Summary
Здесь описана модель фототромботического инсульта, где инсульт производится через неповрежденный череп путем индуцирования постоянной микрососудистой окклюзии с использованием лазерного освещения после введения светочувствительного красителя.
Abstract
Инсульт является основной причиной смерти и приобретенной инвалидности взрослых в развитых странах. Несмотря на обширные исследования новых терапевтических стратегий, остаются ограниченные терапевтические возможности для пациентов с инсультом. Поэтому необходимы дополнительные исследования патофизиологических путей, таких как постинсультное воспаление, ангиогенез, нейронная пластичность и регенерация. Учитывая неспособность моделей in vitro воспроизводить сложность мозга, экспериментальные модели инсульта необходимы для анализа и последующей оценки новых лекарственных мишеней для этих механизмов. Кроме того, для преодоления так называемого кризиса репликации срочно необходимы подробные стандартизированные модели для всех процедур. В рамках исследовательского консорциума ImmunoStroke описана стандартизированная фототромботическая модель мыши с использованием внутрибрюшинной инъекции Rose Bengal и освещения неповрежденного черепа лазером 561 нм. Данная модель позволяет выполнять инсульт у мышей с выделением в любую кортикальный область головного мозга без инвазивной операции; таким образом, позволяя изучать инсульт в различных областях мозга. В этом видео демонстрируются хирургические методы индукции инсульта в фототромботической модели наряду с гистологическим анализом.
Introduction
Ишемический инсульт остается основной причиной смерти и приобретенной инвалидности взрослых в развитых странах в21-м веке, на которую приходится около 2,7 миллиона смертей в 2017 году во всем мире1. Даже при огромных усилиях научного сообщества доступно мало методов лечения. Кроме того, с такими высокими критериями исключения эти и без того ограниченные варианты недоступны для многих пациентов, что приводит к настоятельной необходимости в новых методах лечения для улучшения функционального восстановления после инсульта.
Учитывая неспособность моделей in vitro воспроизводить сложные взаимодействия мозга, животные модели имеют важное значение для доклинических исследований инсульта. Мыши являются наиболее часто используемой животной моделью в области исследований инсульта. Большинство этих моделей мышей направлены на инфаркты путем блокирования кровотока в средней мозговой артерии (MCA), поскольку большинство поражений инсульта человека расположены на территории MCA2. Хотя эти модели лучше повторяют поражения инсульта человека, они включают судорожные операции с высокой изменчивостью объема инфаркта.
С момента предложения Розенблюма и Эль-Саббана фототромботической модели в 1977 г.3,а позднее применения этой модели к крысам Watson et al.4,она стала широко использоваться в исследованиях ишемического инсульта5,6. Модель фототромботического инсульта индуцирует локальный и определенный кортикальный инфаркт в результате фотоактивации светочувствительного красителя, ранее введенного в кровоток. Это вызывает локальный тромбоз сосудов в областях, подверженных воздействию света. Кратко при воздействии света от вводимого фоточувствительного красителя индуцируется локализованное окислительное повреждение мембраны эндотелиальных клеток, приводящее к агрегации тромбоцитов и образованию тромбов с последующим локальным нарушением мозгового кровотока7.
Основное преимущество этой методики заключается в простоте исполнения и возможности направить очаг поражения в нужную область. В отличие от других экспериментальных моделей инсульта, для выполнения модели фототромботического инсульта необходим незначительный хирургический опыт, поскольку поражение индуцируется путем освещения неповрежденного черепа. Кроме того, хорошо разграниченные границы (Фиг.2А и Фиг.5В)и гибкость для индуцирования поражения в определенной области мозга могут облегчить изучение клеточных реакций в ишемической или интактной кортикальнойобласти 8. По этим причинам такой подход подходит для изучения клеточных и молекулярных механизмов кортикальной пластичности.
За последние несколько десятилетий растущая обеспокоенность по поводу отсутствия воспроизводимости между исследовательскими группами была придумана так называемым кризисом репликации9. После согласования первого доклинического рандомизированного контролируемого многоцентрового исследования в 2015 г.10предложенных инструментов для улучшения доклинических исследований11,12,13,было подтверждено, что одной из причин недостаточной воспроизводимости между доклиническими исследованиями из независимых лабораторий было отсутствие достаточной стандартизации экспериментальных моделей инсульта и параметров исхода14. Соответственно, когда был создан консорциум ImmunoStroke (https://immunostroke.de/), сотрудничество, целью которого является понимание мозг-иммунных взаимодействий, лежащих в основе механистических принципов восстановления после инсульта, стандартизация всех экспериментальных моделей инсульта среди каждой исследовательской группы была необходима.
Здесь описана стандартизированная процедура индукции фототромботической модели, используемая в вышеупомянутом исследовательском консорциуме. Вкратце животное подверглось анестезии, получило инъекцию Rose Bengal (10 мкл/г) внутриперитонно, и неповрежденный череп, оставшийся в 3 мм от брегмы, был немедленно освещен лазером 561 нм в течение 20 мин(Рисунок 1). Кроме того, сообщается о связанном гистологическом и поведенческом методе анализа исхода инсульта в этой модели. Все методы основаны на стандартных операционных процедурах, разработанных и используемых в лаборатории.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты, о которых сообщается в этом видео, проводились в соответствии с национальными руководящими принципами использования экспериментальных животных, а протоколы были одобрены немецкими правительственными комитетами (Regierung von Oberbayern, Мюнхен, Германия). Мыши, использованные в этом исследовании, были самцами мышей C57Bl/6J, в возрасте 10-12 недель, отправленными Чарльз Ривер Германия. Животные были размещены при контролируемых температурах (22 ° C ± 2 ° C), с периодом цикла 12-ч светло-темного и доступом к гранулированной пище и воде ad libitum.
1. Подготовка материала и инструментов
- Розу Бенгальскую растворить в 0,9% физиологическом растворе до достижения конечной концентрации 10 мг/мл. Подключите тепловое одеяло, чтобы сохранить область операции в тепле и поддерживать температуру тела мыши во время анестезии на уровне 37 °C.
- Подготовьте ножницы, щипцы, кусочки хлопка, глазную мазь декспантенола, шовный материал. Приготовьте шприц с физиологическим раствором (без иглы) для поддержания области операции гидратированной. Готовят анестезиорный газ (100% O2 + изофлуран).
2. Подготовка животного
- Инъекционная анальгезия за 30 мин до операции (4 мг/кг карпрофена и 0,1 мг/кг бупренорфина).
- Запишите массу тела мыши, чтобы скорректировать дозу розы Бенгалии для инъекции (10 мкл/г, т.е. 100 мкг/г).
- Поместите мышь в индукционную камеру со скоростью потока изофлурана 4%, чтобы обезболить ее до тех пор, пока спонтанное движение тела и вибриссы не прекратятся.
- Переведите мышь в стереотаксическую рамку и поместите ее в положение лежа носом в маску анестезии. Зафиксируйте животное и поддерживайте концентрацию изофлурана на уровне 4% в течение 1 мин. Затем снижают и поддерживают концентрацию изофлурана на уровне 2%.
- Осторожно вставьте ректальный зонд, чтобы контролировать температуру на протяжении всех хирургических процедур. Установите соответствующий грелка с обратной связью для поддержания температуры тела мыши на уровне 37 °C.
- Нанесите мазь для глаз декспантенола на оба глаза и очистите кожу и окружающий мех дезинфицирующим средством.
3. Модель фототромбоза
- Сделайте продольный разрез 2,0-2,5 см и втягивайте, чтобы обнажить череп. Выполните обнажение черепа одним разрезом, чтобы избежать осложнений раны.
- Аккуратно удалите покости ватой и определите корональные швы.
- Наденьте защитные очки, включите лазер 561 нм и отметьте брегму +3 мм влево.
- Выключите лазер, прикрепите наклейку с отверстием диаметром 4 мм, расположенным по указанным выше координатам.
- Вводят мышам бенгальскую розу (10 мкл/г) внутрибрюшинно. Поместите лазерный луч на 4-5 см от черепа, включите лазер 561 нм и осветите череп в течение 20 минут.
- Нанесите две капли 0,9% физиологического раствора на череп для регидратации, зашивайте рану и поместите животное в восстановительную камеру при 37 ° C, чтобы восстановиться после анестезии. Через 1 ч верните мышей в клетки в помещение с контролируемой температурой.
- Вводят анальгезию каждые 12 ч в течение 3 дней после операции (4 мг/кг карпрофена и 0,1 мг/кг бупренорфина).
4. Фиктивная операция
- Выполнять две различные процедуры фиктивных операций, описанные в этапах 4.1.1 и 4.1.2.
- Выполните все процедуры идентично описанной выше операции. Ввести Розу Бенгальскую, не включая лазер. После 20 мин под наркозом дайте животным оставаться в камере восстановления в течение 1 ч, чтобы восстановиться, прежде чем их вернут в клетки.
- Выполняйте все процедуры идентично описанной выше операции, включив лазер. Не вводите Розу Бенгальскую. После 20 мин лазерного освещения дайте животным оставаться в камере восстановления в течение 1 часа, чтобы восстановиться после анестезии, прежде чем их вернут в клетки.
5. Лазерное пятнышко
- Подключите нагретое одеяло, чтобы сохранить область операции теплой и поддерживать температуру тела мыши во время анестезии на уровне 37 °C.
- Поместите мышь в индукционную камеру со скоростью потока изофлурана 4%, чтобы обезболить ее до тех пор, пока спонтанное движение тела и вибриссы не прекратится, а затем переведите мышь в стереотаксическую рамку.
- Поместите мышь в положение лежа носом в анестезионную маску. Зафиксируйте животное и поддерживайте концентрацию изофлурана на уровне 4% в течение 1 мин. Т курицы уменьшают и поддерживают ее на уровне 2%.
- Осторожно вставьте ректальный зонд, чтобы контролировать температуру на протяжении всех хирургических процедур. Установите связанную грелку с контролем обратной связи для поддержания температуры тела мыши на уровне 37 °C и нанесите глазную мазь декспантенола на оба глаза. Очистите кожу и окружающий мех дезинфицирующим средством.
- Сделайте продольный разрез 2,0-2,5 см и втягивайте, чтобы обнажить череп. Выполните обнажение черепа одним разрезом, чтобы избежать осложнений раны.
- Поместите стеротаксическую рамку под лазерное пятнышко и отрегулируйте высоту для получения четкого изображения. Сфокусировать лазерную камеру перфузионной визуализации (LSI) на краниальном окне. Конфигурируйте систему камер с лазерным спекл-изображением (LSI) высокого разрешения, как описаноранее 15.
- Получение данных из поля зрения 1 см x 1 см с помощью лазеров с длиной волны 785 нм и 80 мВт со скоростью кадров 21 изображение/с на рабочем расстоянии 1 см в течение 1 мин.
- После визуализации нанесите две капли 0,9% физиологического раствора на череп для регидратации, зашив рану и поместите животное в восстановительную камеру при 37 °C для восстановления после анестезии в течение 1 ч. Через 1 ч верните мышей в клетки в помещение с контролируемой температурой.
6. Нейрооценка
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа неврологического дефицита используется модифицированная неврологическая шкала, опубликованная Eckenstein et al. в 1997 году15.
- Оценка животных по общему(таблица 1)и очаговой дефицитам(таблица 2). Эта композитная шкала колеблется от 0 (отсутствие дефицита) до 46 (тяжелые нарушения).
- Выполняйте нейрооценку в одно и то же время каждый день и используйте хирургическую одежду, чтобы сохранить нейтральный запах.
- Приживите мышей в течение 30 минут в комнате с открытой клеткой перед тестированием и позвольте им наблюдать за каждым предметом в течение 30 с.
7. Перфузия
- Подготовьте шприц 20 мл, содержащий PBS-гепарин (2 ЕД/мл), и поместите его на 1 м над стендом, чтобы облегчить/обеспечить гравитационную перфузию.
- Вводят внутрибрюшинно 100 мкл кетамина и ксилазина (120/16 мг/кг массы тела соответственно). Подождите 5 мин и подтвердите прекращение спонтанных движений тела и вибрисс.
- Зафиксируйте животное в положении лежа на спине и продезинфицируйте поверхность брюшного тела 100% этанолом. Сделать разрез длиной 3 см в брюшной полости; разрезать диафрагму и ребра, чтобы полностью визуализировать сердце.
- Сделайте небольшой разрез в правом предсердии и вставьте перфузионную канюлю в левый желудочек и перфьюзировать 20 мл PBS-гепарина.
- После перфузии обезглавить животное и удалить мозг, заморозить его с помощью сухого льда и хранить при -80 °C до дальнейшего использования.
8. Объем инфаркта
- Криосечение: последовательно разрезайте мозг на криостате до 20 мкм толщиной каждые 120 мкм и монтируем на слайды. Храните слайды при -80 °C до дальнейшей обработки.
- Окрашивание крезиловой фиалкой (CV)
- Для приготовления окрашивающего раствора смешайте 0,5 г CV ацетата в 500 млH2O. Перемешайте и нагрейте (60 °C) до растворения кристаллов. Дайте раствору остыть и храните его в темном флаконе. Разогревать до 60 °C и фильтровать (бумажный фильтр) перед каждым использованием.
- Высушите горки при комнатной температуре в течение 30 мин. Поместите их в 95% этанол в течение 15 мин, затем 70% этанол в течение 1 мин, а затем в 50% этанол в течение 1 мин.
- Поместите горки в дистиллированную воду на 2 мин, освежите дистиллированную воду и снова поместите горки в воду на 1 мин. Затем поместите слайды в предварительно нагретый раствор для окрашивания на 10 мин при 60 °C. Дважды промойте горки в дистиллированной воде в течение 1 мин.
- Поместите слайды в 95% этанол на 2 мин. Затем поместите их в 100% этанол в течение 5 минут, освежите 100% этанол и снова поместите слайды в 100% этанол в течение 2 минут. После этого накройте слайды монтажным носителем.
- Анализ: Сканируйте слайды и анализируйте объем непрямого инфаркта методом Суонсона16 для коррекции отека: Ишемическая область = (ишемическая область)-((ипсилатеральное полушарие) - (контралатеральное полушарие)).
9. Окрашивание Tunel (комплект для обнаружения апоптозаin situ)
- Высушите слайды, постфиксируйте в 4% параформальдегиде в PBS (ph 7,4) в течение 10-20 мин при RT. Промыть в PBS, постфиксировать в предварительно охлажденный этанол: уксусная кислота 2:1 в течение 5 мин при -20 °C.
- Промыть в PBS и нанести буфер равновесия (от 10 с до максимум 60 мин при RT) и применить фермент TdT рабочей силы (1 ч при 37 °C в увлажненной камере)
- Нанесите фермент остановки/промывки рабочей силы (10 мин при RT), промыть в PBS и нанести нагретый (RT) конъюгат анти-дигоксигенина рабочей силы (30 мин при RT в темноте)
- Вымойте в PBS, высиживайте с DAPI в течение 5 минут на RT и монтируйте слайды с флюоромонтируемой средой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Модель, описанная здесь, представляет собой модель фототромботического инсульта инъекцией Rose Bengal и неповрежденным освещением черепа в течение 20 минут при постоянной длине волны 561 нм и выходной мощности 25 мВт на волокне. Хотя полная фототромботическая операция длится 30 минут, животное содержится под низким наркозом, а повреждение головного мозга умеренное. Примерно через 10 минут после переноса в свои клетки все животные бодрствовали, свободно перемещаясь в клетке и взаимодействуя с однопометниками.
Объемную обработку инфаркта проводили с использованием крезилового фиолетового окрашивания последовательных корональных срезов головного мозга через 24 ч после индукции инсульта(рисунок 2А). Средний объем инфаркта составил 29,3мм3,что составляет 23% одного полушария головного мозга. Более того, вариабельность этой модели удара исключительно низкая со стандартным отклонением примерно 3,5%(рисунок 2B). Область поражения охватывает моторную кору без поражения подкорковых структур.
Фототромбоз вызвал умеренное, длительное сенсомоторное нарушение, обозначенное композитной нейрооценкой17 (рисунок 3); общий и очаговый дефицит измеряли через 24 ч, 3 дня и 7 дней после операции. Общий neuroscore имеет пять пунктов, включая оценку меха, ушей, глаз, осанки и спонтанной активности, с максимальным баллом 18(таблица 1). Фокусный Neuroscore включает в себя семь пунктов, включая оценку симметрии тела, походки, скалолазания, кругового поведения, симметрии передних конечности, обязательной цикличности и реакции усов, с максимальным баллом 28(таблица 2). У животных, перенесших инсульт, произошло значительное изменение композитного нейрооцента через 24 ч после операции по сравнению с животными, оперируемыми Sham. Эти различия сохранялись, хотя у мышей с инсультом со временем улучшалось(рисунок 3).
Смертность во время наблюдения редко встречается у 1-2% животных. В этом отчете ни одно из 10 изученных животных не должно было быть исключено, и все они пережили 7-дневный период наблюдения. Массу тела и изменения температуры у мышей контролировали через 24 ч, 3 дня и 7 дней после операции(рисунок 4А,В). Данные показали, что масса тела и температура снижались через 24 ч после операции только в группе Rose Bengal +illumination, но восстанавливались до уровня животных, оперированных Sham через 3 дня после операции.
Чтобы подтвердить индукцию ишемических изменений, через 24 ч после операции животные прошли тест лазерной визуализации. Лазерная спекл-контрастная визуализация измеряла перфузию коры головного мозга в течение 1 мин, и для каждого животного была получена усредненная цветовая кодированная картина. Это показывает, что Роза Бенгалия или лазерное освещение само по себе не производит поражения, в то время как одновременное применение Розовой Бенгалии и лазерного освещения генерирует круглую гипоперфузированную область диаметром 4 мм, окруженную узкой олигемической зоной(Рисунок 5А). Кроме того, окрашивание крезиловой фиалкой и Тунель для оценки объема инфаркта через 24 ч после операции не выявило повреждения тканей ни при операциях Rose Bengal, ни при операциях с лазерным освещением. С другой стороны, роза Бенгал + лазерное освещение генерировало хорошо разграниченное поражение(рисунок 5B).
Таблица 1: Общая нейрооценка. Для каждого из пяти измеренных общих дефицитов животные могут получать от 0 до 4 баллов в зависимости от тяжести. Затем баллы по пяти областям суммируются, чтобы обеспечить общий общий балл в диапазоне от 0 до 18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Фокальная нейрооценка. Для каждого из семи измеренных общих дефицитов животные могут получать от 0 до 4 баллов в зависимости от тяжести. Затем баллы по пяти областям суммируются, чтобы обеспечить общий общий балл в диапазоне от 0 до 28. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Рисунок 1:Фототромбоз (ПТ). Диаграмма с изображением фототромботической области, в 3 мм от Брегмы. Зеленая точка указывает на положение лазера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Объемный анализ инфаркта и исход инфаркта через 24 ч после ПТ. (А)Репрезентативный крезил фиолетовый окрашенный корональный мозг, срезы каждые 120 мкм через 24 ч после ПТ. Пунктирные линии разграничены область поражения. (B) Анализ объема инфаркта 10 мозгов (каждая точка представляет один индивидуальный мозг) через 24 ч после ПТ. Горизонтальная красная линия представляет среднее значение (29,32 мм3),полосы погрешности указывают на стандартное отклонение (3,45 мм3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Нейрооценка функционального дефицита после ПТ. Композитный нейрооценка до, через 24 ч, 3 дня и 7 дней после PT. BL = до PT, RB = Rose Bengal. n = 5 на группу. *p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Анализ массы тела и температуры после PT. (A)Массы тела и(B)температуры был несколько снижен у животных PT по сравнению с группами, оперируемыми Sham, через 24 ч и восстановился через 3 дня после PT. BL = до PT, RB = Rose Bengal. n = 5 на группу.*p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Подтверждение поражения после ПТ. (A) Лазерная спекл-визуализация(B)Крезиловая фиалка (верхние панели) и окрашивание Tunel (нижние панели) подтвердили поражение только после введения Rose Bengal и последующего лазерного освещения. RB = Роза Бенгалия. Шкала = 1000 мкм в верхней панели B, шкала шкалы = 20 мкм в нижней панели B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный протокол описывает экспериментальную модель инсульта фототромбоза путем освещения интактного черепа лазером 561 нм, с предыдущей внутрибрюшинной инъекцией Розы Бенгалии. До недавнего времени использование этой модели было низким, но неуклонно растет.
Смертность при индукции инсульта в данной модели отсутствует. Общая смертность менее 5% возникает во время операции из-за анестезиологических осложнений или жертвоприношения после соответствия критериям исключения. Чтобы гарантировать низкую изменчивость этой модели и ее воспроизводимость, предлагаются следующие критерии исключения: 1) время работы более 30 минут; 2) инфицирование шва; 3) укус раны; и 4) отсутствие инфаркта или асимметрии в области фории через 24 ч после ПТ.
Широко используемыми экспериментальными моделями инсульта является преходящая окклюзия MCA с использованием шовной нити, которая вводится во внутреннюю сонную артерию до тех пор, пока покрытый кремнием кончик не закроет происхождение MCA. Эта модель допускает реперфузию путем удаления нити и имитирует клинический сценарий человека, при котором происходит восстановление мозгового кровотока после спонтанного или терапевтического (rtPA) лизиса эмболического сгустка18,19. Однако она предполагает комплексную операцию с высокой вариабельностью конечного инфаркта и высокой смертностью10. Напротив, постоянная окклюзия МКА дистальной части лентикулостриатальных артерий может быть достигнута путем коагуляции артерии20,21,что индуцирует локально определяемые поражения в неокортексе22. Хотя эта модель имеет более низкий уровень смертности, она требует инвазивной операции животному путем трепанации черепа над MCA, чтобы позже коагулировать его23. Следовательно, высокие хирургические навыки необходимы для успешного и непредвзятого исследования инсульта in vivo.
По сравнению с другими моделями ишемии головного мозга, фототромботическая модель, проведенная в этом видео, имеет преимущество отсутствия краниотомии или серьезной операции на животном, в отличие от других моделей, которые включают сложные операции или краниотомию головного мозга. Более того, простое выполнение модели делает операцию доступной для многих с низкими трудоемкими тренировками. Низкая смертность, умеренный объем инфаркта и гибкость, чтобы вызвать поражение в определенной области мозга, подчеркивают преимущество этой экспериментальной парадигмы для исследований регенерации мозга и инсульта24,25,26,27.
Несмотря на очевидные преимущества, следует учитывать несколько ограничений данной модели удара. Длительное воздействие анестетиков на животное может быть критическим фактором, который следует учитывать, так как влияние анестетиков на нейропротекцию и исход инсульта уже хорошоизвестно28. Хотя продолжительность этой хирургической процедуры занимает около 30 минут, животное может находиться под низкими концентрациями анестетика из-за минимальных манипуляций с животным в течение 20 минут лазерного освещения. Поскольку эта модель вызывает умеренные травмы головного мозга, обнаруживаются только незначительные поведенческие дефициты. Таким образом, более продвинутые тест-системы с более высокой чувствительностью и качественными параметрами тестирования, такие как квалифицированный тест29 и Neuroscore17,как описано здесь, могут быть более подходящими для обнаружения долгосрочных функциональных результатов в этой модели. Наконец, благодаря постоянной агрегации тромбоцитов в освещенные кровеносные сосуды, реперфузия не может быть получена, что является особенностью, наблюдаемой у значительного процента пациентов с инсультом из-за спонтанного лизиса сгустка или терапии30.
Аналогичная модель фототромботического инсульта была опубликована в 2013 году Labat-gest и Tomasi, описывая протокол PT с использованием лампы холодного света вместо 561 нм зеленого лазера8. Как лазерные, так и холодные источники света могут быть использованы для индуцирования возбуждения Rose Bengal. Преимущество лазерных источников света перед лампами холодного света заключается в том, что лазеры могут быть использованы для нацеливания на отдельные поверхностные артериолы для свертывания in vivo для специфичного для сосудов свертывания31. Хотя мы не нацеливались на конкретные артериолы, мы использовали зеленый лазер 561 нм для освещения мозга и индукции фототромбоза из-за пика абсорбции Rose Bengal на 562 нм. Для обеспечения правильной интенсивности лазера во время освещения для калибровки лазера использовалось программное обеспечение Cobolt Monitor Software-6.1.0.0. Более того, в настоящем исследовании дозировка Rose Bengal 10 мкл / г (100 мкг / г) была достаточной для индуцирования фототромбоза, в то время как в предыдущем протоколе сообщалось о более высокой дозе (150 мкг / г)8. Кроме того, протокол предоставляет поведенческий метод анализа исхода инсульта (Neuroscore) и дополнительную фиктивную контрольную группу (лазерное освещение), чтобы доказать, что сам лазер не производит никаких повреждений тканей, поэтому только комбинация Rose Bengal + лазерное освещение индуцирует поражение головного мозга.
В целом, эта неинвазивная простая хирургическая процедура обеспечивает высокую воспроизводимость и направленность поражения инсульта на головной мозг наряду с возможностью долгосрочного наблюдения из-за минимальной смертности. Эта модель фототромботического инсульта выделяется как ценная экспериментальная парадигма для фундаментальных и трансляционных исследований инсульта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конкурирующих интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Мы благодарим всех наших партнеров по сотрудничеству Консорциумов иммуноинсульта (FOR 2879, От иммунных клеток до восстановления после инсульта) за предложения и обсуждения. Эта работа финансировалась Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) в рамках Стратегии передового опыта Германии в рамках Мюнхенского кластера системной неврологии (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) и в рамках грантов LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 и LL-112/1-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
| Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
| Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
| Forceps | FST | 11616-15 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
| Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
| Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
| Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Xylacine | Albrecht |
References
- GBD 2016 Causes of Death Collaborators. Global, regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental Neuro Therapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).
- Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circulation Research. 40 (3), 320-328 (1977).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Bergeron, M. Inducing photochemical cortical lesions in rat brain. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9 Unit 9.16 (2003).
- Lee, J. K., et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surgical Neurology. 67 (6), 620-625 (2007).
- Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathologica. 72 (4), 315-325 (1987).
- Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50370 (2013).
- McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Bath, P. M., Macleod, M. R., Green, A. R. Emulating multicentre clinical stroke trials: a new paradigm for studying novel interventions in experimental models of stroke. International Journal of Stroke: Official Journal of the INternational Stroke Society. 4 (6), 471-479 (2009).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 94-99 (2010).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).
- Gnyawali, S. C., et al. Retooling laser speckle contrast analysis algorithm to enhance non-invasive high resolution laser speckle functional imaging of cutaneous microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048 (2017).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e511729 (2014).
- Cramer, J. V., et al. In vivo widefield calcium imaging of the mouse cortex for analysis of network connectivity in health and brain disease. Neuroimage. 199, 570-584 (2019).
- Heindl, S., et al. Automated morphological analysis of microglia after stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17 (7), 642-651 (2018).
- Rust, R., et al. Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).
- Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies. Archives of Neurology. 59 (12), 1870-1873 (2002).
- Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope. Journal of Neuroscience Methods. 170 (1), 35-44 (2008).
