Summary

Minimera post-infusion portal ven blödning under intrahepatic holme transplantation hos möss

Published: May 10, 2021
doi:

Summary

Här presenterar vi raffinerade kirurgiska ingrepp på framgångsrikt utföra intraportal holme transplantation, en kliniskt relevant men tekniskt utmanande kirurgiska ingrepp, hos möss.

Abstract

Även om levern för närvarande accepteras som den primära transplantation platsen för mänskliga holmar i kliniska miljöer, holmar transplanteras under njurkapseln i de flesta gnagare prekliniska holme transplantation studier. Denna modell används ofta eftersom murin intrahepatic holme transplantation är tekniskt utmanande, och en hög andel möss kan dö av kirurgiska komplikationer, särskilt blödning från injektionsstället efter transplantation. I denna studie, två förfaranden som kan minimera förekomsten av post-infusion portal ven blödning visas. Den första metoden applicerar en absorberbar hemostatisk gelatinsvamp på injektionsstället, och den andra metoden innebär att man tränger in isinjektionsnålen genom fettvävnaden först och sedan in i portalvenen genom att använda fettvävnaden som en fysisk barriär för att stoppa blödningen. Båda metoderna kan effektivt förhindra blödning-inducerad mus död. Hela lever delen visar holme distribution och bevis på holme blodpropp efter transplantation, en typisk egenskap för intrahepatic holme transplantation, presenterades. Dessa förbättrade protokoll förfinar de intrahepatiska holmetransplantationsförfarandena och kan hjälpa laboratorier att inrätta förfarandet för att studera holmes överlevnad och funktion i prekliniska miljöer.

Introduction

Intraportal holmetransplantation (IIT) via portalvenen är den vanligaste metoden för human holmetransplantation i kliniska miljöer. Musen IIT-modellen erbjuder ett utmärkt tillfälle att studera holmetransplantation och testa lovande interventionella metoder som kan förbättra effekten av holmetransplantation1. IIT beskrevs första gången på 1970-talet och användes av flera grupper1,2,3,4,5. Det återfick popularitet efter genombrottet i människa holmetransplantation i året 20006,7. Emellertid, de flesta holme transplantation studier använde njurkapseln som en föredragen plats för experimentell holme transplantation på grund av dess lätt framgång. Tvärtom är IIT mer tekniskt utmanande och används mindre ofta för holmetransplantationsstudier8,9. Till skillnad från IIT lider dock holmar transplanterade under njurkapseln inte av den omedelbara blodmedierade inflammatoriska reaktionen som kännetecknas av trombos, inflammation och levervävnad ischemi, och har därmed bättre funktion än holmar transplanterade i levern. Njurkapselmodellen kanske därför inte helt efterliknar de påfrestningar som holmar möter i human holmetransplantation10,11,12.

En av de stora komplikationerna av IIT hos möss är blödning från injektionsstället efter transplantation, vilket kan orsaka 10-30% av dödligheten bland olika musstammar12. I detta dokument har två raffinerade metoder utvecklats för att stoppa blödning snabbare och säkrare och för att minska musdödligheten efter en IIT. Visuell demonstration av dessa raffinerade detaljer kommer att hjälpa forskare att identifiera de viktigaste stegen i denna tekniskt utmanande procedur. Dessutom fastställdes placeringen av holmetransplantat i mottagarens lever genom histologisk undersökning av Hematoxylin och Eosin (H&E) färgade levervävnad (hela sektionen) med transplanterade holmar.

Protocol

Alla procedurer genomfördes med godkännande av Institutional Animal Care and Use Committees vid Medical University of South Carolina och Ralph H Johnson Medical Center i Charleston. 1. Diabetesinduktion med streptozotocin (STZ) Mottagarmösspreparat: Väg alla möss individuellt. Kontrollera blodsockernivåerna från ett svansve blodprov med hjälp av en glucometer. STZ-dosbestämning för tre olika scenarier: För möss med fettlev…

Representative Results

Vi utförde syngeneic och xenogeneic holme transplantationer via portal ven. Holme graft funktion observerades på ett dosberoende sätt i båda holme transplantation modeller. I den syngeneiska holme transplantation modellen med C57BL/6 möss, transplantation av 250 holmar ledde till övergående normoglykemi innan möss återvände till hyperglykemi. Möss som fick 500 holmar nådde och bibehöll normoglykemi efter 30 dagar efter transplantation (figur 2A). Möss i båda grupperna visade ?…

Discussion

I denna studie har två förbättrade förfaranden som kan förhindra blödning och kan minska musdödligheten under musen IIT visats. Denna studie gör det möjligt för forskare att visualisera holmetransplantationsmodellen som är unik för att studera det omedelbara blodmedierade inflammatoriska svaret efter transplantation. IIT-modellen är en distinkt modell för att studera holmecellens överlevnad och lever ischemiska skador som svar på holmetransplantation19. Här förfinade vi förfaran…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna studie stöddes av Institutionen för veteranfrågor (VA-ORD BLR&D Merit I01BX004536) och National Institute of Health grants # 1R01DK105183, DK120394, DK118529, till HW. Vi vill tacka er Mr. Michael Lee och Ms Lindsay Swaby för språkredigering

Materials

10% Neutral buffered formalin v/v Fisher Scientific 23426796
1 mL Syringe with needle AHS AH01T
20 mL Syringe BD 301031
25G x 5/8" hypodermic needles BD 305122
Alcohol prep pads, sterile Fisher Scientific 22-363-750
Animal Anesthesia system VetEquip, Inc. 901806
Buprenorphine hydrochloride, injection Par Sterile Products, LLC NDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mL Fisher Scientific 0553859A
CMRL-1066 Corning 15110CV
DMEM Corning 10013CV
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade Fisher Scientific BP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp Roboz Surgical Instrument Co. RS-5882
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35011CV
FreeStyle  Glucose meter Abbott Lite
FreeStyle Blood Glucose test strips Abbott Lite
Gelfoam (absorbable gelatin sponge, USP) Pharmacia & Upjohn Company 34201
Graefe forceps 4” extra delicate tip Roboz Surgical Instrument Co. RS-5136
Heated pad Amazon B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” Roboz Surgical Instrument Co. RS-7850
Insulin syringe with 27-gauge needle BD 879588
Iodine prep pads Fisher Scientific 19-027048
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 66794-017-25
Penicillin/streptomycin (P/S) HyClone SV30010
Polypropylene Suture 4-0 Med-Vet International MV-8683
Polypropylene Suture 5-0 Med-Vet International MV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solution VWR 2B1322Q
Streptozocin (STZ) Sigma S0130
Surgical drape, sterile Med-Vet International DR1826
Tissue Cassette Fisher Scientific 22-272416

References

  1. Pellegrini, S., Cantarelli, E., Sordi, V., Nano, R., Piemonti, L. The state of the art of islet transplantation and cell therapy in type 1 diabetes. Acta Diabetology. 53 (5), 683-691 (2016).
  2. Ballinger, W. F., Lacy, P. E. Transplantation of intact pancreatic islets in rats. Surgery. 72 (2), 175-186 (1972).
  3. Wright, J. R., Hauptfeld, V., Lacy, P. E., et al. Induction of Ia antigen expression on murine islet parenchymal cells does not diminish islet allograft survival. American Journal of Pathology. 134 (2), 237-242 (1989).
  4. Toyofuku, A., et al. Natural killer T-cells participate in rejection of islet allografts in the liver of mice. Diabetes. 55 (1), 34-39 (2006).
  5. Goss, J. A., Nakafusa, Y., Finke, E. H., Flye, M. W., Lacy, P. E. Induction of tolerance to islet xenografts in a concordant rat-to-mouse model. Diabetes. 43 (1), 16-23 (1994).
  6. Hara, M., et al. A mouse model for studying intrahepatic islet transplantation. Transplantation. 78 (4), 615-618 (2004).
  7. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  8. Wang, J., et al. Alpha-1 antitrypsin enhances islet engraftment by suppression of instant blood-mediated inflammatory reaction. Diabetes. 66 (4), 970-980 (2017).
  9. Gou, W., et al. Alpha-1 antitrypsin suppresses macrophage activation and promotes islet graft survival after intrahepatic islet transplantation. American Journal of Transplantation. , (2020).
  10. Contreras, J. L., et al. Activated protein C preserves functional islet mass after intraportal transplantation: A novel link between endothelial cell activation, thrombosis, inflammation, and islet cell death. Diabetes. 53 (11), 2804-2814 (2004).
  11. Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. Lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
  12. Melzi, R., et al. Intrahepatic islet transplant in the mouse: functional and morphological characterization. Cell Transplantation. 17 (12), 1361-1370 (2008).
  13. Wang, H., et al. Donor treatment with carbon monoxide can yield islet allograft survival and tolerance. Diabetes. 54 (5), 1400-1406 (2005).
  14. Desai, C. S., et al. Effect of liver histopathology on islet cell engraftment in the model mimicking autologous islet cell transplantation. Islets. 9 (6), 140-149 (2017).
  15. Cui, W., Angsana, J., Wen, J., Chaikof, E. L. Liposomal formulations of thrombomodulin increase engraftment after intraportal islet transplantation. Cell Transplantation. 19 (11), 1359-1367 (2010).
  16. Cui, W., et al. Thrombomodulin improves early outcomes after intraportal islet transplantation. American Journal of Transplantation. 9 (6), 1308-1316 (2009).
  17. Proto, C., Grasso, G., Fassio, P. G. Hepatoparenchymal clearance of indocyanine green in infectious hepatitis. Giornale di Malattie Infettive e Parassitarie. 20 (9), 845-851 (1968).
  18. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments. (132), e56993 (2018).
  19. Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. Intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57559 (2018).
  20. Wang, H., et al. Autologous mesenchymal stem cell and islet cotransplantation: Safety and efficacy. Stem Cells Translational Medicine. 7 (1), 11-19 (2018).

Play Video

Cite This Article
Gou, W., Cui, W., Cui, Y., Wang, H. Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice. J. Vis. Exp. (171), e62530, doi:10.3791/62530 (2021).

View Video