Summary
Beskrivs här är den fototrobiska stroke modellen, där en stroke produceras genom den intakta skallen genom att inducera permanent mikrovaskulär ocklusion med laser belysning efter administrering av ett ljuskänsligt färgämne.
Abstract
Stroke är en ledande dödsorsak och förvärvad vuxen funktionsnedsättning i utvecklade länder. Trots omfattande undersökning för nya terapeutiska strategier, det finns fortfarande begränsade terapeutiska alternativ för stroke patienter. Därför behövs mer forskning för patofysiologiska vägar som inflammation efter stroke, angiogenes, neuronal plasticitet och regenerering. Med tanke på in vitro-modellernas oförmåga att reproducera hjärnans komplexitet är experimentella strokemodeller avgörande för analys och efterföljande utvärdering av nya läkemedelsmål för dessa mekanismer. Dessutom behövs det snabbt detaljerade standardiserade modeller för alla procedurer för att övervinna den så kallade replikeringskrisen. Som ett försök inom ImmunoStroke forskningskonsortium beskrivs en standardiserad fotothrombotic mus modell med en intraperitoneal injektion av Rose Bengal och belysningen av den intakta skallen med en 561 nm laser. Denna modell möjliggör prestanda av stroke hos möss med tilldelning till någon när region i hjärnan utan invasiv kirurgi; således, vilket möjliggör studier av stroke i olika delar av hjärnan. I denna video demonstreras de kirurgiska metoderna för stroke induktion i den fototrobotiska modellen tillsammans med histologiska analys.
Introduction
Ischemisk stroke är fortfarande en huvudorsak till dödsfall och förvärvade vuxna funktionshinder i utvecklade länder på 2000-talet som står för cirka 2,7 miljoner dödsfall under 2017 överhela världen 1. Även med det vetenskapliga samfundets enorma ansträngningar finns det få behandlingar tillgängliga. Dessutom, med så höga uteslutningskriterier, är dessa redan begränsade alternativ inte tillgängliga för många patienter, vilket resulterar i ett brådskande behov av nya behandlingar för att förbättra funktionell återhämtning efter stroke.
Med tanke på in vitro-modellernas oförmåga att replikera hjärnans komplexa interaktioner är djurmodeller viktiga för preklinisk strokeforskning. Möss är den vanligaste djurmodellen inom strokeforskningsområdet. Majoriteten av dessa musmodeller syftar till att inducera hjärtinfarkt genom att blockera blodflödet inom den mellersta cerebrala artären (MCA) eftersom majoriteten av mänskliga strokeskador ligger i MCA-territoriet2. Även om dessa modeller bättre rekapitulera mänskliga stroke organskador, de innebär convulated operationer med hög infarkt volym variabilitet.
Sedan Rosenblum och El-Sabbans förslag om den fototrobakbotiska modellen 19773, och senare tillämpningen av denna modell på råttor Watson et al.4, har den blivit allmänt använd i ischemisk strokeforskning5,6. Den fototrokrobotiska strokemodellen inducerar en lokal och definierad när infarkt som ett resultat av fotoaktivering av ett ljuskänsligt färgämne som tidigare injicerats i blodflödet. Detta orsakar lokal trombos hos kärlen i de områden som utsätts för ljus. Kort, vid exponering för ljus från det injicerade ljuskänsliga färgämnet, induceras lokaliserad oxidativ skada i endotelcellmembranet, vilket leder till trombocytaggregering och trombbildning, följt av lokala störningar av cerebralt blodflöde7.
Den främsta fördelen med denna teknik ligger i dess enkelhet av utförande och möjligheten att rikta lesion till önskad region. Till skillnad från andra experimentella strokemodeller behövs mindre kirurgisk expertis för att utföra den fototromobotiska strokemodellen eftersom lesion induceras genom belysning av den intakta skallen. Dessutom kan de väl avgränsade gränserna ( figur 2A och figur 5B) och flexibiliteten att inducera lesionen till en specifik hjärnregion underlätta studier av cellulära svar inom det ischemiska eller intakta närområdet8. Av dessa skäl är detta tillvägagångssätt lämpligt för studier av cellulära och molekylära mekanismer för när plasticitet.
Under de senaste decennierna har den växande oron för bristen på reproducerbarhet mellan forskargrupper myntats den så kallade replikeringskrisen9. Efter samordningen av den första prekliniska randomiserade kontrollerade multicenterstudiestudien 201510, ett föreslaget verktyg för att förbättra prekliniskforskning 11,12,13, bekräftades det att en orsak till bristande reproducerbarhet mellan prekliniska studier från oberoende laboratorier var bristen på tillräcklig standardisering av experimentella strokemodeller och utfallsparametrar14. När immunostrokekonsortiet inrättades (https://immunostroke.de/), ett samarbete som syftar till att förstå hjärnimmuna interaktioner som ligger till grund för de mekanistiska principerna för strokeåterhämtning, var standardiseringen av alla experimentella strokemodeller bland varje forskargrupp därför nödvändig.
Beskrivs här är det standardiserade förfarandet för induktion av den fototrokrobotiska modellen som används i ovannämnda forskningskonsortium. Kort, ett djur genomgick bedövningsmedel, fick en Rose Bengal injektion (10 μL/g) intraperitonally, och den intakta skallen, 3 mm kvar från bregma, belystes omedelbart av en 561 nm laser i 20 min (Figur 1). Dessutom rapporteras en relaterad histologisk och beteendemässig metod för att analysera stroke resultatet i denna modell. Alla metoder är baserade på standardrutiner som utvecklats och använts i laboratoriet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experiment som rapporterades i denna video utfördes i enlighet med de nationella riktlinjerna för användning av försöksdjur, och protokollen godkändes av de tyska statliga kommittéerna (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland). Mössen som användes i denna studie var manliga C57Bl/6J möss, 10-12 veckor gamla, och skickades av Charles River Tyskland. Djuren inhystes under kontrollerade temperaturer (22 °C ± 2 °C), med en 12 h ljus-mörk cykelperiod och tillgång till pelleterad mat och vatten ad libitum.
1. Beredning av material och instrument
- Lös upp Rose Bengal i 0,9% saltlösning för att nå en slutlig koncentration på 10 mg/ml. Anslut värmefilten för att hålla operationsområdet varmt och behåll muskroppstemperaturen under anestesin vid 37 °C.
- Förbered sax, tång, bomullsbitar, dexpanthenol ögonsalva och suturmaterial. Förbered en spruta med saltlösning (utan nål) för att bibehålla operationsområdet hydratiserat. Förbered anestesigasen (100% O2 + isofluran).
2. Beredning av djuret
- Injicera analgesi 30 min före operation (4 mg/kg Carprofen och 0,1 mg/kg Buprenorfin).
- Registrera musens kroppsvikt för att justera dosen av Rose Bengal som ska injiceras (10 μL/g dvs. 100 μg/g).
- Placera musen i induktionskammaren med en isofluranflöde på 4% för att bedöva den tills kroppens spontana rörelse och vibrissae stannar.
- Överför musen till den stereotaktiska ramen och placera den i ett utsatt läge med näsan i anestesimasken. Fixera djuret och behåll isoflurankoncentrationen på 4% i 1 min. Minska sedan och behåll isoflurankoncentrationen vid 2%.
- Sätt försiktigt in rektalsonden för att övervaka temperaturen under hela kirurgiska ingrepp. Ställ in den tillhörande återkopplingsstyrda värmedynan för att bibehålla muskroppstemperaturen vid 37 °C.
- Applicera dexpanthenol ögonsalva på båda ögonen och rengör huden och omgivande päls med desinfektionsmedel.
3. Fotothrombosis modell
- Gör ett 2,0-2,5 cm längsgående snitt och dra tillbaka för att exponera skallen. Utför skallexponeringen med ett enda snitt för att undvika sårkomplikationer.
- Ta försiktigt bort periosteumet med bomull och identifiera koronan suturer.
- Sätt på skyddsglasögonen, sätt på 561 nm lasern och markera bregman +3 mm vänster.
- Stäng av lasern, fäst ett klistermärke med ett hål med 4 mm diameter placerat vid de markerade koordinaterna som nämns ovan.
- Injicera musen med Bengal Rose (10 μL/g), intraperitoneally. Placera laserstrålen på 4-5 cm från skallen, slå på 561 nm lasern och tänd skallen i 20 min.
- Applicera två droppar 0,9% saltlösning på skallen för att rehydrera, suturera såret och placera djuret i en återhämtningskammare vid 37 °C för att återhämta sig från anestesi. Efter 1 h, återvänd mössen till sina burar i ett temperaturkontrollerat rum.
- Injicera analgesi var 12: e timme i 3 dagar efter operationen (4 mg/kg Carprofen och 0, 1 mg/kg buprenorfin).
4. Skenoperation
- Genomföra två olika förfaranden för Sham-operationer enligt beskrivningen i steg 4.1.1 och 4.1.2.
- Utför alla procedurer på samma sätt som den åtgärd som beskrivs ovan. Injicera Rose Bengal utan att slå på lasern. Efter 20 min under anestesi, låt djuren stanna i återhämtningskammaren i 1 timme för att återhämta sig innan de returneras till sina burar.
- Utför alla procedurer på samma sätt som den ovan beskrivna operationen och slå på lasern. Injicera inte Rose Bengal. Efter 20 minuters laserbelysning, låt djuren stanna i återhämtningskammaren i 1 timme för att återhämta sig från anestesi, innan de återvänder till sina burar.
5. Laserspekt
- Anslut den uppvärmda filten för att hålla operationsområdet varmt och behåll muskroppstemperaturen under anestesi vid 37 °C.
- Placera musen i induktionskammaren med en isofluranflöde på 4% för att bedöva den tills kroppens spontana rörelse och vibrissae stannar och överför sedan musen till den stereotaktiska ramen.
- Placera musen i ett benägenläge med näsan i anestesimasken. Fixera djuret och behåll isoflurankoncentrationen vid 4% i 1 min. T-öring minska och behåll den vid 2%.
- Sätt försiktigt in rektalsonden för att övervaka temperaturen under hela kirurgiska ingrepp. Ställ in den tillhörande återkopplingsstyrda värmedynan för att bibehålla muskroppstemperaturen vid 37 °C och applicera dexpanthenol ögonsalva på båda ögonen. Rengör huden och den omgivande pälsen med ett desinfektionsmedel.
- Gör ett 2,0-2,5 cm längsgående snitt och dra tillbaka för att exponera skallen. Utför skallexponeringen med ett enda snitt för att undvika sårkomplikationer.
- Placera den sterotaktiska ramen under laserfläcken och justera höjden för att få en skarp bild. Fokusera laserspektkle perfusion imaging (LSI) kameran på hjärnskålen fönstret. Konfigurera LSI-kamerasystemet (High Resolution Laser Speckle Imaging) enligt tidigare beskrivna15.
- Hämta data från ett 1 cm x 1 cm synfält med en 785 nm våglängd och 80 mW lasrar med en bildhastighet på 21 bilder/s på ett arbetsavstånd av 1 cm i 1 min.
- Efter avbildning, applicera två droppar 0,9% saltlösning på skallen för att rehydrera, suturera såret och placera djuret i en återhämtningskammare vid 37 °C för att återhämta sig från anestesi i 1 timme. Efter 1 h, återvänd mössen till sina burar i ett temperaturkontrollerat rum.
6. Neuroscore (neuroscore)
OBS: För neurologiska underskott analys, en modifierad neurologisk skala publicerad av Eckenstein et al. 1997 används15.
- Poängstvår djuren för allmänna underskott(tabell 1)och brännviddsunderskott(tabell 2). Denna sammansatta skala sträcker sig från 0 (inga underskott) till 46 (allvarliga nedskrivningar).
- Utför neuroscore vid samma tid varje dag och använd kirurgiska kläder för att hålla en neutral lukt.
- Habituate mössen i 30 min i rummet med en öppen bur före testningen och låt dem observera varje föremål i 30 s.
7. Perfusion
- Förbered en 20 ml spruta som innehåller PBS-heparin (2 U/ml) och placera den 1 m ovanför bänken för att underlätta/säkerställa gravitationsdriven perfusion.
- Injicera intraperitoneally 100 μL ketamin och xylazin (120/16 mg/kg kroppsvikt, respektive). Vänta i 5 min och bekräfta upphörandet av spontan kroppsrörelse och vibrissae.
- Fixera djuret i ett supin läge och desinficera bukkroppsytan med 100% etanol. Gör ett 3 cm långt snitt i buken; skära membranet och revbenen för att helt visualisera hjärtat.
- Gör ett litet snitt i höger atrium och sätt in perfusions cannula i vänster ventrikel och granska med 20 mL PBS-heparin.
- Efter perfusion, halshugg djuret och ta bort hjärnan, frys det med torr is och förvara dem vid -80 °C tills vidare användning.
8. Infarkt volymtry
- Cryosectioning: Skär hjärnan seriellt på en kryostat till 20 μm tjocka sektioner var 120 μm och montera på diabilder. Förvara diabilderna vid -80 °C tills de bearbetas vidare.
- Cresyl violett (CV) färgning
- För att förbereda färgningslösningen, blanda 0,5 g CV-acetat i 500 ml H2O. Rör om och värm (60 °C) tills kristallerna är upplösta. Låt lösningen svalna och förvara den i en mörk flaska. Värm upp till 60 °C och filtrera (pappersfilter) före varje användning.
- Torka rutschkanorna i rumstemperatur i 30 min. Placera dem i 95% etanol i 15 min, följt av 70% etanol i 1 min och därefter i 50% etanol i 1 min.
- Placera rutschkanorna i destillerat vatten i 2 minuter, uppdatera det destillerade vattnet och placera rutschkanorna i vatten igen i 1 minut. Placera sedan diabilderna i den förvärmda färgningslösningen i 10 min vid 60 °C. Tvätta rutschkanorna två gånger i destillerat vatten i 1 minut.
- Placera bilderna i 95% etanol i 2 min. Placera dem sedan i 100% etanol i 5 min, uppdatera 100% etanol och placera bilderna i 100% etanol igen i 2 min. Täck sedan rutschkanorna med ett monteringsmedium.
- Analys: Skanna bilderna och analysera den indirekta infarktvolymen med Swanson-metoden16 för att korrigera för ödem: Ischemiskt område = (ischemisk region)-((ipsilateral halvklot) - (kontralateral halvklot)).
9. Tunelfärgning(in situ apoptos detektering kit)
- Torka diabilderna, efter fixering i 4% paraformaldehyd i PBS (ph 7.4) i 10-20 min vid RT. Tvätta i PBS, efterfix i förkyld etanol: ättiksyra 2:1 i 5 min vid -20 °C.
- Tvätta i PBS och applicera jämviktsbuffert (10 s till högst 60 min vid RT) och applicera TdT-enzym med arbetsstyrka (1 timme vid 37 °C i fuktig kammare)
- Applicera arbetsstyrka stopp/tvätt enzym (10 min vid RT), tvätta i PBS och applicera uppvärmd (RT) arbetsstyrka anti-digoxigenin konjugat (30 min vid RT i mörker)
- Tvätta i PBS, inkubera med DAPI i 5 minuter på RT och montera bilderna med fluormonterat medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modellen som beskrivs här är en fototrobotisk slagmodell av Rose Bengal injektion och intakt skallbelysning i 20 min, vid en konstant 561 nm våglängd och 25 mW utgångseffekt vid fibern. Även om den kompletta fototrobotiska operationen varar 30 minuter, hålls djuret under låg anestesi och hjärnskadan är måttlig. Ungefär 10 min efter överföring till sina burar var alla djur vakna, rörde sig fritt i buret och interagerade med kullkamrater.
Infarkt volymtry utfördes med cresyl violett färgade seriell koronal hjärnsektioner 24 h efter stroke induktion (Figur 2A). Den genomsnittliga infarktvolymen var 29,3 mm3, vilket motsvarar 23% av en hjärnhalva. Dessutom är variationen i denna slagmodell exceptionellt låg med en standardavvikelse på cirka 3,5 % (figur 2B). Lesion området omfattar motoriska cortex utan tillgivenhet av subkortikala strukturer.
Fototrokrobos orsakade en måttlig, långsiktig sensorisk försämring, indikerad av kompositen Neuroscore17 (Figur 3); allmänna underskott och fokala underskott mättes 24 h, 3 dagar och 7 dagar efter kirurgi. Den allmänna Neuroscore har fem objekt, inklusive utvärdering av päls, öron, ögon, hållning och spontan aktivitet, med en maximal poäng på 18 (tabell 1). Fokal neuroscore består av sju punkter, inklusive utvärdering av kroppssymmetri, gång, klättring, cirklinerande beteende, frambenssymmetri, obligatorisk cykling och whiskers svar, med en maximal poäng på 28 (tabell 2). Stroke djur hade en betydande förändring i sammansatta neuroscore 24 h efter kirurgi jämfört med Sham-drivna djur. Dessa skillnader kvarstod, även om strokemössen förbättrades med tiden (figur 3).
Dödlighet under observationstiden förekommer sällan hos 1-2% av djuren. I denna rapport behövde inget av de 10 studerade djuren uteslutas och alla överlevde den 7-dagars observationsperioden. Kroppsvikten och temperaturförändringar hos mössen övervakades vid 24 timmar, 3 dagar och 7 dagar efter operationen (figur 4A,B). Data visade att kroppsvikt och temperatur minskades 24 timmar efter kirurgi endast i Rose Bengal + belysningsgruppen, men återhämtade sig till nivån för de Sham-drivna djuren i 3 dagar efter operationen.
För att bekräfta en induktion av skandinaviska förändringar, 24 h efter kirurgi, genomgick djuren ett laseravbildningstest. En laser speckle kontrast imaging mätt blod perfusion av cortex under en varaktighet av 1 min och en genomsnittlig färgkodad bild erhölls för varje djur. Detta visar att enbart Rose Bengal eller laserbelysning inte ger någon lesion, medan samtidig applicering av Rose Bengal och laserbelysning genererar ett runt hypoperfused område med 4 mm diameter omgiven av en smal oligemic zon (Figur 5A). Dessutom visade en cresyl violett och Tunel färgning för bedömning av infarct volym 24 h efter kirurgi inga vävnad skador varken i Rose Bengal eller laser belysning operationer. Å andra sidan genererade Rose Bengal + laserbelysning en väl avgränsad lesion (Figur 5B).
Tabell 1: Allmän neuroscore. För vart och ett av de fem allmänna underskott som mäts kan djur få mellan 0 och 4 poäng beroende på svårighetsgraden. Poängen på de fem områdena summeras sedan för att ge en total allmän poäng som sträcker sig från 0-18. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 2: Focal Neuroscore. För vart och ett av de sju allmänna underskott som mäts kan djur få mellan 0 och 4 poäng beroende på svårighetsgraden. Poängen på de fem områdena summeras sedan för att ge en total allmän poäng som sträcker sig från 0-28. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Figur 1: Fototromybosis (PT). Diagram som visar det fototrokrobotiska området, 3 mm från Bregma. Den gröna pricken anger laserns position. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Volymetrisk infarktanalys och infarktutfall 24 timmar efter PT. (A) Representativ cresylviolettfärgad koronal hjärna, sektioner var 120 μm vid 24 h efter PT. Streckade linjer avgränsar lesionsområdet. (B) Infarkt volymanalys av 10 hjärnor (varje punkt som representerar en enskild hjärna) 24 h efter PT. Den horisontella röda linjen representerar medelvärdet (29,32 mm3), felstänger anger standardavvikelse (3,45 mm3). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Neuroscore för funktionella underskott efter PT. Composite Neuroscore före, 24 h, 3 dagar och 7 dagar efter PT. BL = före PT, RB = Rose Bengal. n = 5 per grupp. *p < 0,05. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Kroppsvikt och temperaturanalys efter PT. (A) Kroppsvikten och (B) temperaturen sänktes något hos PT-djur jämfört med Sham-opererade grupper vid 24 timmar och återhämtade sig 3 dagar efter PT. BL = före PT, RB = Rose Bengal. n = 5 per grupp.*p < 0,05. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 5: Lesionsbekräftelse efter PT. (A) Laser Speckle imaging (B) Cresyl violett (övre paneler) och Tunel färgning (nedre paneler) bekräftade lesion först efter administrering av Rose Bengal och efterföljande laser belysning. RB = Rosenbengal. Skalstreck = 1 000 μm i övre panelen B, skalstång = 20 μm i nedre panelen B. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det presenterade protokollet beskriver den experimentella strokemodellen av fotothrombosis genom att belysa den intakta skallen med en 561 nm laser, med en tidigare intraperitoneal injektion av Rose Bengal. Fram till nyligen har användningen av denna modell varit låg men ökar stadigt.
Dödlighet under stroke induktion i denna modell är frånvarande. Den totala dödligheten på mindre än 5% uppstår under drift på grund av anestesiologiska komplikationer eller uppoffring efter uppfyllandet av uteslutningskriterierna. För att motivera den låga variabiliteten hos denna modell och dess reproducerbarhet föreslås följande uteslutningskriterier: 1) driftstid längre än 30 min; 2) infektion i suturen; 3) bettsår; och 4) ingen infarkt eller ingen förasymmetri vid 24 h efter PT.
En allmänt använd experimentell stroke modeller är den övergående ocklusion av MCA, genom att använda en sutur glödtråd, som införs i den inre halsartären tills den kiselbelagda spetsen occludes ursprunget till MCA. Denna modell tillåter reperfusion genom att ta bort glödtråden och efterliknar det mänskliga kliniska scenariot, där det finns en restaurering av cerebrala blodflödet efter spontan eller terapeutisk (rtPA) lys av en embolisk blodpropp18,19. Det innebär dock en komplex kirurgi med hög variabilitet av den slutliga infarkten och hög dödlighet10. Däremot kan den permanenta ocklusionen av MCA distala av lenticulostriatal artärer uppnås genom koagulering avartären 20,21, som inducerar lokalt definierade skador i neocortex22. Även om denna modell har en lägre dödlighet, kräver den invasiv kirurgi på djuret genom trepanation av skallen över MCA för att senare koagulera den23. Följaktligen krävs höga kirurgiska färdigheter för en framgångsrik och opartisk in vivo stroke studie.
Jämfört med andra hjärn ischemi modeller, den fotothrombotic modellen som utförs i denna video har fördelen av ingen craniotomy eller större kirurgi på djuret, till skillnad från andra modeller som innebär komplexa operationer eller hjärnan craniotomy. Dessutom gör det enkla utförandet av modellen operationen tillgänglig för många med låg tidskrävande träning. Låg dödlighet, måttlig infarktvolym och flexibilitet för att inducera lesion till en specifik hjärnregion, betona fördelen med detta experimentella paradigm för hjärnregenerering ochstrokestudier 24,25,26,27.
Trots de uppenbara fördelarna bör några begränsningar av denna slagmodell beaktas. Den långa exponeringen av bedövningsmedel för djuret kan vara en kritisk faktor att ta hänsyn till, eftersom effekten av bedövningsmedel på neuroprotection och strokeresultat redan är välkänd28. Även om varaktigheten av detta kirurgiska ingrepp tar cirka 30 minuter, kan djuret vara under låga bedövningskoncentrationer på grund av minimal manipulering av djuret under 20 minuters laserbelysning. Eftersom denna modell inducerar måttliga hjärnskador, endast mindre beteendemässiga underskott är detekterbara. Således mer avancerade testsystem med högre känslighet och kvalitativa testparametrar, såsom de skickliga som når test29 och Neuroscore17, som beskrivs här, kanske mer lämpliga för att upptäcka långsiktiga funktionella resultat i denna modell. Slutligen, på grund av den permanenta aggregeringen av trombocyterna i de upplysta blodkärlen, kan ingen reperfusion erhållas, vilket är en funktion som observerats hos en betydande andel strokepatienter på grund av spontan blodpropp lysis eller terapi30.
En liknande fototrombotisk slagmodell publicerades 2013 av Labat-gest och Tomasi, som beskriver ett PT-protokoll med en kallljuslampa istället för en 561 nm grön laser8. Både laser och kalla ljuskällor kan användas för att inducera Rose Bengal excitation. En fördel med laserbaserade ljuskällor jämfört med kallljuslampor är att lasrar kan användas för att rikta in sig på enskilda ytartärer för in vivo-kärlspecifik koagulering31. Även om vi inte riktade in oss på specifika arterioler, använde vi en 561 nm grön laser för hjärnan belysning och fototrombosis induktion, på grund av Rose Bengal absortion topp vid 562 nm. För att säkerställa en korrekt laserintensitet under belysningen användes Cobolt Monitor Software-6.1.0.0 för att kalibrera lasern. I denna studie var dessutom en rosebengaldos på 10 μL/g (100 μg/g) tillräcklig för att inducera fototrombos, medan det tidigare protokollet rapporterade en högre dos (150 μg/g)8. Dessutom ger protokollet en beteendemetod för att analysera strokeresultatet (Neuroscore) och en ytterligare sham-control grupp (laserbelysning) för att bevisa att lasern själv inte producerar några vävnadsskador, så endast kombinationen av Rose Bengal + laserbelysning inducerar en hjärnskada.
Sammantaget möjliggör detta icke-invasiva enkla kirurgiska ingrepp hög reproducerbarhet och riktning av stroke lesion till hjärnan tillsammans med möjligheten till långsiktig observation på grund av minimal dödlighet. Denna fototrokrobotiska strokemodell utmärks som ett värdefullt experimentellt paradigm för grundläggande och translationell strokeforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande intressen att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar alla våra samarbetspartners i Immunostroke Consortia (FOR 2879, Från immunceller till strokeåterhämtning) för förslag och diskussioner. Detta arbete finansierades av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG,German Research Foundation) inom ramen för Tysklands excellensstrategi inom ramen för Münchenklustret för systemneurologi (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) och inom ramen för bidragen LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 och LL-112/1-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
| Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
| Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
| Forceps | FST | 11616-15 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
| Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
| Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
| Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Xylacine | Albrecht |
References
- GBD 2016 Causes of Death Collaborators. Global, regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental Neuro Therapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).
- Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circulation Research. 40 (3), 320-328 (1977).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Bergeron, M. Inducing photochemical cortical lesions in rat brain. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9 Unit 9.16 (2003).
- Lee, J. K., et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surgical Neurology. 67 (6), 620-625 (2007).
- Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathologica. 72 (4), 315-325 (1987).
- Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50370 (2013).
- McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Bath, P. M., Macleod, M. R., Green, A. R. Emulating multicentre clinical stroke trials: a new paradigm for studying novel interventions in experimental models of stroke. International Journal of Stroke: Official Journal of the INternational Stroke Society. 4 (6), 471-479 (2009).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 94-99 (2010).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).
- Gnyawali, S. C., et al. Retooling laser speckle contrast analysis algorithm to enhance non-invasive high resolution laser speckle functional imaging of cutaneous microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048 (2017).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e511729 (2014).
- Cramer, J. V., et al. In vivo widefield calcium imaging of the mouse cortex for analysis of network connectivity in health and brain disease. Neuroimage. 199, 570-584 (2019).
- Heindl, S., et al. Automated morphological analysis of microglia after stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17 (7), 642-651 (2018).
- Rust, R., et al. Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).
- Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies. Archives of Neurology. 59 (12), 1870-1873 (2002).
- Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope. Journal of Neuroscience Methods. 170 (1), 35-44 (2008).
