Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

एक अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो के साथ एक मुरीन मॉडल में अग्न्याशय के वीवो सेलुलर-स्तर दृश्य में स्थिर देशांतर

Published: May 6, 2021 doi: 10.3791/62538
Automatic Translation
1, 2,3
1Department of Emergency Medicine, Seoul National University Bundang Hospital, 2Graduate School of Medical Science and Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KI for Health Science and Technology, Korea Advanced Institute of Science and Technology

Summary

विवो में अग्न्याशय की उच्च-संकल्प इमेजिंग अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो के साथ सुविधा प्रदान की गई थी।

Abstract

एक जीवित छोटे पशु मॉडल में अग्न्याशय के वीवो सेलुलर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग में प्रत्यक्ष तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण रहा है। पेट इमेजिंग विंडो के साथ हाल ही में इंट्राविटल इमेजिंग अध्ययन, वीवोमें पेट के अंगों में सेलुलर गतिशीलता के दृश्य को सक्षम करता है। हालांकि, माउस अग्न्याशय की नरम शीट जैसी वास्तुकला के कारण जो आसानी से फिजियोलॉजिकल आंदोलन (जैसे, परिस्टलसिस और श्वसन) से प्रभावित हो सकता है, माउस पैंक्रियाज में आइलेट्स या कैंसर कोशिकाओं की पहचान करने, ट्रैक करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए सेलुलर स्तर पर कई हफ्तों में वीवो इमेजिंग में स्थिर देशांतर करना मुश्किल था। इसके साथ ही, हम एक उपन्यास सहायक आधार, एक एकीकृत अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो को प्रत्यारोपित करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं, जो अग्न्याशय माइक्रोस्ट्रक्चर के देशांतर समय-चूक इंट्राविटल इमेजिंग के लिए आंत्र से अग्न्याशय को अलग कर सकता है। इमेजिंग विंडो के साथ वीवो इमेजिंग में देशांतर स्थिर दृश्य को सक्षम बनाता है, जो 3 सप्ताह की अवधि में आइलेट्स की ट्रैकिंग और माइक्रोस्ट्रक्चर के उच्च-रिज़ॉल्यूशन त्रि-आयामी इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, जैसा कि यहां ऑर्थोटोपिक अग्नाशय के कैंसर मॉडल में सबूत है। हमारी विधि के साथ, आगे इंट्राविटल इमेजिंग अध्ययन सेलुलर स्तर पर अग्न्याशय से जुड़े विभिन्न रोगों के रोगविज्ञान को स्पष्ट कर सकते हैं।

Introduction

अग्न्याशय पाचन तंत्र में एक एक्सोक्राइन समारोह और खून में हार्मोन स्राव के एक अंतःस्रावी समारोह के साथ एक पेट अंग है। अग्न्याशय के उच्च संकल्प सेलुलर इमेजिंग अग्न्याशय, अग्नाशय के कैंसर, और मधुमेह मेलिटस1सहित अग्न्याशय से जुड़े विभिन्न रोगों के रोगविज्ञान प्रकट कर सकता है । पारंपरिक नैदानिक इमेजिंग उपकरण जैसे गणना टोमोग्राफी, चुंबकीय संकल्प इमेजिंग, और अल्ट्रासोनोग्राफी नैदानिक क्षेत्र में व्यापक रूप से उपलब्ध हैं1,2। हालांकि, ये इमेजिंग तौर-तरीके केवल संरचनात्मक या शारीरिक परिवर्तनों की कल्पना करने तक सीमित हैं, जबकि सेलुलर या आणविक स्तर पर परिवर्तन निर्धारित नहीं किए जा सकते हैं । यह देखते हुए कि मनुष्यों में मधुमेह मेलिटस या अग्नाशय के कैंसर में आणविक परिवर्तन निदान3,4 से पहले 10 साल से अधिक शुरू कर सकते हैं, अव्यक्त अवधि केदौरानउनके आणविक संक्रमण से अग्नाशय के रोगों का पता लगाने के लिए एक प्रारंभिक निदान और एक समय पर हस्तक्षेप प्रदान करने की क्षमता है । इस प्रकार, इमेजिंग जो संकल्प की सीमाओं को दूर करेगा और कार्य में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा, अग्नाशय के कैंसर का शीघ्र निदान या मधुमेह की प्रगति के दौरान आइलेट्स के परिवर्तन की उन्नत पहचान प्रदान करके उल्लेखनीय रूप से ध्यान प्राप्त करेगा5।

विशेष रूप से आइलेट्स के साथ, न्यूक्लियर इमेजिंग, बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग, और ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी को गैर-इनवेसिव आइलेट इमेजिंग तकनीक6के रूप में सुझाया गया है। हालांकि, इन तरीकों का संकल्प काफी कम है, जिसमें कई दसियों से लेकर सैकड़ों माइक्रोमीटर तक के विशिष्ट मूल्य हैं, जो आइलेट्स में सेलुलर स्तर पर परिवर्तनों का पता लगाने के लिए एक सीमित क्षमता प्रदान करते हैं। दूसरी ओर, पूर्व वीवो7, 8(उदाहरण केलिए, आइलेट्स के पिछले उच्च-संकल्प अध्ययन किए गए थे। अग्न्याशय का टुकड़ा या पाचन), गैर-फिजियोलॉजिकल9 (उदाहरण के लिए, अग्न्याशय का बाहरीकरण), और हेट्रोटोपिक स्थितियां10,11,12 (उदाहरण के लिए, गुर्दे कैप्सूल के नीचे प्रत्यारोपण, जिगर के अंदर, और आंख के पूर्वकाल कक्ष में), जो उनकी व्याख्या और नैदानिक प्रभावों को प्रतिबंधित करता है। यदि वीवो में,फिजियोलॉजिक, और उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के ऑर्थोटोपिक मॉडल की स्थापना की जा सकती है, तो यह अग्नाशय के आइलेट्स की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण मंच होगा।

इंट्राविटल इमेजिंग, जो एक जीवित जानवर में एक सूक्ष्म संकल्प स्तर पर रोगविज्ञान का पता चलता है, हाल ही में महान ध्यान13प्राप्त हुआ है । वीवो इमेजिंग विधियों में से, एक पेट इमेजिंग विंडो14के विकास, जो माउस के पेट में एक खिड़की प्रत्यारोपित करता है, ने उपन्यास निष्कर्षों की खोज की अनुमति दी है (यानी, प्रारंभिक यकृत मेटास्टेसिस15 का एक पूर्व-माइक्रोमेटास्टेसिस चरण और आंतों के एपिथेलियम16में स्टेम सेल रखरखाव का तंत्र)। हालांकि पेट इमेजिंग खिड़की मूल्यवान परिणाम प्रदान करता है, अग्न्याशय के लिए इस खिड़की के अनुप्रयोगों और जिसके परिणामस्वरूप इंट्राविटल इमेजिंग अग्न्याशय से जुड़े रोगों के आधार पर अनुसंधान, बड़े पैमाने पर जांच नहीं की गई है ।

मानव अग्न्याशय की अच्छी तरह से परिभाषित ठोस अंग विशेषताओं के विपरीत, माउस का अग्न्याशय एक फैलाव वितरित नरम ऊतक जैसी संरचनाहै 17। इसलिए, यह लगातार परिध और श्वसन सहित शारीरिक आंदोलनों से प्रभावित होता है। अग्न्याशय के लिए एक पेट इमेजिंग खिड़की के आवेदन पर पिछले अध्ययन से पता चला है कि भटक गति के कारण हुआ-आंत्र आंदोलनों से प्रेरित कलाकृतियों18। परिणामस्वरूप औसत छवि में गंभीर धुंधला देखा गया, जिसने माइक्रोस्केल संरचनाओं के दृश्य और पहचान को बाधित किया।

इसके साथ, हम अग्न्याशय से जुड़े रोगों में देशांतर सेलुलर स्तर की घटनाओं की जांच करने के लिए इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी19,20 के साथ संयुक्त आधार एकीकृत अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो का समर्थन करने वाले उपन्यास के उपयोग का वर्णन करते हैं। पिछले अध्ययन18में कार्यप्रणाली का विस्तृत विवरण के अलावा, अग्न्याशय से जुड़े विभिन्न रोगों के लिए अग्नाशय इमेजिंग विंडो के विस्तारित आवेदन को इस पेपर में संबोधित किया जाएगा। इस प्रोटोकॉल में, एक कस्टम-निर्मित वीडियो-रेट लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सिस्टम का उपयोग इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी सिस्टम के रूप में किया गया था। चार लेजर मॉड्यूल (405, 488, 561, और 640 एनएम पर तरंगदैर्ध्य) का उपयोग एक उत्तेजन स्रोत के रूप में किया गया था, और बैंडपास फिल्टर (बीपीएफ 1) के माध्यम से फोटोमुलिटैप्टल ट्यूब (पीएमटी) द्वारा उत्सर्जन संकेतों के चार चैनलों का पता लगाया गया था; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40) । लेजर स्कैनिंग में एक घूर्णन बहुभुज दर्पण (एक्स-एक्सिस) और एक गैलेवनोमीटर स्कैनिंग मिरर (वाई-एक्सिस) शामिल था जिसने वीडियो-दर स्कैनिंग (30 फ्रेम प्रति सेकंड) सक्षम किया। इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी के बारे में विस्तृत जानकारी पिछलेअध्ययनों में 10 , 18,19, 20,21,22,23केबारे में वर्णित की गई है .

हमारे पिछले आइलेट अध्ययन18में, हमने ट्रांसजेनिक माउस मॉडल (एमआईपी-जीएफपी)24 का उपयोग करके लाइव चूहों में आइलेट्स को सफलतापूर्वक और स्थिर रूप से चित्रित किया जिसमें आइलेट्स को जीएफपी के साथ टैग किया गया था। विधि ने 1 सप्ताह की अवधि में आइलेट्स में परिवर्तनों के उच्च-संकल्प दृश्य को सक्षम किया। इसने 3 सप्ताह तक एक ही आइलेट्स की इमेजिंग की सुविधा भी प्रदान की, जो मधुमेहमेलिटस 18के रोगजनन के दौरान कार्यात्मक ट्रैकिंग या निगरानी के लिए अग्नाशय के आइलेट्स के दीर्घकालिक अध्ययनों की व्यवहार्यता का सुझाव देता है। इसके अलावा, हमने एक आर्थोटोपिक अग्नाशय का कैंसर मॉडल विकसित किया जिसमें फ्लोरोसेंट अग्नाशय की कैंसर कोशिकाएं (पैनी-1 न्यूलाइट रेड)25 को सीधे माउस के अग्न्याशय में प्रत्यारोपित किया गया था। अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो के आवेदन के साथ, इस मॉडल को अग्नाशय के कैंसर के ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में सेलुलर और आणविक रोगविज्ञान की जांच करने और उपन्यास दवा उम्मीदवारों की चिकित्सीय निगरानी के लिए एक मंच के रूप में उपयोग किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस पत्र में वर्णित सभी प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के8 वें संस्करण के अनुसार आयोजित किया गया (२०११)26 और कोरिया उन्नत विज्ञान और प्रौद्योगिकी संस्थान (KAIST) और सियोल राष्ट्रीय विश्वविद्यालय Bundang अस्पताल (SNUBH) में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित ।

1. खिड़की और अन्य सामग्रियों की तैयारी

  1. कस्टम डिजाइन अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग खिड़की पेट गुहा18 (चित्रा 1A,बी)में आंत्र से अग्न्याशय को अलग करने के लिए । पिछले अध्ययन18के अनुपूरक आंकड़े में खिड़की का विस्तृत खाका बताया गया है .
  2. इंट्राविटल अग्नाशय इमेजिंग के लिए C57BL/6N चूहों, 8-12 सप्ताह पुराने पुरुषों का उपयोग करें । 18 पोत लेबलिंग के उद्देश्य से, इमेजिंग से 2 घंटे पहले एलेक्सा 647 फ्लोरोफोर, 2 घंटे के साथ संयुक्त एंटी-सीडी31एंटीबॉडी इंजेक्ट करें।
  3. आइलेट्स स्टडी के लिए ट्रांसजेनिक माउस मॉडल तैयार करें, जिसमें आइलेट्स को फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के साथ टैग किया गया हो। यहां, हमने एमआईपी-जीएफपी का उपयोग किया, जहां माउस इंसुलिन 1 जीन प्रमोटर के नियंत्रण में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त किया गया था, जो माउस24में सभी आइलेट्स की बीटा कोशिकाओं में सक्रिय है।
  4. अग्नाशय के कैंसर के अध्ययन के लिए, ट्रांसजेनिक कैंसर कोशिकाओं को एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन और BALB/C नग्न चूहों के साथ टैग तैयार करें । इस अध्ययन में पैनी-1 न्यूलाइट रेड सेल्स का इस्तेमाल किया गया। PANC-1 कैंसर कोशिकाओं25 NucLight लाल फ्लोरोसेंट जांच के साथ लेबल थे ।
  5. सभी सर्जिकल उपकरणों को स्टरलाइज करें, ग्लास (खूंटी या नहीं के साथ) कवर करें, और ऑटोक्लेव का उपयोग करके इमेजिंग खिड़कियां।
  6. भड़काऊ प्रतिक्रिया को रोकने और जैव अनुकूलता बढ़ाने के लिए कवर ग्लास पर खूंटी कोटिंग लागू करें, जो दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए उपयुक्त है।

2. सर्जरी

  1. एक बाँझ शल्य चिकित्सा मंच तैयार करें और 70% इथेनॉल के साथ सतहों को निष्फल करें।
    नोट: देशांतर इमेजिंग सत्र के लिए, aseptic तकनीक आवश्यक है।
  2. टिलेटामाइन/जोलाजेपाम (30 मिलीग्राम/किलो) और जाइलाज़ीन (10 मिलीग्राम/किलो) के मिश्रण के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें ।
    नोट: हाइपरग्लाइसेमिया के प्रतिकूल प्रभाव के कारण केटामाइन के बजाय टिलेटामाइन/ज़ोलाजेपैम के उपयोग की सिफारिश की जाती है। प्रयोग9,27के उद्देश्य से इष्टतम संज्ञाहरण का चयन किया जाना चाहिए .
  3. एक होमथेर्मिक नियंत्रित हीटिंग पैड के साथ गुदा जांच का उपयोग करके शरीर के तापमान की निगरानी करें।
  4. माउस के बाएं पार्श्व को शेव करें और बारी-बारी से शराब और आयोडीन आधारित स्क्रब के तीन राउंड लगाएं।
    नोट: यदि डिपिलेटरी क्रीम का उपयोग किया जाता है, तो रासायनिक जलने से बचने के लिए 1 मिनट से अधिक समय न छोड़ें।
  5. माउस के बाएं पार्श्व पर 1.5 सेमी चीरा बनाएं और त्वचा और मांसपेशियों को विच्छेदन करें।
  6. चीरा मार्जिन में काले या नायलॉन 4-0 सीवन के साथ पर्स-स्ट्रिंग सीवन करें।
  7. चीरा पर माइक्रो रिट्रैक्टर का प्रयोग करें और धीरे-धीरे तिल्ली को बेनकाब करें।
  8. ध्यान से अंगूठी संदंश के साथ तिल्ली पूल और अग्न्याशय की पहचान।
  9. माउस के पार्श्व में खिड़की रखें और खिड़की के खुले स्थान के माध्यम से तिल्ली और अग्न्याशय पारित करें। अग्न्याशय के हेरफेर के लिए बहुत गैर-यहूदी होना चाहिए क्योंकि यह रक्तस्राव या अग्नाशयशोथ का कारण बन सकता है
  10. धीरे-धीरे इमेजिंग खिड़की की प्लेट पर अग्न्याशय रखें; तिल्ली खिड़की के खुले स्थान पर रखा जाएगा।
  11. कैंसर सेल अध्ययन के लिए, पैनी-1 न्यूलाइट रेड (1.0 x 106 कोशिकाओं) को सीधे अग्न्याशय में इंजेक्ट करें।
    नोट: ऑर्थोटोपिक मानव अग्नाशय के कैंसर xenografts इमेजिंग के लिए, इस तरह के PANC-1 या अंय मानव अग्नाशय के कैंसर सेल के रूप में कैंसर सेल के प्रत्यक्ष प्रत्यारोपण28की सुविधा हो सकती है । इंट्राविटल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ कल्पना करने के लिए, पैन-1 कोशिकाओं को न्यूलाइट रेड लेंटीवायरल रिएजेंट का उपयोग करके लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ स्थानांतरित किया गया था जो नाभिक29को लेबल करता है। हालांकि अधिकतम इंजेक्शन की मात्रा अनिश्चित है, अग्न्याशय में दबाव प्रभाव से बचने के लिए संभव के रूप में मात्रा में कमी।
  12. इमेजिंग विंडो के मार्जिन पर एन-ब्यूटिल सायनोक्रिलेट गोंद की बूंदें लगाएं।
    1. लागू गोंद की मात्रा को कम करने के लिए, आवेदन के लिए एक 31 जी कैथेटर सुई का उपयोग करें। यदि ड्रॉप की मात्रा बड़ी है, तो ऊतक अनजाने में खिड़की या कवर ग्लास का पालन करेगा।
  13. धीरे-धीरे इमेजिंग विंडो के मार्जिन पर 12 एमएम राउंड कवर ग्लास लगाएं।
  14. सीवन लूप को खिड़की के पार्श्व नाली में फिट करने के लिए खींचें और इसे तीन बार बांधें।
  15. इन चूहों के जागने पर तंग टांके के व्यवधान को रोकने के लिए गाँठ की अधिकतम समीपस्थ साइट को काट लें।
  16. चूहों को संज्ञाहरण (2-3 घंटे) से उबरने दें और दर्द से राहत के लिए गर्दन या जानवर के कूल्हे के आधार पर ढीली त्वचा में केटोप्रोफेन (5 मिलीग्राम/किलो, चमड़े के नीचे) इंजेक्ट करें। हर 12 घंटे में दर्द के संकेतों के लिए पुनर्मूल्यांकन और केटोप्रोफेन को 1-3 दिनों के लिए हर 24 घंटे में माना जाना चाहिए।
    नोट: Analgesia ग्लूकोज 9 के जवाब मेंइंसुलिनस्राव को प्रभावित करता है । प्रायोगिक उद्देश्य के लिए एनाल्जेसिया की पसंद और समय को व्यक्तिगत किया जाना चाहिए।
  17. पिंजरे में खिड़की के संपर्क से बचने के लिए पर्याप्त बिस्तर के साथ पिंजरे में माउस को समायोजित करें। खिड़की की सर्जरी के बिना चूहों के साथ घर आवास से बचें।

3. इंट्राविटल इमेजिंग

  1. लेजर पावर सहित इंट्राविटल माइक्रोस्कोप चालू करें।
  2. हीटिंग पैड चालू करें और होमथॉर्मिक रेगुलेशन को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, यदि कोई होमथॉथिक विनियमन नहीं है तो लगातार नियंत्रण के साथ एक निष्क्रिय हीटिंग पैड या दीपक का उपयोग करें।
  3. तिलेटामाइन/जोलाजेपाम (30 मिलीग्राम/किलो) और जाइलाज़ीन (10 मिलीग्राम/किलो) के मिश्रण के साथ इंट्रामस्कुलर एनेस्थीसिया करें ।
    नोट: हाइपरग्लाइसेमिया के प्रतिकूल प्रभाव के कारण केटामाइन के बजाय टिलेटामाइन/ज़ोलाजेपैम के उपयोग की सिफारिश की जाती है। प्रयोगों के उद्देश्य से इष्टतम संज्ञाहरण का चयन किया जाना चाहिए9,27.
  4. इंजेक्शन के लिए एक संवहनी कैथेटर डालें।
    1. एक टूनीकेट आवेदन के विकल्प के रूप में सूचकांक और तीसरी उंगली के साथ पूंछ के समीपस्थ पक्ष पर दबाव लागू करें। जरूरत पड़ने पर पूंछ को दीपक से गर्म करें।
    2. 70% इथेनॉल स्प्रे के साथ पूंछ नस को स्टरलाइज करें।
    3. पार्श्व पूंछ नस में एक 30 जी कैथेटर डालें। रक्त के regurgitation PE10 ट्यूब में कल्पना की जाएगी।
    4. इसे स्थिर करने के लिए कैथेटर पर सिल्क टेप लगाएं।
    5. फ्लोरोसेंट जांच के संयोजन के अनुसार, उपयुक्त रूप से, फिटसी/टीएमआर डेक्सट्रान या अन्य फ्लोरोसेंट जांच (एलेक्सा 647 के साथ संयुग्मित एंटी-सीडी31 के25माइक्रोन) को इंजेक्ट करें।
      नोट: फ्लोरोसेंट संयुग्मित एंटीबॉडी जांच के लिए, इमेजिंग सत्र से पहले 2 घंटे इंजेक्ट करें।
  5. माउस को सर्जिकल प्लेटफॉर्म से इमेजिंग स्टेज में ट्रांसफर करें।
  6. होमथॉर्मिक हीटिंग पैड सिस्टम के साथ शरीर के तापमान को स्वचालित रूप से नियंत्रित करने के लिए एक गुदा जांच डालें।
  7. इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी सेटअप(चित्रा 2)के दौरान तैयार विंडो होल्डर में अग्नाशय इमेजिंग विंडो डालें। एक उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए, एक खिड़की धारक की आवश्यकता नहीं हो सकती है ।
  8. इंट्राविटल इमेजिंग करें।
    1. अग्न्याशय इमेजिंग के लिए, अग्नाशय इमेजिंग विंडो (अनुशंसित दृश्य क्षेत्र: 2500 x 2500 माइक्रोन) में अग्न्याशय के पूरे दृश्य को स्कैन करने के लिए कम आवर्धन उद्देश्य लेंस (उदाहरण के लिए, 4x) के साथ शुरू करें।
    2. ब्याज के क्षेत्र के निर्धारण के बाद, सेलुलर स्तर इमेजिंग (अनुशंसित क्षेत्र: 500 x 500 माइक्रोन या 250 x 250 माइक्रोन) करने के लिए उच्च आवर्धन उद्देश्य लेंस (20x या 40x) पर स्विच करें। इस प्रयोग में, पार्श्व और अक्षीय संकल्प क्रमशः लगभग 0.5 माइक्रोन और 3 माइक्रोन था।
    3. सेल माइग्रेशन जैसे 3डी संरचना या सेलुलर-स्तर की गतिशीलता का निरीक्षण करने के लिए जेड-स्टैक या टाइम-लैप्स इमेजिंग करें।
      नोट: ट्रांसजेनिक जानवरों (एमआईपी-जीएफपी) की कोशिकाओं को व्यक्त करने वाले फ्लोरोसेंट प्रोटीन इमेजिंग के लिए, 0.43 मिलियन तक बिजली के साथ आंतरायिक 488 एनएम लेजर एक्सपोजर के 30 एस ध्यान देने योग्य फोटोब्लैचिंग या ऊतक क्षति के बिना सहनीय था। एलेक्सा 647 के साथ लेबल फ्लोरोसेंट प्रोटीन इमेजिंग के लिए, 0.17 मीटर तक 640 एनएम लेजर पावर बिना ध्यान देने योग्य फोटोब्लैचिंग या ऊतक क्षति के सहनीय थी। इस सेटिंग के ऊपर एक शक्ति के साथ लंबे समय तक उत्तेजन लेजर एक्सपोजर फोटोटॉक्सीसिटी द्वारा फोटोब्लैचिंग या ऊतक क्षति का कारण बन सकता है। उचित हित के क्षेत्र की छवि के लिए पर्याप्त लाभ और शक्ति को समायोजित करें। संस्थान में तैयार प्रत्येक इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी के लिए इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी में मापदंडों की विस्तृत स्थापना को व्यक्तिगत किया जाना चाहिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी सहायक आधार एकीकृत अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो के साथ संयुक्त एक माउस में अग्न्याशय के अनुनादीय सेलुलर स्तर इमेजिंग सक्षम बनाता है। अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो के साथ यह प्रोटोकॉल दीर्घकालिक ऊतक स्थिरता प्रदान करता है जो 3 सप्ताह तक व्यक्तिगत आइलेट्स को ट्रैक करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के अधिग्रहण को सक्षम बनाता है। नतीजतन, देखने के विस्तारित क्षेत्र के लिए मोज़ेक इमेजिंग, जेड-स्टैक इमेजिंग के त्रि-आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण, और एक ही स्थिति की देशांतर ट्रैकिंग प्राप्त की जा सकती है। इसके अलावा, हमारी इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी अधिग्रहण के चार चैनल (405, 488, 561 और 647 एनएम) प्रदान करती है, जो उनकी बातचीत के साथ एक साथ कई सेल दृश्य को सक्षम बनाती है।

प्रारंभिक इमेजिंग के लिए, खिड़की एक C57BL/6N माउस में प्रत्यारोपित किया गया था नसों के साथ नसों में इंजेक्शन विरोधी CD31 एंटीबॉडी एक एलेक्सा ६४७ फ्लोरोफोर के साथ संयुग्मित । इस प्रणाली के साथ विस्तृत क्षेत्र इमेजिंग(चित्रा 3 ए)और बढ़ाया 3डी इमेजिंग(चित्रा 3बी-डी,अनुपूरक वीडियो 1)की सुविधा थी। अग्नाशय के ऊतकों को ऑटोफ्लोरेसेंस के साथ कल्पना की गई थी, और एंटी-सीडी 31 एंटीबॉडी के साथ लेबल किए गए आसन्न वाक्यूलेचर की पहचान की गई थी। या तो परिस्कालसिस या श्वसन के कारण दोलन की पहचान नहीं की गई थी, जिसके परिणामस्वरूप उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात(चित्र 4)के साथ औसत इमेजिंग होती है। असिनर कोशिकाओं, जो अग्न्याशय में एक माइक्रोस्केल संकल्प पर दृश्य की आवश्यकता होती है, स्पष्ट रूप से औसत छवियों में कल्पना की गई थी ।

आइलेट्स की इमेजिंग के लिए, एक एमआईपी-जीएफपी माउस का उपयोग किया गया था। मोज़ेक इमेजिंग विधि का उपयोग करके, उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के साथ एक व्यापक क्षेत्र दृश्य ने आसन्न वाक्यूलेचर(चित्र 5)के साथ आइलेट्स के दृश्य को सक्षम किया। व्यापक क्षेत्र के दृश्य में लगभग 40-50 आइलेट्स की पहचान की गई थी। यह स्थिर इमेजिंग विधि 3 सप्ताह तक आइलेट्स की ट्रैकिंग को और सुविधाजनक बना सकती है, जैसा कि पिछले अध्ययन(चित्रा 6)18)में दिखाया गया है।

कैंसर सेल इमेजिंग के लिए, PANC-1 NucLight लाल कोशिकाओं को सीधे सर्जरी के दौरान माउस अग्न्याशय में प्रत्यारोपित किया गया(चित्रा 7)। एक दोहरी लेबलिंग रणनीति का उपयोग किया गया था, जिसमें पैन-1 न्यूकलाइट लाल कोशिकाएं और आस-पास के जहाजों से मिलकर एलेक्सा 647 के साथ संयुक्त रूप से विरोधी सीडी 31 के साथ दाग दिया गया था। हमारे प्रोटोकॉल के साथ, अग्नाशय के कैंसर(चित्रा 7A)की व्यापक क्षेत्र इमेजिंग, जो ट्यूमर के मार्जिन को चित्रित करती है, और एकल-कोशिका स्तर पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी इमेजिंग, हासिल की गई(चित्रा 7B-डी, अनुपूरक वीडियो 2)।

Figure 1
चित्रा 1:अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो का डिजाइन और फोटोग्राफ। (A)अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो का 3डी और क्रॉस-सेक्शनल व्यू । आकार और व्यास का एक विस्तृत खाका पिछले कागज18में वर्णित है । (ख)अग्नाशय इमेजिंग विंडो की पूर्वकाल और पीछे की तस्वीर। कॉपीराइट २०२० मधुमेह Metab J. २०२० 44:1:193-198 से कोरियाई मधुमेह एसोसिएशन । कोरियाई मधुमेह एसोसिएशन से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो के कार्यान्वयन की तस्वीर। एक अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग खिड़की XYZ ट्रांसलेशनल चरण में माउस में प्रत्यारोपित किया जाता है और झुकाव माउंट से जुड़े इमेजिंग चैंबर धारक अग्नाशय इमेजिंग खिड़की से जुड़ा हुआ है। कॉपीराइट २०२० मधुमेह Metab J. २०२० 44:1:193-198 से कोरियाई मधुमेह एसोसिएशन । कोरियाई मधुमेह एसोसिएशन से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:C57BL/6N माउस में प्रतिनिधि इंट्राविटल अग्नाशय इमेजिंग । (A)वाइड-एरिया इमेज और(बी)C57BL/6N माउस में अग्न्याशय (हरे) और इसके माइक्रोवसकुलेचर (लाल) की 3डी छवि को बढ़ाया गया है । जहाजों को एलेक्सा 647 फ्लोरोफोर के साथ संयुग्मित एंटी-सीडी 31 एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाता है। (C)3डी खंगाला छवि और(D)माउस अग्न्याशय की सतह प्रतिपादन छवि । स्केल बार: 200 माइक्रोन (ए) और 50 माइक्रोन (बी-डी)। इसके अलावा देखें सप्लीमेंट्री वीडियो 1। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:असिनर सेल और आसन्न वैक्यूलेचर की इंट्राविटल इमेजिंग। C57BL/6N माउस में Acinar कोशिकाओं (हरे) और आसन्न वाक्यूलेचर (लाल) । जहाजों को एलेक्सा 647 फ्लोरोफोर के साथ संयुग्मित एंटी-सीडी 31 एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया है। अग्नाशय इमेजिंग खिड़की के साथ पूरा ऊतक स्थिरता एक उच्च संकेत से शोर अनुपात छवि प्रदान करता है । स्केल बार: 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5:एमआईपी-जीएफपी माउस में अग्नाशय के आइलेट्स की प्रतिनिधि इंट्राविटल इमेजिंग। व्यापक क्षेत्र पच्चीकारी और आइलेट्स (हरे) और आसन्न वाक्यूल्चर (लाल) की बढ़ाया छवि एमआईपी-जीएफपी माउस के अग्न्याशय में अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण विधि के साथ संसाधित। जहाजों को एलेक्सा 647 फ्लोरोफोर के साथ संयुग्मित एंटी-सीडी 31 एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाता है। स्केल बार: 500 माइक्रोन (विस्तृत क्षेत्र) और 50 माइक्रोन (बढ़ाया) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6:एमआईपी-जीएफपी माउस के अग्न्याशय में आइलेट्स की देशांतर इंट्राविटल इमेजिंग। एमआईपी-जीएफपी माउस में अग्न्याशय में 3 सप्ताह तक आइलेट्स की देशांतर छवि। विभिन्न रंगों के साथ प्रत्येक तीर सिर एक ही आइलेट्स इंगित करता है। स्केल बार: 100 माइक्रोन। कॉपीराइट २०२० मधुमेह Metab J. २०२० 44:1:193-198 से कोरियाई मधुमेह एसोसिएशन । कोरियाई मधुमेह एसोसिएशन से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7:अग्नाशय के कैंसर मॉडल का प्रतिनिधि इंट्राविटल इमेजिंग। (ए)वाइड-एरिया इमेज और(बी)बाल्ब/सी न्यूड माउस में प्रत्यारोपित पैनसी-1 न्यूलाइट रेड सेल्स (लाल) की 3डी इमेज बढ़ाया गया । जहाजों (नीले) को एलेक्सा 647 फ्लोरोफोर के साथ संयुग्मित एंटी-सीडी31 एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाता है। (C)3डी खंगाला छवि और(D)माउस मॉडल में अग्नाशय के कैंसर की सतह प्रतिपादन छवि । स्केल बार: 500 माइक्रोन (ए) और 50 माइक्रोन (बी-डी)। इसके अलावा देखें सप्लीमेंट्री वीडियो 2। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक वीडियो 1: C57BL/6N माउस में वीवो 3डी अग्नाशय इमेजिंग में। C57BL/6N माउस के अग्न्याशय (हरे) के वीवो 3 डी इमेजिंग में नसों के साथ एक एंटी-सीडी 31 एंटीबॉडी के साथ इंजेक्शन दिया गया एलेक्सा 647 फ्लोरोफोर (लाल)। वीडियो में स्केल बार को दर्शाया गया है। यह वीडियो चित्रा 3C,डीसे मेल खाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक वीडियो 2: वीवो 3 डी अग्नाशय के कैंसर में (PANC-1 NucLight लाल) BALB/C नग्न माउस में इमेजिंग । बाल्ब/सी न्यूड माउस में प्रत्यारोपित अग्नाशय के कैंसर (लाल) के वीवो 3 डी इमेजिंग में नसों के साथ एक एंटी-सीडी 31 एंटीबॉडी के साथ इंजेक्शन लगाया गया एलेक्सा ६४७ फ्लोरोफोर (नीला) के साथ संयुग्मित । वीडियो में स्केल बार को दर्शाया गया है। यह वीडियो चित्रा 7C,डीसे मेल खाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल में एक उपन्यास का समर्थन करने वाले आधार एकीकृत अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो का उपयोग करके अग्न्याशय की इंट्राविटल इमेजिंग शामिल है जो पेट इमेजिंग विंडो से संशोधित है। ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल में, पहला महत्वपूर्ण कदम माउस में इंट्राविटल अग्नाशय इमेजिंग विंडो का प्रत्यारोपण है। खिड़की में गोंद के आवेदन के लिए, खिड़की और कवर ग्लास के मार्जिन के बीच गोंद को लागू करना महत्वपूर्ण है, लेकिन अग्नाशय के ऊतकों पर नहीं, क्योंकि यह इंट्राविटल इमेजिंग को काफी बाधित कर सकता है। न केवल कांच और ऊतक के बीच गोंद बल्कि सहायक धूल कण इमेजिंग के दौरान प्रकाश बिखरने को प्रेरित कर सकते हैं यदि गोंद सीधे ऊतक पर लागू होता है। इसके अलावा, चिपकने वाले के आवेदन अग्न्याशय पर विषाक्त और गैर शारीरिक प्रभाव हो सकता है।

दूसरा कदम धातु का समर्थन आधार प्लेट पर रखा अग्नाशय के ऊतकों की मात्रा है। क्योंकि अग्नाशय के ऊतक एक चादर की तरह संरचना है, थाली पर अग्नाशय के ऊतकों की मात्रा को नियंत्रित करने की जरूरत है । यदि प्लेट पर बहुत बड़ी मात्रा रखी जाती है, तो अंगूठी के मार्जिन पर लागू गोंद ऊतक का पालन कर सकता है, और बड़े पैमाने पर प्रभाव अग्न्याशय के पर्फ्यूजन को बाधित कर सकता है। दूसरी ओर, यदि वहां बहुत छोटी मात्रा रखी जाती है, तो दृश्य का क्षेत्र सीमित हो सकता है। खिड़की पर सर्जरी के इस प्रोटोकॉल के लिए एक सुसंगत मानक को पूरा करने के लिए कई परीक्षणों की आवश्यकता हो सकती है।

3 सप्ताह की अवधि में दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए, सबसे संबंधित मुद्दा अग्नाशय इमेजिंग खिड़की को संभावित नुकसान था। अग्नाशय इमेजिंग खिड़की में कवर ग्लास का अनपेक्षित विनाश दीर्घकालिक अवलोकन अवधि के दौरान हो सकता है। इसे रोकने के लिए, खिड़की के साथ माउस को अलग से रखा जाना चाहिए, और तेज किनारों वाली कठोर वस्तुओं को पिंजरे से हटा दिया जाना चाहिए। चूहों की इच्छामृत्यु पर विचार किया जाना चाहिए कवर ग्लास तोड़, अगर खिड़की के पास सूजन के गंभीर संकेत हैं, या यदि जानवर संकट में दिखाई देता है। हमारे अनुभव में, अग्नाशय इमेजिंग खिड़की के साथ चूहों खाने के लिए और सामान्य रूप से व्यायाम करने में सक्षम थे जब सर्जरी के बाद वसूली उचित था और कोई अन्य जटिलता विकसित की गई थी।

पेट इमेजिंग खिड़की के साथ हमारे पिछले अनुभव में, हम उच्च गुणवत्ता वाले सेलुलर स्तर इमेजिंग के साथ-साथ कई दिनों में एक ही स्थानों की देशांतर ट्रैकिंग प्राप्त करने में विफल रहे। पेट इमेजिंग खिड़की की तुलना में, जो विभिन्न पेट के अंगों के लिए एक विविध मंच प्रदान करता है, अग्नाशय इमेजिंग खिड़की को अग्न्याशय के साथ-साथ अन्य अंगों को इमेजिंग के लिए आगे निर्दिष्ट किया जाता है जो नरम और आसानी से मेसेंट्री, तिल्ली और छोटी आंत जैसे आंदोलनों से प्रभावित होते हैं। हालांकि, सीमित स्थान की वजह से अग्नाशय इमेजिंग खिड़की में जिगर और गुर्दे अव्यवहार्य हो सकता है ।

जबकि फ्लोरोसेंट माउस, कोशिकाओं और एंटीबॉडी प्रोब का संयोजन एंडोथेलियल कोशिकाओं और या तो आइलेट्स या कैंसर कोशिकाओं के बीच गतिशील बातचीत के दृश्य को सक्षम बनाता है, यहां वर्णित प्रोटोकॉल को फ्लोरोसेंट-लेबल कोशिकाओं या आणविक जांच की अन्य रचनाओं के साथ पुन: पेश किया जा सकता है जो प्रत्येक संबंधित स्थिति के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, हमारी विधि के साथ एकीकृत विशाल अनुप्रयोगों की उम्मीद की जाती है, जैसे इंसुलिन स्राव के साथ CpepSfGFP रिपोर्टर माउस9,30,AAV8-मध्यस्थता जीन वितरण प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS)31,या ऑर्थोटोपिक ट्यूमर मॉडल32,33,34 जिसमें सीटू में ट्यूमर ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट को पूरीतरहसे उत्तेजित कर सकता है, जिसमें ट्यूमर शामिल है। इसके अलावा, रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोबेड़ा मॉडल का भी हमारे प्लेटफ़ॉर्म36का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है।

इस अध्ययन में कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, यहां तक कि जब हम स्थिरीकरण के लिए धातु के आधार का उपयोग किया, हम यांत्रिक आधार और कवर ग्लास, जो रक्त के प्रवाह को प्रभावित कर सकता है द्वारा ऊतक पर प्रेरित तनाव का निर्धारण करने में असमर्थ थे । हालांकि, जैसा कि उपरोक्त आंकड़ों में दर्शाया गया है, फ्लोरेसेंस-संयुग्मित एंटीबॉडी (सीडी 31) या डेक्सट्रान के नसों में इंजेक्शन ने पोत को पर्याप्त रूप से लेबल नहीं किया, जिसमें अग्नाशय के ऊतकों के अंदर सामान्य रक्त प्रवाह पर यांत्रिक तनाव का न्यूनतम प्रभाव पड़ता है। दूसरा, चिपकने वाले के कारण प्रतिकूल प्रतिक्रियाओं अग्नाशय के ऊतकों में मूल्यांकन नहीं किया जा सका। फिर भी, हमने किसी भी अतिरिक्त प्रभाव से बचने के लिए चिपकने वाले अग्न्याशय को उतनी ही सावधानी से छूने से बचने का प्रयास किया। तीसरा, जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, एनेस्थेटिक एजेंटों का अनपेक्षित प्रभाव इंसुलिन संवेदनशीलता और स्राव को प्रभावित कर सकता है, जैसा कि पिछले अध्ययन9,27में वर्णित है। हमारे अनुभव में, टिलेटामाइन, जोलाज़ेपाम और जाइलाज़ीन के मिश्रण की तुलना में केटामाइन और जाइलाज़ीन प्रेरित हाइपरग्लाइसेमिया का मिश्रण। इंसुलिन स्राव पर संज्ञाहरण के प्रभाव की जांच करने वाले एक और अध्ययन का प्रदर्शन किया जाना चाहिए और प्रत्येक प्रयोग के अनुसार न्यूनतम प्रतिकूल प्रभावों के साथ उचित संज्ञाहरण का चयन किया जाना चाहिए। चौथा, अग्न्याशय की इमेजिंग पूंछ भाग पर केंद्रित है, और अग्न्याशय के सिर वाले हिस्से की इमेजिंग हमारी खिड़की के साथ सीमित हो सकती है।

संक्षेप में, कई हफ्तों तक सेलुलर स्तर पर अग्न्याशय की एक स्थिर देशांतर इमेजिंग हमारे इमेजिंग सिस्टम द्वारा सुविधा प्रदान की गई थी जो विवो अग्न्याशय इमेजिंग में अनुकूलित अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो के साथ एकीकृत थी। क्योंकि इंट्राविटल इमेजिंग सेल बायोलॉजी, इम्यूनोलॉजी और ट्यूमर बायोलॉजी में गतिशील अंतर्दृष्टि प्रदान करती है, इसलिए यह प्रोटोकॉल अग्न्याशय से जुड़े विभिन्न रोगों के रोगविज्ञान की जांच के लिए एक उपयोगी तरीका हो सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को स्नूथ रिसर्च फंड से अनुदान संख्या 14-2020-002 और कोरिया सरकार (MSIT) (एनआरएफ-2020R1F1A1A1058381, एनआरएफ-2020R1A2C3005694) द्वारा वित्त पोषित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) Invitrogen A20006 Fluorescent probe for conjugate with antibody
BALB/C Nude OrientBio BALB/C Nude BALB/C Nude
BD Intramedic polyethylene tubing BD Biosciences 427401 PE10 catheter for connection with needle
C57BL/6N OrientBio C57BL/6N C57BL/6N
Cover glasses circular Marienfeld 0111520 Cover glass for pancreatic imaging window
FITC Dextran 2MDa Merck (Former Sigma Aldrich) FD200S For vessel identification
IMARIS 8.1 Bitplane IMARIS Image processing
Intravital Microscopy IVIM tech IVM-C Intravital Microscopy
IRIS Scissor JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD S-1107-10 This product can be replaced with the product from other company
Loctite 401 Henkel 401 N-butyl cyanoacrylate glue
Micro Needle holder JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD H-1126-10 This product can be replaced with the product from other company
Micro rectractor JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD 17004-03 This product can be replaced with the product from other company
Microforceps JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD F-1034 This product can be replaced with the product from other company
MIP-GFP The Jackson Laboratory 006864 B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J
Nylon 4-0 AILEE NB434 Non-Absorbable Suture
Omnican N 100 30G B BRAUN FT9172220S For Vascular Catheter, Use only Needle part
PANC-1 NucLightRed Custom-made Custom-made Made in laboratory
Pancreatic imaging window Geumto Engineering Custom order Pancreatic imaging window - custom order
Physiosuite Kent Scientific PS-02 Homeothermic temperature controller
Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 BD Biosciences 553708 Antibody for in vivo vessel labeling
Ring Forceps JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD F-1090-3 This product can be replaced with the product from other company
Rompun Bayer Rompun Anesthetic agent
TMR Dextran 65-85kDa Merck (Former Sigma Aldrich) T1162 For vessel identification
Window holder Geumto Engineering Custom order Window holder - custom order
Zoletil Virbac Zoletil 100 Anesthetic agent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A. Imaging in pancreatic disease. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 97-109 (2017).
  2. Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. Technologies for imaging the normal and diseased pancreas. Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).
  3. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
  4. Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed. Diabetes Care. 31, Suppl 2 165-169 (2008).
  5. Baetens, D., et al. Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice. Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).
  6. Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).
  7. Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
  8. Ravier, M. A., Rutter, G. A. Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes. Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).
  9. Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose. Science Reports. 11 (1), 603 (2021).
  10. Lee, E. M., et al. Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice. Islets. 10 (1), 25-39 (2018).
  11. Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. In vivo imaging of islet transplantation. Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).
  12. Mojibian, M., et al. Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).
  13. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
  14. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  15. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
  16. Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
  17. Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), 1024405 (2015).
  18. Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
  19. Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
  20. Park, I., et al. Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model. Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).
  21. Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy. Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).
  22. Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
  23. Hwang, Y., et al. In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver. Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).
  24. Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
  25. Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas. International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).
  26. National Institutes of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).
  27. Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice. Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).
  28. Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
  29. Cichocki, F., et al. GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity. Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).
  30. Zhu, S., et al. Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
  31. Reissaus, C. A., et al. A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).
  32. Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma. Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).
  33. Bisht, S., Feldmann, G. Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).
  34. Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).
  35. Feig, C., et al. The pancreas cancer microenvironment. Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).
  36. Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models. Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).

Tags

चिकित्सा अंक 171
एक अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो के साथ एक मुरीन मॉडल में अग्न्याशय के <em>वीवो</em> सेलुलर-स्तर दृश्य में स्थिर देशांतर
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, I., Kim, P. Stabilized… More

Park, I., Kim, P. Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window. J. Vis. Exp. (171), e62538, doi:10.3791/62538 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter