Summary
Cleavage under targets and tagmentation (CUT&Tag) ist eine effiziente Chromatin-Epigenom-Profiling-Strategie. Dieses Protokoll stellt eine verfeinerte CUT&Tag-Strategie für die Profilierung von Histonmodifikationen in Pflanzen dar.
Abstract
Epigenomische Regulation auf chromatischer Ebene, einschließlich DNA- und Histonmodifikationen, Verhalten von Transkriptionsfaktoren und nicht-kodierende RNAs mit ihren rekrutierten Proteinen, führen zu einer zeitlichen und räumlichen Kontrolle der Genexpression. Spaltung unter Targets und Tagmentation (CUT & Tag) ist eine Enzym-Tethering-Methode, bei der das spezifische Chromatinprotein zuerst durch seinen spezifischen Antikörper erkannt wird und dann der Antikörper ein Protein-A-Transposase-Fusionsprotein (pA-Tn5) anbindet, das das gezielte Chromatin in situ durch die Aktivierung von Magnesiumionen spaltet. Hier stellen wir unser zuvor veröffentlichtes CUT&Tag-Protokoll zur Verfügung, das intakte Kerne verwendet, die aus allortetraploiden Baumwollblättern mit Modifikation isoliert wurden. Dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll kann für die epigenomische Forschung an Pflanzen verwendet werden. Darüber hinaus werden wesentliche Modifikationen zur Isolierung von Pflanzenkernen mit kritischen Anmerkungen versehen.
Introduction
Transkriptionsfaktor-bindende DNA-Stellen und offenes Chromatin, das mit Histon-Modifikationsmarkierungen assoziiert ist, spielen eine entscheidende funktionelle Rolle bei der Regulierung der Genexpression und sind die Hauptschwerpunkte der epigenetischen Forschung1. Herkömmlicherweise wurde der Chromatin-Immunpräzipitationsassay (ChIP) in Verbindung mit der Tiefensequenzierung (ChIP-seq) für die genomweite Identifizierung spezifischer Chromatin-Histon-Modifikation oder DNA-Ziele mit spezifischen Proteinen verwendet und ist im Bereich der Epigenetik weit verbreitet2. Die CUT&Tag-Technologie (Cleavage under targets and tagmentation) wurde ursprünglich vom Henikoff Lab entwickelt, um die proteinassoziierten DNA-Fragmente im gesamten Genom zu erfassen5. Im Vergleich zu ChIP kann CUT&Tag DNA-Bibliotheken mit hoher Auflösung und außergewöhnlich niedrigem Hintergrund mit einer kleinen Anzahl von Zellen mit einem vereinfachten Verfahren generieren3. Bisher wurden Methoden zur Analyse von Chromatinregionen mit spezifischen Histonmodifikationen mittels CUT&Tag in tierischen Zellen etabliert4,5. Konkret wurde Single-Cell CUT&Tag (scCUT&Tag) auch erfolgreich für menschliche Gewebe und Zellen entwickelt6. Aufgrund der Komplexität der Zellwand und der Sekundärmetaboliten ist CUT&Tag für Pflanzengewebe jedoch immer noch eine technische Herausforderung.
Zuvor berichteten wir über ein CUT&Tag-Protokoll mit intakten Kernen, die aus allotetraploiden Baumwollblättern isoliert wurden4. Um die Effizienz der Nukleisolierung und DNA-Erfassung unter Verwendung von Pflanzengewebe zu demonstrieren, wird hier das Profiling-Verfahren vorgestellt. Zu den wichtigsten Schritten gehören die Isolierung intakter Kerne, die In-situ-Inkubation mit dem Antikörper zur Chromatinmodifikation, die Transposase-Inkubation , die Adapterintegration und die DNA-Bibliotheksvorbereitung . Die Fehlersuche konzentriert sich auf die Vorbereitung der CUT&Tag-Bibliothek für die Isolierung und Qualitätskontrolle der Pflanzenkerne.
In dieser Studie stellen wir eine verfeinerte CUT&Tag-Strategie für Pflanzen vor. Wir bieten nicht nur ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die H3K4me3-Profilierung in Baumwollblättern, sondern auch eine optimierte Methodik für die Isolierung von Pflanzenkernen, einschließlich der Strategie zur Auswahl der Reinigungsmittelkonzentration für die richtige Zelllyse und der Strategie zur Filterung der Kerne. Detaillierte Schritte mit kritischen Kommentaren sind ebenfalls in diesem aktualisierten Protokoll enthalten.
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Protocol
1. Transposase- und Lagerlösungen vorbereiten (Tag 1)
HINWEIS: In diesem Teil werden die Oligonukleotidadapter mit Tn5-Transposase komplexiert, um eine aktive Transposase zu erzeugen.
- Verdünnen Sie Primer (Primer A, Primer B und Primer C) auf 100 μM-Konzentration mit dem Glühpuffer (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (siehe Tabelle 1 für Sequenzinformationen von Primern und Tabelle 2 für die Rezepte für Arbeitslösungen). Bis zum Gebrauch bei -20 °C lagern.
- Richten Sie die folgenden beiden Reaktionen in PCR-Röhrchen ein: Reaktion 1 (Adapter AB), 10 μL 100 μM Primer A, 10 μL 100 μM Primer B; Reaktion 2 (Adapter AC), 10 μL 100 μM Primer A, 10 μL 100 μM Primer C.
- Glühen Sie die Adapter in der PCR-Maschine mit folgendem Programm: Heizdeckel (102 °C), 75 °C für 15 min, 60 °C für 10 min, 50 °C für 10 min, 40 °C für 10 min, 25 °C für 30 min.
HINWEIS: Die Adapter sind teilweise doppelsträngige DNA-Moleküle (Konzentration = 50 pmol/μL). - Richten Sie die folgende Reaktion in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen ein: 10 μL pA-Tn5-Transposase (500 ng/μL oder 7,5 pmol/μL), 0,75 μL Adapter-AB (50 pmol/μL), 0,75 μL Adapter-AC (50 pmol/μL), 7 μL Kopplungspuffer. 20x vorsichtig gut mischen und bei 30 °C in einem Wasserbad 1 h inkubieren. Die Endkonzentration der Transposase = 4 pmol/μL. Bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
HINWEIS: Molverhältnis des Adapters AB: Adapter AC: Transposase = 0,5:0,5:1. - Bereiten Sie die Stammlösungen gemäß den Rezepturen in Tabelle 2 vor und autoklavieren oder filtern Sie die Stammlösungen zum Sterilisieren.
- Autoklavieren und sterilisieren Sie Scheren, Filterpapier, ein Edelstahlsieb, einen Mörser, Stößel usw.
2. Nuklei-Isolierung (Tag 2)
- Die Zentrifuge auf 4 °C vorkühlen. Für jeweils 1 g des Ausgangsmaterials (Baumwollblätter) sind 25 ml Kernisolationspuffer A (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 20 mL Kernisolationspuffer B (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL Kernwaschpuffer (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM Spermidin, Proteaseinhibitor-Cocktail 0,1%), 1 mL Antikörperpuffer (50 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5 mM Spermidin, 1 mg/ml BSA, Proteaseinhibitor-Cocktail 0,1%, 0,05% mit Digitonin). Lassen Sie die Röhren bis zum Gebrauch auf Eis sitzen.
- Mahlen Sie frische Blätter (~ 1 g) in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver und geben Sie es in ein 50-ml-Röhrchen, das 25 ml gekühlten Kernisolationspuffer A enthält.
- Mischen Sie die Pufferlösung vorsichtig und inkubieren Sie das Rohr auf Eis für 5 Minuten mit sanftem Schütteln, um das Material gleichmäßig zu verteilen.
- Zentrifuge für 5 min bei 500 rcf bei 4 °C, um das Zellpellet zu bilden.
- Dekantieren Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet mit 20 ml gekühltem nuklearem Isolationspuffer B, ergänzt durch 0,5% Triton X-100. Drehen Sie das Rohr vorsichtig um, um das Pellet vollständig zu resuspendieren.
HINWEIS: Der 20 ml nukleare Isolationspuffer B ist für 1 g Ausgangsmaterial anwendbar, und dieses Volumen kann entsprechend skaliert werden.- Führen Sie einen Pilotassay durch, um die Wirkung der Serienkonzentration von Triton X-100 zu testen (z. B. 2 ml Kernisolationspuffer B mit jeweils 0,1%, 0,25%, 0,5% und 1% Triton X-100 für 100 mg gemahlenes Gewebe). Die geeignete Konzentration von Triton X-100 wird durch eine Ansammlung von weißen/grauen Kernen am Boden und einen dunkelgrünen Überstand nach Lyse und Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit (< 500 rcf für 4 min) angezeigt.
- Filtern Sie das resultierende Zelllysat mit einer Kombination aus zwei Sieben: einem 500-Mesh-Sieb auf der Oberseite, um die größeren Gewebeablagerungen zu entfernen, und einem 1000-Mesh-Sieb auf der Unterseite, um die Kerne zu sammeln.
HINWEIS: Wählen Sie eine geeignete Maschenweite für die Siebe in Abhängigkeit von der Kerngröße der Pflanzen. - Verwenden Sie steriles Filterpapier auf der Rückseite des Siebes, um kleinzellige Ablagerungen im Lysat zu absorbieren.
- Die verbleibenden lysathaltigen Kerne auf der Oberseite des 1000-Mesh-Siebes werden auf vier frische 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen übertragen.
- Zentrifuge für 4 min bei 300 rcf bei 4 °C, um die Kerne zu sammeln.
- Entfernen Sie so viel wie möglich vom Überstand mit einer Pipettenspitze und waschen Sie das Pellet mit Kernwaschpuffer.
- Fügen Sie 800 μL des Kernwaschpuffers hinzu und drehen Sie die Röhrchen vorsichtig um, um das Pellet wieder zu suspendieren. Drehen Sie das Rohr erneut für 4 min bei 300 rcf bei 4 °C.
- Führen Sie insgesamt 3 Wäschen durch.
- (Optional) Stellen Sie die Kerne unter einem Mikroskop für die DAPI-Färbung dar.
- Übertragen Sie 100 μL Kernsuspension in den Kernwaschpuffer aus Schritt 2.11. zu einer neuen 1,5 ml Röhre. 900 μL Kernwaschpuffer und 2 μL DAPI-Stammlösung (1 mg/ml) hinzufügen, um eine endgültige Arbeitskonzentration von 2 μg/ml für DAPI zu erreichen. Inkubieren Sie die Röhre im Dunkeln für 30 min bei Raumtemperatur.
- Nach dem Färben 4 min bei 300 rcf bei 4 °C zentrifugieren, um die Kerne zu sammeln.
- Entfernen Sie so viel wie möglich vom Überstand mit einer Pipettenspitze. 3 mal mit 800 μL des Kernwaschpuffers waschen.
- Entfernen Sie so viel wie möglich vom Überstand und suspendieren Sie die Kerne mit 100 μL Kernwaschpuffer.
- Stellen Sie die Kerne unter einem Fluoreszenzmikroskop mit dem DAPI-Kanal dar.
- Kombinieren Sie die Kerne aus zwei Röhrchen (~ 50 μL Kernvolumen in jeder 1,5 mL Röhre). Zentrifuge für 4 min bei 300 rcf bei 4 °C. Entfernen Sie so viel wie möglich vom verbleibenden Puffer mit einer Pipettenspitze.
3. Antikörper-Inkubation
- Resuspendieren Sie jeweils 50 μL Kerne in einem 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml Antikörperpuffer.
- Richten Sie die folgenden Reaktionen in 1,5-ml-Röhrchen ein: zwei biologische Replikate von IgG-Kontrollgruppen mit 150 μL Kernen (~ 1 μg Chromatin) und 2 μL IgG (1 mg/ml) in jeder Röhre, zwei biologische Replikate von H3K4me3-Assay-Gruppen mit 150 μL Kernen und 2 μL Anti-H3K4me3-Antikörper (1 mg/ml) in jeder Tube.
- Mischen Sie die Lösung vorsichtig und lassen Sie die Röhrchen auf einem horizontalen Schüttler für die Hybridisierung über Nacht bei 4 ° C und 12 U / min.
- Die Zentrifuge auf 4 °C vorkühlen. Bereiten Sie frischen 50 ml Immunpräzipitations-Waschpuffer (IP) (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM Spermidin, Proteaseinhibitor-Cocktail 0,1%, 0,05% mit Digitonin) in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen vor. Lassen Sie die Röhre auf Eis sitzen.
- Zentrieren Sie die Röhrchen für 4 min bei 300 rcf bei 4 °C. Entfernen Sie den Antikörperpuffer aus jedem Röhrchen.
- 800 μL IP-Waschpuffer in jedes Röhrchen geben und vorsichtig mischen. Lassen Sie die Rohre 5 min bei Raumtemperatur und 12 U/min auf einem horizontalen Schüttler.
- Nach dem Waschen zentrifugieren Sie die Röhrchen für 4 min bei 300 rcf bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze.
HINWEIS: Um eine Störung des Kernpellets zu vermeiden, lassen Sie ~ 50-80 μL des Puffers mit den Kernen liegen. - Wiederholen Sie die Schritte 3.6.-3.7. zwei weitere Male.
- Nach der dritten Wäsche 2 min bei 300 rcf bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den verbleibenden Puffer so weit wie möglich.
4. Transposase-Inkubation
- Machen Sie frischen 1 ml Transposase-Inkubationspuffer (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM Spermidin, Proteasehemmer-Cocktail 0,1%, 0,05% mit Digitonin), indem Sie 1 ml des IP-Waschpuffers mit 30 μL von 5 M NaCl mischen.
- Um die Tn5-Transposasemischung für die Inkubation vorzubereiten, fügen Sie 1 μL der Transposase zu jeweils 150 μL des Transposase-Inkubationspuffers hinzu.
HINWEIS: Bereiten Sie die Transposase-Lösungsmischung zuerst entsprechend der Anzahl der Reaktionen vor und fügen Sie dann jedem Röhrchen ein Aliquot von 150 μL hinzu. - Resuspendieren Sie die Kerne mit 150 μL Transposaselösung.
- Lassen Sie die Rohre bei 12 U / min für 2-3 h bei Raumtemperatur auf einem horizontalen Schüttler und mischen Sie alle 10-15 min.
- Nach der Transposase-Inkubation zentrifugieren Sie die Röhrchen für 4 min bei 300 rcf bei 4 °C. Entfernen Sie den Transposase-Inkubationspuffer in jedem Röhrchen.
- Waschen Sie die Schläuche mit IP-Waschpuffer. Dazu fügen Sie jedem Röhrchen 800 μL IP-Waschpuffer hinzu, mischen Sie vorsichtig und lassen Sie die Röhrchen bei 12 U / min für 5 min bei Raumtemperatur auf einem horizontalen Shaker.
- Zentrifuge für 4 min bei 300 rcf bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.6.-4.7. zwei weitere Male.
- Nach der dritten Wäsche 2 min bei 300 rcf bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den verbleibenden Puffer so weit wie möglich.
5. Tagmentierung
- Machen Sie 2 ml des Tagmentationspuffers (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM Spermidin, Proteaseinhibitor-Cocktail 0,1%, 10 mM MgCl2, 0,05% mit Digitonin) frisch, indem Sie 2 ml IP-Waschpuffer mit 60 μL 5 M NaCl und 20 μL 1 M MgCl2 mischen.
- Resuspendieren Sie die Kerne mit 300 μL Tagmentationspuffer.
- Mischen Sie die Lösung und inkubieren Sie sie in einem 37 °C warmen Wasserbad für 1 h zur Tagmentation.
- Stoppen Sie die Tagmentation mit 10 μL 0,5 M EDTA (Endkonzentration ~15 mM) und 30 μL von 10% SDS (Endkonzentration 1%).
6. DNA-Extraktion und NGS-Bibliotheksaufbau
- Fügen Sie 300 μL CTAB-DNA-Extraktionspuffer wie beschrieben hinzu7. Die Röhrchen in einem 65 °C warmen Wasserbad für 30 min inkubieren. Invertieren, um alle ~ 10 Minuten zu mischen.
- 600 μL Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25:24:1) in jede Tube geben. Gründlich mischen.
- Vorzentrifugieren Sie die Phase-Lock-Gelröhrchen für 2 min bei 13.000 rcf bei 4 °C. Übertragen Sie die obige Lösung auf Phase-Lock-Gelröhrchen.
- Zentrifuge für 10 min bei 13.000 rcf bei 4 °C.
- Übertragen Sie den Überstand (~600 μL) auf eine neue 1,5 mL Röhre.
- Fügen Sie 600 μL Chloroform zu jedem Röhrchen hinzu. Gründlich mischen.
- Zentrifuge für 10 min bei 13.000 rcf bei 4 °C.
- Übertragen Sie den Überstand (~600 μL) auf ein neues 1,5 ml Röhrchen.
- 12 μL 100% Ethanol und 2 μL GlycoBlue Coprecipitant hinzufügen. Gründlich mischen und bei -20 °C für 1 h lagern.
- Zentrifuge für 10 min bei 13.000 rcf bei 4 °C.
- Dekantieren Sie den Überstand. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 75% (v/v) Ethanol und zentrifugieren Sie für 5 min bei 13.000 rcf bei 4 °C.
- Dekantieren Sie den Überstand. Das DNA-Pellet an der Luft trocknen und die DNA in 25 μL ddH2O resuspendieren.
- Richten Sie die PCR-Reaktion wie folgt ein. Für insgesamt 50 μL Reaktion fügen Sie 24 μL DNA, 11 μL ddH2O, 10 μL 5x TAE-Puffer, 2 μL P5-Primer (10 μM), 2 μL P7-Primer (10 μM) und 1 μL TruePrep Amplify Enzym hinzu. PCR-Programm: 72 °C für 3 min, 98 °C für 30 s; dann 14 Zyklen von 98 °C für 30 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 30 s, gefolgt von 72 °C für 5 min.
HINWEIS: Die ersten 72 °C für 3 min zur Verlängerung können nicht übersprungen werden. Eine Überamplifikation der Bibliothek wird zu einem hohen Niveau an PCR-Duplikaten im NGS führen. Beginnen Sie mit 12-14 PCR-Zyklen in der PCR-Reaktion für H3K4me3, wenn ~ 1 μg Chromatin in jeder Reaktion verwendet werden. - Laden Sie 2 μL der PCR-Produkte auf 1,5% Agarosegel für die Elektrophorese.
- Reinigen Sie die PCR-Produkte mit kommerziellen DNA-Reinigungsmagnetkügelchen.
- Quantifizieren Sie die Bibliothek mit einem Fluorometer und einer Agarosegelelektrophorese.
HINWEIS: Die effektive Konzentration der Bibliothek sollte >2 nM durch qPCR betragen, um eine gute Qualität zu gewährleisten. - Führen Sie Next-Generation-Sequencing (NGS) und Datenanalysen durch.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt den CUT&Tag-Workflow. Abbildung 2 zeigt die DAPI-Färbung der intakten Kerne. Ziel des Schrittes "Nuklei-Isolierung" war es, die intakten Kerne in ausreichender Menge für die anschließende CUT&Tag-Reaktion zu erhalten. Abbildung 3 zeigt die Agarosegelelektrophorese von PCR-Produkten. Die IgG-Negativkontrolle wird parallel zum Aufbau des Experiments benötigt. Im Vergleich zur IgG-Kontrollgruppe reichte der Großteil der DNA-Fragmente, die mit H3K4me3-Antikörperproben gezogen wurden, zwischen ~ 280 und 500 Basenpaaren. Abbildung 4 zeigt die resultierende Next-Generation-Sequenzierung für den Anti-H3K4me3-Antikörper im Vergleich zu den IgG-Negativkontrollgruppen.
Abbildung 1: Der Workflow von CUT&Tag. Diese Figur wurde von Tao et al.4 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: DAPI-Färbung intakter Kerne, die aus Baumwollblättern isoliert wurden. Maßstabsleiste = 20 μM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Agarosegelelektrophorese von 2 μL PCR-Produkten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentativer IGV-Screenshot für H3K4me3-Signale. (A) Repräsentative IGV-Übersicht über CUT&Tag-Signale in einer großen Genomregion. ~1500 kb Genomregionen wurden zufällig ausgewählt. (B) Repräsentativer IGV-Screenshot für Gene mit unterschiedlichen Expressionsniveaus zeigte eine hohe Auflösung der CUT&Tag-Signale. Es wurden die normalisierten bigWig-Dateien verwendet, die aus bamCompare durch den Vergleich der Behandlungs-Bam-Datei (CUT&Tag Anti-H3K4me3-Reaktion) und der Kontroll-Bam-Datei (IgG) generiert wurden. TPM, Transkripte pro Kilobasis des Exon-Modells pro Million zugeordneter Lesevorgänge. Diese Figur wurde von Tao et al.4 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Primer-Sequenzen Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Puffer- und Lösungsrezepte Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Hier haben wir CUT & Tag beschrieben, eine Technologie zur Generierung von DNA-Bibliotheken mit hoher Auflösung und außergewöhnlich niedrigem Hintergrund unter Verwendung einer kleinen Anzahl von Zellen mit einem vereinfachten Verfahren im Vergleich zur Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP). Unser Erfolg mit der H3K4me3-Profilierung in Baumwollblättern legt nahe, dass CUT&Tag, das ursprünglich für tierische Zellen entwickelt wurde, auch für Pflanzenzellen verwendet werden kann. Sowohl das Tris-Puffersystem, das üblicherweise für den ChIP-Assay8 verwendet wird, als auch das HEPES-Puffersystem, das für die CUT&Tag-Arbeit von Tieren für CUT&Tag unter Verwendung von Pflanzenkernen4,9 verwendet wird. Die Isolierung intakter Pflanzenkerne ist der entscheidende Schritt für die erfolgreiche Anwendung von CUT&Tag in Pflanzen. In der zuvor berichteten Methodik zur Zellkernisolierung4 wurde die Lösung von gemahlenem Gewebe vor der Zelllyse durch zwei Schichten Miracloth gefiltert. Wir fanden heraus, dass die Effizienz der Gewinnung angemessener Kerne bei der Verwendung von relativ gealterten Blättern (z. B. Blätter von 2 Monate alten Baumwollpflanzen) und Baumwollfasern (z. B. 20-DPA-Fasern) reduziert ist, da Miracloth den größten Teil des geschliffenen Gewebes zurückhält. In diesem Videoprotokoll wurde die Isolierung der Pflanzenkerne optimiert, indem das Zelllysat durch ein 500-Mesh-Edelstahlsieb (20 μM Porengröße) gefiltert wurde. Diese veränderte Operation verbesserte signifikant die Effizienz der Entfernung größerer Gewebeablagerungen und der Gewinnung geeigneter Kerne für die nachfolgende Reaktion.
Nach der PCR für den Bibliotheksaufbau (Schritt 6.13.) können die DNA-Fragmente gereinigt und anschließend mittels NGS profiliert werden. Wenn die IgG-Kontrollgruppe jedoch auch eine Anreicherung in kleinen Fragmenten darstellt, deutet dies auf einen starken Hintergrund des zufälligen DNA-Schneidens durch Transposase hin, das durch beschädigte Kerne oder unzureichendes Waschen zur Entfernung von ungebundenen Antikörpern oder Transposase verursacht werden kann. In diesem Fall wurden die parallelen Proben für spezifische Antikörper für weiteres NGS nicht empfohlen.
Vor kurzem wurde Single-Cell CUT&Tag durch Anpassung der tröpfchenbasierten 10x Genomics Single-Cell ATAC-seq-Plattform entwickelt und bei der Profilierung von H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac und H3K36me3 Histonmodifikationen angewendet. In einer Studie zur Chromatinbelegung des Transkriptionsfaktors OLIG2 lieferte die Cohesin-Komplexkomponente RAD21 im Gehirn der Maus einzigartige Einblicke in epigenomische Landschaften im zentralen Nervensystem6. So kann CUT&Tag angewendet werden, um die epigenomischen Landschaften sowohl auf die Histonmodifikation als auch auf die spezifischen TFs mit geringen Eingangsanforderungen9 zu untersuchen, selbst auf Einzelzellebene6. Diese Anwendungen von CUT&Tag deuten darauf hin, dass die Untersuchung der epigenetischen Regulation von Pflanzen in koordinierenden Genfunktionsnetzwerken während der Dynamik von Entwicklungs- und Umweltreaktionen im zeitlichen und räumlichen Muster präzise sein kann.
CUT&Tag ist eine Methode, die sich noch in Entwicklungsprozessen befindet und Probleme aufweist, die angegangen werden müssen. Für die Transkriptionsfaktoren, die nicht reichlich exprimiert werden oder schwach, vorübergehend oder indirekt an Chromatin gebunden sind10, müssen die Unterschiede zwischen vernetzten und nativen Kernen in CUT&Tag verglichen werden. Die CUT&Tag-Strategie für das Profiling mit Transkriptionsfaktoren bei geringer Häufigkeit ist technisch immer noch eine Herausforderung. Darüber hinaus funktionieren aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Proteinepitopen die meisten ChIP-Antikörper, die für die Arbeit mit Vernetzungsbedingungen validiert wurden, möglicherweise nicht gut mit nativen Bedingungen in CUT & Tag; Die Sensitivität und Spezifität von Antikörpern muss validiert werden. Darüber hinaus hat die in CUT&Tag verwendete Tn5-Transposase eine hohe Affinität zu offenen Chromatinregionen11, so dass CUT&Tag zu Verzerrungen führen könnte, die auch in zukünftigen Studien angesprochen werden müssen.
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Disclosures
Alle Autoren haben keine Interessenkonflikte mit einem Unternehmen, das eines der oben genannten Produkte handelt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) und Fundamental Research Funds für die Central Universities, das Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), die Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) und das JCIC-MCP-Projekt finanziell unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
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