNC/alginat/D-manniter, för att bedöma de dynamiska förändringarna i BMC:s livskraft som svar på FNC/alginat/D-mannitat-ställningar, för att bedöma de dynamiska förändringarna i BMC:ernas livskraft som svar på FNC/alginat/D-mannitat-ställningar, för att bedöma de dynamiska förändringarna i BMMCs livskraft som svar på FNC/alginat-ställningar/D-manniter, för att bedöma de dynamiska förändringarna i BMM om någon, under längre tidsperioder. XTT-analysen visade att den metaboliska aktiviteten hos BMMCs odlade på 3D bioprintade hydrogelställningar förblev relativt konsekvent vid ~ 100% över alla testade tidpunkter jämfört med BMMCs odlade ensam (figur 7A). Lysen av celler resulterar i frisättning av LDH i cellodlingsmediet, som LDH-analysen detekterar som en funktion av dess oxidoreduktiva enzymatiska aktivitet.
BMMCs odlade på 3D bioprintade hydrogelställningar uppvisade en gradvis tidsberoende ökning av LDH-frisättning jämfört med BMMCs odlade ensam. Denna trend hade dock en icke-signifikant standardavvikelse på mindre än 9 % (figur 7B). PI färgning av BMMCs odlade på 3D bioprinted hydrogelställningar visade inga betydande förändringar i livskraft jämfört med BMMCs odlas ensam vid varje tidpunkt (figur 7C). I synnerhet var MFI av PI-färgade BMMCs odlade på 3D bioprintade hydrogelställningar relativt konsekventa (PI-MFI på 7000) över alla tidpunkter och liknade BMMCs odlade på CNC / agarose / D-mannitol substrat, som uppvisade en konsekvent PI-MFI på 7000 över alla CNC-koncentrationer (2,5-12,5%). Sammantaget visar dessa uppgifter att FNC/alginate/D-mannitol hydrogelställningar inte inverkar negativt på BMMC: s livskraft.
Figur 1: Musbenets anatomi, som visar skenbenet och lårbenet från vilket benmärgen är isolerad. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Beredning av CNC/agarose/D-mannitol hydrogelsubstrat. A) Schematiskt schema för CNC/agarose/D-mannitol hydrogel substratberedningsprotokoll. (B) CNC/agarose/D-mannitolpreparat (0, 1, 2,5, 5, 10 och 12,5% (w/v) CNC i PBS/agarose/D-mannitol) lastades på en 24-brunnsplatta i fyrdubbelt som illustrerats. Förkortningar: PBS = fosfatbuffrad koksaltlösning; CNC = kristallin nanocellulosa. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Flödescytometrisk analys av BMMC-livskraft via propidium Iodide exkludering efter inkubation på CNC/agarose/D-mannitol substrat. BMMCs togs bort från CNC/agarose/D-mannitol hydrogel substrat, tvättades två gånger, återanvändes i PBS-0,5% w/v BSA, färgade med PI för 1 h vid 4 °C och analyseras av flöde cytometri (n =4). Totalt 20 000 celler per prov förvärvades, inklusive upptäckt av PI-fluorescensutsläpp i PE-kanalen. Dataanalys utfördes med hjälp av programvara för flödescytometrianalys. (A) Framåtspridare (x-axel) kontra sidospridning (y-axel) punktdiagramanalys av den totala cellpopulationen från (i) obehandlad kontroll BMMC (0% CNC/agarose/D-mannitol) och ii) BMMCs odlade på 12,5% CNC/agarose/D-mannitol, som visar den gated cellpopulation som används för dataanalys. (B) Histogram överlägg profil av gated celler (oförstörd eller fläckad med PI), från obehandlad kontroll BMMCs (0% CNC / agarose / D-mannitol) och BMMCs odlade på 12,5% CNC / agarose / D-mannitol. (C) BMMCs odlades på olika CNC/agarose/D-mannitol substrat (1-12,5% (w/v) CNC) för 18 h, och cell livskraften fastställdes av flöde cytometrisk analys av PI-färgade celler. Grafisk representation av PI MFI för BMMCs inkuberas på olika CNC / agarose / D-mannitol substrat (1-12,5% (w / v) CNC) i förhållande till BMMCs som var obehandlade och färgade med PI. Förkortningar: BMMCs = benmärgsbaserade mastceller; CNC = kristallin nanocellulosa; PBS = fosfatbuffrad saltlösning; BSA = albumin för bovint serum; PI = propidiumjodid; PE = fycoerythrin. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Flödescytometriska analyser av FcεRI och Kit (CD117) cellytans receptoruttryck. BMMCs odlades antingen i avsaknad eller närvaro av CNC/agarose/D-mannitol substrat för 18 h, bort och analyseras för receptor uttryck. Data är representativa för 4 replikat. Framåtriktad spridning (x-axel) kontra sidospridning (y-axel) punktdiagram för den totala cellpopulationen i det obehandlade BMMC-provet (0% CNC/agaros/D-mannitol), färgat med (A)(i) isotypkontrollantikroppen-APC eller (B)(i) isotypkontrollantikroppen-PE och den gated cellpopulation som används för dataanalys. Histogram överlägg profiler av gated BMMCs (färgade med isotyp kontroll antikroppar eller (A)(ii) anti-FcεRI-APC antikropp eller (B)(ii) anti-Kit-PE antikroppar), inkuberas antingen ensam (0% CNC/agarose/D-mannitol) eller på 12,5% CNC/agarose/D-mannitol substrat. BMMCs odlades i 18 h på olika CNC/agarose/D-mannitol substrat (1-12,5% (w/v) CNC) följt av FcεRI och Kit ytan receptor uttryck analys, respektive, via flöde cytometri (n =4). Grafisk representation av MFI av BMMCs färgade med (A)(iii) anti-FcεRI-APC eller (B)(iii) anti-Kit-PE antikroppar, efter odling på olika CNC/ agarose/ D-mannitol substrat (1-12,5% (w/v) CNC) i förhållande till celler som var obehandlade (0% CNC) och färgade på samma sätt. Förkortningar: CNC = kristallin nanocellulosa; APC = allophycocyanin; PE = fycoerythrin; BMMCs = benmärgsbaserade mastceller; MFI = genomsnittlig fluorescensintensitet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 5: 3D-bioprinterutrustning och förbrukningsmaterial som krävs för att bioprinta 5 x 5 x 1 mm 2-lagers rätlinjära biobläckhygelställningar i ett 24-brunnsplåtformat. A) ii) Startpunktskalibrering av skrivhuvud 1 med en biobläckpatron installerad och placering av skrivarmunstycket direkt över mitten av brunnen D1 i x-y-z-dimensionerna. A) iii) Ph1:s position efter z-axelkalibrering och extruderingstrycket för PH1 som är inställt på 12 kPa. B) i) Bioink-patron (3 ml) som innehåller formulering av alginat/D-mannitolbiomaterial. B) ii) Droppbehållare på 50 mM CaCl2 tvärlänkningslösning. C) i) Schematisk representation av en utskriftslayout från en G-kodfil som kodar utskriften av 5 x 5 x 1 mm rätlinjära biobläckhydrogelställningar i alla brunnar på en 24-brunnsplatta. C) ii) Schematisk representation av en utskriftslayout från en G-kodfil som kodar utskriften av 5 x 5 x 1 mm rätlinjiga biobläckhydrogelställningar endast i brunnarna A1-3, B1-3, C1-3 och D1-3 på en 24-brunnsplatta. C) iii) Utökad vy över 5 x 5 x 1 mm 2-lagers rätlinjära biobläckhydrogelställningar i skivningsprogrammet, Slic3r. D) Topview av faktiska 3D bioprinted 5 x 5 x 1 mm 2-lager rätlinjära bioink hydrogelställningar i ett 24-väl plåtformat nedsänkt i PBS. Förkortningar: 3D = tredimensionell; PH1 = skrivhuvud 1; NFC = nanofibrillär cellulosa; G-kod = geometrisk kod; PBS = fosfatbuffrad koksaltlösning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Schematiskt diagram som visar arbetsflödet för 3D-bioprinting och BMMC-kultur på FNC/alginate/D-mannitol hydrogelställningar. Förkortningar: 3D = tredimensionell; 2D = tvådimensionell; G-kod = geometrisk kod; FNC = fibrillär nanocellulosa; BMMCs = benmärgsbaserade mastceller. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 7: Flödescytometriska (PI) och mikrotiter (XTT och LDH) analyser av BMMC-livskraft efter inkubation på FNC/alginat/D-mannitolställningar. (A) Cellproliferation (XTT) metaboliska analysdata för BMMCs odlade på FNC/Alginate/D-mannitol biobläcksubstrat för 6, 18, 24 respektive 48 h. Värden presenteras som en procentandel av XTT metaboliska data för BMMCs odlas ensam för 6, 18, 24 och 48 h, respektive. Felstaplar anger standardavvikelse (n=3). B) LDH enzymfrisättningsanalysdata för BMMCs odlade på FNC/Alginat/D-mannitol bioinkställningar för 6, 18, 24 respektive 48 h. Värden presenteras som vikförändringar i förhållande till LDH-enzymet som frigörs av BMMCs odlade enbart i 6, 18, 24 respektive 48 h. Felstaplar anger standardavvikelse (n=3). C) Flöde cytometriska data av PI-färgade BMMCs som odlades antingen ensam eller på FNC/Alginate/D-mannitol bioink byggnadsställningar för 6, 18, 24 respektive 48 h. Felstaplar anger standardavvikelse (n=3). Förkortningar: LDH = laktatdehydrogenas; BMMCs = benmärgsbaserade mastceller; FNC = fibrillär nanocellulosa; PI = propidiumjodid; MFI = genomsnittlig fluorescensintensitet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| 1.1.1. 500 ml flaska RPMI (HyClone, GE Healthcare, USA) |
| 1.1.2. 4 mM L-glutamin (Gibco, Waltham Massachusetts, USA) |
| 1.1.3. 50 mM β-Mercaptoethanol (Fisher Scientific, Hampton, New Hampshire, USA) |
| 1.1.4. 1 mM natrium pyruvat (Gibco) |
| 1.1.5. 100 U/ml penicillin (Gibco) |
| 1.1.6. 100 μg/ml streptomycin (Gibco) |
| 1.1.7. 0,1 mM MEM icke-essentiella aminosyror (Gibco) |
| 1.1.8. 25 mM HEPES (Fisher) |
| 1.1.9. 10% värme inaktiverad FBS (Gibco) |
| 1.1.10. 30 ng/mL mus rekombinant IL-3 (Peprotech, Rocky Hill, New Jersey, USA) |
Tabell 1: Kompletta RPMI-1640 mediatillskott.
Kompletterande fil 1. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 3. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tillverkningen av 3D biomimetiska vävnader kräver en framgångsrik sammanslagning av bioink, som efterliknar komponenter i den extracellulära matrisen, med cellulära komponenter för att skapa fysiologiska analoger av in vivo vävnader. Detta kräver användning av primära celler, och inte omvandlade celler, vid tillverkning av fysiologiska biomimetiska vävnader. Primära immunologiska celler, såsom mastceller, är dock särskilt mottagliga för cytotoxiska effekter och fenotypiska förändringar som kan framkallas av själva biobläckmatrisen, vilket inte är önskvärt. Därför är förmågan att snabbt bedöma effekterna av kandidatens biomaterialbläck på mastcellernas livskraft och fenotyp (ytreceptoruttryck) mycket fördelaktig, särskilt före 3D-bioprintning av komplexa vävnader som innehåller olika celltyper inbäddade i biobläckmatrisen, vilket är kostsamt och tidskrävande.
Tillvägagångssättet för detta protokoll innebär odling av BMMCs, ett exempel på primära mastceller, på ytan av förformade kandidat hydrogel bioink substrat (1-12,5% CNC inbäddat i agarose), vilket möjliggör enkel hämtning av BMMCs för efterföljande analys av cell livskraft och ytan receptor uttryck genom flöde cytometri. Isoleringen av benmärg från mus lårben och skenben kräver precision och uppmärksamhet på detaljer på grund av bräcklighet och liten storlek på dessa ben. Efter framgångsrik isolering och nedfall av benmärgen i cellodlingsmedium är det viktigt att upprätthålla cellkulturen med 30 ng/mL mus rekombinant IL-3 kontinuerligt i 4 veckor, vilket säkerställer ihållande stimulering för att differentiera de hematopoetiska stamcellerna i mastceller som är dubbelpositiva för Kit (CD117) och FcεRI cellytan receptorer.
Flödescytometrisk analys av mastceller för ytuttrycket av Kit (CD117) och FcεRI-receptorer bör använda isotypantikroppskontroller för att hjälpa till att skilja icke-specifik bakgrundssignal från de specifika signalerna från de antikroppar som används för att rikta in sig på dessa receptorer, vilket framgår av figur 4A ii, B ii. Det är också viktigt att gate på en väldefinierad mastcellspopulation för att utesluta cellskrot som visas i figur 4A i och 4B i, som också icke-specifikt kan binda antikroppar. Skonsam mikropipetting bör användas vid hämtning av BMMCs från ytan av bioink hydrogel substrat för att minska skjuvningskrafterna som utövas på cellerna, vilket kan skada cellmembranet och resultera i artificiellt förhöjd färgning med PI. Pi-färgade BMMCs bör analyseras med flödescytometri omedelbart efter att inkubationstiden för färgning slutar eftersom PI-färgningsmediet, som är baserat på PBS-0,5% w/v BSA, inte är avsett att upprätthålla celler under längre tidsperioder utanför cellodlingsmediet. Eftersom PI endast genomsyrar celler med komprometterade cellmembran kan den färga nekrotiska celler med hög selektivitet och känslighet. PI kan dock inte upptäcka apoptotiska celler, som upprätthåller intakta cellmembran.
Pi-exkludering flöde cytometriska analysen som beskrivs i detta protokoll kan utökas med Annexin-V-fluorescein isotiiocyanate (FITC), som specifikt binder till fosfolipid, fosfatidylserin, som är omplacerad till den yttre broschyren i cellmembranet i apoptotiska celler. Kompensation är dock nödvändig för att ta hänsyn till fluorescensutsläppsavblåsningen av FITC i den detektorkanal som används för att erhålla fluorescensutsläpp från PI och vice versa. Vid beredningen av bioprintern för 3D-bioprinting från den medföljande G-koden med 24 brunnsplåt är det viktigt att startpunktskalibreringen utförs korrekt, varigenom x- och y-koordinaterna i brunn D1-centret registreras och G-kodfilen uppdateras med dessa x- och y-koordinater på rad 1. Om dessa inledande kalibreringssteg inte utförs korrekt flyttas skrivhuvudena inte till rätt startpunkt när utskriften påbörjas. Korrekt kalibrering av z-axeln är lika viktigt eftersom underlåtenhet att göra detta kan leda till att skrivhuvudets munstycke kolliderar med tryckbädden eller 24-brunnsplattan i början av utskriften.
Det schematiska diagrammet över 5 x 5 x 1 mm 2-lagers rätlinjär rutnätskonstruktion (figur 5C(iii) illustrerar förekomsten av porer mellan de extruderade bioinkfilamenten som bildar substratet. Storleken på filamentens porer och diameter beror på tre parametrar: i) tryckmunstyckets körhastighet, ii) extruderingstrycket som appliceras på biobläcket i patronen och iii) utskriftsmunstyckets diameter. Biobläcksubstrat med stora filamentdiametrar och små porer kan skrivas ut med en långsammare tryckmunstyckeshastighet, högre extruderingstryck (>12 kPa) och tryckmunstycke med större diameter (22 G). Omvänt resulterar en snabbare utskriftsmunstyckeshastighet, lägre extruderingstryck (<12 kPa) och utskriftsmunstycke med mindre diameter (27 G) i substrat med finare filament och större porer. Ett otillräckligt högt extruderingstryck kommer dock att resultera i att inkonsekventa klumpar av bioink extruderas istället för kontinuerliga filament, vilket kommer att påverka kvaliteten och den strukturella integriteten hos det 3D-biotryckta substratet negativt.
CNC/agarose/D-mannitol kandidat bioink presenteras i detta protokoll genomgår termisk gelering när agaros svalnar ner till rumstemperatur. Däremot genomgår den kommersiella biobläck som används för 3D-bioprinting i detta protokoll jonisk korslänkning med CaCl2 på grund av införandet av natriumalginat i biobläckformuleringen. Det är därför nödvändigt att sänk ned de biotryckta FNC/alginat-/D-mannitolställningarna i 50 mM CaCl2-lösningen efter bioprintning för att underlätta tvärbindning (gelering) av substratet. Utelämnande av joniska tvärbindningssteget med CaCl2 kommer att resultera i upplösning av FNC/ alginat/D-mannitolställningar när de är nedsänkta i cellodlingsmedium. Den främsta begränsningen av CNC/ agarose / D-mannitol bioink formuleringen i dess tillämpning i faktisk 3D bioprinting är den exceptionellt höga smälttemperaturen för agaros (90-95 °C). Även om skrivhuvudena för 3D-bioprintern som används i denna studie kan nå en maximal temperatur på 130 °C, kommer de extruderade filamenten i CNC/ agarose/ D-mannitol sannolikt att sprida sig snabbt när successiva lager trycks för att konstruera substratet. Denna begränsning av CNC/ agarose / D-mannitol bioink formulering kan kringgås genom att antingen skriva ut CNC / agarose / D-mannitol bioink direkt på en kyld tryckbädd för att påskynda gelering, eller ersätta agaros med natriumalginat, som kan extruderas vid rumstemperatur och genomgår snabb jonisk korslänkning med 50 mM CaCl2 inom 5 min.
Detta protokoll erbjuder ett tillförlitligt tillvägagångssätt för att snabbt screena och utesluta bioink formuleringar som uppvisar dålig biokemisk kompatibilitet med känsliga immunologiska celler, såsom mastceller, som inte bör utsättas för pneumatisk-extrudering 3D bioprinting. Dessutom är detta protokoll kostnadseffektivt eftersom det kräver relativt låga mängder celler för att utföra en multiplexerad screeninganalys. Däremot måste förformulerade biobläckcellsblandningar bioprintas vid mycket hög celltäthet (>107 celler/ml), vilket kan visa sig vara kostsamt och tidskrävande att utföra en biokompatibilitetsscreening, särskilt vid odling av primärceller som är beroende av dyra rekombinanta tillväxtfaktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta arbete stöddes av National Research Council Canada och Alberta Innovates.
Acknowledgments
Vi tackar Alberta Innovates för att ha tillhandahållit CNC och Ken Harris och Jae-Young Cho för deras tekniska råd när de förbereder CNC / agarose / D-mannitolmatrisen. Vi tackar också Ben Hoffman, Heather Winchell och Nicole Diamantides för deras tekniska råd och support med installation och kalibrering av INKREDIBLE+ 3D bioprinter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).
- Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , Springer. Cham. 1345-1363 (2019).
- Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).
- Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).
- Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).
- Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).
- Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
- Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
- Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
- Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
- Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).
- Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
- Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
- Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
- Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).
