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Neuroscience

चूहों में मॉडलिंग स्ट्रोक: फोकल कॉर्टिकल घाव फोटोथ्रोम्बोसिस द्वारा

Published: May 6, 2021 doi: 10.3791/62536
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Institute for Stroke and Dementia Research, LMU Munich, 2Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy)

Summary

यहां वर्णित फोटोथ्रोम्बोटिक स्ट्रोक मॉडल है, जहां एक स्ट्रोक एक फोटोसेंसिटिव डाई के प्रशासन के बाद लेजर रोशनी का उपयोग करके स्थायी माइक्रोवैस्कुलर ऑक्लुसेशन को प्रेरित करके बरकरार खोपड़ी के माध्यम से उत्पादित किया जाता है।

Abstract

स्ट्रोक मौत का एक प्रमुख कारण है और विकसित देशों में वयस्क विकलांगता का अधिग्रहण किया । उपन्यास चिकित्सकीय रणनीतियों के लिए व्यापक जांच के बावजूद, स्ट्रोक रोगियों के लिए सीमित चिकित्सीय विकल्प रहते हैं। इसलिए, स्ट्रोक के बाद की सूजन, एंजियोजेनेसिस, न्यूरोनल प्लास्टिसिटी और पुनर्जनन जैसे रोगविज्ञानी रास्तों के लिए अधिक शोध की आवश्यकता है। मस्तिष्क की जटिलता को पुन: पेश करने के लिए इन विट्रो मॉडल की असमर्थता को देखते हुए, प्रयोगात्मक स्ट्रोक मॉडल इन तंत्रों के लिए उपन्यास दवा लक्ष्यों के विश्लेषण और बाद में मूल्यांकन के लिए आवश्यक हैं। इसके अलावा, तथाकथित प्रतिकृति संकट से उबरने के लिए सभी प्रक्रियाओं के लिए विस्तृत मानकीकृत मॉडल की तत्काल आवश्यकता है। इम्यूनोस्ट्रोक अनुसंधान कंसोर्टियम के भीतर एक प्रयास के रूप में, गुलाब बंगाल के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन का उपयोग करके एक मानकीकृत फोटोथ्रोम्बोटिक माउस मॉडल और 561 एनएम लेजर के साथ बरकरार खोपड़ी की रोशनी का वर्णन किया गया है। यह मॉडल आक्रामक सर्जरी के बिना मस्तिष्क के किसी भी कॉर्टिकल क्षेत्र में आवंटन के साथ चूहों में स्ट्रोक के प्रदर्शन की अनुमति देता है; इस प्रकार, मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों में स्ट्रोक के अध्ययन को सक्षम करना। इस वीडियो में हिस्टोलॉजिकल एनालिसिस के साथ-साथ फोटोथ्रोम्बोटिक मॉडल में स्ट्रोक इंडक्शन के सर्जिकल तरीकों का प्रदर्शन किया गया है।

Introduction

इस्कीमिक स्ट्रोक मौत का एक प्रमुख कारण बना हुआ है और 21वीं शताब्दी में विकसित देशों में वयस्क विकलांगता प्राप्त की गईहै,जो दुनिया भर में 2017 में लगभग 27 मिलियन मौतों के लिए है। यहां तक कि वैज्ञानिक समुदाय के अपार प्रयासों के साथ, कुछ उपचार उपलब्ध हैं । इसके अलावा, इस तरह के उच्च बहिष्कार मानदंडों के साथ, ये पहले से ही सीमित विकल्प कई रोगियों के लिए सुलभ नहीं हैं, जिसके परिणामस्वरूप स्ट्रोक के बाद कार्यात्मक वसूली में सुधार करने के लिए उपन्यास उपचार की तत्काल आवश्यकता होती है।

मस्तिष्क की जटिल बातचीत को दोहराने के लिए इन विट्रो मॉडल की अक्षमता को ध्यान में रखते हुए, प्रीक्लिनिकल स्ट्रोक अनुसंधान के लिए पशु मॉडल आवश्यक हैं। चूहों स्ट्रोक अनुसंधान क्षेत्र में सबसे अधिक बार इस्तेमाल किया पशु मॉडल हैं । इनमें से अधिकांश माउस मॉडल का उद्देश्य मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) के भीतर रक्त प्रवाह को अवरुद्ध करके इंफार्क्शन को प्रेरित करना है क्योंकि अधिकांश मानव स्ट्रोक घाव एमसीए क्षेत्र2में स्थित हैं। हालांकि इन मॉडलों को बेहतर मानव स्ट्रोक घावों का पुनर्पूंजीकरण, वे उच्च इनफार्ट वॉल्यूम परिवर्तनशीलता के साथ संवहनी सर्जरी शामिल है ।

19773में फोटोथ्रोम्बोटिक मॉडल के रोसेनब्लम और अल-सब्बन के प्रस्ताव के बाद से, और बाद में इस मॉडल का उपयोग इस मॉडल के लिए चूहों वाटसन एट अल4,यह व्यापक रूप से इस्कीमिक स्ट्रोक अनुसंधान5,6में इस्तेमाल किया गया है । फोटोथ्रोम्बोटिक स्ट्रोक मॉडल पहले रक्त प्रवाह में इंजेक्ट किए गए हल्के-संवेदनशील डाई के फोटोएक्टिवेशन के परिणामस्वरूप एक स्थानीय और परिभाषित कॉर्टिकल इनफार्क को प्रेरित करता है। यह प्रकाश के संपर्क में आने वाले क्षेत्रों में जहाजों के स्थानीय थ्रोम्बोसिस का कारण बनता है। संक्षेप में, इंजेक्शन फोटोसेंसिटिव डाई से प्रकाश के संपर्क में आने पर, एंडोथेलियल सेल झिल्ली की स्थानीयकृत ऑक्सीडेटिव चोट प्रेरित होती है, जिससे प्लेटलेट एकत्रीकरण और थ्रोम्बस गठन होता है, जिसके बाद सेरेब्रल रक्त प्रवाह7के स्थानीय व्यवधान होते हैं।

इस तकनीक का मुख्य लाभ निष्पादन की सादगी और वांछित क्षेत्र में घाव को निर्देशित करने की संभावना में रहता है। अन्य प्रयोगात्मक स्ट्रोक मॉडल के विपरीत, फोटोथ्रोम्बोटिक स्ट्रोक मॉडल करने के लिए मामूली सर्जिकल विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है क्योंकि घाव बरकरार खोपड़ी की रोशनी के माध्यम से प्रेरित होता है। इसके अलावा, अच्छी तरह से सीमित सीमाएं(चित्रा 2A और चित्रा 5B)और एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र में घाव को प्रेरित करने के लचीलेपन से इस्कीमिक या अक्षुण्ण कॉर्टिकल क्षेत्र8के भीतर सेलुलर प्रतिक्रियाओं के अध्ययन की सुविधा मिल सकती है। इन कारणों से, यह दृष्टिकोण कॉर्टिकल प्लास्टिसिटी के सेलुलर और आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए उपयुक्त है।

पिछले कुछ दशकों में, अनुसंधान समूहों के बीच प्रजनन की कमी के बारे में बढ़ती चिंता तथाकथित प्रतिकृति संकट9गढ़ा गया है । 201510में प्रथम प्रीक्लिनिकल यादृच्छिक नियंत्रित मल्टीसेंटर परीक्षण अध्ययन के समन्वय के बाद, पूर्व नैदानिक अनुसंधान में सुधार करने के लिए एक प्रस्तावित उपकरण11,12,13,यह पुष्टि की गई कि स्वतंत्र प्रयोगशालाओं से प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के बीच प्रजनन क्षमता में विफल रहने का एक कारण प्रयोगात्मक स्ट्रोक मॉडल और परिणाम मापदंडों14के पर्याप्त मानकीकरण की कमी थी। तदनुसार, जब इम्यूनोस्ट्रोक कंसोर्टियम (https://immunostroke.de/) की स्थापना की गई थी, एक सहयोग जिसका उद्देश्य स्ट्रोक वसूली के मशीनी सिद्धांतों में अंतर्निहित मस्तिष्क-प्रतिरक्षा बातचीत को समझना है, तो प्रत्येक अनुसंधान समूह के बीच सभी प्रयोगात्मक स्ट्रोक मॉडल का मानकीकरण आवश्यक था।

यहां वर्णित फोटोथ्रोम्बोटिक मॉडल को शामिल करने के लिए मानकीकृत प्रक्रिया है जैसा कि उपर्युक्त अनुसंधान कंसोर्टियम में उपयोग किया जाता है। संक्षेप में, एक जानवर एनेस्थेटिक्स से गुजरा, एक गुलाब बंगाल इंजेक्शन (10 μL/g) इंट्रापरिटोनली प्राप्त किया, और बरकरार खोपड़ी, ब्रेग्मा से 3 मिमी छोड़ दिया, तुरंत 20 मिनट(चित्रा 1)के लिए एक ५६१ एनएम लेजर द्वारा प्रकाशित किया गया था । इसके अतिरिक्त, इस मॉडल में स्ट्रोक परिणाम का विश्लेषण करने के लिए एक संबंधित हिस्टोलॉजिकल और व्यवहार विधि की सूचना दी जाती है। सभी विधियां प्रयोगशाला में विकसित और उपयोग की जाने वाली मानक परिचालन प्रक्रियाओं पर आधारित हैं।

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Protocol

इस वीडियो में सूचित प्रयोग प्रयोगात्मक जानवरों के उपयोग के लिए राष्ट्रीय दिशा-निर्देशों के अनुसार किए गए थे, और प्रोटोकॉल को जर्मन सरकारी समितियों (रेजियरुंग वॉन ओबरबायर्न, म्यूनिख, जर्मनी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस अध्ययन में इस्तेमाल चूहों पुरुष C57Bl/6J चूहों, 10-12 सप्ताह पुराने थे, और चार्ल्स नदी जर्मनी द्वारा भेजा । जानवरों को नियंत्रित तापमान (22 डिग्री सेल्सियस ± 2 डिग्री सेल्सियस) के तहत रखा गया था, जिसमें 12 घंटे का प्रकाश-अंधेरा चक्र अवधि और पैलेट किए गए भोजन और पानी विज्ञापन लिबिटम तक पहुंच थी।

1. सामग्री और उपकरणों की तैयारी

  1. 10 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए गुलाब बंगाल को 0.9% खारा समाधान में भंग करें। ऑपरेशन क्षेत्र को गर्म रखने के लिए गर्मी कंबल को कनेक्ट करें और संज्ञाहरण के दौरान माउस शरीर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
  2. कैंची, संदंश, कपास के टुकड़े, dexpanthenol आंख मरहम, और सीवन सामग्री तैयार करें। ऑपरेशन क्षेत्र हाइड्रेटेड बनाए रखने के लिए खारा समाधान (सुई के बिना) के साथ एक सिरिंज तैयार करें। एनेस्थीसिया गैस (100% O2+ आइसोफलुने) तैयार करें।

2. जानवर की तैयारी

  1. सर्जरी से पहले एनाल्जेसिया 30 मिनट इंजेक्ट करें (4 मिलीग्राम/किलो कारप्रोफेन और ०.१ मिलीग्राम/किलो बुप्रेनोरफिन) ।
  2. गुलाब बंगाल की खुराक को समायोजित करने के लिए माउस शरीर के वजन को रिकॉर्ड करें इंजेक्शन (10 μL/g यानी, 100 μg/g)।
  3. शरीर के सहज आंदोलन और वाइब्रिसे बंद हो जाता है जब तक इसे एनेस्थेटाइज करने के लिए 4% की आइसोफ्लुनेव प्रवाह दर के साथ प्रेरण कक्ष में माउस रखें।
  4. माउस को स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में स्थानांतरित करें और इसे अपनी नाक के साथ एनेस्थीसिया मास्क में प्रवण स्थिति में रखें। जानवर को ठीक करें और 1 मिनट के लिए 4% पर आइसोफ्लुन एकाग्रता बनाए रखें। फिर 2% पर आइसोफ्लुन एकाग्रता को कम करें और बनाए रखें।
  5. धीरे-धीरे सर्जिकल प्रक्रियाओं में तापमान की निगरानी करने के लिए गुदा जांच डालें। माउस शरीर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने के लिए संबंधित प्रतिक्रिया-नियंत्रित हीटिंग पैड सेट करें।
  6. दोनों आंखों पर डिप्रेन्थेनॉल आई मरहम लगाएं और कीटाणुनाशक एजेंट के साथ त्वचा और आसपास के फर को साफ करें।

3. फोटोथ्रोम्बोसिस मॉडल

  1. एक 2.0-2.5 सेमी देशांतर चीरा और खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए वापस लेना। घाव जटिलताओं से बचने के लिए एक ही कटौती के साथ खोपड़ी जोखिम प्रदर्शन करें।
  2. पेरिओस्टेम को धीरे-धीरे कपास के साथ निकालें और कोरोनल टांके की पहचान करें।
  3. सुरक्षात्मक चश्मे पर रखो, 561 एनएम लेजर पर स्विच करें और ब्रेग्मा +3 मिमी बाएं चिह्नित करें।
  4. लेजर बंद करें, ऊपर उल्लिखित चिह्नित निर्देशांक पर रखे 4 मिमी व्यास छेद के साथ एक स्टीकर संलग्न करें।
  5. बंगाल रोज (10 μL/g) के साथ माउस इंजेक्ट करें, इंट्रापेरिटेली। लेजर बीम को खोपड़ी से 4-5 सेमी पर रखें, 561 एनएम लेजर पर स्विच करें और खोपड़ी को 20 मिनट के लिए रोशन करें।
  6. पुनर्हाइड्रेट करने, घाव को सीवन करने के लिए खोपड़ी पर 0.9% नमकीन की दो बूंदें लगाएं, और संज्ञाहरण से उबरने के लिए जानवर को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक रिकवरी कक्ष में रखें। 1 घंटे के बाद, चूहों को तापमान नियंत्रित कमरे में उनके पिंजरों में वापस करें।
  7. सर्जरी के बाद 3 दिनों के लिए हर 12 घंटे में एनाल्जेसिया इंजेक्ट करें (4 मिलीग्राम/किलो कारप्रोफेन और ०.१ मिलीग्राम/किलो बुप्रेनोरफिन) ।

4. शाम ऑपरेशन

  1. चरण 4.1.1 और 4.1.2 में वर्णित शाम संचालन की दो अलग-अलग प्रक्रियाओं को पूरा करें।
    1. ऊपर वर्णित ऑपरेशन के समान सभी प्रक्रियाओं को करें। लेजर पर स्विच किए बिना गुलाब बंगाल इंजेक्ट करें। संज्ञाहरण के तहत 20 मिनट के बाद, जानवरों को उनके पिंजरों में वापस आने से पहले, ठीक होने के लिए 1 घंटे के लिए रिकवरी चैंबर में रहने की अनुमति दें।
    2. लेजर पर स्विच करते हुए, ऊपर वर्णित ऑपरेशन के समान सभी प्रक्रियाओं को करें। रोज बंगाल का इंजेक्शन न लगाें। लेजर रोशनी के 20 मिनट के बाद, जानवरों को संज्ञाहरण से उबरने के लिए 1 घंटे के लिए वसूली कक्ष में रहने की अनुमति, इससे पहले कि उनके पिंजरों में वापस आ जा रहा है ।

5. लेजर स्पेक्टल

  1. ऑपरेशन क्षेत्र को गर्म रखने और संज्ञाहरण के दौरान माउस शरीर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने के लिए गर्म कंबल को कनेक्ट करें।
  2. माउस को 4% की आइसोफ्लोरैन प्रवाह दर के साथ इंडक्शन चैंबर में रखें ताकि इसे तब तक एनेस्थेटाइज किया जा सके जब तक कि शरीर का सहज आंदोलन और वाइब्रेसे बंद न हो जाए और फिर माउस को स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में स्थानांतरित न करे।
  3. माउस को अपनी नाक के साथ एक प्रवण स्थिति में संज्ञाहरण मास्क में रखें। जानवर को ठीक करें और 1 मिनट के लिए 4% पर आइसोफ्लुन एकाग्रता बनाए रखें। टी मुर्गी इसे 2% पर कम और बनाए रखें।
  4. धीरे-धीरे सर्जिकल प्रक्रियाओं में तापमान की निगरानी करने के लिए गुदा जांच डालें। माउस शरीर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने के लिए संबंधित प्रतिक्रिया-नियंत्रित हीटिंग पैड सेट करें और दोनों आंखों पर dexpanthenol आंख मरहम लागू करें। एक कीटाणुनाशक एजेंट के साथ त्वचा और आसपास के फर को साफ करें।
  5. एक 2.0-2.5 सेमी देशांतर चीरा और खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए वापस लेना। घाव जटिलताओं से बचने के लिए एक ही कटौती के साथ खोपड़ी जोखिम प्रदर्शन करें।
  6. लेजर धब्बे के नीचे स्टरोटेटिक फ्रेम रखें और एक तेज छवि प्राप्त करने के लिए ऊंचाई को समायोजित करें। कपाल खिड़की पर लेजर स्पेक्टल परफ्यूजन इमेजिंग (एलएसआई) कैमरे पर ध्यान दें। उच्च रिज़ॉल्यूशन लेजर स्पेक्टल इमेजिंग (एलएसआई) कैमरा सिस्टम को कॉन्फ़िगर करें जैसा कि पहले15वर्णित है।
  7. 1 सेमी की कार्य दूरी पर 21 छवियों/एस की फ्रेम दर के साथ 785 एनएम तरंगदैर्ध्य और 80 मिलियन स्वW लेजर का उपयोग करके 1 सेमी x 1 सेमी क्षेत्र से डेटा प्राप्त करें।
  8. इमेजिंग के बाद, रीहाइड्रेट करने के लिए खोपड़ी में 0.9% नमकीन की दो बूंदों को लागू करें, घाव को सीवन करें और जानवर को 1 घंटे के लिए संज्ञाहरण से ठीक करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक रिकवरी कक्ष में रखें। 1 घंटे के बाद, चूहों को तापमान नियंत्रित कमरे में उनके पिंजरों में वापस करें।

6. न्यूरोस्कोर

नोट: न्यूरोलॉजिकल घाटे के विश्लेषण के लिए, 1997 में एक्केनस्टीन एट अल द्वारा प्रकाशित एक संशोधित न्यूरोलॉजिकल पैमाने का उपयोग15किया जाता है।

  1. सामान्य(टेबल 1)और फोकल डेफिसिट(टेबल 2)के लिए जानवरों को स्कोर करें। यह समग्र पैमाना 0 (कोई घाटा नहीं) से लेकर 46 (गंभीर हानि) तक है।
  2. प्रत्येक दिन एक ही समय पर न्यूरोस्कोर करें और तटस्थ गंध रखने के लिए सर्जिकल कपड़ों का उपयोग करें।
  3. परीक्षण से पहले एक खुले पिंजरे के साथ कमरे में 30 मिनट के लिए चूहों को आदत दें और उन्हें 30 एस के लिए प्रत्येक आइटम का निरीक्षण करने की अनुमति दें।

7. परफ्यूजन

  1. पीबीएस-हेपरिन (2 यू/एमएल) युक्त 20 एमएल सिरिंज तैयार करें और गुरुत्वाकर्षण-चालित परफ्यूजन को सुविधाजनक/सुनिश्चित करने के लिए इसे बेंच से 1 मीटर ऊपर रखें ।
  2. केटामाइन और जाइलाज़ीन (120/16 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन, क्रमशः) के इंट्रापीरिटी 100 माइक्रोल इंजेक्ट करें। 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें और सहज शरीर आंदोलन और वाइब्रिसे की समाप्ति की पुष्टि करें।
  3. जानवर को एक रीढ़ की स्थिति में ठीक करें और पेट के शरीर की सतह को 100% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित करें। पेट में 3 सेमी लंबा चीरा बनाएं; दिल को पूरी तरह से कल्पना करने के लिए डायाफ्राम और पसलियों को काट लें।
  4. सही एट्रियम में एक छोटा सा चीरा बनाएं और परफ्यूजन कैनुला को बाएं वेंट्रिकल में डालें और 20 एमएल पीबीएस-हेपरिन के साथ परफ्यूजन करें।
  5. परफ्यूजन के बाद, जानवर को काटना और मस्तिष्क को हटा दें, सूखी बर्फ का उपयोग करके इसे फ्रीज करें और आगे के उपयोग तक उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

8. इनफाक्टिट वॉल्यूम्री

  1. क्रायोसेक्शनिंग: मस्तिष्क को हर 120 माइक्रोन मीटर में 20 माइक्रोन मोटी धाराओं में क्रायोस्टेट पर क्रमिक रूप से काटें और स्लाइड्स पर माउंट करें। आगे की प्रोसेसिंग तक स्लाइड्स को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. क्रेसिल वायलेट (सीवी) धुंधला
    1. धुंधला समाधान तैयार करने के लिए, 500 मिलीएल में 0.5 ग्राम सीवी एसीटेट मिलाएं एच2ओ हलचल और गर्मी (60 डिग्री सेल्सियस) जब तक क्रिस्टल भंग न हो जाएं। समाधान को ठंडा होने दें और इसे एक अंधेरी बोतल में स्टोर करें। हर उपयोग से पहले 60 डिग्री सेल्सियस और फिल्टर (पेपर फिल्टर) को फिर से गरम करें।
    2. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड सूखी । उन्हें 15 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में रखें, इसके बाद 1 मिनट के लिए 70% इथेनॉल और बाद में 1 मिनट के लिए 50% इथेनॉल में रखें।
    3. स्लाइड्स को डिस्टिल्ड वॉटर में 2 मिनट के लिए रखें, डिस्टिल्ड वॉटर को रिफ्रेश करें और स्लाइड्स को फिर से 1 मिनट के लिए पानी में रखें । इसके बाद 60 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए पहले से गर्म धुंधला समाधान में स्लाइड रखें। स्लाइड्स को 1 मिनट के लिए आसुत पानी में दो बार धोएं।
    4. 2 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में स्लाइड रखें। फिर उन्हें 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में रखें, 100% इथेनॉल को ताज़ा करें और स्लाइड को 2 मिनट के लिए फिर से 100% इथेनॉल में रखें। बाद में, एक बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड कवर ।
    5. विश्लेषण: स्लाइड स्कैन करें और एडेमा के लिए सही करने के लिए स्वानसन विधि16 द्वारा अप्रत्यक्ष इनफार्ट वॉल्यूम का विश्लेषण करें: इस्कीमिक क्षेत्र = (इस्कीमिक क्षेत्र) - (इप्सिलाटेरल गोलार्द्ध) - (कॉन्ट्रालेटरल गोलार्द्ध))।

9. ट्यूनल धुंधला(सीटू एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट में)

  1. स्लाइड्स को सुखाएं, पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में पोस्ट-फिक्स (पीएच 7.4) आरटी में 10-20 मिनट के लिए। PBS में वॉश, प्रीकूल्ड इथेनॉल में पोस्ट-फिक्स: एसिटिक एसिड 2:1 पर -20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए।
  2. पीबीएस में धोएं और संतुलन बफर (आरटी में अधिकतम 60 मिनट तक 10 एस) लागू करें और काम करने की ताकत टीडीटी एंजाइम (आर्द्रीकृत कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे) लागू करें
  3. काम की ताकत बंद करो/धोने एंजाइम (आरटी में 10 मिनट), PBS में धोने और गरम (आरटी) काम करने की ताकत विरोधी digoxigenin conjugate (अंधेरे में आरटी में 30 मिनट) लागू करें
  4. पीबीएस में धोएं, आरटी में 5 मिनट के लिए DAPI के साथ इनक्यूबेट और फ्लोरोमाउंट मीडिया के साथ स्लाइड माउंट ।

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Representative Results

यहां वर्णित मॉडल गुलाब बंगाल इंजेक्शन और 20 मिनट के लिए बरकरार खोपड़ी रोशनी द्वारा एक फोटोथ्रोम्बोटिक स्ट्रोक मॉडल है, एक निरंतर ५६१ एनएम तरंगदैर्ध्य और फाइबर पर 25 mW उत्पादन शक्ति पर । हालांकि पूरी फोटोथ्रोम्बोटिक सर्जरी 30 मिनट तक रहता है, जानवर को कम संज्ञाहरण के तहत रखा जाता है और मस्तिष्क की क्षति मध्यम होती है। लगभग 10 मिनट उनके पिंजरों में स्थानांतरित करने के बाद, सभी जानवर जाग रहे थे, स्वतंत्र रूप से पिंजरे में जा रहे थे, और कूड़े के साथ बातचीत कर रहे थे ।

इनफारेक्ट वॉल्यूमरी स्ट्रोक प्रेरण(चित्रा 2 ए)के बाद क्रेसिल वायलेट दाग सीरियल कोरोनल मस्तिष्क अनुभाग 24 घंटे का उपयोग करके किया गया था। मतलब इनफारेक्ट वॉल्यूम 29.3 मिमी3था, जो एक मस्तिष्क गोलार्द्ध का 23% का प्रतिनिधित्व करता था। इसके अलावा, लगभग 3.5%(चित्रा 2B)के मानक विचलन के साथ इस स्ट्रोक मॉडल की परिवर्तनशीलता असाधारण रूप से कम है। घाव क्षेत्र में उपकॉर्टिकल संरचनाओं के स्नेह के बिना मोटर कॉर्टेक्स शामिल हैं।

फोटोथ्रोम्बोसिस ने एक मध्यम, दीर्घकालिक संवेदी हानि का कारण बना, जो समग्र न्यूरोस्कोर17 (चित्र 3)द्वारा इंगित किया गया था; सामान्य और फोकल घाटे को सर्जरी के 24 घंटे, 3 दिन और 7 दिन बाद मापा गया था। जनरल न्यूरोस्कोर में पांच आइटम हैं, जिनमें फर, कान, आंख, आसन और सहज गतिविधि का मूल्यांकन शामिल है, जिसमें अधिकतम स्कोर 18(तालिका 1) शामिल है। फोकल न्यूरोस्कोर में सात आइटम शामिल हैं, जिनमें शरीर की समरूपता, चाल, चढ़ाई, चक्कर व्यवहार, अग्रभाग समरूपता, अनिवार्य साइकिलिंग और मूंछ प्रतिक्रिया, 28(तालिका 2)के अधिकतम स्कोर के साथ शामिल हैं। स्ट्रोक जानवरों ने नकली संचालित जानवरों की तुलना में सर्जरी के बाद कंपोजिट न्यूरोस्कोर 24 एच में महत्वपूर्ण बदलाव किया था । ये मतभेद कायम रहे, हालांकि स्ट्रोक चूहों में समय के साथ सुधार हुआ(चित्रा 3)।

अवलोकन समय के दौरान मृत्यु दर शायद ही कभी जानवरों के 1-2% में होती है। इस रिपोर्ट में अध्ययन किए गए 10 जानवरों में से किसी को भी बाहर नहीं करना पड़ा और ये सभी 7 दिन की ऑब्जर्वेशन पीरियड से बच गए । चूहों में शरीर के वजन और तापमान में परिवर्तन की निगरानी सर्जरी के 24 घंटे, 3 दिन और 7 दिन बाद(चित्रा 4A,बी)पर की गई । आंकड़ों से पता चला है कि केवल गुलाब बंगाल + रोशनी समूह में सर्जरी के बाद शरीर के वजन और तापमान में 24 घंटे की कमी आई थी, लेकिन सर्जरी के बाद 3 दिनों में नकली संचालित जानवरों के स्तर तक बरामद किया गया ।

इस्कीमिक परिवर्तनों के एक प्रेरण की पुष्टि करने के लिए, सर्जरी के बाद 24 घंटे, जानवरों का लेजर इमेजिंग परीक्षण किया गया। एक लेजर स्पेक्टल कंट्रास्ट इमेजिंग ने 1 मिनट की अवधि के लिए कॉर्टेक्स के रक्त परफ्यूजन को मापा और प्रत्येक जानवर के लिए एक औसत रंग-कोडित चित्र प्राप्त किया गया था। यह दर्शाता है कि अकेले गुलाब बंगाल या लेजर रोशनी एक घाव का उत्पादन नहीं करती है, जबकि गुलाब बंगाल और लेजर रोशनी का एक साथ आवेदन एक संकीर्ण अल्पाभिक क्षेत्र(चित्र 5 ए)से घिरा 4 मिमी व्यास का एक गोल हाइपोपर्फ्फ्यूज्ड क्षेत्र उत्पन्न करता है। इसके अलावा, सर्जरी के बाद इनफाक्ट वॉल्यूम 24 एच के आकलन के लिए एक क्रेसिल वायलेट और ट्यूनल धुंधला होने से गुलाब बंगाल या लेजर रोशनी सर्जरी में कोई ऊतक क्षति नहीं हुई। दूसरी ओर, गुलाब बंगाल + लेजर रोशनी ने एक अच्छी तरह से सीमांकित घाव(चित्र 5बी)उत्पन्न किया।

तालिका 1: जनरल न्यूरोस्कोर। मापा पांच सामांय घाटे में से प्रत्येक के लिए, जानवरों की गंभीरता के आधार पर 0 और 4 अंक के बीच प्राप्त कर सकते हैं । इसके बाद पांच क्षेत्रों पर स्कोर को 0-18 से लेकर कुल सामान्य स्कोर प्रदान करने के लिए अभिव्यक्त किया जाता है । कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 2: फोकल न्यूरोस्कोर। मापा सात सामांय घाटे में से प्रत्येक के लिए, जानवरों की गंभीरता के आधार पर 0 और 4 अंक के बीच प्राप्त कर सकते हैं । इसके बाद पांच क्षेत्रों पर स्कोर को 0-28 से लेकर कुल सामान्य स्कोर प्रदान करने के लिए अभिव्यक्त किया जाता है । कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 1
चित्रा 1:फोटोथ्रोम्बोसिस (पीटी)। फोटोथ्रोम्बोटिक क्षेत्र का चित्रण करने वाला आरेख, ब्रेग्मा से 3 मिमी। हरी बिंदी लेजर की स्थिति को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:वॉल्यूमेट्रिक इनफार्ट विश्लेषण और इनफार्ट परिणाम 24 घंटे पीटी के बाद (ए)प्रतिनिधि क्रेसिल वायलेट दाग कोरोनल मस्तिष्क, खंड हर 120 माइक्रोन 24 घंटे पर पीटी धराशायी लाइनों के बाद घाव क्षेत्र का सीमांकन । (ख)पीटी के बाद 10 दिमाग (प्रत्येक एक व्यक्ति मस्तिष्क का प्रतिनिधित्व करने वाला प्रत्येक डॉट) का इनफाक्ट वॉल्यूम विश्लेषण । क्षैतिज लाल रेखा मतलब (29.32 मिमी3)का प्रतिनिधित्व करती है, त्रुटि सलाखों मानक विचलन (3.45 मिमी3)का संकेत देती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:पीटी के बाद कार्यात्मक घाटे के लिए न्यूरोस्कोर। समग्र न्यूरोस्कोर से पहले, 24 एच, 3 दिन, और पीटी बीएल के 7 दिन बाद = पीटी से पहले, आरबी = गुलाब बंगाल। द = 5 प्रति समूह। * पी < 0.05। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:पीटी के बाद शरीर कावजन और तापमान विश्लेषण (ए)शरीर का वजन और(बी)तापमान 24 घंटे में शाम संचालित समूहों की तुलना में पीटी जानवरों में थोड़ा कम हो गया था और पीटी बीएल = पीटी से पहले पीटी, आरबी = गुलाब बंगाल के 3 दिन बाद बरामद किया गया । n = 5 प्रति समूह। * पी < ०.०५ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:पीटी के बाद घाव की पुष्टि। (A)लेजर स्पेक्टल इमेजिंग(बी)क्रेसिल वायलेट (ऊपरी पैनल) और ट्यूनल स्टेनिंग (लोअर पैनल) ने गुलाब बंगाल के प्रशासन और बाद में लेजर रोशनी के बाद ही घाव की पुष्टि की । आरबी = गुलाब बंगाल। स्केल बार = ऊपरी पैनल बी में 1,000 माइक्रोन, स्केल बार = 20 माइक्रोन लोअर पैनल बी में कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल गुलाब बंगाल के पिछले इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ, 561 एनएम लेजर के साथ बरकरार खोपड़ी को रोशन करके फोटोथ्रोम्बोसिस के प्रयोगात्मक स्ट्रोक मॉडल का वर्णन करता है। हाल तक, इस मॉडल का उपयोग कम किया गया है, लेकिन लगातार बढ़ रहा है।

इस मॉडल में स्ट्रोक प्रेरण के दौरान मृत्यु दर अनुपस्थित है। बहिष्कार मानदंडों को पूरा करने के बाद एनेस्थिसियोलॉजिकल जटिलताओं या बलिदान के कारण ऑपरेशन के दौरान 5% से कम की समग्र मृत्यु दर उत्पन्न होती है। इस मॉडल की कम परिवर्तनशीलता और इसकी प्रजनन क्षमता को वारंट करने के लिए, निम्नलिखित अपवर्जन मानदंड सुझाए गए हैं: 1) ऑपरेशन का समय 30 मिनट से अधिक लंबा; 2) सीवन का संक्रमण; 3) घाव काटने; और 4) पीटी के बाद 24 घंटे में कोई इनफाक्ट या कोई सामने विषमता नहीं।

एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला प्रयोगात्मक स्ट्रोक मॉडल एमसीए का क्षणिक ऑक्क्यूज़ेशन है, एक सीवन फिलामेंट का उपयोग करके, जिसे आंतरिक कैरोटिड धमनी में पेश किया जाता है जब तक कि सिलिकॉन-लेपित टिप एमसीए की उत्पत्ति को कम नहीं करता है। यह मॉडल फिलामेंट को हटाकर रिफ्यूजन की अनुमति देता है और मानव नैदानिक परिदृश्य की नकल करता है, जिसमें एम्बोलिक क्लॉट18, 19के सहज या चिकित्सीय (आरटीपीए) लाइसिस के बाद मस्तिष्क रक्त प्रवाह की बहाली होती है। हालांकि, इसमें अंतिम इनफाक्ट और उच्च मृत्यु दर10की उच्च परिवर्तनशीलता के साथ एक जटिल सर्जरी शामिल है। इसके विपरीत, लेंटिकोस्ट्रिट्रियल धमनियों के एमसीए डिस्टल का स्थायी ऑक्क्यूज़ेशनधमनी 20, 21के जमाव द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जो नियोकॉर्टेक्स22में स्थानीय रूप से परिभाषित घावों को प्रेरित करता है। हालांकि इस मॉडल में मृत्यु दर कम है, लेकिन बाद में इसे23को इकट्ठा करने के लिए एमसीए पर खोपड़ी के ट्रेपनेशन द्वारा जानवर के लिए आक्रामक सर्जरी की आवश्यकता होती है। नतीजतन, वीवो स्ट्रोक अध्ययन में एक सफल और निष्पक्ष के लिए उच्च शल्य चिकित्सा कौशल की आवश्यकता होती है।

अन्य मस्तिष्क इस्केमिया मॉडल की तुलना में, इस वीडियो में किए गए फोटोथ्रोम्बोटिक मॉडल में जानवर पर कोई क्रैनियोटॉमी या बड़ी सर्जरी का लाभ नहीं है, अन्य मॉडलों के विपरीत जिसमें जटिल सर्जरी या मस्तिष्क क्रैनिओटॉमी शामिल है। इसके अलावा, मॉडल का सरल निष्पादन सर्जरी को कम समय लेने वाले प्रशिक्षण के साथ कई लोगों के लिए सुलभ बनाता है। कम मृत्यु दर, मध्यम इनफारेक्ट वॉल्यूम, और घाव को एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र में प्रेरित करने के लिए लचीलापन, मस्तिष्कउत्थान और स्ट्रोक अध्ययन24, 25,26, 27के लिए इस प्रयोगात्मक प्रतिमान के लाभ पर जोरदेतेहैं।

स्पष्ट फायदों के बावजूद, इस स्ट्रोक मॉडल की कुछ सीमाओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए। जानवर के लिए एनेस्थेटिक्स का लंबा एक्सपोजर ध्यान में रखने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक हो सकता है, क्योंकि न्यूरोप्रोटेक्शन और स्ट्रोक परिणाम पर एनेस्थेटिक्स का प्रभाव पहले से ही प्रसिद्धहै 28। यद्यपि इस शल्य प्रक्रिया की अवधि लगभग 30 मिनट लेती है, लेकिन लेजर रोशनी के 20 मिनट के दौरान जानवर के न्यूनतम हेरफेर के कारण जानवर कम एनेस्थेटिक सांद्रता के तहत हो सकता है। क्योंकि यह मॉडल मध्यम मस्तिष्क चोटों को प्रेरित करता है, केवल मामूली व्यवहार घाटे का पता लगाया जा सकता है। इस प्रकार, उच्च संवेदनशीलता और गुणात्मक परीक्षण मापदंडों के साथ अधिक उन्नत परीक्षण प्रणालियां, जैसे कुशल पहुंच परीक्षण29 और न्यूरोस्कोर17,जैसा कि यहां वर्णित है, शायद इस मॉडल में दीर्घकालिक कार्यात्मक परिणामों का पता लगाने के लिए अधिक उपयुक्त है। अंत में, प्रबुद्ध रक्त वाहिकाओं में प्लेटलेट्स के स्थायी एकत्रीकरण के कारण, कोई रिफ्यूजन प्राप्त नहीं किया जा सकता है, जो सहज थक्का लाइसिस या थेरेपी30के कारण स्ट्रोक रोगियों के पर्याप्त प्रतिशत में मनाया जाने वाला एक विशेषता है।

इसी तरह का एक फोटोट्रोम्बोटिक स्ट्रोक मॉडल 2013 में लाबाट-गेस्ट और टोमसी द्वारा प्रकाशित किया गया था, जिसमें 561 एनएम ग्रीन लेजर8के बजाय ठंडे प्रकाश लैंप का उपयोग करके पीटी प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया था। लेजर और ठंडी रोशनी दोनों स्रोतों का उपयोग गुलाब बंगाल उत्तेजन को प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है। ठंडे प्रकाश लैंप पर लेजर आधारित प्रकाश स्रोतों का एक लाभ यह है कि लेजर का उपयोग वीवो पोत-विशिष्ट थक्के31में व्यक्तिगत सतह धमनियों को लक्षित करने के लिए किया जा सकता है। यद्यपि हम विशिष्ट धमनियों को लक्षित नहीं कर रहे थे, हमने मस्तिष्क रोशनी और फोटोट्रोम्बोसिस प्रेरण के लिए 561 एनएम ग्रीन लेजर का उपयोग किया, क्योंकि गुलाब बंगाल अवशोषण शिखर 562 एनएम पर था। रोशनी के दौरान एक उचित लेजर तीव्रता सुनिश्चित करने के लिए, लेजर को जांचने के लिए कोबोल्ट मॉनिटर सॉफ्टवेयर-6.1.0.0 का उपयोग किया गया था। इसके अलावा, वर्तमान अध्ययन में 10 माइक्रोन/जी (१०० माइक्रोग्राम/जी) की गुलाब बंगाल खुराक फोटोट्रोम्बोसिस को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त थी, जबकि पिछले प्रोटोकॉल में उच्च खुराक (१५० माइक्रोग्राम/जी)8की सूचना दी गई थी । इसके अलावा, प्रोटोकॉल स्ट्रोक परिणाम (न्यूरोस्कोर) और एक अतिरिक्त नकली नियंत्रण समूह (लेजर रोशनी) का विश्लेषण करने के लिए एक व्यवहार विधि प्रदान करता है ताकि यह साबित किया जा सके कि लेजर स्वयं किसी भी ऊतक क्षति का उत्पादन नहीं करता है, इसलिए केवल गुलाब बंगाल + लेजर रोशनी का संयोजन मस्तिष्क घाव को प्रेरित करता है।

कुल मिलाकर, यह गैर-इनवेसिव सीधी शल्य प्रक्रिया न्यूनतम मृत्यु के कारण दीर्घकालिक अवलोकन की संभावना के साथ मस्तिष्क में स्ट्रोक घाव की उच्च प्रजनन क्षमता और दिशात्मकता को सक्षम बनाती है। इस फोटोथ्रोम्बोटिक स्ट्रोक मॉडल बुनियादी और अनुवाद स्ट्रोक अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान प्रयोगात्मक प्रतिमान के रूप में प्रतिष्ठित है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हितों की है ।

Acknowledgments

हम सुझावों और चर्चाओं के लिए इम्यूनोस्ट्रोक संघ (2879 के लिए, प्रतिरक्षा कोशिकाओं से स्ट्रोक रिकवरी तक) के हमारे सभी सहयोग भागीदारों को धन्यवाद देते हैं। इस काम को जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति के तहत ड्यूश फोर्स्चुंग्सगेमेइस्चैफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) द्वारा सिस्टम न्यूरोलॉजी (एक्ससी 2145 स्नेर्जी - आईडी 390857198) के ढांचे के भीतर और अनुदान के तहत एलआई-2534/6-1 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। ली-2534/7-1 और एलएल-112/1-1 ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
561 nm wavelenght laser Solna Cobolt HS-03
Acetic Acid Sigma Life Science 695092
Anesthesia system for isoflurane Drager
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit Millipore S7100
Bepanthen pomade Bayer 1578681
C57Bl/6J mice Charles River 000664
Collimeter Thorlabs F240APC-A
Cotons NOBA Verbondmitel Danz 974116
Cresyl violet Sigma Life Science C5042-10G
Cryostat Thermo Scientific CryoStarNX70
Ethanol 70% CLN Chemikalien Laborbedorf 521005
Ethanol 96% CLN Chemikalien Laborbedorf 522078
Ethanol 99% CLN Chemikalien Laborbedorf ETO-5000-99-1
Filter paper Macherey-Nagel 432018
Fine Scissors FST 15000-00
Forceps FST 11616-15
Heating blanket FHC DC Temperature Controller  40-90-8D
Isoflurane Abbot B506
Isopentane Fluka 59070
Ketamine Inresa Arzneimittel GmbH
Laser Speckle Perimed PeriCam PSI HR
Mayor Scissors FST 1410-15
Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 Apotheke Innestadt Uni Munchen P32799
Protective glasses Laser 2000 NIR-ZS2-38
Rose Bengal Sigma Aldrich 198250-5G
Roti-Histokit mounting medium Roth 6638.1
Saline solution Braun 131321
Stereomikroskop Zeiss Stemi DV4
Stereotactic frame Stoelting 51500U
Superfrost Plus Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Xylacine Albrecht

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References

  1. GBD 2016 Causes of Death Collaborators. Global, regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).
  2. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental Neuro Therapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).
  3. Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circulation Research. 40 (3), 320-328 (1977).
  4. Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
  5. Bergeron, M. Inducing photochemical cortical lesions in rat brain. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9 Unit 9.16 (2003).
  6. Lee, J. K., et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surgical Neurology. 67 (6), 620-625 (2007).
  7. Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathologica. 72 (4), 315-325 (1987).
  8. Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50370 (2013).
  9. McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
  10. Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
  11. Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
  12. Bath, P. M., Macleod, M. R., Green, A. R. Emulating multicentre clinical stroke trials: a new paradigm for studying novel interventions in experimental models of stroke. International Journal of Stroke: Official Journal of the INternational Stroke Society. 4 (6), 471-479 (2009).
  13. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 94-99 (2010).
  14. Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).
  15. Gnyawali, S. C., et al. Retooling laser speckle contrast analysis algorithm to enhance non-invasive high resolution laser speckle functional imaging of cutaneous microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048 (2017).
  16. Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
  17. Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
  18. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  19. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
  20. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
  21. Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
  22. Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
  23. Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e511729 (2014).
  24. Cramer, J. V., et al. In vivo widefield calcium imaging of the mouse cortex for analysis of network connectivity in health and brain disease. Neuroimage. 199, 570-584 (2019).
  25. Heindl, S., et al. Automated morphological analysis of microglia after stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
  26. Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17 (7), 642-651 (2018).
  27. Rust, R., et al. Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).
  28. Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
  29. Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).
  30. Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies. Archives of Neurology. 59 (12), 1870-1873 (2002).
  31. Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope. Journal of Neuroscience Methods. 170 (1), 35-44 (2008).

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न्यूरोसाइंस अंक 171 स्ट्रोक मस्तिष्क इस्केमिया पशु मॉडल फोटोथ्रोम्बोटिक स्थायी गुलाब बंगाल लेजर रोशनी
चूहों में मॉडलिंग स्ट्रोक: फोकल कॉर्टिकल घाव फोटोथ्रोम्बोसिस द्वारा
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Llovera, G., Pinkham, K., Liesz, A. Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis. J. Vis. Exp. (171), e62536, doi:10.3791/62536 (2021).

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