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Neuroscience

Modelagem de AVC em Camundongos: Lesões Corticais Focais por Fototrombose

Published: May 6, 2021 doi: 10.3791/62536

Summary

Descrito aqui é o modelo de derrame fototrombótico, onde um derrame é produzido através do crânio intacto induzindo a oclusão microvascular permanente usando iluminação laser após a administração de um corante fotossensível.

Abstract

O AVC é uma das principais causas de morte e incapacidade adulta adquirida em países desenvolvidos. Apesar da extensa investigação para novas estratégias terapêuticas, permanecem opções terapêuticas limitadas para pacientes com AVC. Portanto, mais pesquisas são necessárias para vias fisiofisiológicas como inflamação pós-acidente vascular cerebral, angiogênese, plasticidade neuronal e regeneração. Dada a incapacidade de modelos in vitro para reproduzir a complexidade do cérebro, modelos experimentais de derrame são essenciais para a análise e posterior avaliação de novos alvos de drogas para esses mecanismos. Além disso, modelos padronizados detalhados para todos os procedimentos são urgentemente necessários para superar a chamada crise de replicação. Como um esforço dentro do consórcio de pesquisa ImmunoStroke, um modelo de rato fototrombótico padronizado usando uma injeção intraperitoneal de Rose Bengala e a iluminação do crânio intacto com um laser de 561 nm é descrito. Este modelo permite o desempenho do AVC em camundongos com alocação para qualquer região cortical do cérebro sem cirurgia invasiva; assim, possibilitando o estudo do AVC em várias áreas do cérebro. Neste vídeo, são demonstrados os métodos cirúrgicos de indução de AVC no modelo fototrombótico, juntamente com a análise histológica.

Introduction

O AVC isquêmico continua sendo a principal causa de morte e incapacidade adulta adquirida em países desenvolvidos no séculoXXI, representando aproximadamente 2,7 milhões de mortes em 2017 em todo o mundo1. Mesmo com os imensos esforços da comunidade científica, poucos tratamentos estão disponíveis. Além disso, com critérios de exclusão tão elevados, essas opções já limitadas não são acessíveis a muitos pacientes, resultando em uma necessidade urgente de novos tratamentos para melhorar a recuperação funcional após o AVC.

Considerando a incapacidade dos modelos in vitro de replicar as interações complexas do cérebro, os modelos animais são essenciais para a pesquisa de derrame pré-clínico. Os camundongos são o modelo animal mais usado no campo de pesquisa de derrame. A maioria desses modelos de camundongos visa induzir infartos bloqueando o fluxo sanguíneo dentro da artéria cerebral média (MCA) uma vez que a maioria das lesões de derrame humano estão localizadas no territóriomca 2. Embora esses modelos recapitulem melhor as lesões de derrame humano, envolvem cirurgias convuladas com alta variabilidade de volume infarto.

Desde a proposta de Rosenblum e El-Sabban do modelo fototrombótico em 19773, e mais tarde a aplicação deste modelo aos ratos Watson et al.4, tornou-se amplamente utilizado na pesquisa isquêmica de derrame5,6. O modelo de derrame fototrombótico induz um infarto cortical local e definido como resultado da fotoativação de um corante sensível à luz previamente injetado no fluxo sanguíneo. Isso causa trombose local dos navios nas áreas expostas à luz. Brevemente, após a exposição à luz do corante fotossensível injetado, induzida a lesão oxidativa localizada da membrana celular endotelial é induzida, levando à agregação plaquetária e à formação de trombos, seguida pela interrupção local do fluxo sanguíneo cerebral7.

A principal vantagem dessa técnica reside na sua simplicidade de execução e na possibilidade de direcionar a lesão para a região desejada. Ao contrário de outros modelos experimentais de derrame, é necessário menor experiência cirúrgica para realizar o modelo de derrame fototrombótico, pois a lesão é induzida pela iluminação do crânio intacto. Além disso, as bordas bem delimitadas (Figura 2A e Figura 5B) e a flexibilidade para induzir a lesão a uma região cerebral específica podem facilitar o estudo das respostas celulares dentro da área cortical isquêmica ou intacta8. Por essas razões, essa abordagem é adequada para o estudo de mecanismos celulares e moleculares de plasticidade cortical.

Ao longo das últimas décadas, a crescente preocupação com a falta de reprodutibilidade entre os grupos de pesquisa foi cunhada da chamada crise de replicação9. Após a coordenação do primeiro estudo de ensaio multicêntrico controlado randomizado pré-clínico em 201510, uma ferramenta proposta para melhorar a pesquisa pré-clínica11,12,13, foi confirmado que uma das causas para a falha na reprodutibilidade entre estudos pré-clínicos de laboratórios independentes foi a falta de padronização suficiente de modelos experimentais de avc e parâmetros de desfecho14. Assim, quando o consórcio ImmunoStroke foi estabelecido (https://immunostroke.de/), uma colaboração que visa compreender as interações cérebro-imunes subjacentes aos princípios mecanicistas da recuperação do AVC, a padronização de todos os modelos experimentais de AVC entre cada grupo de pesquisa foi essencial.

Descrito aqui é o procedimento padronizado para a indução do modelo fototrombótico, conforme utilizado no consórcio de pesquisa acima mencionado. Resumidamente, um animal foi submetido a anestésicos, recebeu uma injeção de Bengala Rosa (10 μL/g) intraperitonalmente, e o crânio intacto, 3 mm restante de bregma, foi imediatamente iluminado por um laser de 561 nm por 20 min (Figura 1). Além disso, é relatado um método histológico e comportamental relacionado para analisar o desfecho do AVC neste modelo. Todos os métodos são baseados em procedimentos operacionais padrão desenvolvidos e utilizados em laboratório.

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Protocol

Os experimentos relatados neste vídeo foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais para o uso de animais experimentais, e os protocolos foram aprovados pelos comitês governamentais alemães (Regierung von Oberbayern, Munique, Alemanha). Os camundongos utilizados neste estudo foram camundongos C57Bl/6J machos, de 10 a 12 semanas de idade, e despachados pela Alemanha do Rio Charles. Os animais foram alojados sob temperaturas controladas (22 °C ± 2 °C), com um período de ciclo claro-escuro de 12 horas e acesso a alimentos e ad libitum de água.

1. Preparação do material e instrumentos

  1. Dissolver Rose Bengala em solução salina de 0,9% para atingir uma concentração final de 10 mg/mL. Conecte a manta de calor para manter a área de operação aquecida e mantenha a temperatura corporal do rato durante a anestesia a 37 °C.
  2. Prepare tesouras, fórceps, pedaços de algodão, pomada de olhos dexpanthenol e material de sutura. Prepare uma seringa com solução salina (sem agulha) para manter a área de operação hidratada. Prepare o gás anestesia (100% O2 + isoflurane).

2. Preparação do animal

  1. Injete analgesia 30 min antes da cirurgia (4 mg/kg carprofeno e 0,1 mg/kg Buprenorfina).
  2. Registo o peso corporal do rato para ajustar a dose de Rose Bengala a ser injetada (10 μL/g i.e., 100 μg/g).
  3. Coloque o rato na câmara de indução com uma taxa de fluxo isoflurane de 4% para anestesiar até que o movimento espontâneo do corpo e a vibrissae parem.
  4. Transfira o mouse para o quadro estereotático e coloque-o em uma posição propensa com o nariz na máscara de anestesia. Conserte o animal e mantenha a concentração de isoflurane em 4% por 1 min. Em seguida, reduza e mantenha a concentração de isoflurane em 2%.
  5. Insira suavemente a sonda retal para monitorar a temperatura durante os procedimentos cirúrgicos. Defina a almofada de aquecimento controlada pelo feedback associada para manter a temperatura corporal do mouse a 37 °C.
  6. Aplique pomada ocular dexpanthenol em ambos os olhos e limpe a pele e a pele circundante com um agente desinfetante.

3. Modelo de fototrombose

  1. Faça uma incisão longitudinal de 2,0-2,5 cm e retrate-se para expor o crânio. Realize a exposição do crânio com um único corte para evitar complicações da ferida.
  2. Remova o periosteum suavemente com algodão e identifique as suturas coronais.
  3. Coloque os óculos de proteção, ligue o laser de 561 nm e marque o bregma +3 mm à esquerda.
  4. Desligue o laser, conecte um adesivo com um orifício de 4 mm de diâmetro colocado nas coordenadas marcadas acima mencionadas.
  5. Injete o mouse com Bengal Rose (10 μL/g), intraperitonealmente. Coloque o raio laser a 4-5 cm do crânio, ligue o laser de 561 nm e ilumine o crânio por 20 minutos.
  6. Aplique duas gotas de soro fisiológico de 0,9% no crânio para reidratar, suturar a ferida e colocar o animal em uma câmara de recuperação a 37 °C para se recuperar da anestesia. Depois de 1h, devolva os ratos para suas gaiolas em uma sala controlada pela temperatura.
  7. Injete analgesia a cada 12 h durante 3 dias após a cirurgia (4 mg/kg carprofeno e 0,1 mg/kg Buprenorfina).

4. Operação Sham

  1. Realizar dois procedimentos diferentes das operações de Sham, conforme descrito nas etapas 4.1.1 e 4.1.2.
    1. Realizar todos os procedimentos de forma idêntica à operação descrita acima. Injete Rose Bengala sem ligar o laser. Após 20 minutos sob anestesia, permitem que os animais fiquem na câmara de recuperação por 1h para se recuperarem, antes de serem devolvidos às suas gaiolas.
    2. Realize todos os procedimentos de forma idêntica à operação descrita acima, ligando o laser. Não injete Rose Bengala. Após 20 minutos de iluminação a laser, permitem que os animais fiquem na câmara de recuperação por 1h para se recuperarem da anestesia, antes de serem devolvidos às suas gaiolas.

5. Mancha laser

  1. Conecte a manta aquecida para manter a área de operação aquecida e mantenha a temperatura do corpo do rato durante a anestesia a 37 °C.
  2. Coloque o mouse na câmara de indução com uma taxa de fluxo isoflurane de 4% para anestesiar até que o movimento espontâneo do corpo e vibrissae pare e, em seguida, transfira o mouse para o quadro estereotático.
  3. Coloque o mouse em uma posição propensa com o nariz na máscara de anestesia. Conserte o animal e mantenha a concentração de isoflurane em 4% por 1 min. A galinha T reduza e mantenha-o em 2%.
  4. Insira suavemente a sonda retal para monitorar a temperatura durante os procedimentos cirúrgicos. Defina a almofada de aquecimento controlada pelo feedback associado para manter a temperatura corporal do mouse a 37 °C e aplique pomada dexpanthenol nos olhos em ambos os olhos. Limpe a pele e a pele ao redor com um agente desinfetante.
  5. Faça uma incisão longitudinal de 2,0-2,5 cm e retrate-se para expor o crânio. Realize a exposição do crânio com um único corte para evitar complicações da ferida.
  6. Coloque o quadro estotactic sob a mancha de laser e ajuste a altura para obter uma imagem nítida. Concentre a câmera de imagem de perfusão de manchas de laser (LSI) na janela craniana. Configure o sistema de câmera de imagem de manchas a laser (LSI) de alta resolução como descrito anteriormente15.
  7. Adquira dados de um campo de visão de 1 cm x 1 cm usando um comprimento de onda de 785 nm e lasers de 80 mW com uma taxa de quadros de 21 imagens/s a uma distância de trabalho de 1 cm por 1 min.
  8. Após a imagem, aplique duas gotas de soro fisiológico de 0,9% no crânio para reidratar, suturar a ferida e colocar o animal em uma câmara de recuperação a 37 °C para se recuperar da anestesia por 1h. Depois de 1h, devolva os ratos para suas gaiolas em uma sala controlada pela temperatura.

6. Neuroscore

NOTA: Para a análise do déficit neurológico, utiliza-se15.

  1. Pontuação dos animais para geral(Tabela 1) e déficits focais(Tabela 2). Esta escala composta varia de 0 (sem déficits) a 46 (prejuízos graves).
  2. Realize o neuroscore ao mesmo tempo todos os dias e use roupas cirúrgicas para manter um cheiro neutro.
  3. Habituar os ratos por 30 minutos na sala com uma gaiola aberta antes do teste e permitir que eles observem cada item por 30 s.

7. Perfusão

  1. Prepare uma seringa de 20 mL contendo PBS-heparin (2 U/mL) e coloque-a 1 m acima do banco para facilitar/garantir a perfusão movida pela gravidade.
  2. Injete intraperitoneally 100 μL de cetamina e xilazina (120/16 mg/kg de peso corporal, respectivamente). Aguarde 5 min e corroia a cessação do movimento espontâneo do corpo e da vibrissae.
  3. Fixar o animal em uma posição supina e desinfetar a superfície abdominal do corpo com 100% de etanol. Faça uma incisão de 3 cm de comprimento no abdômen; corte o diafragma e as costelas para visualizar completamente o coração.
  4. Faça uma pequena incisão no átrio direito e insira a cânula de perfusão no ventrículo esquerdo e perfuuse com 20 mL PBS-heparin.
  5. Após a perfusão, decapite o animal e remova o cérebro, congele-o usando gelo seco e armazene-os a -80 °C até que use mais.

8. Volumetria infarto

  1. Criosectioning: Corte o cérebro em série em um criostat para seções de 20 μm de espessura a cada 120 μm e monte em slides. Armazene os slides a -80 °C até que seja mais processamento.
  2. Mancha de cresyl violeta (CV)
    1. Para preparar a solução de coloração, misture 0,5 g de acetato cv em 500 mL de H2O. Mexa e aqueça (60 °C) até dissolver os cristais. Deixe a solução esfriar e armazená-la em uma garrafa escura. Reaqueça a 60 °C e filtro (filtro de papel) antes de cada uso.
    2. Seque os slides à temperatura ambiente por 30 minutos. Coloque-os em 95% de etanol por 15 min, seguido por 70% de etanol por 1 min, e depois em 50% de etanol por 1 min.
    3. Coloque os slides em água destilada por 2 minutos, refresque a água destilada e coloque os slides na água novamente por 1 min. Em seguida, coloque os slides na solução de coloração pré-aquecida por 10 min a 60 °C. Lave os slides duas vezes em água destilada por 1 min.
    4. Coloque os slides em 95% de etanol por 2 minutos. Em seguida, coloque-os em 100% etanol por 5 min, refresque o etanol 100% e coloque os slides em 100% etanol novamente por 2 min. Depois, cubra os slides com um meio de montagem.
    5. Análise: Escaneie os slides e analise o volume indireto de infarto pelo método Swanson16 para corrigir o edema: Área isquêmica = (região isquêmica)-((hemisfério ipsilateral) - (hemisfério contralateral)).

9. Coloração de tunel(in situ kit de detecção de apoptose)

  1. Seque os slides, pós-fixação em 4% de paraformaldeído em PBS (ph 7.4) por 10-20 min na RT. Lave em PBS, pós-fixação em etanol pré-cozido: ácido acético 2:1 por 5 min a -20 °C.
  2. Lave em PBS e aplique tampão de equilíbrio (10 s a um máximo de 60 min no RT) e aplique enzima TdT de força de trabalho (1 h a 37 °C em câmara umidificada)
  3. Aplique força de trabalho parar/lavar enzima (10 min no RT), lavar em PBS e aplicar a força de trabalho aquecida (RT) conjugado anti-digoxigenina (30 min em RT no escuro)
  4. Lave em PBS, incuba com DAPI por 5 minutos no RT e monte os slides com mídia fluoromount.

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Representative Results

O modelo descrito aqui é um modelo de derrame fototrombótico pela injeção de Rose Bengala e iluminação intacta do crânio por 20 minutos, em um comprimento de onda constante de 561 nm e 25 mW de potência de saída na fibra. Embora a cirurgia fototrombótica completa dure 30 minutos, o animal é mantido sob baixa anestesia e o dano cerebral é moderado. Aproximadamente 10 minutos após a transferência para suas gaiolas, todos os animais estavam acordados, movendo-se livremente na gaiola, e interagindo com os companheiros de lixo.

A volumetria infarto foi realizada utilizando-se seções coronárias coronárias de cresílico violeta 24 h após indução de derrame(Figura 2A). O volume médio de infarto foi de 29,3 mm3,representando 23% de um hemisfério cerebral. Além disso, a variabilidade deste modelo de traçado é excepcionalmente baixa com um desvio padrão de aproximadamente 3,5%(Figura 2B). A área da lesão abrange o córtex motor sem o afeto de estruturas subcorticais.

A fototrombose causou um prejuízo sensorial moderado e de longo prazo, indicado pelo neuroscore composto17 (Figura 3); os déficits gerais e focais foram medidos 24h, 3 dias e 7 dias após a cirurgia. O Neuroscore geral possui cinco itens, incluindo a avaliação da pele, orelhas, olhos, postura e atividade espontânea, com pontuação máxima de 18 (Tabela 1). O Neuroscore focal compreende sete itens, incluindo a avaliação de simetria corporal, marcha, escalada, comportamento circulante, simetria de membros dianteiros, ciclismo obrigatório e resposta aos bigodes, com pontuação máxima de 28 (Tabela 2). Os animais de AVC tiveram uma mudança significativa no neuroscore composto 24 h após a cirurgia em comparação com animais operados por Sham. Essas diferenças persistiram, embora os ratos de avc tenham melhorado ao longo do tempo(Figura 3).

A mortalidade durante o tempo de observação raramente ocorre em 1-2% dos animais. Neste relatório, nenhum dos 10 animais estudados teve que ser excluído e todos sobreviveram ao período de observação de 7 dias. As mudanças de peso e temperatura nos camundongos foram monitoradas às 24h, 3 dias e 7 dias após a cirurgia(Figura 4A,B). Os dados mostraram que o peso corporal e a temperatura foram diminuídos 24 horas após a cirurgia apenas no grupo Rose Bengal + illumination, mas se recuperaram ao nível dos animais operados por Sham em 3 dias após a cirurgia.

Para confirmar a indução de alterações isquêmicas, 24h após a cirurgia, os animais foram submetidos a um teste de imagem a laser. Uma imagem de contraste de manchas laser mediu a perfusão sanguínea do córtex por uma duração de 1 min e uma imagem codificada por cores média foi obtida para cada animal. Isso demonstra que só a Rose Bengala ou a iluminação laser não produzem uma lesão, enquanto a aplicação simultânea de Rose Bengala e iluminação laser gera uma área hipoperfusada redonda de 4 mm de diâmetro cercada por uma zona oligêmica estreita(Figura 5A). Além disso, uma coloração de cresirél e tunel para avaliação do volume de infarto 24 h após a cirurgia não revelou danos teciduais, nem em Rose Bengala ou cirurgias de iluminação a laser. Por outro lado, a iluminação a laser Rose Bengala + gerou uma lesão bem demarcada(Figura 5B).

Tabela 1: Neuroscore Geral. Para cada um dos cinco déficits gerais medidos, os animais podem receber entre 0 e 4 pontos, dependendo da gravidade. Os pontuadores nas cinco áreas são então somados para fornecer um placar geral total variando de 0 a 18. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Neuroscore Focal. Para cada um dos sete déficits gerais medidos, os animais podem receber entre 0 e 4 pontos, dependendo da gravidade. Os pontuadores nas cinco áreas são então somados para fornecer uma pontuação geral total variando de 0 a 28. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Figure 1
Figura 1: Fototrombose (PT). Diagrama representando a área fototrombótica, 3 mm de Bregma. O ponto verde indica a posição do laser. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Análise volumostrica infarto e desfecho infarto 24 h após PT. (A) Cérebro coronal manchado de cresílo violeta, seções a cada 120 μm a 24 h após PT. Linhas tracejadas demarcam a área da lesão. (B) Análise do volume infarto de 10 cérebros (cada ponto representando um cérebro individual) 24 h após PT. A linha vermelha horizontal representa a média (29,32 mm3),as barras de erro indicam desvio padrão (3,45 mm3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Neuroscore para déficits funcionais após PT. Neuroscore composto antes, 24h, 3 dias e 7 dias após PT. BL = antes de PT, RB = Rose Bengala. n = 5 por grupo. *p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Análise do peso corporal e temperatura após PT. (A) O peso corporal e(B)temperatura foi ligeiramente reduzido em animais pt em comparação com grupos operados por Sham às 24 horas e recuperados 3 dias após PT. BL = antes de PT, RB = Rose Bengala. n = 5 por grupo.*p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Confirmação da lesão após PT. (A) Imagens de Manchas a Laser(B) Cresyl violeta (painéis superiores) e coloração de tunel (painéis inferiores) confirmaram a lesão somente após a administração de Rose Bengala e subsequente iluminação laser. RB = Rose Bengala. Barra de escala = 1.000 μm no painel superior B, barra de escala = 20 μm no painel inferior B. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O protocolo apresentado descreve o modelo experimental de derrame de fototrombose iluminando o crânio intacto com um laser de 561 nm, com uma injeção intraperitoneal anterior de Rose Bengala. Até recentemente, o uso desse modelo tem sido baixo, mas está aumentando constantemente.

A mortalidade por indução de AVC neste modelo está ausente. A mortalidade geral de menos de 5% surge durante a operação devido a complicações anestesiológicas ou sacrifício após o cumprimento dos critérios de exclusão. Para justificar a baixa variabilidade deste modelo e sua reprodutibilidade, sugerem-se os seguintes critérios de exclusão: 1) tempo de operação superior a 30 min; 2) infecção da sutura; 3) ferida de mordida; e 4) sem infarto ou sem assimetria em 24 h após PT.

Um modelo de avc experimental amplamente utilizado é a oclusão transitória do MCA, utilizando um filamento de sutura, que é introduzido na artéria carótida interna até que a ponta revestida de silício oclui a origem do MCA. Este modelo permite a reperfusão removendo o filamento e imita o cenário clínico humano, no qual há uma restauração do fluxo sanguíneo cerebral após lise espontânea ou terapêutica (rtPA) de um coágulo embólico18,19. No entanto, envolve uma cirurgia complexa com alta variabilidade do infarto final e alta taxa de mortalidade10. Em contrapartida, a oclusão permanente do distal MCA das artérias lenticulostriais pode ser alcançada por coagulação da artéria20,21, que induz lesões localmente definidas no neocórtex22. Embora este modelo tenha uma taxa de mortalidade menor, requer cirurgia invasiva ao animal por trepanação do crânio sobre o MCA para posteriormente coagular23. Consequentemente, altas habilidades cirúrgicas são necessárias para um estudo de derrame in vivo bem-sucedido e imparcial.

Comparado a outros modelos de isquemia cerebral, o modelo fototrombótico realizado neste vídeo tem a vantagem de não haver craniotomia ou cirurgia grave no animal, ao contrário de outros modelos que envolvem cirurgias complexas ou craniotomia cerebral. Além disso, a simples execução do modelo torna a cirurgia acessível a muitos com treinamento demorado. Baixa mortalidade, volume de infarto moderado e flexibilidade para induzir a lesão a uma região cerebral específica, enfatizam a vantagem desse paradigma experimental para a regeneração cerebral e estudos de derrame24,25,26,27.

Apesar das vantagens óbvias, algumas limitações deste modelo de AVC devem ser levadas em consideração. A longa exposição de anestésicos ao animal pode ser um fator crítico a ser levado em conta, já que o impacto dos anestésicos na neuroproteção e no desfecho do AVC já é bem conhecido28. Embora a duração deste procedimento cirúrgico leve aproximadamente 30 minutos, o animal pode estar sob baixas concentrações anestésicos devido à manipulação mínima do animal durante os 20 minutos de iluminação laser. Como este modelo induz lesões cerebrais moderadas, apenas pequenos déficits comportamentais são detectáveis. Assim, sistemas de teste mais avançados com maior sensibilidade e parâmetros de teste qualitativos, como o teste de atingimento qualificado29 e Neuroscore17, como descrito aqui, talvez mais adequados para detectar resultados funcionais de longo prazo neste modelo. Finalmente, devido à agregação permanente das plaquetas nos vasos sanguíneos iluminados, não se pode obter reperfusão, característica observada em uma porcentagem substancial de pacientes com AVC devido à lise espontânea de coágulo ou terapia30.

Um modelo semelhante de derrame fototrombotico foi publicado em 2013 por Labat-gest e Tomasi, descrevendo um protocolo PT usando uma lâmpada de luz fria em vez de um laser verde de 561 nm8. Fontes de laser e luz fria podem ser usadas para induzir a excitação de Rose Bengala. Uma vantagem das fontes de luz baseadas em laser sobre lâmpadas de luz fria é que os lasers podem ser usados para atingir artérias de superfície individuais para coagulação específica do vaso in vivo 31. Embora não estivéssemos mirando arterioles específicos, usamos um laser verde de 561 nm para iluminação cerebral e indução de fonometria, por causa do pico de absorção de Rose Bengala em 562 nm. Para garantir uma intensidade de laser adequada durante a iluminação, o Cobolt Monitor Software-6.1.0.0 foi usado para calibrar o laser. Além disso, no presente estudo, uma dosagem de Rose Bengala de 10 μL/g (100 μg/g) foi suficiente para induzir a fototrombose, enquanto o protocolo anterior relatou uma dose maior (150 μg/g)8. Além disso, o protocolo fornece um método comportamental para analisar o resultado do derrame (Neuroscore) e um grupo adicional de controle de sham (iluminação laser) a fim de provar que o laser em si não produz nenhum dano tecidual, de modo que apenas a combinação de Rose Bengal + iluminação laser induz uma lesão cerebral.

No geral, este procedimento cirúrgico não invasivo permite alta reprodutibilidade e direcionalidade da lesão do derrame ao cérebro, juntamente com a possibilidade de observação a longo prazo devido à mortalidade mínima. Este modelo de derrame fototrombótico é distinguido como um valioso paradigma experimental para pesquisas básicas e translacionais de AVC.

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Disclosures

Os autores não têm interesses concorrentes para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos a todos os nossos parceiros de colaboração do Consórcio imunogol (FOR 2879, das células imunes à recuperação do AVC) por sugestões e discussões. Este trabalho foi financiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) sob a Estratégia de Excelência da Alemanha no âmbito do Cluster de Munique para Neurologia de Sistemas (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) e sob as bolsas LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 e LL-112/1-1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
561 nm wavelenght laser Solna Cobolt HS-03
Acetic Acid Sigma Life Science 695092
Anesthesia system for isoflurane Drager
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit Millipore S7100
Bepanthen pomade Bayer 1578681
C57Bl/6J mice Charles River 000664
Collimeter Thorlabs F240APC-A
Cotons NOBA Verbondmitel Danz 974116
Cresyl violet Sigma Life Science C5042-10G
Cryostat Thermo Scientific CryoStarNX70
Ethanol 70% CLN Chemikalien Laborbedorf 521005
Ethanol 96% CLN Chemikalien Laborbedorf 522078
Ethanol 99% CLN Chemikalien Laborbedorf ETO-5000-99-1
Filter paper Macherey-Nagel 432018
Fine Scissors FST 15000-00
Forceps FST 11616-15
Heating blanket FHC DC Temperature Controller  40-90-8D
Isoflurane Abbot B506
Isopentane Fluka 59070
Ketamine Inresa Arzneimittel GmbH
Laser Speckle Perimed PeriCam PSI HR
Mayor Scissors FST 1410-15
Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 Apotheke Innestadt Uni Munchen P32799
Protective glasses Laser 2000 NIR-ZS2-38
Rose Bengal Sigma Aldrich 198250-5G
Roti-Histokit mounting medium Roth 6638.1
Saline solution Braun 131321
Stereomikroskop Zeiss Stemi DV4
Stereotactic frame Stoelting 51500U
Superfrost Plus Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Xylacine Albrecht

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Llovera, G., Pinkham, K., Liesz, A. Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis. J. Vis. Exp. (171), e62536, doi:10.3791/62536 (2021).

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