Het vastleggen van actief geproduceerde microbiële vluchtige organische stoffen uit mens-geassocieerde monsters met vacuümondersteunde sorptie-extractie
Summary
Dit protocol beschrijft de extractie van vluchtige organische stoffen uit een biologisch monster met de vacuümondersteunde sorptiemiddelextractiemethode, gaschromatografie in combinatie met massaspectrometrie met behulp van de Entech Sample Preparation Rail en data-analyse. Het beschrijft ook de kweek van biologische monsters en stabiele isotooponderzoek.
Abstract
Vluchtige organische stoffen (VOS) uit biologische monsters hebben een onbekende oorsprong. VOC’s kunnen afkomstig zijn van de gastheer of verschillende organismen uit de microbiële gemeenschap van de gastheer. Om de oorsprong van microbiële VOC’s te ontrafelen, werden vluchtige headspace-analyse van bacteriële mono- en coculturen van Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa en Acinetobacter baumannii en stabiele isotooponderzoek in biologische monsters van uitwerpselen, speeksel, rioolwater en sputum uitgevoerd. Mono- en coculturen werden gebruikt om vluchtige productie van individuele bacteriesoorten te identificeren of in combinatie met stabiele isotooponderzoek om het actieve metabolisme van microben uit de biologische monsters te identificeren.
Vacuüm-geassisteerde sorptiemiddelextractie (VASE) werd gebruikt om de VOC’s te extraheren. VASE is een eenvoudig te gebruiken, gecommercialiseerde, oplosmiddelvrije headspace-extractiemethode voor semi-vluchtige en vluchtige stoffen. Het gebrek aan oplosmiddelen en de bijna-vacuümomstandigheden die tijdens de extractie worden gebruikt, maken het ontwikkelen van een methode relatief eenvoudig en snel in vergelijking met andere extractieopties zoals tert-butylatie en micro-extractie in vaste fase. De hier beschreven workflow werd gebruikt om specifieke vluchtige handtekeningen van mono- en coculturen te identificeren. Bovendien identificeerde analyse van de stabiele isotooponderzoek van menselijke geassocieerde biologische monsters VOS die algemeen of uniek werden geproduceerd. Dit artikel presenteert de algemene workflow en experimentele overwegingen van VASE in combinatie met stabiele isotooponderzoek van levende microbiële culturen.
Introduction
Vluchtige organische stoffen (VOS) zijn veelbelovend voor bacteriële detectie en identificatie omdat ze worden uitgestoten door alle organismen en verschillende microben unieke VOC-handtekeningen hebben. Vluchtige moleculen zijn gebruikt als een niet-invasieve meting voor het detecteren van verschillende luchtweginfecties, waaronder chronische obstructieve longziekte1, tuberculose2 in urine3 en beademingsgerelateerde pneumonie4, naast het onderscheiden van proefpersonen met cystische fibrose (CF) van gezonde controlepersonen 5,6. Vluchtige handtekeningen zijn zelfs gebruikt om specifieke pathogene infecties bij CF te onderscheiden (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 en S. aureus vs. P. aeruginosa10). Met de complexiteit van dergelijke biologische monsters is het echter vaak moeilijk om de bron van specifieke VOS te lokaliseren.
Een strategie voor het ontwarren van de vluchtige profielen van meerdere infecterende microben is het uitvoeren van headspace-analyse van micro-organismen in zowel mono- als co-cultuur11. Headspace-analyse onderzoekt de analyten die worden uitgezonden in de “headspace” boven een monster in plaats van die ingebed in het monster zelf. Microbiële metabolieten zijn vaak gekarakteriseerd in monoculturen vanwege de moeilijkheid om de oorsprong van microbiële metabolieten in complexe klinische monsters te bepalen. Door vluchtige stoffen uit bacteriële monoculturen te profileren, kunnen de soorten vluchtige stoffen die een microbe in vitro produceert een basislijn van zijn vluchtige repertoire vertegenwoordigen. Het combineren van bacterieculturen, bijvoorbeeld het creëren van coculturen, en het profileren van de geproduceerde vluchtige moleculen kan de interacties of kruisvoeding tussen de bacteriënonthullen 12.
Een andere strategie voor het identificeren van de microbiële oorsprong van vluchtige moleculen is om een voedingsbron te bieden die is gelabeld met een stabiele isotoop. Stabiele isotopen zijn van nature voorkomende, niet-radioactieve vormen van atomen met een verschillend aantal neutronen. In een strategie die sinds de vroege jaren 1930 wordt gebruikt om het actieve metabolisme bij dieren te traceren13, voedt het micro-organisme zich met de gelabelde voedingsbron en neemt het de stabiele isotoop op in zijn metabole routes. Meer recent is een stabiele isotoop in de vorm van zwaar water (D2O) gebruikt om metabolisch actieve S. aureus te identificeren in een klinisch CF-sputummonster14. In een ander voorbeeld is 13C-gelabelde glucose gebruikt om de kruising van metabolieten tussen CF klinische isolaten van P. aeruginosa en Rothia mucilaginosa aan te tonen 12 .
Met de vooruitgang van massaspectrometrietechnieken zijn methoden voor het detecteren van vluchtige signalen overgegaan van kwalitatieve waarnemingen naar meer kwantitatieve metingen. Door gebruik te maken van gaschromatografie massaspectrometrie (GC-MS) is de verwerking van biologische monsters binnen handbereik gekomen voor de meeste laboratorium- of klinische omgevingen. Veel methoden om vluchtige moleculen te onderzoeken zijn gebruikt om monsters zoals voedsel, bacterieculturen en andere biologische monsters te profileren, en lucht en water om besmetting te detecteren. Verschillende gangbare methoden voor vluchtige bemonstering met een hoge doorvoer vereisen echter oplosmiddel en worden niet uitgevoerd met de voordelen van vacuümextractie. Bovendien zijn grotere volumes of hoeveelheden (groter dan 0,5 ml) bemonsterde materialen vaak vereist voor analyse 15,16,17,18,19, hoewel dit substraatspecifiek is en optimalisatie vereist voor elk monstertype en elke methode.
Hier werd vacuümondersteunde sorptiemiddelextractie (VASE) gevolgd door thermische desorptie op een GC-MS gebruikt om de vluchtige profielen van bacteriële mono- en coculturen te onderzoeken en actief geproduceerde vluchtige stoffen te identificeren met stabiele isotoopsondering uit menselijke uitwerpselen, speeksel, rioolwater en sputummonsters (figuur 1). Met beperkte monsterhoeveelheden werden VOC’s geëxtraheerd uit slechts 15 μL sputum. Isotopenonderzoeksexperimenten met menselijke monsters vereisten het toevoegen van een stabiele isotoopbron, zoals 13C glucose, en media om de groei van de microbiële gemeenschap te cultiveren. De actieve productie van vluchtige stoffen werd door GC-MS geïdentificeerd als een zwaarder molecuul. Extractie van vluchtige moleculen onder een statisch vacuüm maakte de detectie van vluchtige moleculen met verhoogde gevoeligheidmogelijk 20,21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om vluchtige productie in in vitro culturen en met de mens geassocieerde monsters te identificeren, werden vluchtige analyses van mono- en coculturen van P. aeruginosa, S. aureus en A. baumanii en stabiele isotooponderzoek van verschillende biologische monsters uitgevoerd. In de analyse voor de mono- en coculturen werden vluchtige stoffen gedetecteerd door een korte extractie gedurende 1 uur bij 70 °C uit te voeren. De vluchtige analyse van mono- en coculturen maakte het mogelijk om de verbin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Heather Maughan en Linda M. Kalikin voor het zorgvuldig bewerken van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door NIH NHLBI (subsidie 5R01HL136647-04).
Materials
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) – blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
References
- Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
- Nakhleh, M. K., et al. Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors. European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).
- Lim, S. H., et al. Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds. ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).
- Schnabel, R., et al. Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia. Scientific Reports. 5, 17179 (2015).
- Paff, T., et al. Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).
- Robroeks, C. M. H. H. T., et al. Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls. Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).
- Neerincx, A. H., et al. Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus. European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).
- Goeminne, P. C., et al. Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis. Respiratory Research. 13, 87 (2012).
- Joensen, O., et al. Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections. PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).
- Nasir, M., et al. Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can ‘rule-in’ Pseudomonas aeruginosa and ‘rule-out’ Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients. Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).
- Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. Volatiles in inter-specific bacterial interactions. Frontiers in Microbiology. 6, 1412 (2015).
- Gao, B., et al. Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites. mSphere. 3 (2), 00151 (2018).
- Schoenheimer, R., Rittenberg, D. Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism. Science. 82 (2120), 156-157 (1935).
- Neubauer, C., et al. Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).
- Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).
- Mayor, A. S. R. Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies. Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).
- Camarasu, C. C. Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).
- Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID. Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).
- Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices. Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).
- Trujillo-Rodríguez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples. Talanta. 208, 120390 (2020).
- Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater. Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).
- Psillakis, E. The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).
- Carmody, L. A., et al. The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation. Microbiome. 3, 12 (2015).
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).
- Mahboubi, M. A., et al. Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).
