Summary
Burada optimize edilmiş FlashPack kılcal sütun paketleme prosedürü için bir protokol sunuyoruz. Optimize edilmiş bir protokolün ortak bir 100 bar basınçlı bomba kurulumuna uygulanması, uzun ultra yüksek performanslı kılcal sütunların 10 kat daha hızlı paketlenerek üretilmesini sağlar.
Abstract
Kılcal ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (UHPLC) şu anda LC-MS tabanlı proteomikte örnek ayırma adımı için tercih edİlen bir yöntemdir. Bununla birlikte, kılcal sütunlar daha yüksek akış karşı tiplerine kıyasla çok daha az sağlamdır. Kolay kontaminasyon ve engelleme nedeniyle, genellikle değiştirilmesi gerekir. Bu da onları toplam LC-MS analiz maliyetinin belirgin şekilde pahalı bir parçası yapar. UHPLC kılcal sütunların şirket içinde paketlenerek çok para tasarrufu sağlar ve özelleştirmeye olanak tanır. Bununla birlikte, 100 bar basınçlı bombadaki standart paketleme prosedürü yalnızca HPLC sütunları için iyi çalışır, ancak UHPLC sorbentleri için çok yavaştır. Burada, aynı 100 bar basınçlı bomba kurulumuna uygulanan optimize edilmiş bir FlashPack protokolünün açıklamasını sunuyoruz. Yöntem, ultra yüksek sorbent konsantrasyon bulamacından paketlemeye dayanmaktadır ve uhplc kılcal sütunların makul sürede sınırsız uzunlukta şirket içinde üretimi için geliştirilmiştir.
Introduction
Modern proteomik, en iyi analiz hızını ve hassasiyetini sağlayan ultra yüksek performanslı nano akışlı kromatografi (50-150 μm sütun iç çapı (ID)) ayrımı ile sıvı kromatografisi bağlantılı kütle spektrometresine dayanmaktadır1. Çok sayıda ticari UHPLC kılcal sütun mevcut olsa da, fiyatları, özellikle laboratuvarda birden fazla farklı proje çalıştırıldığında ve projeye özgü kolon kirlenmesi sık karşılaşıkça karşılaşıldığında sarf malzemeleri maliyetinin önemli bir kısmını oluşturur. Ayrıca, şirket içinde sütunların paketlenebilmesi, özel deneye özgü sorbts (örneğin, polyCAT-A sorbent2gibi) ve sütun özelliklerinin hazır bir sütun olarak satın alınamaz.
Bununla başa çıkmak için, birçok laboratuvar kılcal sütunları şirket içinde paketler. Bununla birlikte, 100 bar basınçlı bomba (basınç enjeksiyon hücresi)3 ile ortak paketleme prosedürü, alt 2 μm UHPLC sorbentlerinin yüksek geri basıncı nedeniyle UHPLC kolon ambalajı için uygun değildir ve bu da daha büyük boyutlu HPLC sorbentlerine kıyasla çarpıcı bir paketleme oranı düşüşü ile sonuçlanır. Kısa UHPLC sütunları hala çok yavaş paketlenebilirken, uzun UHPLC sütunlarının üretimi fiziksel olarak imkansızdır4.
Standart kılcal sütun paketleme, 100 bara kadar nispeten düşük basınçlarda ve çok düşük bir bulamaç konsantrasyonu ile yapılır. Bu nedenle, süreci hızlandırmanın iki olası yönü mevcuttur. Paketleme basıncını arttırmak mümkündür5. Bununla birlikte, bu özel ekipman ve pratik olarak laboratuvarda yeni bir yöntemin kurulmasını gerektirir. Başka bir yol, sorbent bulamaç konsantrasyonuartırmaktır 6. Yüksek sorbent bulamaç konsantrasyonu ambalajı, önceki bir yayında ultra yüksek paketleme basıncı ile birlikte açıklanmıştır7. Bununla birlikte, mevcut paketleme bombalarının çoğunda kullanılan 100 bar basınçta, daha yüksek sorbent konsantrasyonu paketleme hızının yavaşlamasına veya düpedüz paketleme durmasına neden olur. Etkinin son zamanlarda sütun girişindeki sorbent kümelemeden kaynaklandığı gösterildi ve sütun girişini bir sorbent şişenin içindeki mıknatıs çubuğuyla çekiçleyarak sorbent cupola istikrarsızlaştırmanın basit bir hilesi önerildi4. FlashPack adlı elde eden yöntem, aynı 100 bar basınçlı bomba paketleme kurulumunu kullanır. Aynı zamanda, paketleme prosedüründeki küçük ama kritik değişiklikler, çok yüksek sorbent bulamaç konsantrasyonundan paketlemeye ve bir saatten kısa sürede çok uzun UHPLC sütunlarının (50 ila 70 cm ve daha uzun) üretimine izin verirken, aynı parametrelerin ticari sütunlarına eşit ayırma kalitesi ile dakikalar içinde kısa bir sütun üretilebilir4. FlashPack yaklaşımı, hem ters faz (RP) 8 ,9, 10 , 11 ,12,13,14ve hidrofilik etkileşim (HILIC)2kılcal sütunların hazırlanması için birden fazla proteomikprojede başarıyla kullanıldı.
Burada, FlashPack yaklaşımının standart 100 bar basınçlı bomba paketleme prosedürüne uyarlandırıcısı için gereken değişiklikleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz.
Protocol
Paketleme protokolü beş adımdan oluşur (Şekil 1): 1) Paketleme istasyonu hazırlama, 2) kılcal hazırlık, 3) sorbent bulamaç hazırlama, 4) basınçlı bombada kılcal ambalajlama ve 5) HPLC sisteminde kolon paketleme, boyut ve UHPLC bağlantı kurulumunu kesme. FlashPack optimizasyonu, ortak protokole kıyasla bölüm 3 ve 4'te ayarlamalar yapılmasını gerektirir.
1. Paketleme istasyonu montajı
- Çıkış basıncı 50 bar > tek kademeli gaz regülatörü ile döşenmiş azot, helyum veya argon ile dolu bir gaz tankı hazırlayın. Maksimum basınç, basınç bombası uyumluluğu ile sınırlıdır.
- Regülatörü basınç bombasının havalandırma vanasına bağlayın.
- Basınç bombası entegre bir manyetik karıştırıcı ile donatılmamışsa, bombayı manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin.
- Dar bir kimlik plastik boruyu (örneğin, 0,13 mm) basınçlı bombanın havalandırma çıkışına bağlayın ve su içeren bir kaba koyun.
2. Kılcal damar hazırlığı
- Kasil ve formamid15'ten oluşan entegre bir cam frit veya lazer çekme16tarafından hazırlanan çekilmiş bir yayıcı kılcal damar ile fritlenmiş bir kılcal damar hazırlayın. Kılcal damar, hedeflenen kolon uzunluğundan 10-15 cm daha uzun yapılır.
NOT: Farklı kılcal boyut ve frit türleriyle ilişkili olası sorunların tartışılması için Tablo 1'e bakın. Tablo 2, çekilen yayıcı kılcal damarlar yapmak için bir P2000 lazer çekme programı örneği içerir. - Çekilmiş bir yayıcı ucunu kesilmiş jel yükleme pipet ucuyla koruyun.
- Ucu 360 μm OD kılcal damarın etrafına sıkıca sığacak şekilde kesin (kılcal damar boyunca hareket ettirilebilir, ancak bunu yapmak için biraz çaba gerektirir).
- Kesilen pipet ucunu kılcal ön ucun yönünden kılcal damar üzerine kaydırın ve yayıcı ucuna kadar hareket ettirİn.
- Sütun püskürtülürken koruma ucunu geri kaydırın. Sütun püskürtülmediğinde (sütun akışın altında olsa bile, yine de püskürtmediğinde) yayıcının ucunun ucunun içinde olması için ucu ileri kaydırın.
3. Sorbent bulamaç hazırlığı
- Bir stok sorbent şişesi hazırlayın: 1,5 mL santrifüj tüpüne ~50 mg kuru sorbent yerleştirin. Burada, Reprosil Pur C18 örnek olarak kullanılır.
- Sorbent tüpüne 1 mL metanol ekleyin.
- Tamamen karıştırmak için, bir girdap karıştırıcı kullanarak 10 s için tüpü girdaplayın.
- Sonicate 10 s için bir sonication banyoda.
- Sorbent'in 20-30 dakika boyunca iyice ıslatmasına izin verin. Sonra, girdap ve sonicate bir kez daha.
- Çalışan bir sorbent şişesi hazırlayın. Bombaya uyan konik bir alt şişe kullanın.
NOT: Belirli bir basınçlı bomba tasarımına bağlı olarak başka bir 1,5 mL santrifüj tüpü veya başka bir şişe olabilir. Bu deney için basınç bombasının yüksekliğine kadar kesilmiş konik alt vidalı kapak tüpü kullanılır. - Sorbent'i stok sorbent şişesine yeniden depon ve 500 μL'yi 2 x 3 mm büyüklüğünde bir mıknatıs çubuğu ile çalışan sorbent şişesine aktarın.
- Çalışma şişesine ~1 mL'ye kadar metanol ekleyin.
- Sorbent'in yerçekimi ile yerleşmesi için çalışma şişesinin 10 dakika boyunca masada durmasına izin verin.
- Yerleştikten sonra, sorbent tabakası 4 mm'nin altındaysa, stok sorbent bulamacından daha fazlasını ekleyin ve sorbent'in 10 dakika daha yetinmesini bekleyin.
NOT: Hazırlanan çalışma şişesi, aylar boyunca birden fazla sütunun hazırlanması için tasarlanmıştır. Çalışan sorbent şişesi 2 saatten fazla karıştırmadan kalırsa, 10 sn boyunca girdaplı olmalı, 10 sn için sonik hale verilmeli ve yerçekimi ile yerleşmelidir. Rutin olarak, sorbent paketlemeden önce sabahları yeniden kullanılır. Ardından, sıralı sütun paketleme arasında uzun duraklamalar yoksa, tüm gün boyunca paketleme için iyidir. Çalışma şişeslerindeki sorbent kurursa, metanol ekleyin ve stok sorbent şişesi için olduğu gibi tam sorbent hazırlama prosedürünü çalıştırın (adım 3.2-3.5).
4. Bir basınçlı bomba içinde paketlenmiş kılcal damarlar
DİkKAT: Basınçlı bomba ile çalışırken daima koruyucu gözlük takın. Eldiven takmayın. Bunlar, küçük çaplı kılcal damarların düzgün kullanımı için gereken dokunma hissini ciddi şekilde azaltır ve hatalara yol açar.
- Sorbent şişesini basınçlı bombaya yerleştirin ve tüm somunları sıkıca sabitleyin.
- Rotasyona 60-100 rpm'de başlayın.
- Fritted veya çekilmiş yayıcı kılcal damarı bombanın içine yerleştirin: şişenin en altına itin ve ardından 2-3 mm yukarı kaldırın ve somunu sabitle.
NOT: Kılcal damar ve yüksük hasarını önlemek için kılcal damarı sabitlemek için minimum gerekli kuvveti uygulayın. En iyisi el sıkmadır. Altıgen anahtar kullanılıyorsa, sıkma için minimum yeterli çabayı uygulayın. - Kılcal damarın düzgün bir şekilde sabitlenip sabitlenmediğini kontrol edin - kılcal damarı elle çekerek hareket ettirmek imkansız olmalıdır.
- Kılcal damarın açık ucunu yüzünüzden uzak tutarken basınçlı bomba vanasını çok yavaşça açın.
- Paketleme işleminin ilk adımlarını izleyin.
NOT: Basınçlandırmadan hemen sonra, sorbent kılcal damarı doldurur ve tüm uzunluk boyunca şeffaf olmaz. Sorbent distal ucun içine toplanmaya başlar başlamaz, geri basınç artar, akış yavaşlar ve kılcal reformların içindeki sorbent bulamaç, sorbent içermeyen boşluklarla ayrılmış birkaç sorbent pakete dönüşür. Zaten paketlenmiş sorbent, yoğun renkli sürekli büyüyen bir bölge olarak görülebilir. - Sorbent dolgulu bölgeleri, paketleme işlemi boyunca küçük sorbent serbest boşluklarla kılcal uzunluğun en az% 70'i olacak şekilde tutun.
- Paketleme işlemi sırasında izlenmesi gereken ve kılcal damarlara verimli sorbent teslimatı sağlamak için uçuşta kurulum ayarı gerektiren birkaç yaygın sorun vardır.
NOT: Sorbent-delivery efficiency ayarlaması hakkında daha fazla ayrıntı Tablo 3'te açıklanmıştır.- Sayı 1: Yeni sorbent kılcal damara girmeyi bıraktığında, sorbent zaten içeride hareket etmeye devam ederken, aşağıdaki adımları izleyin.
NOT: Bu en sık karşılaşılanı konudur. Çoğu durumda kılcal damar girişi kendi kendine toplanan sorbent kümeleri tarafından engellenir. Sorbent akışı geri yüklenene kadar aşağıdaki adımları tek tek uygulayın ve sonra sorunla ilgili diğer adımları atlayın.- Dönüş hızını 500 rpm'ye çıkarın ve hemen 60-100 rpm'ye düşürün. Genellikle, sorbent akışını geri yükler. Paketleme işleminin geri kalanı için dönüş hızının en az 60 rpm olacak şekilde kontrol edin.
- Yardımcı olmazsa, ambalaj bombasını kısa bir süre havalandırın ve hemen geri bastırın.
- Yardımcı olmazsa veya engelleme tekrar olursa, kılcal damarı sorbent katmanın içinde yeniden konumlandırın. Sorbent'in yokluğu, kılcal açık ucun mıknatıs çubuğunun çok üzerinde olması nedeniyle olabilir, bu nedenle sütun ucu dokunmaz veya kılcal damar şişe tabanına yapışır. İlk olarak, bombayı tamamen çıkarın, somunu gevşetin, kılcal damarı dibe itin ve ardından 2 mm geri çekin. Somunu tamir et.
- Engelleme devam ederse, sistemi boşaltın, sorbent şişesini ve girdabı çıkarın ve bir kez daha sonicate edin. Kılcal ön uç mikroskop altında hasar olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse ön ucun ~5 mm'lik kısmını kesin.
- Sayı 2: Sorbent kılcal damarın sadece küçük bir kısmını uzun boş bölgelerle doldurduğunda, aşağıdaki adımları izleyin.
- Dönüş hızını kontrol et. Rotasyon çok yavaşsa, kümbet kırılması yeterince verimli değildir. Dönüş hızını ~150 rpm'ye yükseltin.
- Döndürme çok hızlıysa, sorbent daha büyük şişe hacmine yeniden harcanır ve sütun girişinin etrafındaki yerel sorbent konsantrasyonu düşüktür. Dönüş hızını 60-100 RPM'ye düşür.
- Sorbent seviyesini kontrol edin. Kılcal damarın içindeki az sorbent ile aynı sorun, şişede yeterli sorbent olmadığında gözlenir. Sorbent kullanıldığında, yer çekimine bağlı yerleşmeden sonra sorbent tabakasını en az 4 mm yüksek tutmak için şişeyi yeni sorbent ile doldurun.
- Sayı 1: Yeni sorbent kılcal damara girmeyi bıraktığında, sorbent zaten içeride hareket etmeye devam ederken, aşağıdaki adımları izleyin.
- Hedef sütun uzunluğu artı 5-7 cm elde edilene kadar sütunu paketlemeye devam edin.
- Dönüşü durdurun ve bombanın basıncını yavaşça düşür.
- Bomba vanasını biraz açın ve su şişesinin içindeki baloncuğun patlamasını bekleyin. Ardından, vanayı biraz daha açın ve tekrar kabarcık patlamasının yavaşlamasını bekleyin.
- Vanadan gaz çıkmayana kadar basıncı artışlarla bırakın.
NOT: Vanayı aynı anda açmayın - kılcal damarın içinde köpürmeye ve sorbent'in şişeye geri dönmesine neden olur. Bu olursa, bombayı geri bastırın ve sütunun tekrar toplandığını bekleyin.
- Havalandırma vanasının içinden gaz çıkmadığında, paketlenmiş kılcal damarı basınç bombasından çıkarın.
NOT: Sütunun kurumasına izin vermeyin. Daha fazla paketleme için hplc sistemine hemen bağlı değilse, paketlenmiş kılcal damarı% 10 EtOH çözeltisine tamamen batırarak depoya koyun. Kılcal depolama için sıvı sıkı polipropilen gıda saklama kabı kullanılabilir. Bağlantısı kesilen HPLC sütunları da aynı şekilde depolanır. - Başka bir paketleme planlanmazsa, sorbent şişesini bombadan çıkar ve sıkıca kapatın. Daha fazla sütun paketleme için saklayın.
5. HPLC sütununda paketleme
- Paketlenmiş kılcal damarı HPLC bağlantısı ile HPLC sistemine bağlayın.
- Akışı% 95 solvent B'de (% 80 veya% 100 asetonitril,% 0.1 formik asit (FA)) 250-300 bar basıncı hedef alarak başlatın. 40 cm paketlenmiş kılcal damarlar için 200-300 nL/dk akış hızını kullanın.
NOT: Ambalaj akış hızı 40-50 cm sütun için 200 nL / dk'dır ve 100 μm kimliği 2 μm sorbent ile doludur. Diğer bazı sütun boyutları Tablo 4'te listelenmiştir. Diğer sütun uzunlukları ve kimlikleri için akış hızları, geri basınç ile sütun uzunluğu ve kesiti arasındaki doğru orantılılıktan tahmin edilir. Tam akış hızı, varsayılan olarak hedeflenen sütun uzunluğundan daha uzun olan gerçek paketlenmiş uzunluğa ayarlanır. Ayrıca, 300 bar basıncın HPLC bağlantısının fiziksel basınç sınırını hedeflediğini unutmayın. Daha yüksek basınçlı bağlantılar için, daha hızlı paketleme için bağlantı basıncı sınırına kadar daha yüksek akış hızları kullanılacaktır. - Kılcal damarın içindeki gevşek sorbent'in paketlenmesini ve toplam paketlenmiş uzunluğa eklenmesini izleyin.
- Akışı durdurmadan, sütun gövdesini sonikasyon banyosuna iki kez daldırın.
NOT: Sütun uçlarını ve kılcal bağlantıları sütun gövdesinin yalnızca bir bölümüne batırmayın. Sonication adımı, özellikle 50 cm uzunluğundaki son derece uzun sütunlar için sütun tekrarlanabilirliğini artırmaya yardımcı > (yayınlanmamış veriler); ancak, çekilen yayıcı kılcal damarın yayıcı ucunun içindeki kendiliğinden bir araya gelen sorbent frit'i kırmak ve sütunu tamamen engellemek için rastgele bir şans ekler. Sonication herhangi bir cam-fritted sütunlara evrensel olarak uygulanabilir iken, biz sonicating çekilmiş yayıcı sütunlar sadece sütun uzunluğu için > 50 cm öneririz. - Sorbent yatak küçülme durduğunda, sütun gövdesini akışı durdurmadan sonikasyon banyosuna iki kat daha fazla daldırın.
- Sütunu 300 çubukta 10 dakika daha çalıştırın.
- Akışı durdurun, basıncın üç çubuğun altına düşmesini bekleyin ve sütunun bağlantısını kesin.
- Sütunda boşluk ve renk değişikliği olmamasını görsel olarak inceleyin. Varsa, akış altında sonication tekrarlanabilir. Kritik denemeler için yeni bir sütun oluşturmayı düşünün.
- Sütunu istediğiniz uzunluğa kesin.
NOT: Düzgün yapılmış kesim, kolon verimliliği için bir ön koşuldur. Katip ile poliimid kaplamada bir çentik yapın, kılcal damarı kısmen çatlatın ve iki parçayı ayırın. - Sütun ön ucunu seramik bir gofret üzerinde veya lepleme filmiyle parlatın.
- UHPLC bağlantısı kullanarak sütunu LC sistemine yeniden bağlayın.
- Tablo 4'e göre sütun kimliğine bağlı olarak çalışma akış hızını %2B'den başlatın. Basıncın dengelemesini bekleyin ve sütun geri basıncını kontrol edin.
NOT: Çalışma akış hızı sütun parametrelerine göre ayarlanır. Örneğin, 500 nL/dk'da 30 cm uzunluğunda 100 μm kimlik sütunu çalıştırılır. - Geri basıncın beklenen değerin %5'i içinde olduğundan emin olun (bkz. Tablo 5), Bu, sütunun düzgün bir şekilde paketli olduğunu ve kullanıma hazır olduğunu onaylar.
NOT: Sütun geri basıncı, HPLC sisteminin degrade kanalındaki toplam basınçtır ve sütun, sütundan önce kılcal damarların geri basıncı eksi bağlanır. Aynı zamanda, Tablo 5'teki değerler rastgeledir (ne beklendiğine ilişkin rastgele bir ölçek verirler). Backpressure'ın kolondan sütuna laboratuvar içi benzerliği, her şeyin düzgün çalıştığının daha önemli bir göstergesidir. Gerçek mutlak geri basınç, sorbent boyutu ve özellikleri, kılcal kimlik, üretici ve parti, çekilen yayıcı ucunun şekli veya cam frit yoğunluğu ve uzunluğu, çözücü özellikleri ve odadaki ortam sıcaklığı vb. Geri basınç çok yüksekse, olası sorunlar için Tablo 1'e bakın.
Representative Results
FlashPack yaklaşımı standart ambalaj kurulumunu temel alır ve aynı paketleme işlem hattını izler. Ambalaj standart fritted veya çekilmiş yayıcı kılcal damarlar halinde yapılır. Ana optimizasyon, sorbent bulamaç konsantrasyonunda yatmaktadır: standart yöntem FlashPack'te kullanılan yüksek konsantre bir sorbent süspansiyon ile uyumsuzdur. Sonuç, uzun UHPLC sütunları için hızlı bir üretim yöntemidir, örneğin, 1 saatten az bir sürede 1,9 μm sorbent ile 50 cm uzunluğunda paketlenmiş bir sütundur (Şekil 2).
FlashPack yaklaşımının uygulanmasını göstermek için 30 cm 100 μm ID kılcal sütun hazırlanmıştır (Tablo 6). ReprosilPur C18 1.9 μm sorbent ambalajı, 60 çubukta bir P2000 lazer çekici tarafından hazırlanan 50 cm uzunluğunda 100 μm ID çekilen yayıcı kılcal damar içine yapıldı. Kılcal damar, kılcal damarın içinde biraz daha gevşek sorbent bırakarak 40 dakikada ~ 40 cm'ye paketlendi. Paketlenmiş kılcal damar bir HPLC sistemine bağlandı ve çözücü B (%80 asetonitril, %0,1 FA) ile 300 nL/dak'ta çalıştırıldı. 5 s sonication iki tur sonra, son paketlenmiş uzunluk 43 cm oldu. Kolonun bağlantısı kesildi, 30 cm'ye düşürüldü ve UHPLC bağlantısı kullanılarak HPLC sistemine bağlandı. Rutin olarak 360 μm kolsuz PEEK somun-yüksük ve 360 μm paslanmaz çelik birliği kullanıyoruz. Bu kombinasyon, güçlü bir şekilde sıkılırsa en az 700 bar tutar. Üretilen sütun, beklenen değer aralığıyla tutarlı olan 500 nL / dak'ta% 2 solvent B'de 520 çubukluk bir geri basınça sahiptir (Tablo 5).
Kolon verimliliğinin bir göstergesi olarak, imal edilen 30 cm'lik sütunu, sitokrom C proteininin 15 dakikalık bir gradyanda 50 fmolünü% 2'den% 50'ye ayırmak için kullandık B. Çıkarılan iyon kromatogramları, tepelerin minimum kuyruk ile son derece simetrik olduğunu gösterdi. Ortalama FWHM 3 s civarındaydı(Şekil 3).
Tablo 1: Sütunun yüksek çalışma geri basıncı için sorun giderme. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: P2000 /F lazer çekme programı. 360 μm OD 100 μm ID kaynaşmış-silika poliimid kaplı kılcal damarlardan oda sıcaklığında 23-25 °C çekilmiş yayıcı kılcal damarların hazırlanması için P2000/F lazer çekme programı.
Tablo 3: FlashPack'e özgü paketleme sorunları ve paketleme işlemi sırasında kontrol etmek için kontrol noktaları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 4: Farklı sütun kimlikleri ve uzunluğu için örnek ambalajlama ve çalışma akış hızları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 5: 2 μm küresel sorbentlerle dolu ve RT'deki RP çözücü sisteminde çalışma akış hızında (sütun kimliğine göre) çalışan bir sütun için beklenen geri basınç.
Tablo 6: 30 cm UHPLC sütun örnek ambalaj. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 1: Kılcal sütun paketleme şeması. 1'den 3'e kadar olan aşamalar hazırlık aşamasındadır, ardından basınçlı bomba paketleme ve HPLC paketleme ile tamamlanır. Aşama 3 ve 4, ultra verimli FlashPack protokolü için değiştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Metanolde 100 çubukta ReprosilPur C18 AQ 1.9 μm ile 100 μm kimlikli bir kılcal damar için paketleme oranı.
Şekil 3: Sitokrom C'nin triptik peptitlerinin iyon kromatogramları çıkarılmıştır. 30 cm uzunluğunda 50 fmol ayrıldıktan sonra sitokrom C'nin triptik peptitlerinin iyon kromatogramları çıkarılmış 100 mm ID, B tampon gradyanı (%80 asetonitril), ReprosilPur C18 AQ 1.9 μm ile dolu yayıcı kılcal sütun çekti. %0,1 FA) ve A tamponunda (%2 asetonitril, %0,1 FA) 15 dakikada %2'den %40 B'ye 500 nL/dk'da RT'de algılama bir kütle spektrometresi kullanılarak gerçekleştirildi. Her peptit için mutlak yoğunluklar ve çıkarılan m/z aralıkları spektranın sağında gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Şirket içi kılcal sütun ambalajı, birden fazla bağımsız proje üzerinde çalışan büyük laboratuvarlarda oldukça popülerdir. Bununla birlikte, düşük konsantrasyonda sorbent süspansiyondan yaygın bir paketleme yönteminin hızında büyük sınırlamalar vardır ve uzun UHPLC sütunları üretemez.
FlashPack, çok yüksek bir sorbent konsantrasyonundan paketlemeyi mümkün kılan standart paketleme prosedürünün bir modifikasyonudur. Yöntemin teorik temeli, tüm paketleme süresi boyunca sütun girişindeki sürekli sorbent kümbet dengesinin bozulmasında yatmaktadır. İkincisi teknik olarak sütun girişinin sürekli olarak bir mıknatıs çubuğu ile vurulması ile elde edilir. Kümbet istikrarsızlaştırma yöntemi, ambalaj kurulumunun tamamen ortak paketleme sürecine benzer şekilde kasıtlı olarak geliştirilmiştir, ancak FlashPack'in püf noktası, paketleme işlemi sırasında sorbent bulamaç hazırlama, kılcal konumlandırma ve mıknatıs çubuğu kullanımının ayrıntılarında yatmaktadır.
Sorbent bulamacı, büyük bir çözücü hacminde tortu sorbent tabakası olarak hazırlanır. Basınçlı bomba tabanlı ambalajın sütundan sütuna aynı paketleme koşullarını gerektirmemesi ilginçtir. FlashPack'te, sütun girişinin etrafındaki tam bulamaç konsantrasyonunu asla bilemeyeceğiz. Paketleme işlemi sırasında da değiştiği için tam olarak ölçmek ve kontrol etmek imkansızdır. Ancak, son sütunlar, ambalajın nasıl elde edildiğine bakılmaksızın hala çok tekrarlanabilir4'tür.
Hızlı paketlemenin temeli, verimli sorbent kümbet dengesinin bozulmasında yatmaktadır. Bu nedenle, kılcal damara giren sorbent'i kontrol etmek ve tüm paketleme süresi boyunca en uygun kümbet dengesizleştirme koşullarını korumak önemlidir. Verimli sorbent teslimini önleyebilecek birkaç olası sorun vardır. Bunlara bazı örnekler, hızlı manyetik çubuk dönüşü ile sorbent tabaka resüspensyonu, mıknatıs çubuğu konumlandırmasına yanlış bağıl kılcal veya çok yavaş mıknatıs çubuğu dönüşü nedeniyle verimsiz kümbet dengesizliğidir. Konuların kendileri ve nasıl ele alınacağı protokol bölümünde ayrıntılı olarak ele alınmıştır.
Sütun paketlendikten sonra, denetlenecek ana sütun parametresi sütun geri basıncıdır. Tablo 5'te listelenen basınç değerleri, popüler alt 2 μm boncuk boyutu sorbent-ReproSil PUR C18 AQ (1,9 μm) için beklenenlere bir referans noktası sağlar. Aynı zamanda, frit veya çok dar çekilmiş bir yayıcı tarafından ek geri basınç eklenebilir ve bunun için sürekli olarak izlenmelidir. Ambalajlama çekilmiş bir yayıcıya yapılırsa, önce fırfırlı kılcal damarları paketleyerek ve daha sonra kendiliğinden monte edilen frit'in çok fazla eklenip eklenmediğini görmek için kullanımdaki belirli bir sorbent için beklenen sütun geri basıncını ölçmeyi öneririz. Yüksek basınç sorunları için, sorunu tam olarak belirlemek üzere Tablo 1'de sağlanan yönergeleri kullanın.
Deneyimlerimize göre, renk değişikliği, boşluklar ve uygun geri basınç ile dolu bir sütun, vakaların% 100'unda çalışır ve ayırma kalitesini sütun uzunluğundan ve sorbent özelliklerinden beklenebileceklere yakın verir. Renk değişikliği olan bir sütunun düzgün çalışması garanti edilmez, ancak yine de tatmin edici sonuçlar verebilir.
Çoğu zaman, ayırma kalitesiyle ilgili herhangi bir sorun varsa, bunlar sütunun kendisinden değil, ayırma sisteminin diğer bölümlerinden, yani pompalardan, çözücülerden veya bağlantılardan gelir. Özellikle potansiyel olarak zararlı olan herhangi bir sütun sonrası bağlantıdır. Yayıcı ve fırfırlı sütun arasındaki ölü hacimle kötü bağlantı, kılcal kromatografide çok düşük akış hızları nedeniyle büyük tepe genişletme ve kuyruklama sağlar.
FlashPack yaklaşımına özgü bir diğer önemli konu, çalışan bir sorbent bulamaç şişesinde çok pahalı sorbts kullanmasıdır. FlashPack'teki sorbent bulamacın birden fazla kullanım için tasarlandığınızı lütfen unutmayın. Sorbent'e dikkat edin. Sorbent taşlamayı azaltmak için gereksiz mıknatıs çubuğunu karıştırmaktan kaçının-paketleme biter bitmez dönüşü durdurmayı unutmayın. Ve sorbent kurumasını önlemek için açık sorbent şişesini basınçlı bombada bırakmayın. Sorbent bundan sonra hala kullanılabilir olsa da, sorbent bulamacı yeniden yapmak zaman alır.
Yöntem hem fritted kılcal damarlar hem de çekilmiş yayıcı kılcal damarlar için eşit derecede iyi çalışır. FlashPack prensibi, kılcal kimlikler için paketleme oranını 20'den 250 μm'ye yükseltir (daha küçük ve daha büyük test edilmiştir). Ayrıca, hem tam hem de yüzeysel olarak gözenekli olan tüm sorbentler için de geçerlidir, test edebiliriz (yüksek sorbent bulamaç konsantrasyonundaki sorbent kümbet oluşumunun özellikle RP sorbbents ile sınırlı olmadığını yansıtarak). Ayrıca, solvent parametreleri fiziksel ve kimyasal özelliklerine göre ambalajı açıkça etkiler. Örneğin, daha az viskoz aseton, aynı ambalaj basıncında metanolden daha yüksek ambalajlama oranı sağlar. Bununla birlikte, aynı zamanda metanolden daha az polardır ve birbirine yapışan sorbent parçacıkları azaltır. Etkisi tek başına akış hızı hala yüksek olduğunda ambalajın başlangıcında sorbent kümbet oluşumunu önler. Bununla birlikte, sorbent parçacık etkileşiminde azalma, daha az güvenilir kendi kendine monte edilmiş frit oluşumuna ve paketleme sırasında daha sık çekilmiş uç engellemesine yol açar. Bu nedenle, aseton fritted kılcal damarların paketlenebilmesi için daha iyi olsa da, bulamaç çözücü olarak metanol daha yavaş ancak her iki uç türü için de uygun olan çekilmiş yayıcı kılcal damarlar için daha az uygundur. Heksam veya dikloromethaneden (DCM) paketleme, metanolden asetona geçmenin aşırı durumlarıdır: daha da az polardırlar, bu nedenle sorbent kümbet oluşumunu tamamen önlerler, ancak çekilen yayıcı paketleme için hiç uygun değildirler. Ayrıca, son derece düşük DCM polaritesinin iç kılcal duvara yapışan ve üzerinde kalın bir tabaka yapan sorbent parçacıklara yol açtığı kaydedildi. Katman kalınlığı yavaş yavaş büyür ve rastgele yerel bloklar oluşur, bu da sütunun sorbent olmayan bölgelere ayrılmış birkaç parça halinde paketlenmesini neden eder. C18 Peptid Aeris sorbent için böyle bir etki gözlendi.
Gözlenen bir diğer sorun, YMC Triart C18 sorbent'in metanolde düzgün bir şekilde askıya alınmaması, ancak bir tür pul oluşturmaktı. Ancak, bu, FlashPack ile paketlenmesini ve çok iyi ayırma verimliliği (yayınlanmamış veriler) vermesini engellemez. Bu nedenle, bazı durumlar için en uygun olmasa da, metanol test edilen tüm sorbentler ve sütunlar için çalışmak için en evrensel çözücüydü. Farklı bulamacı çözücülerin kolon ayırma verimliliğini nasıl etkilediğini henüz analiz etmediğimizi belirtmek gerekir. Aynı zamanda, metanolden paketlenmiş sütunların verimliliği zaten aynı sorbentler için ticari sütunlara tamameneşittir 4.
FlashPack, UHPLC sütunlarının paketleme oranını iyileştirmek için mevcut tek yaklaşım değildir. Ultra yüksek basınçlı paketleme7kullanımı ile yüksek sorbent bulamaç konsantrasyonundan hızlı paketleme de mümkündür. FlashPack'in avantajı, sorbent teslimat ve kılcal bağlantılar için özel ultra yüksek basınçlı pompalar ve basınçlı bombalar gerektirmediği için çok daha basit olmasıdır. Aynı zamanda, aşırı basınçlarda paketlenmiş sütunların, düşük basınçlı paketlenmiş sütunlardan daha yüksek ayırma verimliliğine sahip olabileceği gösterilmiştir17. Ve FlashPack karşılaştırmada kullanılanlarla aynı sütunları üretirken4, ambalajlama yöntemini bilmediğimiz, FlashPack sütunlarının ultra yüksek basınçlı paketlenmiş sütunlara karşı nasıl durduğu henüz test edildi.
Özetle, açıklanan FlashPack yöntemi, protokolde yapılan bazı ayarlamalarla laboratuvardaki mevcut ambalaj protokolüne kolayca uyarlanabilirken, kurulum tamamen aynı kalır. HPLC kılcal sütun paketlemeyi dakikalarca hızlandırır ve standart paketleme prosedürü ile açıkça imkansız olan uzun UHP kılcal sütunların üretilmesine izin verir. FlashPack yaklaşımının uygulanmasıyla laboratuvar için zaman ve paradaki genel ekonomi yılda on binlerce Euro olarak sayılabilir. Ayrıca, UHP kılcal sütunları yerel olarak üretebilme yeteneği, mevcut ticari ürünlerle imkansız olan deneme özelleştirme olanaklarını açar.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Çalışma RSF hibe 20-14-00121 tarafından desteklendi. Yazarlar verimli tartışmalar için P. V. Shliaha'ya (Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi) teşekkür ediyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59002 | |
| centrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | ||
| Ceramic Scoring Wafer | Restek | 20116 | any ceramic wafer is suitable for capillary polishing |
| Diamond-chip bladed scribe | NewObjective | Diamond-chip bladed scribe | recommended for capillary cutting |
| fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD | CM Scientific | TSP100375 | |
| GELoader tips | Eppendorf | 30001222 | |
| HPLC system | ThermoScientific | Ultimate3000 RSLCnano | |
| laser puller | Sutter | P2000/F | |
| magnet bar 2x5 mm | Merck | Z283819 | |
| MeOH | Merck | 1.06018 | |
| microspatula | Merck | Z193216 | |
| PEEK ferrule 360 mm | VICI | JR-C360NFPK | use to connect the column to UPLC union |
| pipette tip, 1000 uL | Merck | Z740095 | |
| pipette, 1000 uL | Gilson | Pipetman L P1000L | |
| pressure bomb | NextAdvance | PC-77 MAG | |
| regulator | GCE | Jetcontrol 600 200/103 | |
| Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm | Dr. Maisch | r13.aq.0001 | |
| Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL | Merck | AXYST050SS | |
| Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL | Merck | AXYST150SS | |
| Screw caps with O-rings | Merck | AXYSCOC | |
| sonication bath | Elma | Elmasonic S30 H | |
| union HPLC | VICI | JR-C360RU1PK6 | HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
| union UPLC | VICI | JR-C360RU1FS6 | UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
| vortex | BioSan | V-1plus | |
| Water with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59013 |
References
- Shishkova, E., Hebert, A. S., Now Coon, J. J. Now, more than ever, proteomics needs better chromatography. Cell Systems. 3 (4), 321-324 (2016).
- Shliaha, P. V., et al. Middle-down proteomic analyses with ion mobility separations of endogenous isomeric proteoforms. Analytical Chemistry. 92 (3), 2364-2368 (2020).
- Pressure injection cells - next advance - laboratory instruments. , Available from: https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview (2021).
- Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A. FlashPack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (2), 383-390 (2019).
- MacNair, J. E., Lewis, K. C., Jorgenson, J. W. Ultrahigh-pressure reversed-phase liquid chromatography in packed capillary columns. Analytical Chemistry. 69 (6), 983-989 (1997).
- Bruns, S., et al. Slurry concentration effects on the bed morphology and separation efficiency of capillaries packed with sub-2 µm particles. Journal of Chromatography. A. 1318, 189-197 (2013).
- Godinho, J. M., Reising, A. E., Tallarek, U., Jorgenson, J. W. Implementation of high slurry concentration and sonication to pack high-efficiency, meter-long capillary ultrahigh pressure liquid chromatography columns. Journal of Chromatography. A. 1462, 165-169 (2016).
- Andrzejczak, O. A. The effect of phytoglobin overexpression on the plant proteome during nonhost response of barley (Hordeum vulgare) to wheat powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici). Scientific Reports. 10 (1), 9192 (2020).
- Elchaninov, A., et al. Comparative analysis of the transcriptome, proteome, and miRNA profile of kupffer cells and monocytes. Biomedicines. 8 (12), 627 (2020).
- Babenko, V. V., et al. Draft genome sequences of Hirudo medicinalis and salivary transcriptome of three closely related medicinal leeches. BMC Genomics. 21 (1), 331 (2020).
- Babenko, V. V., et al. Identification of unusual peptides with new Cys frameworks in the venom of the cold-water sea anemone Cnidopus japonicus. Scientific Reports. 7 (1), 14534 (2017).
- Loughran, G., et al. Unusually efficient CUG initiation of an overlapping reading frame in POLG mRNA yields novel protein POLGARF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (40), 24936-24946 (2020).
- Radzisheuskaya, A., et al. PRMT5 methylome profiling uncovers a direct link to splicing regulation in acute myeloid leukemia. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 999-1012 (2019).
- Rubtsova, M., et al. Protein encoded in human telomerase RNA is involved in cell protective pathways. Nucleic Acids Research. 46 (17), 8966-8977 (2018).
- Maiolica, A., Borsotti, D., Rappsilber, J. Self-made frits for nanoscale columns in proteomics. PROTEOMICS. 5 (15), 3847-3850 (2005).
- Ishihama, Y., Rappsilber, J., Andersen, J. S., Mann, M. Microcolumns with self-assembled particle frits for proteomics. Journal of Chromatography. A. 979 (1-2), 233-239 (2002).
- Shishkova, E., Hebert, A. S., Westphall, M. S., Coon, J. J. Ultra-high pressure (>30,000 psi) packing of capillary columns enhancing depth of shotgun proteomic analyses. Analytical Chemistry. 90 (19), 11503-11508 (2018).
