Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

استقر الطولي في فيفو الخلوية المستوى التصور من البنكرياس في نموذج مورين مع نافذة التصوير داخل الجسم البنكرياس

Published: May 6, 2021 doi: 10.3791/62538
Automatic Translation
1, 2,3
1Department of Emergency Medicine, Seoul National University Bundang Hospital, 2Graduate School of Medical Science and Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KI for Health Science and Technology, Korea Advanced Institute of Science and Technology

Summary

في الجسم الحي عالية الدقة التصوير البنكرياس تم تسهيل مع نافذة التصوير داخل الجسم البنكرياس.

Abstract

مباشرة في الجسم الحي الخلوي القرار التصوير البنكرياس في نموذج صغير يعيش كان تحديا من الناحية الفنية. وقد مكنت دراسة حديثة للتصوير داخل الجسم، مع نافذة تصوير البطن، من تصور الديناميكيات الخلوية في أعضاء البطن في الجسم الحي. ومع ذلك ، بسبب البنية الناعمة الشبيهة بالصفائح لبنكرياس الماوس التي يمكن أن تتأثر بسهولة بالحركة الفسيولوجية (على سبيل المثال ، التثابر والتنفس) ، كان من الصعب إجراء تصوير طولي مستقر في التصوير الحي على مدى عدة أسابيع على المستوى الخلوي لتحديد الجزر أو الخلايا السرطانية في البنكرياس الماوس وتتبعها وتحديدها كميا. هنا، ونحن نصف طريقة لزرع قاعدة دعم جديدة، نافذة التصوير داخل الجسم البنكرياس المتكاملة، التي يمكن أن تفصل مكانيا البنكرياس من الأمعاء للتصوير الطولي الفاصل الزمني داخل الجسم من البنية المجهرية البنكرياس. التصوير الطولي في الجسم الحي مع نافذة التصوير يمكن التصور مستقرة، مما يسمح لتتبع الجزر على مدى فترة 3 أسابيع وعالية الدقة التصوير ثلاثي الأبعاد من البنية المجهرية، كما يتضح هنا في نموذج سرطان البنكرياس العظام. مع طريقتنا، يمكن لمزيد من دراسات التصوير داخل الأمعاء توضيح الفيزيولوجيا المرضية لمختلف الأمراض التي تنطوي على البنكرياس على المستوى الخلوي.

Introduction

البنكرياس هو عضو في البطن مع وظيفة الغدد الصماء في الجهاز الهضمي ووظيفة الغدد الصماء من إفراز الهرمونات في مجرى الدم. يمكن أن يكشف التصوير الخلوي عالي الدقة للبنكرياس عن الفيزيولوجيا المرضية لمختلف الأمراض التي تشمل البنكرياس ، بما في ذلك التهاب البنكرياس وسرطان البنكرياس ومرض السكري1. تتوفر أدوات التصوير التشخيصي التقليدية مثل التصوير المقطعي المحوسب والتصوير بدقة مغناطيسية والتصوير فائق السونوغرافيا على نطاق واسع في المجال السريري1و2. ومع ذلك، تقتصر طرائق التصوير هذه على تصور التغيرات الهيكلية أو التشريحية فقط، في حين لا يمكن تحديد التعديلات على المستوى الخلوي أو الجزيئي. وبالنظر إلى أن التغيرات الجزيئية في مرض السكري أو سرطان البنكرياس في البشر يمكن أن تبدأ أكثر من 10 سنوات قبل التشخيص3،4، والكشف عن أمراض البنكرياس من انتقالها الجزيئي خلال الفترة الكامنة لديه القدرة على توفير التشخيص المبكر والتدخل في الوقت المناسب. وهكذا، فإن التصوير الذي سيتغلب على قيود الدقة ويوفر رؤى قيمة في الوظيفة سيكسب الانتباه بشكل ملحوظ من خلال توفير التشخيص المبكر لسرطان البنكرياس أو تحديد متقدم لتغيير الجزر أثناء تطور مرض السكري5.

وعلى وجه الخصوص مع الجزر، تم اقتراح التصوير النووي، والتصوير الإضاءة الحيوية، والتصوير المقطعي التماسك البصري وتقنيات التصوير الجزيرة غير الغازية6. ومع ذلك ، فإن دقة هذه الأساليب منخفضة إلى حد كبير ، مع قيم نموذجية تتراوح بين عدة عشرات إلى مئات من ميكرومتر ، مما يوفر قدرة محدودة على اكتشاف التغيرات على المستوى الخلوي في الجزر. من ناحية أخرى، أجريت دراسات سابقة عالية الدقة من الجزر تحت الجسم الحي السابق7،8 (على سبيل المثال ، تشريح أو هضم البنكرياس) ، غيرالفسيولوجية 9 (على سبيل المثال ، التشظي الخارجي للبنكرياس) ، والحالات غير النظيرية10،11،12 (على سبيل المثال ، الزرع تحت كبسولة الكلى ، داخل الكبد ، وفي الغرفة الأمامية للعين) ، مما يحد من تفسيرها وآثارها السريرية. إذا كان في الجسم الحي, فسيولوجيا, ويمكن إنشاء نموذج تقويم العظام من التصوير عالية الدقة, وسوف يكون منصة حاسمة للتحقيق في الجزر البنكرياس.

وقد تلقى التصوير داخلفيتال، الذي يكشف عن الفيزيولوجيا المرضية على مستوى الدقة المجهرية في حي، مؤخرا اهتماما كبيرا13. من طرق التصوير في الجسم الحي ، وقد سمح تطوير نافذة تصوير البطن14، الذي يزرع نافذة في بطن الفأر ، واكتشاف نتائج جديدة (أي مرحلة ما قبل micrometastasis من الانبثاث الكبد المبكر15 وآلية صيانة الخلايا الجذعية في ظهارة الأمعاء16). على الرغم من أن نافذة التصوير البطني توفر نتائج قيمة، إلا أن تطبيقات هذه النافذة للبنكرياس وأبحاث التصوير داخل الأمعاء الناتجة عن ذلك على أساس الأمراض التي تنطوي على البنكرياس، لم يتم التحقيق فيها على نطاق واسع.

على عكس خصائص الأعضاء الصلبة المحددة جيدا للبنكرياس البشري ، فإن البنكرياس للفأر هو هيكل يشبه الأنسجة الرخوة الموزعة بشكل منتشر17. لذلك ، فإنه يتأثر باستمرار بالحركات الفسيولوجية بما في ذلك التثاق والتنفس. أظهرت دراسة سابقة على تطبيق نافذة تصوير البطن للبنكرياس أن التجول حدث بسبب الحركة القطع الأثرية الناجمة عن حركات الأمعاء18. ولوحظ عدم وضوح شديد في متوسط الصورة الناتجة، مما أعاق تصور وتحديد الهياكل الصغيرة.

هنا، ونحن نصف استخدام قاعدة دعم جديدة متكاملة نافذة التصوير داخل الجسم البنكرياس جنبا إلى جنب مع المجهر داخل الجسم19،20 للتحقيق في أحداث المستوى الخلوي الطولي في الأمراض التي تنطوي على البنكرياس. بالإضافة إلى وصف مفصل للمنهجية في الدراسة السابقة18، سيتم تناول التطبيق الموسع لنافذة تصوير البنكرياس لمختلف الأمراض التي تنطوي على البنكرياس في هذه الورقة. وفي هذا البروتوكول، استخدم نظام مجهري كونفوكوكال مصمم خصيصا لمعدل الفيديو كنظام مجهري داخل الفيتية. واستخدمت أربع وحدات ليزر (أطوال موجية في 405 و488 و561 و640 نانومتر) كمصدر للإثارة، وتم الكشف عن أربع قنوات لإشارات الانبعاثات بواسطة أنابيب التمائم الضوئي (PMT) من خلال مرشحات ممر النطاق (BPF1: FF01-442/46؛ BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). تألف المسح بالليزر من مرآة مضلعة دوارة (محور X) ومرآة مسح مقياس ال galvanometer (محور ص) التي مكنت المسح الضوئي لمعدل الفيديو (30 إطارا في الثانية). وقد وصفت معلومات مفصلة عن المجهر داخلفيتال في الدراسات السابقة10،18،19،20،21،22،23.

في دراستنا السابقة جزيرة18، ونحن بنجاح وثبات صورت الجزر في الفئران الحية باستخدام نموذج الماوس المعدلة وراثيا (MIP - GFP)24 التي تم وضع علامات الجزر مع GFP. مكنت الطريقة التصور عالي الدقة للتغييرات في الجزر على مدى فترة أسبوع واحد. كما سهل تصوير نفس الجزر لمدة تصل إلى 3 أسابيع ، مما يشير إلى جدوى الدراسات طويلة الأجل لقنيائل البنكرياس للتتبع الوظيفي أو الرصد أثناء مرض السكري18. وعلاوة على ذلك, وضعنا نموذج سرطان البنكرياس العظام التي الفلورسنت خلايا سرطان البنكرياس (PANC-1 NucLight الأحمر)25 زرعت مباشرة في البنكرياس من الماوس. مع تطبيق نافذة التصوير داخل الجسم البنكرياس, ويمكن استخدام هذا النموذج كمنصة للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية الخلوية والجزيئية في البيئة الدقيقة الورم من سرطان البنكرياس والرصد العلاجي للمرشحين المخدرات الرواية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء جميع الإجراءات الموصوفة في هذه الورقة وفقا للطبعة الثامنة من دليل رعاية واستخدام المختبر (2011)26 ووافقت عليها اللجنة المؤسسيةلرعاية الحيوانات واستخدامها في المعهد الكوري المتقدم للعلوم والتكنولوجيا (KAIST) ومستشفى بوندانغ التابع لجامعة سيول الوطنية (SNUBH).

1. إعداد النافذة وغيرها من المواد

  1. تصميم مخصص نافذة التصوير داخل الجسم البنكرياس إلى عزل البنكرياس من الأمعاء في تجويف البطن18 (الشكل 1A, ب). ويرد وصف مخطط تفصيلي للنافذة في شكل تكميلي لدراسة سابقة18.
  2. استخدم فئران C57BL/6N، الذكور الذين تتراوح أعمارهم بين 8 و12 أسبوعا، للتصوير داخل البنكرياس. حقن المضادة للCD31 الأجسام المضادة المقترنة مع الفلوروفور اليكسا 647، 2 ساعة قبل التصوير، لغرض وضع العلاماتالسفينة 18.
  3. لدراسة الجزر، وإعداد نموذج الماوس المعدلة وراثيا التي يتم وضع علامات الجزر مع بروتين مراسل الفلورسنت. هنا، ونحن تستخدم MIP-GFP، حيث أعرب عن البروتين الفلوري الأخضر تحت سيطرة الماوس الأنسولين 1 الجينات المروج، الذي ينشط في خلايا بيتا من جميع الجزر في الماوس24.
  4. لدراسة سرطان البنكرياس، وإعداد الخلايا السرطانية المعدلة وراثيا الموسومة بروتين مراسل الفلورسنت والفئران عارية BALB / C. في هذه الدراسة، تم استخدام الخلايا الحمراء NUC-1 NucLight. PANC-1 الخلايا السرطانية25 وصفت مع التحقيق الفلورسنت الأحمر NucLight.
  5. تعقيم جميع الأدوات الجراحية، وتغطية الزجاج (مع PEG أم لا)، وتصوير النوافذ باستخدام الأوتوكلاف.
  6. تطبيق طلاء PEG على الزجاج الغطاء لمنع الاستجابة الالتهابية وزيادة التوافق البيولوجي، وهو مناسب للتصوير على المدى الطويل.

2. الجراحة

  1. إعداد منصة جراحية معقمة وتعقيم الأسطح مع الإيثانول 70٪.
    ملاحظة: بالنسبة لجلسات التصوير الطولي، يعد الأسلوب العقيم أمرا ضروريا.
  2. تخدير الفئران بمزيج من البلاط/الزولازيبام (30 ملغم/كغ) والزيلازيني (10 ملغم/كغم).
    ملاحظة: ينصح باستخدام tiletamine / zolazepam بدلا من الكيتامين بسبب تأثيره السلبي على ارتفاع السكر في الدم. يجب اختيار التخدير الأمثل لغرض التجربة9،27.
  3. مراقبة درجة حرارة الجسم باستخدام مسبار المستقيم مع لوحة التدفئة المنزلية التي تسيطر عليها.
  4. حلق الجناح الأيسر من الماوس وتطبيق ثلاث جولات من الكحول بالتناوب وفرك اليود القائم.
    ملاحظة: إذا تم استخدام كريم إزالة الشعر، لا تترك أطول من 1 دقيقة لتجنب الحروق الكيميائية.
  5. إجراء شق 1.5 سم على الجناح الأيسر من الماوس وتشريح الجلد والعضلات.
  6. إجراء خياطة سلسلة محفظة مع خياطة سوداء أو نايلون 4-0 في هامش الشق.
  7. استخدام متراجع صغير على شق وفضح بلطف الطحال.
  8. تجمع بعناية الطحال مع ملقط حلقة وتحديد البنكرياس.
  9. ضع النافذة على جانب الفأرة ومرر الطحال والبنكرياس عبر الفضاء المفتوح للنافذة. التلاعب البنكرياس يجب أن يكون غير لطيف جدا لأنها يمكن أن تسبب النزيف أو التهاب البنكرياس
  10. وضع البنكرياس بلطف على لوحة من نافذة التصوير. سيتم وضع الطحال على مساحة مفتوحة من النافذة.
  11. لدراسة الخلايا السرطانية، حقن PANC-1 NucLight الأحمر (1.0 × 106 خلايا) مباشرة في البنكرياس.
    ملاحظة: لتصوير سرطان البنكرياس البشري orthotopic xenografts, زرع مباشر للخلايا السرطانية مثل PANC-1 أو غيرها من خلايا سرطان البنكرياس البشري يمكن أن يسهل28. لتصور مع المجهر الفلوري داخلفيتال, تم نقل خلايا PANC-1 مع البروتين الفلوري الأحمر باستخدام كاشف NucLight الأحمر العدسي الذي التسميات النواة29. على الرغم من أن حجم الحقن القصوى غير مؤكد, تقليل حجم ممكن لتجنب تأثير الضغط في البنكرياس.
  12. تطبيق قطرات من N-بوتيل سيانواكريلات الغراء على هامش نافذة التصوير.
    1. لتقليل كمية الغراء المطبق، استخدم إبرة قسطرة 31 G للتطبيق. إذا كانت كمية قطرة كبيرة، ثم النسيج سوف تلتزم عن غير قصد إلى النافذة أو الزجاج الغطاء.
  13. ضعي زجاج غطاء دائري مقاس 12 مم برفق على هامش نافذة التصوير.
  14. سحب حلقة خياطة لتناسب الأخدود الجانبي للنافذة وربطه ثلاث مرات.
  15. قطع أقصى موقع قريب من العقدة لمنع انقطاع غرز ضيقة عندما تكون هذه الفئران مستيقظا.
  16. دع الفئران تتعافى من التخدير (2-3 ساعات) وحقن الكيتوبروفين (5 ملغم / كجم ، تحت الجلد في الجلد الفضفاض عند قاعدة الرقبة أو الورك للحيوان) لتخفيف الألم. إعادة تقييم لعلامات الألم كل 12 ساعة وينبغي النظر كيتوبروفين كل 24 ساعة لمدة 1-3 أيام.
    ملاحظة: مسكن يؤثر إفراز الأنسولين استجابة للجلوكوز9. يجب أن يكون اختيار وتوقيت التسكين فرديا للغرض التجريبي.
  17. Accomodate الماوس في القفص مع الفراش كافية لتجنب الاتصال من النافذة إلى القفص. تجنب السكن المنزل مع الفئران دون جراحة النافذة.

3. التصوير داخل الفيتال

  1. قم بتشغيل المجهر داخل الفيتال بما في ذلك قوة الليزر.
  2. بدوره على وسادة التدفئة وتعيين تنظيم الأمهات المنزلي إلى 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم لوحة تدفئة سلبية أو مصباح مع التحكم المتكرر إذا لم يكن هناك تنظيم تدفئة منزلية.
  3. إجراء التخدير العضلي مع خليط من tiletamine / zolazepam (30 ملغ / كغ) وxylazine (10 ملغ / كغ).
    ملاحظة: ينصح باستخدام tiletamine / zolazepam بدلا من الكيتامين بسبب تأثيره السلبي على ارتفاع السكر في الدم. يجب اختيار التخدير الأمثل لغرض التجارب9،27.
  4. أدخل قسطرة وعائية للحقن.
    1. تطبيق الضغط على الجانب القريب من الذيل مع مؤشر والاصبع الثالث كبديل لتطبيق tourniquet. سخني الذيل بمصباح إذا لزم الأمر.
    2. تعقيم الوريد الذيل مع رذاذ الإيثانول 70٪.
    3. أدخل قسطرة 30 جيجا في وريد الذيل الجانبي. سيتم تصور قلس الدم في أنبوب PE10.
    4. ضعي شريط حرير على القسطرة لتثبيته.
    5. حقن FITC / TMR dextran أو غيرها من المسابير الفلورية (25 ميكروغرام من مكافحة CD31 المقترنة مع اليكسا 647) ، حسب الاقتضاء ، وفقا لمزيج من المسابير الفلورية18.
      ملاحظة: بالنسبة للمسابير الفلورية المترافقة مع الأجسام المضادة، قم بحقن 2 ساعة قبل جلسة التصوير.
  5. نقل الماوس من منصة جراحية إلى مرحلة التصوير.
  6. أدخل مسبار المستقيم للتحكم تلقائيا في درجة حرارة الجسم باستخدام نظام لوحة التدفئة المنزلية.
  7. أدخل نافذة تصوير البنكرياس في حامل النافذة المعد أثناء إعداد المجهر داخل الجسم(الشكل 2). بالنسبة للمجهر المقلوب، قد لا يكون حامل النافذة مطلوبا.
  8. إجراء التصوير داخل الفيتوريال.
    1. لتصوير البنكرياس، ابدأ بعدسة موضوعية منخفضة التكبير (على سبيل المثال، 4x) لمسح الرؤية الكاملة للبنكرياس في نافذة تصوير البنكرياس (مجال الرؤية الموصى به: 2500 × 2500 ميكرومتر).
    2. بعد تحديد المنطقة ذات الاهتمام، انتقل إلى عدسة هدف التكبير الأعلى (20x أو 40x) لإجراء التصوير على المستوى الخلوي (مجال الرؤية الموصى به: 500 × 500 ميكرومتر أو 250 × 250 ميكرومتر). في هذه التجربة، كان القرار الجانبي والمحازب حوالي 0.5 ميكرومتر و 3 ميكرومتر، على التوالي.
    3. إجراء التصوير ببنية z-stack أو الفاصل الزمني لمراقبة البنية ثلاثية الأبعاد أو الديناميكيات على المستوى الخلوي، مثل ترحيل الخلايا.
      ملاحظة: لتصوير البروتين الفلوري الذي يعبر عن خلايا الحيوانات المعدلة وراثيا (MIP-GFP)، كان من المقبول 30 ثانية من التعرض المتقطع بالليزر 488 نانومتر مع طاقة تصل إلى 0.43 كيلوواط دون bleaching ملحوظ أو تلف الأنسجة. لتصوير البروتينات الفلورية المسماة مع اليكسا 647، كانت قوة الليزر 640 نانومتر تصل إلى 0.17 كيلوواط مقبولة دون photobleaching ملحوظ أو تلف الأنسجة. التعرض الليزر الإثارة لفترات طويلة مع قوة فوق هذا الإعداد قد يؤدي إلى photobleaching أو تلف الأنسجة عن طريق السمية الضوئية. ضبط المكاسب والقوة الكافية لتصوير منطقة الاهتمام بشكل مناسب. يجب أن يكون الإعداد التفصيلي للمعلمات في المجهر داخل الحتمية فرديا لكل مجهر داخلفيتال يتم إعداده في المعهد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتيح الفحص المجهري داخل الجسم جنبا إلى جنب مع قاعدة دعم متكاملة إطار التصوير داخل الجسم البنكرياس التصوير طوليا على مستوى الخلوية البنكرياس في الماوس. يوفر هذا البروتوكول المزود بنافذة التصوير داخل الجسم البنكرياسي استقرار الأنسجة على المدى الطويل الذي يمكن من الحصول على التصوير عالي الدقة لتتبع الجزر الفردية لمدة تصل إلى 3 أسابيع. ونتيجة لذلك، يمكن تحقيق تصوير الفسيفساء لحقل رؤية ممتد، وإعادة بناء ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) للتصوير بالتكديس z، وتتبع طولي لنفس الموضع. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر المجهر داخلفيتال لدينا أربع قنوات (405 و 488 و 561 و 647 نانومتر) من الاستحواذ ، مما يتيح تصور الخلايا المتعددة المتزامنة مع تفاعلاتها.

للتصوير الأولي ، تم زرع النافذة في فأر C57BL/6N مع الأجسام المضادة CD31 المحقونة عن طريق الوريد المقترنة بفلورو 647 Alexa. تم تسهيل التصوير على نطاق واسع(الشكل 3A)والتصوير ثلاثي الأبعاد المكبر(الشكل 3B- D ، الفيديو التكميلي 1)للبنكرياس مع هذا النظام. تم تصور أنسجة البنكرياس مع الفلورة الذاتية ، وتم التعرف على الأوعية الدموية المجاورة المسماة بالأجسام المضادة CD31. لم يتم تحديد التذبذب بسبب التثاؤم أو التنفس ، مما أدى إلى متوسط التصوير بنسبة إشارة عالية إلى الضوضاء(الشكل 4). تم تصور خلايا Acinar ، التي تتطلب تصورا بدقة صغيرة في البنكرياس ، بوضوح في الصور المتوسطة.

لتصوير الجزر، تم استخدام فأر MIP-GFP. باستخدام طريقة التصوير الفسيفساء، عرض واسع المجال مع التصوير عالية الدقة تمكين التصور من الجزر مع الأوعية المجاورة (الشكل 5). وتم تحديد ما يقرب من 40-50 جزيرة في المنظر الميداني الواسع. ويمكن لهذه الطريقة التصوير مستقرة تسهيل مزيد من تتبع الجزر لمدة تصل إلى 3 أسابيع، كما هو مبين في دراسة سابقة (الشكل 6)18.

لتصوير الخلايا السرطانية، تم زرع الخلايا الحمراء PANC-1 NucLight مباشرة في البنكرياس الماوس أثناء الجراحة (الشكل 7). واستخدمت استراتيجية وضع العلامات المزدوجة، وتتألف من الخلايا الحمراء PANC-1 NucLight والأوعية القريبة الملطخة بمضادات CD31 المقترنة مع اليكسا 647. مع بروتوكولنا ، والتصوير واسع المجال لسرطان البنكرياس (الشكل 7A) ، الذي يحدد هامش الورم ، والتصوير ثلاثي الأبعاد عالية الدقة على مستوى الخلية الواحدة ، تم تحقيقه (الشكل 7B-D ، فيديوتكميلي 2).

Figure 1
الشكل 1:تصميم وصورة من نافذة التصوير داخل الجسم البنكرياس. (أ) عرض ثلاثي الأبعاد وعرضي لنافذة التصوير داخل الجسم البنكرياسي. ويرد وصف مخطط مفصل لحجم وقطر في الورقة السابقة18. (ب) صورة أمامية و الخلفية من نافذة التصوير البنكرياس. حقوق الطبع والنشر 2020 جمعية السكري الكورية من مرض السكري ميتاب J. 2020 44:1:193-198. أعيد طبعها بإذن من جمعية السكري الكورية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: صورة لتنفيذ نافذة التصوير داخل الجسم البنكرياس. يتم زرع نافذة تصوير البنكرياس داخل الجسم في الماوس في المرحلة الترجمية XYZ ويتم توصيل حامل غرفة التصوير المرفقة بجبل الميل بنافذة تصوير البنكرياس. حقوق الطبع والنشر 2020 جمعية السكري الكورية من مرض السكري ميتاب J. 2020 44:1:193-198. أعيد طبعها بإذن من جمعية السكري الكورية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:تصوير البنكرياس التمثيلي داخل الجسم في الماوس C57BL/6N. (أ)صورة واسعة المساحة و (ب) صورة 3D المكبرة للبنكرياس (الأخضر) وmicrovasculature (أحمر) في الماوس C57BL/6N. تم تسمية الأوعية بأجسام مضادة للCD31 مترافقة مع فلوروفور Alexa 647. (ج) صورة 3D أعيد بناؤها و (D) صورة سطح تقديم البنكرياس الماوس. شريط المقياس: 200 ميكرومتر (A) و50 ميكرومتر (B-D). انظر أيضا الفيديو التكميلي 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4:التصوير داخل الفيتية للخلية الأسينار والمفارس المجاورة. خلايا Acinar (خضراء) والمفارس المجاورة (أحمر) في الماوس C57BL/6N. تم تسمية السفن بأجسام مضادة للCD31 مترافقة مع فلوروفور Alexa 647. يوفر استقرار الأنسجة الذي يتم إنجازه مع نافذة تصوير البنكرياس صورة عالية نسبة الإشارة إلى الضوضاء. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5:التصوير التمثيلي داخل الجسم من الجزر البنكرياس في الماوس MIP-GFP. فسيفساء واسعة المساحة وصورة مكبرة من الجزر (الخضراء) والمجاورة vasculature (أحمر) معالجتها مع طريقة الإسقاط كثافة قصوى في البنكرياس من الماوس MIP-GFP. تم تسمية الأوعية بأجسام مضادة للCD31 مترافقة مع فلوروفور Alexa 647. شريط المقياس: 500 ميكرومتر (مساحة واسعة) و50 ميكرومتر (مكبر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6:التصوير الطولي داخل الفيتية من الجزر في البنكرياس من الماوس MIP-GFP. صورة طولية للزائل لمدة تصل إلى 3 أسابيع في البنكرياس في الماوس MIP-GFP. يشير كل رأس سهم بألوان مختلفة إلى نفس الجزر. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. حقوق الطبع والنشر 2020 جمعية السكري الكورية من مرض السكري ميتاب J. 2020 44:1:193-198. أعيد طبعها بإذن من جمعية السكري الكورية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: تصوير تمثيلي داخل الجسم لنموذج سرطان البنكرياس. (A) صورة واسعة المساحة و (B) صورة ثلاثية الأبعاد مكبرة للخلايا الحمراء المزروعة PANC-1 NucLight (حمراء) في الماوس عارية BALB / ج. تم تسمية الأوعية (الزرقاء) بأجسام مضادة للCD31 مترافقة مع فلوروفور Alexa 647. (ج) صورة 3D أعيد بناؤها و (D) صورة سطح تقديم سرطان البنكرياس في نموذج الماوس. شريط المقياس: 500 ميكرومتر (A) و50 ميكرومتر (B-D). انظر أيضا الفيديو التكميلي 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيديو التكميلي 1: في تصوير البنكرياس ثلاثي الأبعاد في الماوس C57BL/6N. في التصوير ثلاثي الأبعاد في الجسم الحي للبنكرياس (الأخضر) من الماوس C57BL/6N حقن عن طريق الوريد مع الأجسام المضادة CD31 المقترنة مع الفلوروفور اليكسا 647 (الأحمر). يتم تصوير شريط المقياس في الفيديو. يتوافق هذا الفيديو مع الشكل 3C, D. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

الفيديو التكميلي 2: في الجسم الحي سرطان البنكرياس 3D (PANC-1 NucLight الأحمر) التصوير في BALB / C عارية الماوس. في التصوير 3D فيفو من سرطان البنكرياس (الأحمر) زرعت في BALB / C عارية الماوس حقن عن طريق الوريد مع الأجسام المضادة CD31 المقترنة مع الفلوروفور اليكسا 647 (الأزرق). يتم تصوير شريط المقياس في الفيديو. يتوافق هذا الفيديو مع الشكل 7C, D. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البروتوكول الموصوف هنا يتكون من التصوير داخل الجسم البنكرياس باستخدام قاعدة دعم جديدة متكاملة نافذة التصوير داخل الجسم البنكرياس تعديل من نافذة التصوير البطني. من بين البروتوكولات المذكورة أعلاه ، فإن الخطوة الحرجة الأولى هي زرع نافذة تصوير البنكرياس داخل الجسم في الماوس. لتطبيق الغراء في النافذة، من المهم تطبيق الغراء بين هامش النافذة وزجاج الغطاء، ولكن ليس على أنسجة البنكرياس، كما أنه قد يقطع بشكل كبير التصوير داخل الجسم. ليس فقط الغراء نفسه بين الزجاج والأنسجة ولكن أيضا جزيئات الغبار المساعد قد تحفز تشتت الضوء أثناء التصوير إذا تم تطبيق الغراء مباشرة على الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون لتطبيق المادة اللاصقة آثار سامة وغير فسيولوجية على البنكرياس.

الخطوة الثانية هي كمية أنسجة البنكرياس الموضوعة على لوحة الأساس الداعمة للمعادن. لأن أنسجة البنكرياس هو هيكل ورقة مثل, حجم أنسجة البنكرياس على لوحة يحتاج إلى السيطرة عليها. إذا تم وضع حجم كبير جدا على اللوحة ، فقد يلتصق الغراء المطبق على هامش الحلقة بالأنسجة ، وقد يعوق تأثير الكتلة تغلغل البنكرياس. من ناحية أخرى، إذا تم وضع حجم صغير جدا على هناك، قد يكون مجال الرؤية التي يمكن تصورها محدودة. قد يتطلب هذا البروتوكول للجراحة على النافذة عدة تجارب لتلبية معيار ثابت.

بالنسبة للتصوير طويل الأجل على مدى فترة 3 أسابيع ، كانت القضية الأكثر إثارة للقلق هي الأضرار المحتملة لنافذة تصوير البنكرياس. يمكن أن يحدث تدمير غير مقصود لزجاج الغطاء في نافذة تصوير البنكرياس خلال فترة المراقبة طويلة الأجل. لمنع ذلك، يجب أن يكون موجودا الماوس مع النافذة بشكل منفصل، وينبغي إزالة الكائنات الصلبة مع حواف حادة من القفص. يجب النظر في القتل الرحيم للفئران إذا كان الغطاء الزجاجي ، إذا كانت هناك علامات شديدة للالتهاب بالقرب من النافذة ، أو إذا كان الحيوان يبدو في محنة. في تجربتنا ، كانت الفئران مع نافذة تصوير البنكرياس قادرة على تناول الطعام وممارسة الرياضة بشكل طبيعي عندما كان الانتعاش بعد الجراحة مناسبا ولم يتم تطوير أي مضاعفات أخرى.

في تجربتنا السابقة مع نافذة التصوير البطني ، فشلنا في الحصول على تصوير عالي الجودة على المستوى الخلوي بالإضافة إلى التتبع الطولي لنفس البقع على مدى عدة أيام. بالمقارنة مع نافذة التصوير البطني ، والتي توفر منصة متنوعة لمختلف أعضاء البطن ، يتم تحديد نافذة تصوير البنكرياس لتصوير البنكرياس وكذلك الأعضاء الأخرى الناعمة والتي تتأثر بسهولة بحركات مثل السينتاري والطحال والأمعاء الدقيقة. ومع ذلك، قد يكون الكبد والكلى غير قابلين للتدوير في إطار تصوير البنكرياس بسبب المساحة المحدودة.

في حين أن الجمع بين الماوس الفلوري والخلايا ومسابير الأجسام المضادة يمكن من تصور التفاعلات الديناميكية بين الخلايا البطانية وإما الجزر أو الخلايا السرطانية ، يمكن إعادة إنتاج البروتوكول الموصوف هنا مع مؤلفات أخرى من الخلايا ذات العلامات الفلورية أو المسابير الجزيئية المناسبة لكل حالة منها. وعلاوة على ذلك، من المتوقع تطبيقات توسعية متكاملة مع طريقتنا، مثل الماوس مراسل CpepSfGFP مع إفراز الأنسولين9،30، AAV8 بوساطة تسليم الجينات التي تستهدف أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS)31،أو نموذج الورم التقويمي32،33،34 التي الورم في الموقع يمكن أن تحفز تماما البيئة الدقيقة الورم، بما في ذلك الورم، والتنمية، والانبثاث35. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تدرس نماذج xenograft المشتقة من المريض باستخدام منصتنا36.

هناك بعض القيود التي يجب معالجتها في هذه الدراسة. أولا، حتى عندما استخدمنا القاعدة المعدنية لتحقيق الاستقرار، لم نتمكن من تحديد الإجهاد الميكانيكي الناجم عن الأنسجة من قبل القاعدة وزجاج الغطاء، مما قد يؤثر على تدفق الدم. ومع ذلك ، كما هو مبين في الأرقام المذكورة أعلاه ، فإن الحقن الوريدي لأجسام مضادة مضانة (CD31) أو dextran وصفت بشكل كاف السفينة مع عدم وجود منطقة غير متغلغلة مميزة ، مما يشير إلى تأثير ضئيل من الإجهاد الميكانيكي على تدفق الدم الطبيعي داخل أنسجة البنكرياس. ثانيا، لا يمكن تقييم ردود الفعل السلبية بسبب لاصقة في أنسجة البنكرياس. ومع ذلك، حاولنا تجنب لمس البنكرياس مع المواد اللاصقة بعناية قدر الإمكان لتجنب أي آثار إضافية. ثالثا، كما نوقش أعلاه، قد يؤثر التأثير غير المقصود للعوامل المخدرة علىحساسيةالأنسولين وإفرازه، كما هو موضح في الدراسة السابقة 9،27. في تجربتنا، مزيج من الكيتامين والإكسيلازين الناجم عن فرط السكر في الدم مقارنة بخليط من البلاط، زولازيبام، وزيلاسين. وينبغي إجراء دراسة أخرى التحقيق في تأثير التخدير على إفراز الأنسولين والتخدير السليم مع الحد الأدنى من الآثار السلبية ينبغي أن يتم اختيار وفقا لكل تجربة. رابعا، يركز تصوير البنكرياس على الجزء الذيل، ويمكن أن يكون تصوير الجزء الرأسي من البنكرياس محدودا بنافذتنا.

باختصار، تم تسهيل التصوير الطولي المستقر للبنكرياس على المستوى الخلوي لمدة تصل إلى عدة أسابيع من خلال نظام التصوير المدمج مع نافذة التصوير داخل الفيتية البنكرياسية المحسنة للتصوير في البنكرياس الحي. لأن التصوير داخل الأمعاء يوفر رؤى ديناميكية في بيولوجيا الخلايا والمناعة وبيولوجيا الورم ، يمكن أن يكون هذا البروتوكول طريقة مفيدة للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية لمختلف الأمراض التي تنطوي على البنكرياس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة بمنحة رقم 14-2020-002 من صندوق أبحاث SNUBH ومنحة المؤسسة الوطنية لبحوث كوريا (NRF) الممولة من الحكومة الكورية (NRF-2020R1F1A1058381، NRF-2020R1A2C3005694).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) Invitrogen A20006 Fluorescent probe for conjugate with antibody
BALB/C Nude OrientBio BALB/C Nude BALB/C Nude
BD Intramedic polyethylene tubing BD Biosciences 427401 PE10 catheter for connection with needle
C57BL/6N OrientBio C57BL/6N C57BL/6N
Cover glasses circular Marienfeld 0111520 Cover glass for pancreatic imaging window
FITC Dextran 2MDa Merck (Former Sigma Aldrich) FD200S For vessel identification
IMARIS 8.1 Bitplane IMARIS Image processing
Intravital Microscopy IVIM tech IVM-C Intravital Microscopy
IRIS Scissor JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD S-1107-10 This product can be replaced with the product from other company
Loctite 401 Henkel 401 N-butyl cyanoacrylate glue
Micro Needle holder JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD H-1126-10 This product can be replaced with the product from other company
Micro rectractor JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD 17004-03 This product can be replaced with the product from other company
Microforceps JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD F-1034 This product can be replaced with the product from other company
MIP-GFP The Jackson Laboratory 006864 B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J
Nylon 4-0 AILEE NB434 Non-Absorbable Suture
Omnican N 100 30G B BRAUN FT9172220S For Vascular Catheter, Use only Needle part
PANC-1 NucLightRed Custom-made Custom-made Made in laboratory
Pancreatic imaging window Geumto Engineering Custom order Pancreatic imaging window - custom order
Physiosuite Kent Scientific PS-02 Homeothermic temperature controller
Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 BD Biosciences 553708 Antibody for in vivo vessel labeling
Ring Forceps JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD F-1090-3 This product can be replaced with the product from other company
Rompun Bayer Rompun Anesthetic agent
TMR Dextran 65-85kDa Merck (Former Sigma Aldrich) T1162 For vessel identification
Window holder Geumto Engineering Custom order Window holder - custom order
Zoletil Virbac Zoletil 100 Anesthetic agent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A. Imaging in pancreatic disease. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 97-109 (2017).
  2. Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. Technologies for imaging the normal and diseased pancreas. Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).
  3. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
  4. Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed. Diabetes Care. 31, Suppl 2 165-169 (2008).
  5. Baetens, D., et al. Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice. Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).
  6. Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).
  7. Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
  8. Ravier, M. A., Rutter, G. A. Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes. Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).
  9. Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose. Science Reports. 11 (1), 603 (2021).
  10. Lee, E. M., et al. Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice. Islets. 10 (1), 25-39 (2018).
  11. Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. In vivo imaging of islet transplantation. Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).
  12. Mojibian, M., et al. Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).
  13. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
  14. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  15. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
  16. Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
  17. Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), 1024405 (2015).
  18. Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
  19. Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
  20. Park, I., et al. Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model. Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).
  21. Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy. Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).
  22. Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
  23. Hwang, Y., et al. In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver. Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).
  24. Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
  25. Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas. International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).
  26. National Institutes of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).
  27. Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice. Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).
  28. Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
  29. Cichocki, F., et al. GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity. Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).
  30. Zhu, S., et al. Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
  31. Reissaus, C. A., et al. A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).
  32. Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma. Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).
  33. Bisht, S., Feldmann, G. Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).
  34. Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).
  35. Feig, C., et al. The pancreas cancer microenvironment. Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).
  36. Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models. Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).

Tags

الطب، العدد 171،
استقر الطولي <em>في فيفو</em> الخلوية المستوى التصور من البنكرياس في نموذج مورين مع نافذة التصوير داخل الجسم البنكرياس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, I., Kim, P. Stabilized… More

Park, I., Kim, P. Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window. J. Vis. Exp. (171), e62538, doi:10.3791/62538 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter