Summary
In vivo הדמיה ברזולוציה גבוהה של הלבלב היה קל עם חלון הדמיה תוך וינטלית הלבלב.
Abstract
הדמיה ישירה ברזולוציה תאית של הלבלב במודל של בעלי חיים קטנים וחיים הייתה מאתגרת מבחינה טכנית. מחקר הדמיה תוך-וינטלי שנערך לאחרונה, עם חלון הדמיה בבטן, איפשר הדמיה של הדינמיקה התאית באיברי הבטן ב- vivo. עם זאת, בשל הארכיטקטורה הרכה דמוית גיליון של לבלב העכבר שיכול להיות מושפע בקלות על ידי תנועה פיזיולוגית (למשל, פריסטלזיס ונשימה), היה קשה לבצע אורך מיוצב בהדמיית vivo במשך מספר שבועות ברמה התאית כדי לזהות, לעקוב, לכמת איים או תאים סרטניים בלבלב העכבר. כאן, אנו מתארים שיטה להשתלת בסיס תומך חדשני, חלון הדמיה תוך-ויטלי משולב של הלבלב, שיכול להפריד את הלבלב מהמעי להדמיה תוך-וינטלית של הלבלב. הדמיית vivo אורך עם חלון ההדמיה מאפשרת הדמיה יציבה, המאפשר מעקב אחר איים על פני תקופה של 3 שבועות והדמיה תלת ממדית ברזולוציה גבוהה של המיקרו- מבנה, כפי שניתן לראות כאן במודל סרטן הלבלב האורתופופי. בשיטה שלנו, מחקרי הדמיה תוך-וינטליים נוספים יכולים לברוח את הפתופיזיולוגיה של מחלות שונות המערבות את הלבלב ברמה התאית.
Introduction
הלבלב הוא איבר בטן עם תפקוד אקסוקריני במערכת העיכול ותפקוד אנדוקריני של הפרשת הורמונים למחזור הדם. הדמיה תאית ברזולוציה גבוהה של הלבלב יכולה לחשוף את הפתופיזיולוגיה של מחלות שונות הקשורות ללבלב, כולל דלקת הלבלב, סרטן הלבלב, סוכרת1. כלי הדמיה אבחוניים קונבנציונליים כגון טומוגרפיה ממוחשבת, הדמיה ברזולוציה מגנטית ואולטרה סאונוגרפיה זמינים באופן נרחב בתחום הקליני1,2. עם זאת, שיטות הדמיה אלה מוגבלות להדמיה של שינויים מבניים או אנטומיים בלבד, בעוד שלא ניתן לקבוע שינויים ברמה התאית או המולקולרית. בהתחשב בכך שינויים מולקולריים בסוכרת או בסרטן הלבלב בבני אדם יכולים ליזום יותר מ -10 שנים לפני האבחון3,4, גילוי מחלות לבלב מהמעבר המולקולרי שלהם במהלך התקופה הסמויה יש פוטנציאל לספק אבחנה מוקדמת והתערבות בזמן. לכן, הדמיה שתתגבר על מגבלות הרזולוציה ותספק תובנות חשובות על הפונקציה תזכה לתשומת לב להפליא על ידי מתן אבחון מוקדם של סרטן הלבלב או זיהוי מתקדם של שינוי האיים במהלך התקדמות הסוכרת5.
בפרט עם האיים, הדמיה גרעינית, הדמיית ביולומינציה וטומוגרפיה קוהרנטית אופטית הוצעו בטכניקות הדמיה לא פולשניות של האי6. עם זאת, הרזולוציה של שיטות אלה נמוכה באופן משמעותי, עם ערכים אופייניים הנעים בין כמה עשרות למאות מיקרומטרים, המציע יכולת מוגבלת לזהות שינויים ברמה התאית באיים. מצד שני, מחקרים קודמים ברזולוציה גבוהה של איים בוצעו תחת ex vivo7,8 (למשל, חיתוך או עיכול של הלבלב), לא פיזיולוגי9 (למשל, חיצוניות של הלבלב), ותנאים הטרוטופסיים10,11,12 (למשל, השתלה מתחת לקפסולת הכליה, בתוך הכבד, ובתא השמאלי של העין), אשר מגביל את הפרשנות שלהם ואת ההשלכות הקליניות. אם ניתן להקים במודלפיזיולוגי ואורתוטופי של הדמיה ברזולוציה גבוהה, זו תהיה פלטפורמה קריטית לחקירת איי הלבלב.
הדמיה תוך-וינטלית, החושפת את הפתופיזיולוגיה ברמת רזולוציה מיקרוסקופית בחיה חיה, קיבלה לאחרונה תשומת לב רבה13. מתוך שיטות ההדמיה in vivo, התפתחות של חלון הדמיהבטן 14, אשר משתיל חלון לתוך הבטן של עכבר, אפשר גילוי של ממצאים חדשניים (כלומר, שלב טרום micrometastasis של גרורות כבד מוקדם15 ומנגנון של תחזוקת תאי גזע אפיתל המעי16). למרות שחלון הדמיית הבטן מספק תוצאות חשובות, היישומים של חלון זה עבור הלבלב וכתוצאה מכך מחקר הדמיה תוך-ויאלית המבוסס על מחלות הקשורות ללבלב, לא נחקרו בהרחבה.
שלא כמו מאפייני האיבר המוצק המוגדרים היטב של הלבלב האנושי, הלבלב של עכבר הוא מבנה רקמות רכות מופץ בצורה מפוזרת17. לכן, הוא מושפע ללא הרף על ידי תנועות פיזיולוגיות כולל פרייסטליזה ונשימה. מחקר קודם על יישום חלון הדמיה בטן עבור הלבלב הראה כי נדודים התרחשו עקב תנועה-חפצים הנגרמים על ידי תנועות מעיים18. טשטוש חמור נצפה בתמונה הממוצעת המתקבלת, אשר עכב את ההדמיה והזיהוי של המבנים microscale.
להלן, אנו מתארים את השימוש בחלון הדמיה תוך-ויטלי משולב של הלבלב בשילוב עם מיקרוסקופיה תוך-ויאלית19,20 כדי לחקור את אירועי רמת התא האורך במחלות המערבות את הלבלב. בנוסף לתיאור מפורט של המתודולוגיה במחקר הקודם18, היישום המורחב של חלון הדמיית הלבלב למחלות שונות הקשורות ללבלב יטופל במאמר זה. בפרוטוקול זה, מערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית לסרוק לייזר בקצב וידאו מותאם אישית שימשה כמערכת מיקרוסקופיה תוך-ויאלית. ארבעה מודולי לייזר (אורכי גל ב-405, 488, 561 ו-640 ננומטר) נוצלו כמקור עירור, וארבעה ערוצים של אותות פליטה זוהו על ידי צינורות פוטומולטיפלייר (PMT) באמצעות מסנני פסים (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). סריקת לייזר כללה מראה מצולעת מסתובבת (ציר X) ומראה סריקת גלבנומטר (ציר Y) שאפשרה את סריקת קצב הווידאו (30 פריימים לשנייה). מידע מפורט על מיקרוסקופיה תוך-וינטלית תואר במחקרים הקודמים10,18,19,20,21,22,23.
במחקר האי הקודם שלנו18, צילמנו בהצלחה ובייצוב את האיים בעכברים חיים באמצעות מודל עכבר מהונדס (MIP-GFP)24 שבו האיים תויגו עם GFP. השיטה אפשרה תצוגה חזותית ברזולוציה גבוהה של השינויים באיים על פני תקופה של שבוע אחד. זה גם הקל הדמיה של אותם איים עד 3 שבועות, אשר מציע את ההיתכנות של מחקרים ארוכי טווח של איי הלבלב עבור מעקב פונקציונלי או ניטור במהלך הפתוגנזה של סוכרת18. יתר על כן, פיתחנו מודל סרטן לבלב אורתופופי שבו תאים סרטניים לבלב פלואורסצנטי (PANC-1 NucLight אדום)25 הושתלו ישירות לתוך הלבלב של העכבר. עם היישום של חלון הדמיה תוך-וינטלית הלבלב, מודל זה יכול לשמש כפלטפורמה לחקירת הפתופיזיולוגיה התאית והמולקולרית במיקרו-סביבה הגידולית של סרטן הלבלב ולניטור טיפולי של מועמדים חדשים לתרופה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים המתוארים במאמר זה נערכו בהתאם למהדורההשמינית של המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (2011)26 ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש במכון המתקדם למדע וטכנולוגיה בקוריאה (KAIST) ובאוניברסיטת סיאול הלאומית בונדאנג בית החולים (SNUBH).
1. הכנת החלון וחומרים אחרים
- עיצוב מותאם אישית של חלון ההדמיה התוך-וינטלי של הלבלב כדי לבודד את הלבלב מהמעי בחלל הבטן18 (איור 1A,B). שרטוט מפורט של החלון מתואר בדמות משלימה של מחקר קודם18.
- השתמש בעכברים C57BL/6N, זכרים בני 8-12 שבועות, להדמיית לבלב תוך-ויאלית. הזריק נוגדן נגד CD31 מצומד עם פלואורופור Alexa 647, 2 שעות לפני ההדמיה, לצורך תיוג כלי18.
- למחקר האיים, הכינו מודל עכבר מהונדס שבו האיים מתויגים בחלבון עיתונאי פלואורסצנטי. כאן, השתמשנו MIP-GFP, שבו חלבון פלורסנט ירוק בא לידי ביטוי תחת שליטתו של מקדם גנים אינסולין העכבר 1, אשר פעיל בתאי ביתא של כל האיים בעכבר24.
- לחקר סרטן הלבלב, הכינו תאים סרטניים מהונדסים המתויגים בחלבון עיתונאי פלואורסצנטי ועכברים עירומים BALB/C. במחקר זה, PANC-1 NucLight תאים אדומים שימשו. PANC-1 תאים סרטניים25 תויגו עם גשושית הפלואורסצנט האדום NucLight.
- לחטא את כל הכלים הכירורגיים, לכסות זכוכית (עם PEG או לא), וחלונות הדמיה באמצעות autoclave.
- יש למרוח ציפוי PEG על הכיסוי כדי למנוע תגובה דלקתית ולהגביר את הכשירות הביולוגית, המתאימה להדמיה ארוכת טווח.
2. ניתוח
- הכן פלטפורמה כירורגית סטרילית וחטא את המשטחים עם 70% אתנול.
הערה: עבור מפגשי הדמיה אורך, טכניקה אספטית היא חיונית. - עכברים מרדים עם תערובת של טילטמין/זולאזפאם (30 מ"ג/ק"ג) וקסילאזין (10 מ"ג/ק"ג).
הערה: מומלץ להשתמש בטילטמין/זולאזפאם במקום בקטמין בגלל השפעתו השלילית של היפרגליקמיה. הרדמה אופטימלית יש לבחור לצורך הניסוי9,27. - נטר את טמפרטורת הגוף באמצעות בדיקה רקטלית עם כרית חימום מבוקרת הומיאותרמית.
- גילחו את האגף השמאלי של העכבר והחלו שלושה סיבובים של אלכוהול לסירוגין וקרצוף על בסיס יוד.
הערה: אם קרם depilatory משמש, לא להשאיר יותר מ 1 דקה כדי למנוע כוויות כימיות. - בצע 1.5 ס"מ חתכו על האגף השמאלי של העכבר ולנתק את העור והשריר.
- בצע תיל מחרוזת ארנק עם שחור או ניילון 4-0 תיל בשולי החתיכה.
- השתמש מפסק מיקרו על הסינג'ן וחשוף בעדינות את הטחול.
- בזהירות לאגד את הטחול עם מלקחיים טבעת ולזהות את הלבלב.
- הנח את החלון באגף העכבר והעבר את הטחול והלבלב דרך המרחב הפתוח של החלון. מניפולציה של הלבלב צריך להיות מאוד גוי כפי שהוא יכול לגרום לדימום או דלקת הלבלב
- מניחים בעדינות את הלבלב על צלחת חלון ההדמיה; הטחול יונח על השטח הפתוח של החלון.
- למחקר תא הסרטן, להזריק PANC-1 NucLight אדום (1.0 x 106 תאים) ישירות לתוך הלבלב.
הערה: להדמיה את קסנוגרפטים סרטן הלבלב האנושי האורתוטופי, השתלה ישירה של תאים סרטניים כגון PANC-1 או תא סרטן לבלב אנושי אחר ניתן להקלעל 28. כדי לדמיין עם מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות תוך-וינטלית, תאי PANC-1 הועברו עם חלבון פלואורסצנטי אדום באמצעות ריאגנט לנטיוויראלי אדום NucLight המסמן את הגרעין29. למרות נפח הזרקה מקסימלי הוא לא בטוח, להקטין את הנפח ככל האפשר כדי למנוע את אפקט הלחץ בלבלב. - החל טיפות של דבק N-בוטיל ציאנואקרילט בשולי חלון ההדמיה.
- כדי למזער את כמות הדבק המוחל, השתמש במחט קטטר 31 G עבור היישום. אם כמות הטיפה גדולה, אז הרקמה תדבוק בשוגג בחלון או בזכוכית הכיסוי.
- יש למרוח בעדינות כיסוי עגולה 12 ממ על שולי חלון ההדמיה.
- משוך את לולאת התפר כדי להתאים לחריץ לרוחב של החלון ולקשור אותו שלוש פעמים.
- לחתוך את האתר הפרוקסימלי המרבי של הקשר כדי למנוע את ההפרעה של תפרים הדוקים כאשר עכברים אלה ערים.
- תן לעכברים להתאושש מהרדמה (2-3 שעות) ולהזריק ketoprofen (5 מ"ג / קילוגרם, תת עורי בעור הרופף בבסיס הצוואר או הירך של החיה) לשיכוך כאבים. הערכה מחדש לסימני כאב כל 12 שעות וקטופרפן צריך להיחשב כל 24 שעות במשך 1-3 ימים.
הערה: שכוויות נטל משפיעות על הפרשת אינסולין בתגובה גלוקוז9. הבחירה והתזמון של שך נטל חייב להיות אינדיבידואלי למטרה הניסיונית. - להתארח את העכבר בכלוב עם מצעים מספיקים כדי למנוע את המגע של החלון לכלוב. הימנע דיור הבית עם העכברים ללא ניתוח החלון.
3. הדמיה תוך-ויאלית
- הפעל את המיקרוסקופ התוך-וינטלי כולל כוח הלייזר.
- הפעל את כרית החימום והגדר את הרגולציה ההומיאותרמית ל -37 מעלות צלזיוס.
הערה: לחלופין, השתמש כרית חימום פסיבית או מנורה עם שליטה תכופה אם אין רגולציה הומיאותרמית. - בצע הרדמה תוך שרירית עם תערובת של טילטמין/זולאזפאם (30 מ"ג/ק"ג) קסילאצין (10 מ"ג/ק"ג).
הערה: מומלץ להשתמש בטילטמין/זולאזפאם במקום בקטמין בגלל השפעתו השלילית של היפרגליקמיה. הרדמה אופטימלית יש לבחור לצורך הניסויים9,27. - הכנס קטטר וסקולרי להזרקה.
- החל לחץ על הצד הפרוקסימלי של הזנב עם האינדקס והאצבע השלישית כחלופה ליישום חוסם עורקים. מחממים את הזנב עם מנורה במידת הצורך.
- לחטא את וריד הזנב עם תרסיס אתנול 70%.
- הכנס קטטר 30 גרם לתוך הווריד זנב לרוחב. התחדשות של דם תהיה דמיונית בצינור PE10.
- החל סרט משי על הקטטר כדי לייצב אותו.
- הזרקת FITC / TMR dextran או בדיקות פלואורסצנטיות אחרות (25 מיקרוגרם של אנטי CD31 מצומד עם Alexa 647), לפי הצורך, על פי השילוב של בדיקות פלואורסצנטיות18.
הערה: עבור בדיקות נוגדנים מצומדות פלואורסצנטיות, הזריקו 2 שעות לפני מפגש ההדמיה.
- העבר את העכבר מהפלטפורמה הכירורגית לשלב ההדמיה.
- הכנס בדיקה רקטלית כדי לשלוט באופן אוטומטי בטמפרטורת הגוף באמצעות מערכת כרית חימום הומיאותרמית.
- הכנס את חלון הדמיית הלבלב למחזיק החלון שהוכן במהלך ההתקנה של מיקרוסקופיה תוך-ויאלית(איור 2). עבור מיקרוסקופ הפוך, ייתכן שלא יידרש מחזיק חלון.
- בצע הדמיה תוך-ויאלית.
- להדמיית הלבלב, התחילו בעדשה אובייקטיבית להגדלה נמוכה (למשל, פי 4) לסריקת כל הנוף של הלבלב בחלון הדמיית הלבלב (שדה ראייה מומלץ: 2500 x 2500 מיקרומטר).
- לאחר קביעת אזור העניין, עבור לעדשת יעד הגדלה גבוהה יותר (20x או 40x) כדי לבצע את ההדמיה ברמה התאית (שדה ראייה מומלץ: 500 x 500 מיקרומטר או 250 x 250 מיקרומטר). בניסוי זה, הרזולוציה לרוחב ולקסיאלי הייתה כ-0.5 מיקרומטר ו-3 מיקרומטר, בהתאמה.
- בצע הדמיה של z-stack או זמן-לשגות כדי לבחון את המבנה התלת-ממדי או את הדינמיקה ברמה התאית, כגון העברת תאים.
הערה: להדמיית חלבון פלואורסצנטי המבטא תאים של בעלי חיים מהונדסים (MIP-GFP), 30 s של חשיפה לייזר לסירוגין 488 ננומטר עם כוח עד 0.43 mW היה נסבל ללא בליבנה פוטו או נזק לרקמות מורגש. להדמיית החלבונים הפלואורסצנטיים המסומנים באלקסה 647, כוח הלייזר של 640 ננומטר עד 0.17 מ"ו היה נסבל ללא בליבנה או נזק לרקמות. חשיפה ממושכת בלייזר עם כוח מעל הגדרה זו עלולה להוביל להלבנה פוטו או לנזק לרקמות על ידי פוטוטוקסיה. התאם את הרווח והעוצמה המתאימים כדי לדמות כראוי את אזור העניין. הגדרה מפורטת של פרמטרים במיקרוסקופיה תוך-ויאלית חייבת להיות אינדיבידואלית עבור כל מיקרוסקופיה תוך-ויאלית שהוכנה במכון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מיקרוסקופיה תוך-וינטלית בשילוב עם חלון ההדמיה התוך-ויטלי המשולב בבסיס הלבלב מאפשר הדמיה של רמת התא האורך של הלבלב בעכבר. פרוטוקול זה עם חלון ההדמיה התוך-וינטלי של הלבלב מספק יציבות רקמות לטווח ארוך המאפשרת רכישת הדמיה ברזולוציה גבוהה כדי לעקוב אחר איים בודדים עד 3 שבועות. כתוצאה מכך, ניתן להשיג הדמיית פסיפס לשדה ראייה מורחב, שחזור תלת מימדי (תלת-ממדי) של הדמיית z-stack ומעקב אורך של אותה תנוחה. בנוסף, המיקרוסקופיה התוך-וינטלית שלנו מספקת ארבעה ערוצים (405, 488, 561 ו- 647 ננומטר) של רכישה, המאפשרת הדמיה בו זמנית של תאים מרובים עם האינטראקציות שלהם.
עבור ההדמיה הראשונית, החלון הושתל בעכבר C57BL/6N עם נוגדן אנטי CD31 מוזרק תוך ורידי עם פלואורופור Alexa 647. הדמיה רחבת היקף (איור 3A) והדמיה תלת-ממדית מוגדלת (איור 3B-D, וידאו משלים 1) של הלבלב הקלו עם מערכת זו. רקמת הלבלב הוצגה עם פלואורסצנטיות אוטומטית, ונוגדן האנטי-CD31 הסמוך זוהה. תנודה עקב פרייסטאלזיס או נשימה לא זוהתה, וכתוצאה מכך הדמיה ממוצעת עם יחס אות לרעש גבוה(איור 4). תאי Acinar, הדורשים הדמיה ברזולוציה מיקרו-קשקשית בלבלב, הוצגו בבירור בתמונות הממוצעות.
להדמיה של האיים, נעשה שימוש בעכבר MIP-GFP. באמצעות שיטת הדמיית הפסיפס, תצוגה רחבת-שדה עם הדמיה ברזולוציה גבוהה אפשרה את ההדמיה של האיים עם כלי ההשמה הסמוך (איור 5). כ-40-50 איונים זוהו בתצוגת השדה הרחב. שיטת הדמיה יציבה זו יכולה להקל עוד יותר על המעקב אחר האיים עד 3 שבועות, כפי שמוצג במחקר קודם (איור 6)18.
עבור הדמיית תאים סרטניים, PANC-1 NucLight תאים אדומים הושתלו ישירות לתוך לבלב העכבר במהלך הניתוח(איור 7). נעשה שימוש באסטרטגיית תיוג כפולה, המורכבת מתאים אדומים PANC-1 NucLight וכלי שיט סמוכים מוכתמים באנטי-CD31 מצומדים עם Alexa 647. עם הפרוטוקול שלנו, הושגה הדמיה רחבת היקף של סרטן הלבלב (איור 7A),הממתווה את שולי הגידול, והדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה ברמת התא הבודד (איור 7B-D, סרטון משלים 2).
איור 1: עיצוב וצילום של חלון ההדמיה התוך-וינטלי של הלבלב. (A)מבט תלת-ממדי וחתך רוחבי של חלון ההדמיה התוך-וינטלי של הלבלב. שרטוט מפורט של הגודל ואת הקוטר מתואר במאמר הקודם18. (B)תמונה אחורית ואחורית של חלון הדמיית הלבלב. זכויות יוצרים 2020 האגודה לסוכרת קוריאנית מסוכרת Metab J. 2020 44:1:193-198. הודפס מחדש באישור האגודה הקוריאנית לסוכרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: צילום יישום חלון ההדמיה התוך-וינטלי של הלבלב. חלון הדמיה תוך-וינטלי של הלבלב מושתל בעכבר בשלב התרגום של XYZ ומחזיק תא ההדמיה המחובר להר ההטיה מחובר לחלון ההדמיה של הלבלב. זכויות יוצרים 2020 האגודה לסוכרת קוריאנית מסוכרת Metab J. 2020 44:1:193-198. הודפס מחדש באישור האגודה הקוריאנית לסוכרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הדמיית לבלב תוך-ויאלית מייצגת בעכבר C57BL/6N. (A)תמונה רחבת שטח ו- (B) תמונה תלת-ממדית מוגדלת של הלבלב (ירוק) והמיקרו-סקולטורה שלו (אדום) בעכבר C57BL/6N. כלי הדם מסומנים בנוגדן נגד CD31 עם הפלואורופור של Alexa 647. (C)תמונה משוחזרת תלת-ממדית ותמונה(D)של לבלב העכבר. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר (A) ו 50 מיקרומטר (B-D). ראה גם וידאו משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדמיה תוך-וינטלית של תא סינאר וערם סמוך. תאי Acinar (ירוק) ו vasculature סמוך (אדום) בעכבר C57BL / 6N. כלי הדם מסומנים בנוגדן נגד CD31 עם פלואורופור Alexa 647. יציבות הרקמות המושגת עם חלון הדמיית הלבלב מספקת תמונה גבוהה של יחס אות לרעש. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הדמיה תוך-וינטלית מייצגת של איי הלבלב בעכבר MIP-GFP. פסיפס רחב שטח ותמונה מוגדלת של האיים (ירוק) vasculature הסמוך (אדום) מעובד עם שיטת הקרנה בעוצמה מקסימלית בלבלב של עכבר MIP-GFP. כלי הדם מסומנים בנוגדן נגד CD31 עם הפלואורופור של Alexa 647. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר (שטח רחב) ו 50 מיקרומטר (מוגדל). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: הדמיה תוך-וינטלית אורך של איים בלבלב של עכבר MIP-GFP. תמונה אורך של האיים עד 3 שבועות בלבלב בעכבר MIP-GFP. כל ראש חץ בצבעים שונים מציין את אותם איונים. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. זכויות יוצרים 2020 האגודה לסוכרת קוריאנית מסוכרת Metab J. 2020 44:1:193-198. הודפס מחדש באישור האגודה הקוריאנית לסוכרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: הדמיה תוך-וינטלית מייצגת של מודל סרטן הלבלב. (A) תמונה רחבת שטח ו- (B) הגדילה את התמונה בתלת-ממד של התאים האדומים המושתלים PANC-1 NucLight (אדום) בעכבר העירום BALB/c. כלי דם (כחול) מסומנים בנוגדן נגד CD31 עם פלואורופור Alexa 647. (C)תמונה משוחזרת תלת-ממדית ותמונה(D)של סרטן הלבלב במודל העכבר. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר (A) ו 50 מיקרומטר (B-D). ראה גם וידאו משלים 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו משלים 1: In vivo הדמיית לבלב 3D בעכבר C57BL /6N. In vivo הדמיה תלת ממדית של הלבלב (ירוק) של עכבר C57BL / 6N מוזרק תוך ורידי עם נוגדן אנטי CD31 מצומד עם פלואורופור Alexa 647 (אדום). סרגל קנה המידה מתואר בסרטון. סרטון וידאו זה מתאים לאיור 3C,D. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו משלים 2: In vivo 3D סרטן הלבלב (PANC-1 NucLight אדום) הדמיה בעכבר עירום BALB / C. In vivo הדמיה תלת ממדית של סרטן הלבלב (אדום) מושתל עכבר עירום BALB / C מוזרק תוך ורידי עם נוגדן נגד CD31 מצומד עם פלואורופור Alexa 647 (כחול). סרגל קנה המידה מתואר בסרטון. סרטון וידאו זה מתאים לאיור 7C,D. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מורכב מהדמיה תוך-וינטלית של הלבלב באמצעות חלון הדמיה תוך-וינטלי משולב בסיסי של הלבלב שונה מחלון הדמיה בבטן. בין הפרוטוקולים שתוארו לעיל, הצעד הקריטי הראשון הוא השתלת חלון הדמיית הלבלב התוך-וינטלי בעכבר. ליישום הדבק בחלון, חשוב להחיל את הדבק בין שולי החלון לבין זכוכית הכיסוי, אך לא על רקמת הלבלב, שכן הוא עשוי להפריע באופן משמעותי להדמיה תוך-וינטלית. לא רק הדבק עצמו בין הזכוכית לרקמה, אלא גם חלקיקי אבק מן החוץ עלול לגרום לפיזור אור במהלך ההדמיה אם הדבק מוחל ישירות על הרקמה. בנוסף, היישום של הדבק עשוי להיות השפעות רעילות ולא פיזיולוגיות על הלבלב.
השלב השני הוא כמות רקמת הלבלב המונחת על צלחת הבסיס התומכת במתכת. מכיוון שרקמת הלבלב היא מבנה דמוי גיליון, יש לשלוט בנפח רקמת הלבלב על הצלחת. אם נפח גדול מדי ממוקם על הצלחת, הדבק המוחל על השוליים של הטבעת עשוי לדבוק ברקמה, ואת אפקט המסה עלול לעכב את זלוף הלבלב. מצד שני, אם אמצעי אחסון קטן מדי ממוקם שם, שדה הראייה שניתן לדמיין עשוי להיות מוגבל. פרוטוקול זה של ניתוח בחלון עשוי לדרוש מספר ניסויים כדי לעמוד בסטנדרט עקבי.
עבור הדמיה ארוכת טווח על פני תקופה של 3 שבועות, הבעיה המדאייגה ביותר הייתה נזק פוטנציאלי לחלון הדמיית הלבלב. הרס לא מכוון של זכוכית הכיסוי בחלון הדמיית הלבלב יכול להתרחש במהלך תקופת התצפית ארוכת הטווח. כדי למנוע זאת, העכבר עם החלון חייב להיות מאוכסן בנפרד, ויש להסיר אובייקטים קשים עם קצוות חדים מהכלוב. המתת החסד של עכברים צריכה להיחשב אם זכוכית הכיסוי נשברת, אם יש סימנים חמורים של דלקת ליד החלון, או אם החיה נראית במצוקה. מניסיוננו, עכברים עם חלון הדמיית הלבלב היו מסוגלים לאכול ולהתאמן כרגיל כאשר ההתאוששות לאחר הניתוח הייתה מתאימה ולא פותח סיבוך אחר.
מניסיוננו הקודם עם חלון ההדמיה בבטן, לא הצלחנו לרכוש הדמיה ברמה התאית באיכות גבוהה, כמו גם מעקב אורך של אותם כתמים על פני מספר ימים. בהשוואה לחלון הדמיית הבטן, המספק פלטפורמה מגוונת לאברי בטן שונים, חלון הדמיית הלבלב מצוין עוד יותר להדמיית הלבלב כמו גם לאיברים אחרים הרכים ומושפעים בקלות מתנועות כגון מזנטריה, טחול ומעי דק. עם זאת, הכבד והכליות עשויים להיות בלתי אפשריים בחלון ההדמיה של הלבלב בגלל המרחב המוגבל.
בעוד שהשילוב של עכבר פלואורסצנטי, תאים וגשושיות נוגדנים מאפשר הדמיה של האינטראקציות הדינמיות בין תאי אנדותל לבין האיים או התאים הסרטניים, הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות משוחזר עם קומפוזיציות אחרות של תאים בעלי תווית פלואורסצנטית או בדיקות מולקולריות המתאימות לכל מצב בהתאמה. יתר על כן, יישומים נרחבים המשולבים בשיטה שלנו צפויים, כגון עכבר כתב CpepSfGFP עם הפרשת אינסולין9,30, AAV8 בתיווך אספקת גנים מיקוד מינים חמצן תגובתי (ROS)31, או מודל גידול אורתופדי32,33,34 שבו הגידול בסיטו יכול לעורר באופן מלא את microenvironment הגידול, כולל tumorigenesis, פיתוח, גרורות35. יתר על כן, מודלים קסנוגרפט נגזר המטופל ניתן ללמוד גם באמצעות הפלטפורמה שלנו36.
יש כמה מגבלות שיש לטפל בהן במחקר זה. ראשית, גם כאשר השתמשנו בבסיס המתכת לייצוב, לא הצלחנו לקבוע את הלחץ המכני שנגרם על הרקמה על ידי הבסיס וזכוכית כיסוי, אשר יכול להשפיע על זרימת הדם. עם זאת, כפי שמתואר בדמויות לעיל, הזרקה תוך ורידי של נוגדן מצומד פלואורסצנטית (CD31) או dextran כראוי שכותרתו כלי השיט ללא אזור לא מובחנ, דבר המצביע על השפעה מינימלית של לחץ מכני על זרימת הדם הרגילה בתוך רקמת הלבלב. שנית, תופעות לוואי עקב הדבק לא ניתן להעריך ברקמת הלבלב. עם זאת, ניסינו להימנע מלגעת בלבלב עם דבקים בזהירות רבה ככל האפשר כדי למנוע השפעות נוספות. שלישית, כפי שנדון לעיל, ההשפעה הלא מכוונת של חומרי הרדמה עשויה להשפיע על הרגישות לאינסולין והפרשה, כפי שתואר במחקר הקודם9,27. מניסיוננו, תערובת של קטמין קסילאצין המושרה היפרגליקמיה בהשוואה לתערובת של טילאמין, זולאזפאם, קסילאצין. מחקר נוסף החוקר את ההשפעה של הרדמה על הפרשת אינסולין צריך להתבצע והרדמה נכונה עם תופעות לוואי מינימליות יש לבחור על פי כל ניסוי. רביעית, הדמיה של הלבלב מתמקדת בחלק הזנב, והדמיה של חלק הראש של הלבלב יכולה להיות מוגבלת עם החלון שלנו.
לסיכום, הדמיה אורך מיוצבת של הלבלב ברמה התאית עד מספר שבועות התאימה על ידי מערכת ההדמיה שלנו המשולבת עם חלון ההדמיה התוך-ויטלי של הלבלב המותאם להדמיית לבלב ב- vivo. מכיוון שהדמיה תוך-וינטלית מספקת תובנות דינמיות על ביולוגיה של התא, אימונולוגיה וביולוגיה של הגידול, פרוטוקול זה יכול להיות שיטה שימושית לחקירת הפתופיזיולוגיה של מחלות שונות המערבות את הלבלב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענק מס '14-2020-002 מקרן המחקר SNUBH ועל ידי מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window - custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder - custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
References
- Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A. Imaging in pancreatic disease. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 97-109 (2017).
- Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. Technologies for imaging the normal and diseased pancreas. Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed. Diabetes Care. 31, Suppl 2 165-169 (2008).
- Baetens, D., et al. Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice. Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Ravier, M. A., Rutter, G. A. Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes. Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).
- Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose. Science Reports. 11 (1), 603 (2021).
- Lee, E. M., et al. Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice. Islets. 10 (1), 25-39 (2018).
- Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. In vivo imaging of islet transplantation. Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).
- Mojibian, M., et al. Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), 1024405 (2015).
- Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Park, I., et al. Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model. Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).
- Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy. Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Hwang, Y., et al. In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver. Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas. International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).
- National Institutes of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).
- Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice. Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Cichocki, F., et al. GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity. Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
- Reissaus, C. A., et al. A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).
- Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma. Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).
- Bisht, S., Feldmann, G. Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).
- Feig, C., et al. The pancreas cancer microenvironment. Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).
- Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models. Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).
