Summary
Klyvning under mål och tagning (CUT&Tag) är en effektiv kromatin epigenomisk profileringsstrategi. Detta protokoll presenterar en förfinad CUT&Tag-strategi för profilering av histonmodifieringar i växter.
Abstract
Epigenomisk reglering på kromatisk nivå, inklusive DNA och histon modifieringar, beteenden av transkriptionsfaktorer och icke-kodande RNAs med sina rekryterade proteiner, leder till temporal och rumslig kontroll av genuttryck. Klyvning under mål och tagning (CUT&Tag) är en enzym-tethering metod där det specifika kromatinproteinet först känns igen av sin specifika antikropp, och sedan antikroppen binder ett protein A-transponas (pA-Tn5) fusionsprotein, som klyver det riktade kromatinet in situ genom aktivering av magnesiumjoner. Här tillhandahåller vi vårt tidigare publicerade CUT&Tag-protokoll med intakta kärnor isolerade från allortetraploid bomullsblad med modifiering. Detta steg-för-steg-protokoll kan användas för epigenomisk forskning i växter. Dessutom är betydande ändringar för isolering av växtkärnor kritiska kommentarer.
Introduction
Transkriptionsfaktorbindande DNA-platser och öppet kromatin i samband med histonmodifieringsmärken fyller kritiska funktionella roller för att reglera genuttryck och är de viktigaste fokusen för epigenetisk forskning1. Konventionellt har kromatin immunoprecipitation assay (ChIP) i kombination med djup sekvensering (ChIP-seq) använts för genomomfattande identifiering av specifika kromatin histon modifiering eller DNA-mål med specifika proteiner, och är allmänt antagen inom området epigenetik2. Klyvning under mål och tagningsteknik (CUT&Tag) utvecklades ursprungligen av Henikoff Lab för att fånga de proteinanslutna DNA-fragmenten i hela genomet5. Jämfört med ChIP genererar CUT&Tagcan DNA-bibliotek med hög upplösning och exceptionellt låg bakgrund med hjälp av ett litet antal celler med ett förenklat förfarande3. Hittills har metoder för analys av kromatinregioner med specifika histonmodifieringar med CUT&Tag fastställts i djurceller4,5. Specifikt har encelliga CUT&Tag (scCUT&Tag) också framgångsrikt utvecklats för mänskliga vävnader och celler6. Men på grund av cellväggens och sekundära metaboliters komplexitet är CUT&Tag fortfarande tekniskt utmanande för växtvävnader.
Tidigare rapporterade vi ett CUT&Tag-protokoll med intakta kärnor isolerade från allotetraploid bomullsblad4. För att demonstrera effektiviteten av atomisolering och DNA-fångst med hjälp av växtvävnad presenteras profileringsförfarandet här. De viktigaste stegen inkluderar intakt atomkärnor isolering, in situ inkubation med antikroppen för kromatin modifiering, transposase inkubation, adapter integration, och DNA bibliotek förberedelse. Felsökningen fokuserar på CUT&Tag-bibliotekets förberedelse för isolering av växtkärnor och kvalitetskontroll.
I denna studie presenterar vi en förfinad CUT&Tag-strategi för växter. Vi tillhandahåller inte bara ett steg-för-steg-protokoll för H3K4me3-profilering i bomullsblad, utan vi tillhandahåller också en optimerad metodik för isolering av växtkärnor, inklusive strategin för att välja koncentrationen av tvättmedel för korrekt celllys och strategin att filtrera kärnorna. Detaljerade steg med kritiska kommentarer ingår också i det här uppdaterade protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered transposas- och lagerlösningar (dag 1)
OBS: I den här delen är oligonukleotidadaptrarna komplexa med Tn5-transponat för att göra aktiv transposas.
- Späd primers (primer A, primer B och primer C) till 100 μM koncentration med hjälp av glödgningsbufferten (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (se tabell 1 för sekvensinformation om primers och tabell 2 för recept för arbetslösningar). Förvara vid -20 °C tills den används.
- Ställ in följande två reaktioner i PCR-rör: Reaktion 1 (adapter AB), 10 μL av 100 μM primer A, 10 μL 100 μM primer B; Reaktion 2 (adapter AC), 10 μL 100 μM primer A, 10 av μL 100 μM primer C.
- Anneal adaptrarna i PCR-maskinen med följande program: värmelock (102 °C), 75 °C i 15 min, 60 °C i 10 min, 50 °C i 10 min, 40 °C i 10 min, 25 °C i 30 min.
OBS: Adaptrarna är delvis dubbelsträngade DNA-molekyler (koncentration = 50 pmol/μL). - Ställ in följande reaktion i ett 1,5 mL centrifugrör: 10 μL pA-Tn5 transposas (500 ng/μL eller 7,5 pmol/μL), 0,75 μL adapter AB (50 pmol/μL), 0,75 μL adapter AC (50 pmol/μL), 7 μL Pipettera 20x försiktigt för att blanda väl och inkubera vid 30 °C i ett vattenbad i 1 h. Den slutliga koncentrationen av transposas = 4 pmol/μL. Förvara vid -20 °C fram till användning.
OBS: Molarförhållande för adapter AB: adapter AC: transposas = 0,5:0,5:1. - Förbered lagerlösningarna enligt recepten i tabell 2 och autoklav eller filtrera lagerlösningarna för att sterilisera.
- Autoklav och sterilisera sax, filterpapper, en sikt i rostfritt stål, en mortel, mortel, mortel etc.
2. Isolering av atomkärnor (dag 2)
- Förkyl centrifugen till 4 °C. För varje 1 g av utgångsmaterialet (bomullsblad), bered 25 ml kärnisoleringsbuffert A (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 20 ml kärnisoleringsbuffert B (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL kärnsp wash buffert (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL kärnisoleringsbuffert B (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL kärnsp wash buffert B (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL kärnisoleringsbuffert B (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL kärnsprängningsbuffert B (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL kärnsprängningsbuffert B (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL kärnisoleringsbuffert B (10 mM Tri 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidin, proteashämmare cocktail 0,1%), 1 ml antikroppsbuffert (50 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidin, 1 mg/mL BSA, proteashämmare cocktail 0,1%, 0, 0, 0, 5 mM spermidin, 1 mg/mL BSA, proteashämmare cocktail 0,1%, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 5 mM spermidin, 1 mg/mL BSA, proteashämmare cocktail 0,1%, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 5 mM spermidin, 1 mg/mL BSA, proteashämmare cocktail 0,1%, 0, 0, 0, 0, 5 mM spermidin, 1 mg/mL BSA, proteashämmare cocktail 0,1%, 0, 0, 0, 0, 5 mM spermidin, 1 mg/mL BSA, proteashämmare cocktail 0,1%, 0, 0, 0, 5 mM spermidin, 1 mg/mL Låt rören sitta på is tills de används.
- Mala färska blad (~1 g) i flytande kväve till ett fint pulver och överför till ett 50 ml rör som innehåller 25 ml kyld kärnisoleringsbuffert A.
- Blanda buffertlösningen försiktigt och inkubera röret på is i 5 minuter med mild skakning för att fördela materialet jämnt.
- Centrifugera i 5 min vid 500 rcf vid 4 °C för att bilda cellpelleten.
- Dekantera supernatanten och återanvänd pelleten med 20 ml kyld kärnisoleringsbuffert B kompletterad med 0,5% Triton X-100. Vänd röret försiktigt för att återanvända pelleten helt.
OBS: Kärnisoleringsbufferten B på 20 ml är tillämplig för 1 g startmaterial, och denna volym kan skalas i enlighet därmed.- Utför en pilotanalys för att testa effekten av seriekoncentrationen av Triton X-100 (t.ex. 2 ml kärnisoleringsbuffert B, var och en med 0,1%, 0,25%, 0,5% och 1% Triton X-100 för 100 mg slipade vävnader). Lämplig koncentration av Triton X-100 indikeras av en ackumulering av vita/grå kärnor i botten och en mörkgrön supernatant efter lys och centrifugering vid låg hastighet (< 500 rcf i 4 min).
- Filtrera den resulterande cell lysate med en kombination av två siktar: en 500-mesh sikt på toppen för att ta bort de större vävnadsskräp och en 1000-mesh sikt på botten för att samla kärnorna.
OBS: Välj en lämplig maskstorlek för siktarna beroende på växternas kärnstorlek. - Använd sterilt filterpapper på baksidan av sikten för att absorbera små cellrester i lysat.
- Överför de återstående kärnorna som innehåller lysate på ovansidan av sikten med 1000 maskor till fyra färska 1,5 ml centrifugrör.
- Centrifugera i 4 min vid 300 rcf vid 4 °C för att samla in kärnorna.
- Ta bort så mycket av supernatanten som möjligt med en pipettspets och tvätta pelleten med kärntvättbuffert.
- Tillsätt 800 μL av kärntvättbufferten och vänd rören försiktigt för att återanvända pelleten. Snurra röret igen i 4 min vid 300 rcf vid 4 °C.
- Utför totalt 3 tvättar.
- (Frivillig uppgift) Avbilda kärnorna under ett mikroskop för DAPI-färgning.
- Överför 100 μL kärnor suspension i kärntvättbufferten från steg 2.11. till ett nytt 1,5 mL-rör. Tillsätt 900 μL kärntvättbuffert och 2 μL DAPI-stamlösning (1 mg/ml) för att göra en slutlig arbetskoncentration på 2 μg/ml för DAPI. Inkubera röret i mörker i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Efter färgning, centrifugera i 4 min vid 300 rcf vid 4 °C för att samla kärnorna.
- Ta bort så mycket av supernatanten som möjligt med hjälp av en pipettspets. Tvätta 3 gånger med 800 μL av kärntvättbufferten.
- Ta bort så mycket av supernatanten som möjligt och återanvänd kärnorna med 100 μL kärntvättbuffert.
- Avbilda kärnorna under ett fluorescensmikroskop med DAPI-kanalen.
- Kombinera kärnorna från två rör (~50 μL kärnor i volym i varje 1,5 ml rör). Centrifugera i 4 min vid 300 rcf vid 4 °C. Ta bort så mycket av den återstående bufferten som möjligt med en pipettspets.
3. Inkubation av antikroppar
- Återsuspend varje 50 μL kärnor i ett 1,5 ml rör med 1 ml antikroppsbuffert.
- Ställ in följande reaktioner i 1,5 ml rör: två biologiska replikat av IgG-kontrollgrupper med 150 μL kärnor (~ 1 μg kromatin) och 2 μL IgG (1 mg/mL) i varje rör, två biologiska replikat av H3K4me3-analysgrupper med 150 μL kärnor och 2 μL anti-H3K4
- Blanda lösningen försiktigt och lämna rören på en horisontell skakapparat för hybridisering över natten vid 4 °C och 12 varv/min.
- Förkyl centrifugen till 4 °C. Förbered färsk 50 ml immunprecipiteringstvättbuffert (IP) (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidin, proteashämmare cocktail 0,1%, 0,05% w/v digitonin) i ett 50 mL centrifugrör. Låt röret sitta på is.
- Centrifugera rören i 4 min vid 300 rcf vid 4 °C. Ta bort antikroppsbufferten från varje rör.
- Tillsätt 800 μL IP-tvättbuffert till varje rör och blanda försiktigt. Låt rören på en horisontell skakapparat i 5 min vid rumstemperatur och 12 varv/min.
- Centrifugera rören i 4 minuter vid 300 rcf vid 4 °C efter tvätt. Ta bort supernatanten med en pipettspets.
OBS: För att undvika störningar av nukleipellet, lämna ~50-80 μL av bufferten med kärnorna. - Upprepa steg 3.6.-3.7. två gånger till.
- Efter den tredje tvätten, centrifugera i 2 min vid 300 rcf vid 4 °C. Ta bort den återstående bufferten så mycket som möjligt.
4. Transposasinkubation
- Gör färsk inkubationsbuffert på 1 mL transposas (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM spermidin, proteashämmare cocktail 0,1%, 0,05% w/v digitonin) genom att blanda 1 ml ip-tvättbuffert med 30 μL 5 M NaCl.
- För att bereda Tn5-transposasblandningen för inkubation, tillsätt 1 μL transponas till varje 150 μL av transposasinkubationsbufferten.
OBS: Förbered blandningen av transponeraslösning först enligt antalet reaktioner och tillsätt sedan en alikvot på 150 μL till varje rör. - Återanvänd kärnorna med 150 μL transposaslösning.
- Lämna rören på en horisontell skakapparat vid 12 varv/min i 2-3 timmar vid rumstemperatur och blanda var 10-15 min.
- Centrifugera rören i 4 minuter vid 300 rcf vid 4 °C efter transposasinkubation. Ta bort transposasinkubationsbufferten i varje rör.
- Tvätta rören med IP-tvättbuffert. För att göra det, tillsätt 800 μL IP-tvättbuffert till varje rör, blanda försiktigt och lämna rören på en horisontell skakapparat vid 12 rpm i 5 min vid rumstemperatur.
- Centrifugera i 4 min vid 300 rcf vid 4 °C. Ta bort supernatanten med en pipettspets.
- Upprepa steg 4.6.-4.7. två gånger till.
- Efter den tredje tvätten, centrifugera i 2 min vid 300 rcf vid 4 °C. Ta bort den återstående bufferten så mycket som möjligt.
5. Tagmentation
- Gör nyligen 2 ml av tagmenteringsbufferten (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM spermidin, proteashämmare cocktail 0,1%, 10 mM MgCl2, 0,05% w/v digitonin) genom att blanda 2 mL IP-tvättbuffert med 60 μL 5 M NaCl.
- Återsuspend nukleerna med 300 μL taggningsbuffert.
- Blanda lösningen och inkubera i ett vattenbad på 37 °C i 1 h för tagning.
- Stoppa taggningen med 10 μL 0,5 M EDTA (slutlig koncentration ~15 mM) och 30 μL 10% SDS (slutlig koncentration 1%).
6. DNA-extraktion och NGS-bibliotekskonstruktion
- Tillsätt 300 μL CTAB DNA-extraktionsbuffert enligt beskrivningen7. Inkubera rören i ett vattenbad på 65 °C i 30 minuter. Invertera för att blanda varje ~ 10 min.
- Tillsätt 600 μL fenol: kloroform: isoamylalkohol (25:24:1) till varje rör. Blanda ordentligt.
- Förcentrera faslåsgelrören i 2 min vid 13 000 rcf vid 4 °C. Överför ovanstående lösning till faslåsgelrör.
- Centrifugera i 10 min vid 13 000 rcf vid 4 °C.
- Överför supernatanten (~600 μL) till ett nytt 1,5 mL-rör.
- Tillsätt 600 μL kloroform till varje rör. Blanda ordentligt.
- Centrifugera i 10 min vid 13 000 rcf vid 4 °C.
- Överför supernatanten (~600 μL) till ett nytt 1,5 ml rör.
- Tillsätt 12 μL 100 % etanol och 2 μL GlycoBlue Coprecipitant. Blanda noggrant och förvara vid -20 °C i 1 h.
- Centrifugera i 10 min vid 13 000 rcf vid 4 °C.
- Dekantera supernatanten. Tvätta DNA-pelleten med 75% (v/v) etanol och centrifug i 5 min vid 13 000 rcf vid 4 °C.
- Dekantera supernatanten. Lufttorka DNA-pelleten och återanvända DNA i 25 μL ddH2O.
- Ställ in PCR-reaktionen enligt följande. För totalt 50 μL reaktion tillsätt 24 μL DNA, 11 μL ddH2O, 10 μL 5x TAE-buffert, 2 μL P5 primer (10 μM), 2 μL P7 primer (10 μM) och 1 μL TruePrep Amplify Enzyme. PCR-program: 72 °C i 3 min, 98 °C för 30 s; sedan 14 cykler på 98 °C för 30 s, 60 °C för 30 s och 72 °C för 30 s, följt av 72 °C för 5 min.
OBS: De första 72 °C för 3 min för förlängning kan inte hoppas över. Överimplementering av biblioteket kommer att leda till en hög nivå av PCR-dubbletter i NGS. Börja från 12-14 PCR cykler i PCR reaktion för H3K4me3 när du använder ~1 μg kromatin i varje reaktion. - Ladda 2 μL pcr-produkterna på 1,5% agarosgel för elektrofores.
- Rena PCR-produkterna med hjälp av kommersiella DNA-rening magnetiska pärlor.
- Kvantifiera biblioteket med fluorometer och agarosgelelektrofores.
OBS: Effektiv koncentration av biblioteket bör vara >2 nM av qPCR för att säkerställa god kvalitet. - Utför nästa generations sekvensering (NGS) och dataanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bild 1 visar ARBETSFLÖDET CUT&Tag. Figur 2 visar DAPI-färgningen av de intakta kärnorna. Målet med "nuklei isolering" steget var att få intakta kärnor på en tillräcklig mängd för den efterföljande CUT&Tag reaktionen. Figur 3 visar agarosegelelektrofores av PCR-produkter. Den negativa IgG-kontrollen krävs parallellt när experimentet ställs in. Jämfört med IgG-kontrollgruppen varierade huvuddelen av DNA-fragmenten som drogs med H3K4me3 antikroppsprov från ~ 280 till 500 baspar. Figur 4 visar den resulterande nästa generations sekvensering för antikroppen mot H3K4me3 jämfört med IgG-negativa kontrollgrupper.
Bild 1: Arbetsflödet för CUT&Tag. Denna siffra är oförändrad från Tao et al.4. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: DAPI-färgning av intakta kärnor isolerade från bomullsblad. Skalstång = 20 μM. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: Agarose gel elektrofores av 2 μL PCR-produkter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 4: Representativ IGV-skärmdump för H3K4me3-signaler. (A) Representativ IGV-översikt över CUT&Tag-signaler över en stor genomregion. ~ 1500 kb genomregioner valdes slumpmässigt ut. (B) Representativ IGV skärmdump för gener med olika uttrycksnivåer visade hög upplösning av CUT&Tag-signaler. De normaliserade bigWig filer genereras från bamCompare genom att jämföra behandling bam fil (CUT&Tag anti-H3K4me3 reaktion) och kontroll bam fil (IgG) användes. TPM, transkriptioner per kilobas exon-modell per miljon kartlagda läsningar. Denna siffra är modifierad från Tao et al.4. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Tabell 1: Primer-sekvenser. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 2: Buffert- och lösningsrecept. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi beskrivit CUT&Tag, en teknik för att generera DNA-bibliotek med hög upplösning och exceptionellt låg bakgrund med hjälp av ett litet antal celler med ett förenklat förfarande jämfört med kromatinimprecipitering (ChIP). Vår framgång med H3K4me3-profilering i bomullsblad tyder på att CUT&Tag, som först designades för djurceller, också kan användas för växtceller. Både Tris buffertsystem som vanligen används för ChIP-analys8 och HEPES-buffertsystemet som används för animal CUT&Tag-arbete för CUT&Tag med hjälp av växtkärnor4,9. Isoleringen av intakta växtkärnor är det avgörande steget för en framgångsrik tillämpning av CUT&Tag i växter. I den tidigare rapporterade metoden för atomkärnor isolering4 filtrerades lösningen av slipade vävnader genom två lager av Miracloth före celllys. Vi fann effektiviteten av att få adekvata kärnor reducerade vid användning av relativt åldrade blad (t.ex. löv från 2 månader gamla bomullsplantor) och bomullsfibrer (t.ex. 20-DPA-fiber) eftersom Miracloth behåller de flesta av de slipade vävnaderna. I detta videoprotokoll optimerades växtkärnor isoleringen genom filtrering av cell lysate genom en 500-mesh (20 μM porstorlek) rostfritt stål sikt. Denna förändrade operation förbättrade avsevärt effektiviteten av att ta bort större vävnad skräp och erhålla adekvata kärnor för den efterföljande reaktionen.
Efter PCR för bibliotekskonstruktion (steg 6.13.) kan DNA-fragmenten renas och sedan profileras av NGS. Men om IgG-kontrollgruppen också visar en berikning i små fragment, indikerar den en stark bakgrund av slumpmässig DNA-skärning genom transposas, som kan orsakas av skadade kärnor eller otillräcklig tvättning för avlägsnande av obundna antikroppar eller transponeras. I detta fall rekommenderades inte parallella prover för specifika antikroppar för ytterligare NGS.
Nyligen har encelliga CUT&Tag genom att anpassa den droppbaserade 10x Genomics encelliga ATAC-seq-plattformen utvecklats och tillämpats vid profilering av H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac och H3K36me3 histonmodifieringar. I en studie om kromatinbeläggningen av transkriptionsfaktorN OLIG2 gav den cohesin komplexa komponenten RAD21 i mushjärnan unika insikter i epigenomiska landskap i centrala nervsystemet6. Cut&Tag kan således tillämpas för att undersöka de epigenomiska landskapen för både bulk histonmodifiering och de specifika TFs med låga inmatningskrav9, även på encellsnivå6. Dessa tillämpningar av CUT&Tag indikerar att studien av växt epigenetisk reglering i samordning av gen funktionella nätverk under dynamiken i utveckling och miljöreaktioner kan vara exakt i det tidsmässiga och rumsliga mönstret.
CUT&Tag är en metod som fortfarande är under utvecklingsprocesser med problem som behöver åtgärdas. För transkriptionsfaktorer som inte uttrycks rikligt eller är svagt, övergående eller indirekt bundna till kromatin10 måste skillnaderna mellan tvärlänkade och inhemska kärnor i CUT&Tag jämföras. CUT&Tag-strategin för profilering med transkriptionsfaktorer vid lågt överflöd är fortfarande tekniskt utmanande. På grund av den begränsade tillgången på proteinepiltop kan det dessutom kullvägsantikroppar som är validerade för att fungera med tvärbindningsförhållanden inte fungera bra med inhemska förhållanden i CUT&Tag; Antikropparnas känslighet och specificitet måste valideras. Dessutom har Tn5-transponsen som används i CUT&Tag hög affinitet till öppna kromatinregioner111, vilket innebär att CUT&Tag kan införa partiskhet, vilket också måste åtgärdas i framtida studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare har inga intressekonflikter med något företag som handlar med en av de produkter som nämns ovan.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis ekonomiskt av bidrag från National Natural Science Foundation of China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) och fundamentala forskningsfonder för de centrala universiteten, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) och JCIC-MCP-projektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
- Abascal, F., et al. Perspectives on ENCODE. Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120 (2020).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
- Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
- Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).
- Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).
- Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).
