Summary
A imagem in vivo de alta resolução do pâncreas foi facilitada com a janela de imagem intravital pancreática.
Abstract
A imagem direta de resolução celular in vivo do pâncreas em um modelo animal pequeno vivo tem sido tecnicamente desafiadora. Um estudo recente de imagem intravital, com uma janela de imagem abdominal, possibilitou a visualização da dinâmica celular em órgãos abdominais in vivo. No entanto, devido à arquitetura macia do pâncreas do mouse que pode ser facilmente influenciada pelo movimento fisiológico (por exemplo, peristalse e respiração), foi difícil realizar imagens longitudinais estabilizadas ao longo de várias semanas no nível celular para identificar, rastrear e quantificar ilhotas ou células cancerígenas no pâncreas do rato. Aqui, descrevemos um método para implantar uma nova base de suporte, uma janela de imagem intravital pancreática integrada, que pode separar espacialmente o pâncreas do intestino para imagens intravitais longitudinal do pâncreas microestrutura. A imagem longitudinal in vivo com a janela de imagem permite a visualização estável, permitindo o rastreamento de ilhotas durante um período de 3 semanas e imagens tridimensionais de alta resolução da microestrutura, como evidenciado aqui em um modelo de câncer pancreático ortotópico. Com nosso método, novos estudos de imagem intravital podem elucidar a fisiopatologia de várias doenças envolvendo o pâncreas a nível celular.
Introduction
O pâncreas é um órgão abdominal com uma função exócrina no trato digestivo e uma função endócrina de secretar hormônios na corrente sanguínea. Imagens celulares de alta resolução do pâncreas podem revelar a fisiopatologia de várias doenças envolvendo o pâncreas, incluindo pancreatite, câncer de pâncreas e diabetes mellitus1. Ferramentas convencionais de diagnóstico por imagem, como tomografia computadorizada, resolução magnética e ultrassonografia estão amplamente disponíveis no campo clínico1,2. No entanto, essas modalidades de imagem estão restritas à visualização apenas de alterações estruturais ou anatômicas, enquanto alterações no nível celular ou molecular não podem ser determinadas. Dado que alterações moleculares no diabetes mellitus ou câncer de pâncreas em humanos podem iniciar mais de 10 anos antes do diagnóstico3,4, a detecção de doenças pancreáticas de sua transição molecular durante o período latente tem o potencial de fornecer um diagnóstico precoce e uma intervenção oportuna. Assim, imagens que superarão as limitações da resolução e fornecerão insights valiosos sobre a função ganharão notavelmente atenção, fornecendo diagnóstico precoce de câncer de pâncreas ou identificação avançada da alteração das ilhotas durante a progressão do diabetes mellitus5.
Em particular com as ilhotas, imagens nucleares, imagens de bioluminescência e tomografia de coerência óptica têm sido sugeridas como técnicas de imagem de ilhotas não invasivas6. No entanto, a resolução desses métodos é substancialmente baixa, com valores típicos que variam de várias dezenas a centenas de micrômetros, oferecendo uma capacidade limitada para detectar alterações no nível celular nas ilhotas. Por outro lado, foram realizados estudos anteriores de alta resolução de ilhotas sob ex vivo7,8 (por exemplo, fatiamento ou digestão do pâncreas), não fisiológico9 (por exemplo, exteriorização do pâncreas) e condições heterotópicas10,11,12 (por exemplo, implantação sob a cápsula renal, dentro do fígado, e na câmara anterior do olho), o que restringe sua interpretação e implicações clínicas. Se in vivo,modelo fisiológico e ortotópico de imagem de alta resolução pode ser estabelecido, será uma plataforma crítica para a investigação de ilhotas pancreáticas.
A imagem intravital, que revela a fisiopatologia em um nível de resolução microscópica em um animal vivo, recebeu recentemente grande atenção13. Dos métodos de imagem in vivo, o desenvolvimento de uma janela de imagem abdominal14, que implanta uma janela no abdômen de um camundongo, permitiu a descoberta de novos achados (ou seja, um estágio pré-micrometastase da metástase hepática precoce15 e mecanismo de manutenção de células-tronco no epitélio intestinal16). Embora a janela de imagem abdominal forneça resultados valiosos, as aplicações desta janela para o pâncreas e a pesquisa de imagem intravital resultante baseada em doenças envolvendo pâncreas, não foram amplamente investigadas.
Ao contrário das características bem definidas do órgão sólido do pâncreas humano, o pâncreas de um camundongo é uma estrutura difusamente distribuída de tecido mole17. Portanto, é incessantemente afetada por movimentos fisiológicos, incluindo peristalse e respiração. Um estudo anterior sobre a aplicação de uma janela de imagem abdominal para o pâncreas demonstrou que a erração ocorreu devido a artefatos de movimento induzidos pelos movimentos intestinais18. A desfoca severa foi observada na imagem média resultante, o que impediu a visualização e identificação das estruturas de microescala.
Aqui, descrevemos o uso de uma nova base de apoio integrada janela de imagem intravital pancreática combinada com microscopia intravital19,20 para investigar os eventos longitudinais de nível celular em doenças envolvendo o pâncreas. Além de uma descrição detalhada da metodologia no estudo anterior18,a aplicação estendida da janela de imagem pancreática para diversas doenças envolvendo o pâncreas será abordada neste artigo. Neste protocolo, um sistema de microscopia confocal de varredura a laser de velocidade de vídeo personalizado foi utilizado como um sistema de microscopia intravital. Quatro módulos laser (comprimentos de onda em 405, 488, 561 e 640 nm) foram utilizados como fonte de excitação, e quatro canais de sinais de emissão foram detectados por tubos fotomultiplier (PMT) através de filtros de bandpass (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). A varredura a laser consistia em um espelho poligonal rotativo (eixo X) e um espelho de varredura galvanômetro (eixo Y) que permitia a digitalização da taxa de vídeo (30 quadros por segundo). Informações detalhadas sobre microscopia intravital foram descritas nos estudos anteriores10,18,19,20,21,22,23.
Em nosso estudo anteriorde ilhotas 18,nós com sucesso e imagem as ilhotas em camundongos vivos usando um modelo de rato transgênico (MIP-GFP)24 em que as ilhotas foram marcadas com GFP. O método possibilitou a visualização de alta resolução das alterações nas ilhotas durante um período de 1 semana. Também facilitou a imagem das mesmas ilhotas por até 3 semanas, o que sugere a viabilidade de estudos de longo prazo das ilhotas pancreáticas para o rastreamento ou monitoramento funcional durante a patogênese do diabetes mellitus18. Além disso, desenvolvemos um modelo ortotópico de câncer de pâncreas no qual células cancerígenas pancreáticas fluorescentes (PANC-1 NucLight Red)25 foram implantadas diretamente no pâncreas do camundongo. Com a aplicação da janela de imagem intravital pancreática, este modelo poderia ser utilizado como uma plataforma para investigar a fisiopatologia celular e molecular no microambiente tumoral do câncer de pâncreas e para o monitoramento terapêutico de novos candidatos a medicamentos.
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Protocol
Todos os procedimentos descritos neste artigo foram realizados de acordo com a8ª edição do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (2011)26 e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Avançado de Ciência e Tecnologia da Coreia (KAIST) e do Hospital Bundang da Universidade Nacional de Seul (SNUBH).
1. Preparação da janela e outros materiais
- Design personalizado a janela de imagem intravital pancreática para isolar o pâncreas do intestino na cavidade abdominal18 (Figura 1A, B). Um projeto detalhado da janela é descrito em uma figura suplementar de um estudo anterior18.
- Use camundongos C57BL/6N, machos de 8 a 12 semanas, para imagens pancreáticas intravitais. Injete anticorpo anti-CD31 conjugado com um fluoróforo Alexa 647, 2 h antes da imagem, com o propósito de rotular o vaso18.
- Para o estudo das ilhotas, prepare um modelo de camundongo transgênico no qual as ilhotas são marcadas com uma proteína repórter fluorescente. Aqui, utilizamos o MIP-GFP, onde a proteína fluorescente verde foi expressa sob o controle do promotor genético de insulina do camundongo 1, que está ativo nas células beta de todas as ilhotas do mouse24.
- Para o estudo do câncer de pâncreas, prepare células cancerígenas transgênicas marcadas com uma proteína repórter fluorescente e ratos nus BALB/C. Neste estudo, foram utilizadas as células VERMELHAS PANC-1 NucLight. As células cancerígenas PANC-125 foram rotuladas com a sonda fluorescente NucLight Red.
- Esterilize todas as ferramentas cirúrgicas, cubra vidros (com PEG ou não) e janelas de imagem usando uma autoclave.
- Aplique revestimento PEG no vidro de cobertura para evitar resposta inflamatória e aumentar a biocompatibilidade, que é adequada para imagens de longo prazo.
2. Cirurgia
- Prepare uma plataforma cirúrgica estéril e esterilize as superfícies com 70% de etanol.
NOTA: Para sessões de imagem longitudinal, a técnica asséptica é essencial. - Anesthetize camundongos com uma mistura de tiletamina/zolazepam (30 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
NOTA: Recomenda-se o uso de tiletamina/zolazepam em vez de cetamina devido ao seu efeito adverso da hiperglicemia. A anestesia ideal deve ser selecionada para efeitos do experimento9,27. - Monitore a temperatura do corpo usando uma sonda retal com uma almofada de aquecimento controlada homeotermica.
- Raspe o flanco esquerdo do mouse e aplique três rodadas de álcool alternado e esfoliante à base de iodo.
NOTA: Se for usado creme depilatório, não deixe mais de 1 minuto para evitar queimaduras químicas. - Faça uma incisão de 1,5 cm no flanco esquerdo do mouse e disseque a pele e o músculo.
- Realize uma sutura de corda de bolsa com uma sutura preta ou de nylon 4-0 na margem de incisão.
- Use um micro retrátil na incisão e exponha suavemente o baço.
- Misture cuidadosamente o baço com fórceps do anel e identifique o pâncreas.
- Coloque a janela no flanco do mouse e passe o baço e o pâncreas pelo espaço aberto da janela. A manipulação do pâncreas tem que ser muito gentile, pois pode causar sangramento ou pancreatite
- Coloque suavemente o pâncreas na placa da janela de imagem; o baço será colocado no espaço aberto da janela.
- Para o estudo de células cancerígenas, injete PANC-1 NucLight Red (1,0 x 10 6 células)diretamente no pâncreas.
NOTA: Para a imagem dos xenoenxertos ortotópicos de câncer pancreático humano, a implantação direta de células cancerígenas como o PANC-1 ou outras células cancerígenas pancreáticas humanas poderia ser facilitada28. Para visualizar com microscopia de fluorescência intravital, as células PANC-1 foram transduzidas com proteína fluorescente vermelha usando o reagente lentiviral NucLight Red que rotula o núcleo29. Embora o volume de injeção máxima seja incerto, diminua o volume possível para evitar o efeito de pressão no pâncreas. - Aplique gotas de cola de cianoacrilato N-butil na margem da janela de imagem.
- Para minimizar a quantidade da cola aplicada, use uma agulha de cateter de 31 G para a aplicação. Se a quantidade da gota for grande, então o tecido irá involuntariamente aderir à janela ou cobrir o vidro.
- Aplique suavemente um vidro de cobertura redondo de 12 mm na margem da janela de imagem.
- Puxe o laço de sutura para caber no sulco lateral da janela e amarre-o três vezes.
- Corte o local proximal máximo do nó para evitar a interrupção de pontos apertados quando esses ratos estiverem acordados.
- Deixe os camundongos se recuperarem da anestesia (2-3 horas) e injetem cetoprofeno (5 mg/kg, subcutâneo na pele solta na base do pescoço ou quadril do animal) para alívio da dor. Reavaliar para sinais de dor a cada 12 horas e cetoprofeno deve ser considerado a cada 24 horas durante 1-3 dias.
NOTA: A analgesia influencia a secreção da insulina em resposta à glicose9. A escolha e o tempo da analgesia devem ser individualizados para o propósito experimental. - Acomodar o rato na gaiola com roupa de cama suficiente para evitar o contato da janela com a gaiola. Evite abrigar a casa com os ratos sem a cirurgia da janela.
3. Imagem intravital
- Ligue o microscópio intravital, incluindo a potência laser.
- Ligue a almofada de aquecimento e coloque o regulamento homeotémico em 37 °C.
NOTA: Alternativamente, use uma almofada de aquecimento passiva ou lâmpada com controle frequente se não houver regulação homeotérmica. - Realize anestesia intramuscular com uma mistura de tiletamina/zolazepam (30 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
NOTA: Recomenda-se o uso de tiletamina/zolazepam em vez de cetamina devido ao seu efeito adverso da hiperglicemia. A anestesia ideal deve ser selecionada para fins dos experimentos9,27. - Insira um cateter vascular para a injeção.
- Aplique pressão no lado proximal da cauda com o índice e o terceiro dedo como alternativa a uma aplicação de torniquete. Aqueça a cauda com uma lâmpada, se necessário.
- Esterilize a veia traseira com um spray de 70% de etanol.
- Insira um cateter de 30 G na veia lateral da cauda. A regurgitação de sangue será visualizada no tubo PE10.
- Aplique uma fita de seda no cateter para estabilizá-la.
- Injete fitc/TMR dextran ou outras sondas fluorescentes (25 μg de anti-CD31 conjugado com Alexa 647), conforme apropriado, de acordo com a combinação de sondas fluorescentes18.
NOTA: Para sondas de anticorpos conjugados fluorescentes, injete 2 h antes da sessão de imagem.
- Transfira o mouse da plataforma cirúrgica para o estágio de imagem.
- Insira uma sonda retal para controlar automaticamente a temperatura corporal com o sistema de almofada de aquecimento homeotémico.
- Insira a janela de imagem pancreática no suporte da janela preparado durante a configuração da microscopia intravital(Figura 2). Para um microscópio invertido, um suporte de janela pode não ser necessário.
- Realize imagens intravitais.
- Para a imagem do pâncreas, comece com uma lente objetiva de baixa ampliação (por exemplo, 4x) para digitalizar toda a visão do pâncreas na janela de imagem pancreática (campo de visão recomendado: 2500 x 2500 μm).
- Após a determinação da região de interesse, mude para lente objetiva de ampliação mais alta (20x ou 40x) para realizar a imagem de nível celular (campo de visão recomendado: 500 x 500 μm ou 250 x 250 μm). Neste experimento, a resolução lateral e axial foi de aproximadamente 0,5 μm e 3 μm, respectivamente.
- Execute imagens de z-stack ou time-lapse para observar a estrutura 3D ou a dinâmica de nível celular, como a migração celular.
NOTA: Para a imagem da proteína fluorescente que expressa células de animais transgênicos (MIP-GFP), 30 s de exposição intermitente a laser de 488 nm com potência de até 0,43 mW era tolerável sem fotobleaching ou dano tecidual. Para a imagem das proteínas fluorescentes rotuladas com Alexa 647, a potência laser de 640 nm até 0,17 mW era tolerável sem fotobleaching perceptível ou danos teciduais. Exposição prolongada ao laser de excitação com uma potência acima desta configuração pode levar a fotobleaching ou dano tecidual por fototoxicidade. Ajuste o ganho e o poder adequados para imagem adequada da região de interesse. A definição detalhada dos parâmetros na microscopia intravital deve ser individualizada para cada microscopia intravital preparada no instituto.
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Representative Results
A microscopia intravital combinada com a janela de imagem intravital pancreática integrada da base de suporte permite imagens longitudinal do nível celular do pâncreas em um rato. Este protocolo com a janela de imagem intravital pancreática fornece estabilidade tecidual de longo prazo que permite a aquisição de imagens de alta resolução para rastrear ilhotas individuais por até 3 semanas. Como resultado, imagens de mosaico para um campo de visão estendido, reconstrução tridimensional (3D) de imagens de pilha de z e rastreamento longitudinal da mesma posição podem ser alcançadas. Além disso, nossa microscopia intravital fornece quatro canais (405, 488, 561 e 647 nm) de aquisição, o que permite visualização simultânea de múltiplas células com suas interações.
Para a imagem preliminar, a janela foi implantada em um mouse C57BL/6N com anticorpo anti-CD31 injetado por via intravenosa conjugado com um fluorophore Alexa 647. Imagens de ampla área(Figura 3A) e imagens 3D ampliadas(Figura 3B-D, Vídeo Suplementar 1) do pâncreas foram facilitadas com este sistema. O tecido pancreático foi visualizado com autofluorescência, e a vasculatura adjacente rotulada com o anticorpo anti-CD31 foi identificada. A oscilação por peristalse ou respiração não foi identificada, resultando em imagem média com alta relação sinal-ruído(Figura 4). As células acinar, que requerem visualização em resolução de microescala no pâncreas, foram claramente visualizadas nas imagens médias.
Para a imagem das ilhotas, utilizou-se um mouse MIP-GFP. Utilizando o método de imagem de mosaico, uma visão de campo largo com imagem de alta resolução possibilitou a visualização das ilhotas com a vasculatura adjacente(Figura 5). Aproximadamente 40-50 ilhotas foram identificadas na visão de campo largo. Este método de imagem estável poderia facilitar ainda mais o rastreamento das ilhotas por até 3 semanas, como mostrado em um estudo anterior (Figura 6)18.
Para a imagem das células cancerígenas, as células vermelhas do NUCLight PANC-1 foram implantadas diretamente no pâncreas do camundongo durante a cirurgia(Figura 7). Foi utilizada uma estratégia de dupla rotulagem, consistindo de células Panc-1 NucLight Red e vasos próximos manchados com anti-CD31 conjugados com Alexa 647. Com nosso protocolo, foi alcançada a imagem em larga campo do câncer de pâncreas(Figura 7A),que delineia a margem do tumor, e a imagem 3D de alta resolução no nível unicelular ,(Figura 7B-D, Vídeo Suplementar 2).
Figura 1: Desenho e fotografia da janela de imagem intravital pancreática. (A) Uma visão 3D e transversal da janela de imagem intravital pancreática. Um projeto detalhado do tamanho e diâmetro está descrito no artigo anterior18. (B) Foto anterior e posterior da janela de imagem pancreática. Copyright 2020 Associação Coreana de Diabetes de Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Reimpresso com permissão da Associação Coreana de Diabetes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fotografia da implementação da janela de imagem intravital pancreática. Uma janela de imagem intravital pancreática é implantada no mouse no estágio translacional XYZ e o suporte da câmara de imagem ligado ao suporte de inclinação está conectado à janela de imagem pancreática. Copyright 2020 Associação Coreana de Diabetes de Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Reimpresso com permissão da Associação Coreana de Diabetes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem pancreática intravital representativa no mouse C57BL/6N. (A) Imagem de ampla área e (B) imagem 3D ampliada do pâncreas (verde) e sua microvasculatura (vermelho) no mouse C57BL/6N. Os vasos são rotulados com um anticorpo anti-CD31 conjugado com o fluoróforo Alexa 647. (C) imagem reconstruída em 3D e(D)imagem de renderização superficial do pâncreas do mouse. Barra de escala: 200 μm (A) e 50 μm (B-D). Veja também o Vídeo Suplementar 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagem intravital de células acinar e vasculatura adjacente. Células acinar (verde) e vasculatura adjacente (vermelho) no mouse C57BL/6N. Os vasos são rotulados com anticorpo anti-CD31 conjugado com o fluoróforo Alexa 647. A estabilidade do tecido realizada com a janela de imagem pancreática fornece uma imagem de alta relação sinal-ruído. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagem intravital representativa de ilhotas pancreáticas no mouse MIP-GFP. Mosaico de grande área e imagem ampliada das ilhotas (verde) e vasculatura adjacente (vermelho) processados com método de projeção de intensidade máxima no pâncreas do mouse MIP-GFP. Os vasos são rotulados com um anticorpo anti-CD31 conjugado com o fluoróforo Alexa 647. Barra de escala: 500 μm (ampla área) e 50 μm (ampliada). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Imagem intravitanal longitudinal de ilhotas no pâncreas do mouse MIP-GFP. Imagem longitudinal das ilhotas por até 3 semanas no pâncreas no mouse MIP-GFP. Cada ponta de seta com cores diferentes indica as mesmas ilhotas. Barra de escala: 100 μm. Copyright 2020 Associação Coreana de Diabetes de Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Reimpresso com permissão da Associação Coreana de Diabetes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Imagem intravital representativa do modelo de câncer de pâncreas. (A) Imagem de ampla área e (B) imagem 3D ampliada das células vermelhas nuclight implantadas (vermelhas) no rato NU BALB/c. Os vasos (azul) são rotulados com um anticorpo anti-CD31 conjugado com o fluoróforo Alexa 647. (C) imagem reconstruída 3D e (D) imagem de renderização superficial de câncer de pâncreas no modelo do mouse. Barra de escala: 500 μm (A) e 50 μm (B-D). Veja também o Vídeo Suplementar 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo suplementar 1: Imagens pancreáticas in vivo 3D no mouse C57BL/6N. In vivo imagem 3D de pâncreas (verde) do mouse C57BL/6N injetou por via intravenosa com um anticorpo anti-CD31 conjugado com o fluorohore Alexa 647 (vermelho). A barra de escala é retratada no vídeo. Este vídeo corresponde à Figura 3C,D. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo suplementar 2: In vivo 3D pancreatic cancer (PANC-1 NucLight Red) imagem em BALB/C Nude mouse. In vivo imagem 3D de câncer de pâncreas (vermelho) implantado em BALB/C Camundongo nu injetou por via intravenosa com um anticorpo anti-CD31 conjugado com o fluoróforo Alexa 647 (azul). A barra de escala é retratada no vídeo. Este vídeo corresponde à Figura 7C,D. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
O protocolo descrito aqui consiste em imagens intravitais do pâncreas usando uma nova base de suporte integrada janela de imagem intravital pancreática modificada de uma janela de imagem abdominal. Entre os protocolos descritos acima, o primeiro passo crítico é a implantação da janela de imagem pancreática intravital no camundongo. Para a aplicação da cola na janela, é importante aplicar a cola entre a margem da janela e o vidro de cobertura, mas não no tecido pancreático, pois pode interromper significativamente a imagem intravital. Não só a cola em si entre o vidro e o tecido, mas também partículas de poeira adjunta podem induzir a dispersão de luz durante a imagem se a cola for diretamente aplicada ao tecido. Além disso, a aplicação do adesivo pode ter efeitos tóxicos e não fisiológicos no pâncreas.
O segundo passo é a quantidade de tecido pancreático colocado na placa base de suporte metálico. Como o tecido pancreático é uma estrutura semelhante a uma folha, o volume de tecido pancreático na placa precisa ser controlado. Se um volume muito grande for colocado na placa, a cola aplicada à margem do anel pode aderir ao tecido, e o efeito de massa pode dificultar a perfusão do pâncreas. Por outro lado, se um volume muito pequeno for colocado lá, o campo de visão que pode ser visualizado pode ser limitado. Este protocolo de cirurgia na janela pode exigir vários ensaios para atender a um padrão consistente.
Para imagens de longo prazo durante um período de 3 semanas, a questão mais preocupante foi danos potenciais à janela de imagem pancreática. A destruição não intencional do vidro de cobertura na janela de imagem pancreática pode ocorrer durante o período de observação a longo prazo. Para evitar isso, o mouse com a janela deve ser alojado separadamente, e objetos duros com bordas afiadas devem ser removidos da gaiola. A eutanásia dos camundongos deve ser considerada caso o vidro da tampa quebre, se houver os sinais graves de inflamação perto da janela, ou se o animal parece estar em perigo. Em nossa experiência, camundongos com a janela de imagem pancreática foram capazes de comer e se exercitar normalmente quando a recuperação após a cirurgia foi apropriada e nenhuma outra complicação foi desenvolvida.
Em nossa experiência anterior com a janela de imagem abdominal, não conseguimos adquirir imagens de alto nível celular, bem como rastreamento longitudinal dos mesmos pontos ao longo de vários dias. Em comparação com a janela de imagem abdominal, que fornece uma plataforma diversificada para vários órgãos abdominais, a janela de imagem pancreática é especificada para a imagem do pâncreas, bem como outros órgãos que são macios e facilmente influenciados por movimentos como mesentery, baço e intestino delgado. No entanto, o fígado e o rim podem ser inviáveis na janela de imagem pancreática por causa do espaço limitado.
Enquanto a combinação de um rato fluorescente, células e sondas de anticorpos permite a visualização das interações dinâmicas entre células endoteliais e as ilhotas ou células cancerosas, o protocolo descrito aqui poderia ser reproduzido com outras composições de células fluorescentes ou sondas moleculares adequadas para cada condição respectiva. Além disso, são esperadas aplicações expansivas integradas ao nosso método, como o rato repórter CpepSfGFP com secreção de insulina9,30, entrega genética mediada a AAV8 visando espécies reativas de oxigênio (ROS)31, ou tumor ortotópico modelo32,33,34 em que o tumor in situ pode estimular totalmente o microambiente tumoral, incluindo tumorigenese, desenvolvimento e metástase35. Além disso, modelos de xenoenxerto derivados do paciente também podem ser estudados usando nossa plataforma36.
Há algumas limitações a serem abordadas neste estudo. Primeiro, mesmo quando utilizamos a base metálica para estabilização, não conseguimos determinar o estresse mecânico induzido no tecido pela base e pelo vidro de cobertura, o que poderia afetar o fluxo sanguíneo. No entanto, como descrito nas figuras acima, a injeção intravenosa de um anticorpo conjugado fluorescência (CD31) ou dextran rotulou adequadamente o vaso sem uma área não perfusada distintiva, sugerindo um impacto mínimo do estresse mecânico no fluxo sanguíneo normal dentro do tecido pancreático. Em segundo lugar, as reações adversas devido ao adesivo não puderam ser avaliadas no tecido pancreático. No entanto, tentamos evitar tocar o pâncreas com adesivos o mais cuidadosamente possível para evitar quaisquer efeitos adicionais. Em terceiro lugar, como discutido acima, o impacto não intencional dos agentes anestésicos pode afetar a sensibilidade e a secreção da insulina, conforme descrito no estudo anterior9,27. Em nossa experiência, uma mistura de cetamina e xilazina induziu hiperglicemia em comparação com a mistura de tiletamina, zolazepam e xilazina. Um novo estudo que investigue o efeito da anestesia na secreção de insulina deve ser realizado e a anestesia adequada com efeitos adversos mínimos deve ser selecionada de acordo com cada experimento. Em quarto lugar, a imagem do pâncreas está focada na parte da cauda, e a imagem da parte da cabeça do pâncreas pode ser limitada com a nossa janela.
Em resumo, uma imagem longitudinal estabilizada do pâncreas ao nível celular por até várias semanas foi facilitada pelo nosso sistema de imagem integrado com a janela de imagem intravital pancreática otimizada para imagens in vivo do pâncreas. Como a imagem intravital fornece insights dinâmicos sobre biologia celular, imunologia e biologia tumoral, esse protocolo pode ser um método útil para investigar a fisiopatologia de várias doenças envolvendo o pâncreas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela subvenção nº 14-2020-002 do Fundo de Pesquisa snubh e pela Bolsa da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiada pelo governo da Coreia (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window - custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder - custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
References
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