Summary
Neuronal dendritisk morfologi ligger ofte til grund for funktion. Faktisk manifesterer mange sygdomsprocesser, der påvirker udviklingen af neuroner, sig med en morfologisk fænotype. Denne protokol beskriver en enkel og kraftfuld metode til analyse af intakte dendritiske arbors og deres tilknyttede pigge.
Abstract
Hjerneaktivitet, de elektrokemiske signaler, der overføres mellem neuroner, bestemmes af forbindelsesmønstrene i neuronale netværk og fra morfologien af processer og understrukturer inden for disse neuroner. Som sådan er meget af det, der er kendt om hjernefunktion, opstået sammen med udviklingen inden for billeddannelsesteknologier, der giver yderligere indsigt i, hvordan neuroner er organiseret og forbundet i hjernen. Forbedringer i vævsrydning har gjort det muligt at billeddannelse i høj opløsning af tykke hjerneskiver, lette morfologisk rekonstruktion og analyser af neuronale understrukturer, såsom dendritiske arbors og rygsøjler. I tandem giver fremskridt inden for billedbehandlingssoftware metoder til hurtigt at analysere store billeddatasæt. Dette arbejde præsenterer en relativt hurtig metode til behandling, visualisering og analyse af tykke skiver af mærket neuralt væv ved høj opløsning ved hjælp af CLARITY væv clearing, konfokal mikroskopi, og billedanalyse. Denne protokol vil lette bestræbelserne på at forstå de konnektivitetsmønstre og neuronale morfologier, der karakteriserer sunde hjerner, og de ændringer i disse egenskaber, der opstår i syge hjernetilstande.
Introduction
Forståelse af den rumlige organisation, mønstre af konnektivitet og morfologi af komplekse tredimensionelle biologiske strukturer er afgørende for afgrænsning af specifikke cellers og vævs funktioner. Dette gælder især i neurovidenskab, hvor der er blevet dedikeret en enorm indsats til at opbygge neuroanatomiske kort over centralnervesystemet i høj opløsning1,2. Nøje undersøgelse af de neuroner, der omfatter disse kort giver varierede morfologier, med forbindelser og steder, der afspejler funktionen af disse forskellige sæt neuroner3,4. Desuden kan undersøgelse af subcellulære strukturer, især dendritiske pigge, informere modenheden af synapser og derved afspejle udviklingsprocesser og neurologiske sygdomstilstande5,6,7. Således er tilgange, der forbedrer billeddannelsesopløsning og gennemløb, afgørende for bedre forståelse af hjernefunktion på alle skalaer.
Nylige fremskridt har udvidet den molekylære og genetiske værktøjskasse til mærkning og manipulation af populationer af neuroner. Udviklingen af nye fluorescerende markører, kombineret med nye metoder til at indføre disse markører i neuroner, giver mulighed for differentieret mærkning af populationer af interagerende neuroner inden for samme dyr eller hjerneprøve8,9,10,11. Fordi lys er spredt af uigennemsigtige lipider, og i betragtning af det høje lipidindhold i hjernevæv, imaging neuronale populationer har primært været begrænset til tynde sektioner eller har påberåbt sig avancerede mikroscropy teknikker (f.eks confocal, multi-foton, og lys-ark mikroskopi) til billede dybe strukturer. Men disse bestræbelser er blevet stærkt styrket af fremskridt inden for væv clearing teknikker. Clear Lipid-udvekslet Acrylamid-hybridiseret Rigid Imaging/immunostaining/in situ hybridisering-kompatibel Tissue-hYdrogel (CLARITY) er en sådan teknik, hvor væv af interesse er infunderes med hydrogel monomers (acrylamid og bis-acrylamid) og derefter vaskes medvaskemidler 12. Hydrogel monomers hybridisere at skabe en stabil 3D hydrogel stillads, der er optisk gennemsigtig og gennemtrængelig for makromolekyle etiketter. Nukleinsyrer og proteiner opretholdes inden for den hybridiserede matrix, mens lipider fjernes af vaskemiddelvasken (Figur 1). Dette resulterer i et stabilt væv, der er stiv nok til at opretholde den oprindelige form og orientering af celler og ikke-lipidmolekyler, mens optisk gennemsigtige nok til nemt at afbilde dybe strukturer ved høj opløsning. Denne vedligeholdelse af vævsstruktur og orientering giver mulighed for billeddannelse af tykke skiver og derved bevare celle-til-celle-forbindelser og rumlige relationer. Da placeringen og tilgængeligheden af proteiner og nukleinsyrer opretholdes under clearingprocessen, er renset væv desuden i stand til at holde udtryksbaserede markører samt eksogene etiketter. Således, CLARITY egner sig som en potent metode til billeddannelse store mængder af dybe hjernestrukturer og forbindelserne mellem disse strukturer ved høj opløsning.
Brugen af CLARITY forbedrer i høj grad tilgange til billeddannelse neuronale populationer. Denne teknik er især dygtig til at generere store mængder billeddata. CLARITY fungerer godt med flere former for proteinbaseret fluorescens. Denne protokol anvender en lentiviral-baseret tilgang til tyndt etiketceller med EGFP og tdTomato; Der er dog rutinemæssigt blevet anvendt transgene reporter-alleler, der udtrykker tdTomato eller EGFP for at mærke celler til genopbygning. Det er vigtigt at vælge en fluorophore, der er både fotostabil og lys (f.eks. EGFP eller tdTomato). Derudover giver brug af en stærk promotor til at udtrykke fluorophoren overlegen kontrast og billedkvalitet. Ulemperne ved denne teknik opstår, da korrekt analyse af denne store mængde data kan være både arbejds- og tidsintensiv. Specialiserede mikroskoper kan hjælpe med at forbedre gennemløbet og reducere arbejdsbyrden. Men bygning, eje, og / eller drift avancerede mikroskoper er ofte omkostnings-uoverkommelige for mange laboratorier. Dette arbejde præsenterer en høj gennemløb, relativt hurtig og enkel metode til at visualisere store mængder neuralt væv ved høj opløsning ved hjælp af CLARITY væv clearing af store sektioner, kombineret med standard konfokal mikroskopi. Denne protokol beskriver denne fremgangsmåde gennem følgende trin: 1) dissekering og forberedelse af neurale væv, 2) clearing af vævet, 3) montering af vævet, 4) billeddannelse af de forberedte skiver og 5) behandling af fuld skive billeder ved hjælp af mikroskopi visualisering software rekonstruktion og analyse (Figur 2). Disse bestræbelser resulterer i billeder i høj opløsning, der kan bruges til at analysere populationer af neuroner, neuronale forbindelsesmønstre, 3D dendritisk morfologi, dendritisk rygsøjle overflod og morfologi og molekylære udtryksmønstre i intakt hjernevæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol følger alle retningslinjer for dyrepleje for Baylor College of Medicine.
1. Dissektion og vævspræparat
- Aflive musen med en overdosis af isoflurane ved at placere musen i en lukket beholder med et håndklæde gennemblødt i isoflurane (eller ved andre IUCAC-godkendte midler).
- Gennemgå dyret transcardially ved hjælp af en 25 G nål med 10 mL iskold PBS, efterfulgt af 10 mL af 4% PFA.
- Dissekere hjernen regionen (eller væv) af interesse.
- Læg det dissekerede væv i 4 % PFA natten over ved 4 °C. Korrekt fiksering er nøglen til denne protokol. Du må ikke springe dette trin over eller forkortes.
- Efter fiksering i 4% PFA i mindst 12 timer overføres vævet til en 4% acrylamidhydroxidblanding i 24 timer ved 4 °C.
BEMÆRK: Når du optøer hydrogelen, skal du sørge for, at den ikke er polymeriseret, dette kan ske, hvis hydrogelen bliver for varm. Tø op på is for at forhindre for tidlig polymerisering.
2. Vævsrydning
- Anbring hjernevævet (stadig nedsænket i hydrogel) i en vakuumkuvøse i 3 timer ved 37 °C med et -90 kPa-vakuum. Lad røret skrues af, så vakuumet kan dannes korrekt.
- Vævet vaskes med PBS i 10 min ved stuetemperatur (25 °C) med skånsom rysten.
- Placer den polymeriserede vævsprøve i elektroforesekammeret, idet der noteres vævets orientering i kammeret.
- Fyld kammeret og reservoiret med den medfølgende elektroforese SDS buffer.
- Prøven udtages ved 70 V, 1 A og 35 C med konstant strøm i ca. 2 timer/mm væv.
- Kontroller prøven med jævne mellemrum. det kan kræve mere tid i salen at rydde ordentligt. Et godt udgangspunkt for clearing er 1-2 timer pr. mm hjernevæv. En hel mus hjerne kræver 8-10 timer for tilstrækkelig clearing. Husk prøvens retning, før du fjerner den fra kammeret, og sørg for at skifte den tilbage i kammeret i samme retning.
BEMÆRK: Figur 3A viser, hvordan en fuldt ryddet hjerne vil se ud. Hjernen vil se uigennemsigtig og ikke klar på dette tidspunkt på grund af tilstedeværelsen af opløst SDS, men der bør være lidt at ingen gul væv farvet nuance efter lipid ekstraktion.
- Kontroller prøven med jævne mellemrum. det kan kræve mere tid i salen at rydde ordentligt. Et godt udgangspunkt for clearing er 1-2 timer pr. mm hjernevæv. En hel mus hjerne kræver 8-10 timer for tilstrækkelig clearing. Husk prøvens retning, før du fjerner den fra kammeret, og sørg for at skifte den tilbage i kammeret i samme retning.
3. Klargøring og montering af det rensede væv
- Når prøven er færdig med at rydde og ser tilstrækkelig klar ud, skal du vaske pbs natten over ved stuetemperatur. Udskift PBS med frisk PBS så ofte som muligt. Dette trin er afgørende for at fjerne resterende SDS, der kan danne bundfald i senere trin.
- Efter den endelige vask i PBS vaskes vævet i 5 minutter i deioniseret vand ved stuetemperatur tre gange. Vævet vil blive uigennemsigtigt på dette trin og kan udvide.
- Inkuberes vævet i brydningsindekset, der svarer til opløsningen (se tabel 1) i mindst 4 timer ved stuetemperatur. Figur 3B viser et stykke renset væv efter inkubation i brydningsindeks matching opløsning.
- Under inkubation af væv i brydningsindeks matching opløsning, konstruere et egnet huskammer til at afbilde prøven, hvis det er nødvendigt.
- Konstruktion af et billedkammer til små vævsprøver/skiver
- Brug en glasrutschebane som base til montering, læg enten gummi- eller plaststykker og fastgør med superlim. Hvis der ikke er præfabrikerede afstandsstykker til rådighed, skal du bruge plastringe lavet af koniske rør tværsnit.
- Sørg for at fastgøre disse stykker til glasrutschebanen uden huller (Figur 3C).
- Placer det rensede væv i monteringskammeret, der er udfyldt med brydningsindeksmatchende opløsning.
- Fastgør vævet ved at placere et glascoverlip på toppen og forsegle det med neglelak.
- Billede dette væv ved at tilføje en dråbe brydningsindeks matchende monteringsopløsning direkte oven på glasset.
- Stort vævsbilledkammer
- Konstruer dette kammer, hvis vævet er større end 5 mm tykt (egnet til hele hjerner eller halvkugler).
- Brug en 10 cm glasskål med en høj væg, placere en 50 mL koniske rør i midten, og sørg for, at diameteren af konisk er stor nok til at acceptere tønden af den anvendte objektive linse.
- Lav 3% agarose i vand og hæld det i rummet mellem glasskålen og det koniske rør, lad afkøle i 1 time (Figur 3D). Dette vil danne en ring af fast agarose (figur 3E).
- Fastgør vævet sikkert til bunden af kammeret ved hjælp af superlim og fyld kammeret med brydningsindeks matching opløsning. Påfør lim til at klæbe vævet på en region, der ikke vil blive afbildet for at tillade genvinding af vævet fra fadet uden at beskadige de områder af interesse.
BEMÆRK: Dette præparat er tidsfølsomt, da brydningsindeksmediet kan begynde at polymerisere, medmindre det opbevares fra luften og opbevares ved 4 °C.
4. Billedbehandling ryddet vævsprøver
- Hent billedet ved hjælp af et konfokalt mikroskop, der passer med et 25x/0,95 NA-mål med en 4 mm arbejdsafstand.
- Tænd for alt relevant billedudstyr. Sæt prøven på scenen, og læg en dråbe brydningsindekstilpasningsopløsning på toppen af monteringskammeret.
- Nænsomt henfaldsmedierne med målet og danne en kontinuerlig kolonne af medier.
- Ved hjælp af epifluorescence skal du finde et passende billedfelt.
- Start proceduren for billedopsamling ved at teste de relevante indstillinger.
- Start med at indstille indstillingerne for opløsning og scanningshastighed ved hjælp af Figur 4A som vejledning. Hvis billeddannelse ved hjælp af en konfokal mikroskop, lukke pinhole for at opnå den mindste optiske sektion og dermed bedste z-opløsning.
- Gradvist øge laser magt / sensor gain indtil et passende billede er opnået med et højt signal-til-støj-forhold.
- Hvis du bruger standard-EGFP/tdTomato tofarvet billedbehandling, skal du angive indstillingerne for lyssamling ved hjælp af Figur 4B som vejledning.
- Indstil z-stack parametre baseret på de observerede start- og slutpunkter i vævet. Angiv trinstørrelsen baseret på den ønskede z-opløsning ved hjælp af Figur 4C som vejledning.
BEMÆRK: Mindre trin størrelser vil give en større z-opløsning, men vil også indføre mere laser ophold tid, potentielt fører til prøve blegning. - Når du er tilfreds med billedopsamlingsindstillinger, skal du anskaffe billedet.
- Sørg for, at billedet har et højt signal-til-støj-forhold og viser forskellige grænser for strukturer (Figur 4D).
5. Billedbehandling og 3D kvantificering ved hjælp af mikroskopianalysesoftware
BEMÆRK: Mikroskopiske billedanalyse softwarepakker er kraftfulde værktøjer til tre-dimensionelle billede visualisering og behandling. Mange af disse programmer er perfekt egnet til håndtering af store datasæt, der genereres fra billeddannelse ryddet vævsprøver. Følgende trin og tilknyttede tal svarer til Imaris-softwarearbejdsgangen.
- Åbn billedstakken, og importer den til den valgte analysesoftware.
- Få vist billedet i tredimensionelt rum, og foretag de ønskede ændringer af opslagstabellerne ved hjælp af displayjusteringen for bedre at visualisere billedet.
BEMÆRK: Figur 5A demonstrerer den mulige ekstreme billeddybde, der er tilgængelig via 2-fotonmikroskopi parret med CLARITY-vævsrydning. Figur 5B viser forskellige dendritprocesser samt tydeligt synlige rygsøjlemorfologier fra z-stakken i figur 5A. - Hvis du vil filtrere en ensartet baggrund fra, skal du klikke på knappen Billedbehandling og vælge filteret for baggrundstrækning.
BEMÆRK: Figur 5C viser billedet med et ensartet diset baggrundssignal før behandling. Figur 5D viser billedet, efter at filteret for baggrundstræk er blevet anvendt. - Overhold 3D-billedet og bliv fortrolig med det ved at se på det fra flere vinkler og zoomniveauer.
- Start sporingen af dendrit ved først at vælge filamentsporingsværktøjet.
- Klik på Rediger glødetråden manuelt, Spring automatisk oprettelse over.
- Indstil tilstanden til automatisk sti, og kontroller Auto-center og Auto-diameter korrektioner.
- Skift + højreklik på celleteksten for at angive et udgangspunkt.
- Spor neuronen langs hele dendrittens længde; venstre klik i slutningen af dendritten for at indstille afslutningspunktet, så softwaren automatisk kan beregne stien mellem start- og slutpunkterne.
- Gentag dette trin for alle dendritterne, og spor cellestrukturen helt.
- Visualiser den sporede celle og bekræft dens nøjagtighed. Foretag manuelle justeringer efter behov.
- Vælg fanen Oprettelse.
- Vælg indstillingen Genkompiler dendritdiameter.
- Følg guiden til færdiggørelse for en mere præcist spores dendrit.
- Vælg fanen Tegning.
- Klik på spine radioknappen for at begynde at tegne pigge.
- Indstil den omtrentlige rygsøjlediameter efter behov, og brug måleværktøjet til at få en nøjagtig repræsentation af rygsøjlensdiametre.
- Klik på midten af rygsøjlen hoveder for at tilføje en ny rygsøjle.
- Gentag dette for alle pigge på dendritten.
BEMÆRK: Det er vigtigt at observere dendritten fra alle mulige vinkler, når der manuelt tilføjes pigge. - Kontroller de nyligt tilføjede pigge for nøjagtighed og foretage ændringer efter behov.
- Vælg fanen Oprettelse.
- Vælg indstillingen Recompute Spine Diameter for at give softwaren mulighed for at bestemme de korrekte hoved- og halsdiametre, som er afgørende for downstream-dataanalyse.
- Følg rygsøjlen diameter skabelse guiden til færdiggørelse.
- Overhold resultatet af beregningen og foretag eventuelle manuelle justeringer efter behov. Figur 5E viser en fuldt sporet neuron komplet med rygsøjler.
- Hvis du vil oprette en klassificeret liste over rygsøjler, skal du vælge fanen Funktioner.
BEMÆRK: MATLAB-udvidelsen skal være installeret, for at dette kan fungere.- Hvis du vil installere MATLAB-udvidelsen, skal du åbne indstillingsvinduet.
- Vælg indstillingen Brugerdefinerede værktøjer.
- Tilføj den relevante MATLAB-kørsels-MCR.
- Klik på Klassificere Spines.
- Rediger de ønskede parametre for rygsøjlen klassificering.
- Klik på Klassificere Spines på MATLAB udvidelse. Figur 5F viser dendrit overlejret med farvekodede klassificerede pigge.
- Vælg fanen Statistik.
- Konfigurer den ønskede statistik for at kvantificere dataene ved at klikke på knappen Konfigurer i nederste venstre hjørne af denne fane.
- Når metoden til statistikrepræsentation er valgt, skal du eksportere dataene ved hjælp af knappen Eksportstatistik under fanevisning til Fil nederst til højre i dette vindue.
- Graf statistikken ved hjælp af en foretrukken grafmetode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter billedopsamling blev den repræsentative cellemorfologi analyseret ved hjælp af indlejret statistik og klassificering af scripts i analysesoftwaren. De indsamlede data (Figur 6A) afspejler, at neuron 2 har en større dendritisk struktur med en højere tæthed af rygsøjler. Som helhed tyder dataene på, at neuron 2 har en mere kompleks dendritisk struktur sammenlignet med neuron 1. For at underbygge dette resultat blev der udført standard Sholl-analyse, hvilket bekræfter, at neuron 2 er mere dendritisk kompleks end neuron 1 som angivet af det øgede antal Sholl-kryds ved 50-100 μm fra somaen (Figur 6B). Endelig blev dendritiske pigge af de to afbildede neuroner klassificeret i fire hovedkategorier baseret på deres overordnede former og størrelser. Pigge, der udviser mere filopodia-lignende former er sandsynligvis mere umodne rygsøjlen undertyper. Pigge med definerede hoveder, kaldet champignon pigge, sandsynligvis indeholder mere udviklede og modne synapser7. Analysen præsenteret her viser, at neuron 1 indeholder en større andel af filopodia-lignende pigge i forhold til neuron 2 (Figur 6C). Således, baseret på morfologi, neuron 2 er mere udviklingsmæssigt moden, da det er større, mere stærkt forgrenet, og indeholder en højere tæthed af modne pigge.
Figur 1: CLARITY-protokollen gør væv gennemsigtige, samtidig med at iboende struktur og rumlige relationer mellem molekyler og molekyler molekyler opretholdes. (B) Hydrogel monomers (lilla linjer) infunderes i vævet og polymeriseres i et hydrogelnet. Væv og hydrogel mesh er crosslinked via formaldehyd fiksering. (C) Vævet vaskes derefter med ioniske vaskemiddelopløsninger, mens det udsættes for elektriske felter. Under denne proces fjerner vaskemiddelmikrollerne lipidmolekyler fra vævet og efterlader et krydslinket netværk af gennemsigtige hydrogel og biomolekyler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Flowdiagram over protokollen, diagram over vævsforberedelse, rydning, montering, billeddannelse og billedbehandling.
Figur 3: Konstruktion af monteringskamre til rensede vævsprøver. (A) Ryddet hele hjernen i PBS før nedsænkning i brydningsindeks matching opløsning. (B) Hjerne skive i brydningsindeks matching opløsning. (C) Billedkammer til store og små rensede vævsprøver. Kamrene kan fremstilles ved hjælp af en række forskellige materialer, herunder men ikke begrænset til 3D-printet plast og skæres koniske rør. (D) Billedbehandling kammer for hele hjernen eller halvkugle billeddannelse, ved hjælp af 50 mL koniske rør som en lettelse, før hælde agarose. (E) Hele hjernen eller halvkugle billeddannelse kammer med agarose fuldt indstillet; denne opsætning er optimal til store tønde nedsænkning mål. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Erhverve store datasæt af høj kvalitet fra rensede vævsprøver. (A) Indstillinger for billedopsamling, der bruges til billedbehandling i hele cellen i høj opløsning. Pinhole var helt lukket for at muliggøre fine optiske sektioner. Scanningshastigheden blev bestemt empirisk baseret på optimale pixelbotider. (B) Lys sti indstillinger: disse vil afhænge af fluorophore og udstyr, der anvendes. (C) Indstillinger for Z-stak; en fin z-trin blev brugt til at fange så mange oplysninger i z-retning som muligt. d) Repræsentativ max-projektion skalalinjen repræsenterer 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: 3D-analyse af dendritter i analysesoftwaren. (A) Side-visning af en to-foton erhvervet 600 μm z-stack erhvervet fra et 1 mm tykt væv, der udtrykker tdTomato; skalalinjen repræsenterer 100μm. (B) Top-visning af den samme z-stak, der er erhvervet i panel A skalastangen repræsenterer 100μm. (C) Confocal erhvervet billede af væv, der udtrykker EGFP. Billedfiler kan importeres direkte til analysesoftwaren og forbehandles for at opnå større billedkvalitet. skalalinjen repræsenterer 25 μm. (D) Tærskel subtraktion bruges til at fjerne det ensartede baggrundssignal, der findes i C. (E) Filamentsporing og rygsøjleidentifikation: Denne proces er bedst, når den udføres semiautomatisk med den auto-dybdefunktion kontrolleret. Spines blev derefter hånd mærket efter fuld dendrit genopbygning; skalastangen repræsenterer 25 μm. (F) Rygsøjleklassifikation ved hjælp af en indbygget MATLAB-udvidelse. Spines er blevet farvekodet baseret på deres morfologi; stubby pigge er røde; champignon pigge er grønne; lange tynde rygsøjler er blå; filopodia er lilla; skalalinjen repræsenterer 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Repræsentative resultater. (A) Tabel over fælles morfologiske målinger, der automatisk genereres af det valgte analyseprogram. (B) Antal Sholl-kryds genereret af programstatistik. (C) Cirkeldiagram, der repræsenterer fordelingen af dendritiske rygsøjlemorfologier. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Opløsning | Sammensætning | Noter |
| Brydningsindeks matching løsning | 80 g histodenz | pH til 7,5 med NaOH |
| 60 mL af 0,02 M fosfatbuffer | Opbevar ved 4 °C | |
| 0,01% af natriumhyrde | Tilpasset fra Marx, V. Nature Methods bind 11, side 1209-1214 (2014) | |
| Hydrogel | 13,33 mL af 30% acrylamid (no-bis) | Bland sammen på is, ellers kan opløsningen begynde at polymerisere |
| 10 mL af 10x PBS | Aliquot og opbevares ved -20 °C | |
| 250 mg VA-044 | ||
| 76,66 mL ddH2O |
Tabel 1: Opskrifter til brydningsbillede matching løsning og hydrogel løsning. Sammensætningen af brydningsindeksets matchende opløsning og hydrogel er opført.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Før fremkomsten af moderne væv clearing teknikker, studere neuronal morfologi bestod af tidskrævende ektioner, billeddannelse, og genopbygning af tilstødende meget tynde sektioner. Brug af elektrophoretisk væv clearing i kombination med konfokal billeddannelse giver en uhindret visning af komplet neuronal morfologi. Fra intakte dendritiske træer, ned til den mindste synaptiske bouton, billeddannelse og kvantificering neuronal morfologi har aldrig været mere muligt.
Forberedelsen af renset hjernevæv er ligetil og kræver kun et stykke specialiseret udstyr. Væv ryddet og afbildet ved hjælp af denne protokol undergraver behovet for kedelige tynde snit, håndtering og montering, drastisk faldende tid fra eksperimenter til billede erhvervelse. Derudover forbliver væv afbildet uden sektion mere tro mod de oprindelige strukturer, da der ikke er nogen kilder til skade eller nødvendig post-hoc billedrekonstruktion. Endelig sparer denne protokol tid ved at tillade samtidig billeddannelse af store funktioner såsom dendritiske træer sammen med små submicronfunktioner som rygsøjler.
En vigtig samling af trin i denne protokol er de vasketrin, der følger clearingprocessen. Disse trin er afgørende for at fjerne alle spor af SDS elektrophoretic clearing buffer. Hvis det rensede væv ikke vaskes tilstrækkeligt, dannes bundfald under monteringstrinnet. Disse bundfald kan undertiden omfordeles ved at inkubere vævet ved 37-55 °C i en kort periode. Men hvis bundfaldene fortsætter, vil de sprede lys, hvilket giver dårlig billeddybde og kvalitet.
Montering store stykker væv udgør en udfordring i forhold til traditionelle tynde skive billeddannelse. Her præsenterer vi flere processer til montering af stort væv, som afhænger af billeddannelsesteknikken, objektive linseegenskaber og størrelsen af vævsprøven. For det første er det vigtigt at bruge en objektiv linse, der er egnet til nedsænkning i de specifikke brydningsindeks matchende medier, der anvendes, og som har tilstrækkelig arbejdsafstand til billeddannelse store vævsprøver. Denne protokol er i vid udstrækning begrænset af de optiske egenskaber af billedbehandling platform, der anvendes, specielt arbejdsafstand af mål. Billedbehandling i dybden opnås let ved hjælp af denne protokol. Men hvis et mål med tilstrækkelig arbejdsafstand ikke er tilgængeligt, vil vævet selv udgøre en fysisk barriere for at erhverve store billeder. Den næste vigtige beslutning er billedbehandling teknik. To-foton mikroskopi bruges typisk til sin fremragende billedkvalitet, dybde af billeddannelse, og hastigheden af erhvervelse. To-fotonmikroskopi gør det muligt at billeddannelse på op til 1 mm i CLARITY-renset væv uden tab af billedkvalitet som vist i figur 5A,B. Men meget lignende resultater kan opnås ved brug af traditionel konfokal mikroskopi, omend med et offer til billeddannelse dybde i forhold til to-foton mikroskopi (Figur 5C,D).
Sammenfattende giver denne metode en robust og bekvem platform til analyse af neuronal morfologi i både store og små skalaer. Derudover minimerer denne metode i vid udstrækning håndterings- og behandlingstiden, samtidig med at den giver mere nøjagtige og komplette tredimensionelle billeder. Cellulær morfologi er en almindeligt anvendt proxy til vurdering af kredsløbsfunktion og sundhed, der ligger til grund for mange sygdomme og patologier13,14,15. Imaging neuron morfologi er kraftfuld, ligetil, og velegnet til assay i et væld af sygdom modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre på nuværende tidspunkt.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke den virale kerne NRDDC på Jan og Dan Duncan Neurologiske Institut for at producere AAVs og lentivirus, der anvendes i disse eksperimenter. Derudover vil vi gerne takke Baylor College of Medicine Center for Comparative Medicine for musehold og generel vedligeholdelse af de anvendte mus. Vi vil gerne takke American Heart Association for deres støtte under tildeling nummer 20PRE35040011, og BRASS: Baylor Research Advocates for Student Scientists for deres støtte (PJH). Endelig vil vi gerne takke Logos for at give vores laboratorium med Logos X-Clarity elektrophoretic væv clearing system.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| 25 G x 1" Needle | BD | 305127 | |
| 30% Acrylamide (No-Bis) | National Diagnostics | EC-810 | |
| 50 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339653 | |
| Electrophoretic Tissue Clearing Solution | Logos | C13001 | |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | |
| Hydrogel Solution Kit | Logos | C1310X | |
| Imaris | Oxford Instruments | N/A | |
| Paraformaldehyde 16% | EMS | 15710 | |
| PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case | fisher | MT21040CV | |
| VA-044 | Wako | 925-41020 | |
| X-CLARITY Polymerization System | Logos | C20001 | |
| X-CLARITY Tissue Clearing System II | Logos | C30001 |
References
- Abbott, L. F., et al. The Mind of a mouse. Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), (2015).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Araya, R., Vogels, T. P., Yuste, R. Activity-dependent dendritic spine neck changes are correlated with synaptic strength. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), (2014).
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
- Martínez-Cerdeño, V. Dendrite and spine modifications in autism and related neurodevelopmental disorders in patients and animal models. Developmental Neurobiology. 77 (4), 393-404 (2017).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetics and imaging technologies for circuit-based neuroanatomy. Nature. 461 (7266), 900-907 (2009).
- Kim, E. H., Chin, G., Rong, G., Poskanzer, K. E., Clark, H. A. Optical probes for neurobiological sensing and imaging. Accounts of Chemical Research. 51 (5), 1023-1032 (2018).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2014).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Ledda, F., Paratcha, G. Mechanisms regulating dendritic arbor patterning. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (24), 4511-4537 (2017).
- Falougy, H. E., Filova, B., Ostatnikova, D., Bacova, Z., Bakos, J. Neuronal morphology alterations in autism and possible role of oxytocin. Endocrine Regulations. 53 (1), 46-54 (2019).
