Summary
मच्छरों के जीनोम में बहिर्जात जीन को पेश करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन तकनीकें आवश्यक हैं। यह प्रोटोकॉल जेम्स प्रयोगशाला द्वारा परिवर्तित मच्छरों को उत्पन्न करने के लिए एनोफिलीज़ गैम्बिया भ्रूण में डीएनए निर्माणों को माइक्रोइंजेक्ट करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक विधि की व्याख्या करता है।
Abstract
भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन तकनीक कीट प्रजातियों के कई आणविक और आनुवंशिक अध्ययनों के लिए आवश्यक हैं। वे बहिर्जात डीएनए टुकड़ों को एक स्थिर और वंशानुगत तरीके से कीट जर्मलाइन में ब्याज के जीन के साथ-साथ अनुकूल लक्षणों को एन्कोडिंग करने का एक साधन प्रदान करते हैं। परिणामी ट्रांसजेनिक उपभेदों का अध्ययन बुनियादी सवालों के जवाब देने या व्यावहारिक अनुप्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले एकीकृत डीएनए की अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप फेनोटाइपिक परिवर्तनों के लिए किया जा सकता है। यद्यपि तकनीक सीधी है, लेकिन इसे दक्षता को अधिकतम करने वाले कौशल के स्तर को प्राप्त करने के लिए अन्वेषक धैर्य और अभ्यास की आवश्यकता होती है। यहाँ दिखाया गया है अफ्रीकी मलेरिया मच्छर, Anopheles gambiaeके भ्रूण के microinjection के लिए एक विधि है। इसका उद्देश्य भ्रूण को माइक्रोइंजेक्शन बहिर्जात डीएनए द्वारा वितरित करना है ताकि इसे विकासशील जर्मलाइन (पोल) कोशिकाओं में लिया जा सके। ट्रांसपोसेस, इंटीग्रेसेस, रीकॉम्बिनेज, या अन्य न्यूक्लिएज (उदाहरण के लिए CRISPR-संबद्ध प्रोटीन, कैस) के इंजेक्ट किए गए डीएनए से अभिव्यक्ति उन घटनाओं को ट्रिगर कर सकती है जो गुणसूत्रों में इसके सहसंयोजक सम्मिलन का कारण बनती हैं। इन प्रौद्योगिकियों से उत्पन्न ट्रांसजेनिक एन गाम्बिया का उपयोग प्रतिरक्षा प्रणाली के घटकों, रक्त-भोजन में शामिल जीन और घ्राण प्रणाली के तत्वों के बुनियादी अध्ययन के लिए किया गया है। इसके अलावा, इन तकनीकों का उपयोग लक्षणों के साथ ए. गाम्बिया उपभेदों का उत्पादन करने के लिए किया गया है जो मलेरिया परजीवी के संचरण को नियंत्रित करने में मदद कर सकते हैं।
Introduction
1900 के दशक की शुरुआत से जीवों में प्रयोगात्मक रूप से हेरफेर करने के लिए माइक्रोइंजेक्शनतकनीकोंका उपयोग किया जा रहा है। माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग दोनों बुनियादी जैविक कार्यों का अध्ययन करने और / या वांछित जीव के जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण परिवर्तनों को पेश करने के लिए किया गया है। माइक्रोइंजेक्शन तकनीक वेक्टर जीवविज्ञानियों के लिए विशेष रुचि की रही है और व्यापक रूप से वेक्टर जीनोम2-11में हेरफेर करने के लिए उपयोग की गई है। आर्थ्रोपोड वैक्टर में ट्रांसजेनेसिस प्रयोगों का उद्देश्य अक्सर वैक्टर को रोगजनकों को प्रसारित करने में कम कुशल बनाना होता है, जो या तो उन परिवर्तनों को लागू करते हैं जो वेक्टर की फिटनेस को कम करते हैं या रोगजनकों के लिए अपवर्तकता को बढ़ाते हैं जो वे संचारित करते हैं। मच्छर विभिन्न प्रकार के मानव रोगजनकों को प्रसारित करते हैं और दुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु दर पर महत्वपूर्ण प्रभाव डालते हैं। मच्छरों का एनोफिलीज जीनस मानव मलेरिया परजीवी रोगजनकों, प्लास्मोडियम एसपीपी को प्रसारित करता है। एनोफिलीज़ के साथ जेनेटिक इंजीनियरिंग प्रयोगों का उद्देश्य जीव विज्ञान को बेहतर ढंग से समझना और उपन्यास मलेरिया उन्मूलन रणनीतियों को विकसित करने के प्रयासों में इन मच्छरों की वेक्टरीय क्षमता को कम करना है।
मच्छर वैक्टर जो दुनिया भर में सबसे अधिक मलेरिया संक्रमण का योगदान करते हैं, वे एनोफिलीज़ गैम्बिया प्रजाति परिसर में हैं। हालांकि, अधिकांश सफल ट्रांसजेनेसिस प्रयोग भारतीय उपमहाद्वीप के मलेरिया वेक्टर, एनोफिलीज स्टीफेंसीपर किए गए हैं। जबकि बहुत सारे प्रयोगशाला-अनुकूलित एनोफिलीज़ गैम्बिया उपभेद मौजूद हैं, साहित्य में रिपोर्ट की गई ट्रांसजेनिक एनोफिलीज़ गाम्बिया एसपीपी लाइनों की संख्या एनोफिलीज़ स्टीफेंसीकी तुलना में नहीं है। यह माना जाता है कि एनोफिलीज़ गैम्बिया भ्रूण को एनोफिलीज़ स्टीफेंसी कीतुलना में सफल ट्रांसजेनेसिस को इंजेक्ट करना और प्राप्त करना अधिक कठिन है, हालांकि इन मतभेदों के कारण अज्ञात हैं। यह प्रोटोकॉल एक ऐसी विधि का वर्णन करता है जो माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से एनोफिलीज़ गैम्बिया भ्रूण के ट्रांसजेनेसिस को प्राप्त करने में लगातार सफल साबित हुआ है। प्रोटोकॉल एक विधि पर आधारित है जो पहले हर्वे बोसिन और मार्क बेनेडिक्ट12 द्वारा विकसित की गई थी, जिसमें कुछ अतिरिक्त विवरण और परिवर्तन जोड़े गए थे जो ट्रांसजेनेसिस की दक्षता बढ़ाने के लिए पाए गए हैं।
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Protocol
1. microinjection के लिए मच्छरों की तैयारी
- ~ 100 पुरुष और200-300मादा 1-2 दिन वयस्क पोस्ट-एक्लोज़न मच्छरों के साथ एक पिंजरे 13 (~ 5000 सेमी 3) बीज और उन्हें 2 दिनों के लिए संभोग करने की अनुमति दें।
- संभोग की अवधि के बाद, मच्छरों को एक कृत्रिम खिला उपकरण के साथ या तो 2 मिलीलीटर रक्त का उपयोग करके रक्त भोजन प्रदान करें या कीटना प्रथाओं के आधार पर जीवित एनेस्थेटिक जानवरोंको जीवित करें। अगले दिन मच्छरों को यह सुनिश्चित करने के लिए एक दूसरा रक्त भोजन प्रदान करता है कि सभी मादा मादाओं को खिलाने का अवसर मिला है और आंशिक रूप से खिलाए गए मच्छर पूरी तरह से engorged हो गए हैं।
- दूसरे रक्त भोजन के 2-4 दिनों के बाद भ्रूण संग्रह के लिए मच्छरों का उपयोग करें।
नोट: लार्वा पोषण वयस्क मजबूती और प्रजनन फिटनेस के लिए महत्वपूर्ण है। स्वस्थ कीड़ों को पालने के तरीके के बारे में जानकारी के लिए बेनेडिक्ट एट अल( 2020)देखें। अंडे देने में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया है जब मच्छरों को कृत्रिम फीडर या जीवित एनेस्थेटिक जानवरों पर खिलाया जाता है। कीट में एनोफिलीज गाम्बिया के लिए नियमित रूप से उपयोग की जाने वाली किसी भी विधि का उपयोग करें।
2. भ्रूण की तैयारी
- एक पारदर्शी 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 20-30 महिलाओं को रखने के लिए एक एस्पिरेटर का उपयोग करें जिसे दोनों सिरों पर खुला होने के लिए काटा गया है (एक बैंड देखा गया है) और एक छोर पर लेटेक्स डेंटल फिल्म और दूसरे पर नायलॉन जाल और फिल्टर पेपर के साथ कवर किया गया है(चित्रा 1)।
नोट: मच्छर फिल्टर पेपर पर अपने अंडे जमा करेंगे और नायलॉन जाल फिल्टर पेपर को सुरक्षित रूप से जगह में रखेगा। मच्छर के अंडे आकार में बेलनाकार होते हैं, लंबाई में ~ 500 μm, उनके व्यापक बिंदु पर व्यास में ~ 200 μm, और पूर्वकाल और पीछे के सिरों पर टेपरिंग(चित्रा 2)। - मच्छर से भरी ट्यूब को एक छोटे (60 मिमी x 15 मिमी) पेट्री डिश में रखें जो डबल-आसुत पानी (डीडीएच2ओ) से भरा हुआ है। ट्यूब और डिश को एक इनक्यूबेटर में 45 मिनट के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर रखें(चित्र 3)।
- इनक्यूबेटर से ट्यूब को हटा दें और ट्यूब को एक खाली पिंजरे में डालें। मच्छरों को बाहर उड़ने की अनुमति देने के लिए ट्यूब को धीरे से टैप करें और सभी मच्छरों के बाहर निकलने के बाद पिंजरे से ट्यूब को हटा दें।
- जब ट्यूब मच्छरों से मुक्त होती है, तो नीचे की अंगूठी को खोलें, नायलॉन को हटा दें, और ट्यूब से अंडे के साथ फ़िल्टर पेपर को सावधानीपूर्वक हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें। फिल्टर पेपर को एक प्लास्टिक पेट्री डिश (100 मिमी x 15 मिमी) में रखें जिसमें डीडीएच2ओ के साथ नम फिल्टर पेपर की एक परत होती है।
- अंडों का निरीक्षण करें। अंडे जो उस बिंदु तक वृद्ध हो गए हैं जहां वे रंग में हल्के भूरे रंग के हैं(चित्रा 4)संरेखण के लिए तैयार हैं।
- यदि अंडे अभी भी सफेद हैं, तो उन्हें इनक्यूबेटर में वापस कर दें और हर 5 मिनट में रंग की जांच करें। सफेद अंडे नाजुक होते हैं, आसानी से टूट जाते हैं, और इंजेक्शन प्रक्रिया के बाद अच्छी तरह से जीवित नहीं रहते हैं जिसके परिणामस्वरूप कम हैचिंग होती है।
- अंडे जो गहरे भूरे या काले होते हैं, वे बहुत अधिक बूढ़े हो गए हैं। इनका उपयोग न करें।
3. भ्रूण संरेखण
- एक रेजर ब्लेड के साथ नायलॉन ब्लोटिंग झिल्ली (2 सेमी x 1 सेमी) का एक टुकड़ा काटें, यह सुनिश्चित करें कि किनारे को बड़े करीने से छंटनी की गई है।
नोट: यदि किनारा सीधा नहीं है, तो अंडे इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान झिल्ली से ठीक से चिपके नहीं रहेंगे। - एक ग्लास स्लाइड पर एक झिल्ली रखो और फिल्टर पेपर (2 सेमी x 2 सेमी) के एक टुकड़े के साथ झिल्ली को कवर करें, जिससे झिल्ली फिल्टर के ~ 1 मिमी को खुला छोड़ दिया गया(चित्रा 5)।
नोट: सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप स्लाइड उपयोग करने से पहले साफ हैं और झिल्ली फ़िल्टर में हेरफेर करने के लिए स्वच्छ संदंश का उपयोग करें। - विआयनीकृत एच2ओ के साथ फ़िल्टर पेपर को गीला करें क्योंकि अंडे मर जाएंगे यदि लंबे समय तक निर्जलित किया जाता है।
नोट: कागज पर बहुत अधिक पानी न डालें क्योंकि भ्रूण इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान स्थानांतरित हो जाएंगे, लेकिन सुनिश्चित करें कि भ्रूण को सूखने से रोकने के लिए पर्याप्त है(चित्रा 6 ए,बी)। अतिरिक्त पानी को फिल्टर पेपर के एक टुकड़े के साथ अवशोषित करके हटाया जा सकताहै। - धीरे से एक पेंटब्रश (आकार # 0) के साथ झिल्ली के किनारे पर 30-50 भ्रूण स्थानांतरित करें। अंडे को झिल्ली के साथ लंबवत रूप से संरेखित करने के लिए ब्रश का उपयोग करें, धीरे से उन्हें स्लाइड पर रोल करके ताकि वेंट्रल साइड (उत्तल) ऊपर की ओर सामना कर सके।
- सभी अंडों को एक ही दिशा में उन्मुख करें ताकि जब अंडों को माइक्रोइंजेक्शन माइक्रोस्कोप के तहत देखा जाता है, तो पीछे का छोर (अधिक नुकीला, चित्रा 6 ए,बी)नीचे की स्थिति में होता है और सुई के साथ ~ 15 डिग्री का कोण बनाता है(चित्रा 6 सी)। अंडे (30-50) के साथ झिल्ली के पूरे किनारे को लाइन करें और इंजेक्शन के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे स्लाइड रखें।
नोट: अंडे को ध्यान से चुनें। उन लोगों को छोड़ दें जो सफेद (बहुत युवा या अविकसित) या गहरे भूरे रंग के हैं (बहुत पुराने और सुई को तोड़ देंगे), और असामान्य लोगों(चित्रा 7)। सुनिश्चित करें कि फिल्टर पेपर हर समय नम रहताहै।
4. डीएनए तैयारी
- इंजेक्शन के लिए प्लास्मिड डीएनए को शुद्ध करें, कम से कम, निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए एंडोटॉक्सिन-मुक्त डीएनए प्लास्मिड मैक्सिप्रैप किट के साथ।
- पीसीआर-ग्रेड पानी में डीएनए को फिर से निलंबित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक प्रशीतित सेंट्रीफ्यूज में 17,100 x जी पर सेंट्रीफ्यूज करें। फिर, supernatant को एक नई, साफ 1.5 मिली शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। ध्यान से माइक्रो पिपेट स्तंभ से अवांछित कण पदार्थ को स्थानांतरित करने से बचने के लिए।
- 3एम सोडियम एसीटेट की दसवीं मात्रा और 100% इथेनॉल की दो गुना मात्रा का उपयोग करके डीएनए की दूसरी वर्षा करें।
- 1000 ng/μL की अंतिम प्लास्मिड सांद्रता के लिए PCR-ग्रेड पानी के 300-500 μL में DNA को पुन: निलंबित करें। 300-400 ng/μL की अंतिम प्लास्मिड सांद्रता के लिए इंजेक्शन बफर में प्लास्मिड कॉकटेल को मिलाएं और 10-20 μL ऐलीकोट बनाएं।
नोट: डीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है डीएनए माइक्रोइंजेक्शन एलीकोट को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, या आरएनए घटकों का उपयोग करते समय -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। इंजेक्शन मिश्रण में डीएनए के 800 एनजी / μL से अधिक न करें क्योंकि चिपचिपाहट सुइयों को बंद करने का कारण बनेगी।
5. सुई की तैयारी
- एक प्रोग्राम माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करके 10 सेमी क्वार्ट्ज केशिकाओं को खींचकर सुइयों को बनाएं।
- यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत सुई की जांच करें कि टिप अच्छी तरह से बनाई गई है। सुनिश्चित करें कि प्रोग्राम करने योग्य खींचने पर सुई सेटिंग एक टिप उत्पन्न करती है जो टर्मिनल छोर से ~ 0.5 मिमी को पतला करना शुरू कर देती है और एक ठीक बिंदु में समाप्त होती है (चित्रा 6देखें)। आसानी से टूटने वाली सुइयों में आमतौर पर एक टेपर का बहुत लंबा होता है।
नोट:: शर्तें सुई खींचने के आधार पर भिन्न हो सकती हैं (लेखक ों को उनके द्वारा उपयोग किए जाने वाले प्रोग्राम योग्य पुलर के लिए सेटिंग्स का अनुरोध करने पर उपलब्ध कराया जाएगा। जर्नल प्रतिबंध हमें एक विशिष्ट ब्रांड का हवाला देने से रोकते हैं)। सुइयों को हाथ से खींचा जा सकता है, लेकिन इसके लिए एक कौशल-सेट की आवश्यकता होती है जो अधिकांश प्रयोगशालाओं में उपलब्ध नहीं है।
6. भ्रूण microinjection
- डीएनए मिश्रण के 2 μL के साथ सुइयों को भरने के लिए एक माइक्रो-लोडर टिप का उपयोग करें। सुई धारक में सुई डालें और स्वचालित दबाव पंप टयूबिंग(चित्रा 8)को कनेक्ट करें।
- महत्वपूर्ण: सुई को संरेखित करें ताकि यह स्लाइड के विमान के साथ 15 ° का कोण बना सके(चित्र8)।
- पहले अंडे को ध्यान से छूकर सुई की नोक को खोलें और पीछे के ध्रुव में 10 μm ≤ सुई की नोक को सम्मिलित करके इसे इंजेक्ट करें। एक सफल इंजेक्शन अंडे के भीतर साइटोप्लाज्म के एक छोटे से आंदोलन को जन्म देगा।
- इंजेक्शन जारी रखने के लिए अगले अंडे में जाने के लिए माइक्रोस्कोप समाक्षीय चरण नियंत्रण का उपयोग करें।
- यह सुनिश्चित करने के लिए कि सुई की नोक खुली रहती है और भरी नहीं है, दूसरे भ्रूण में प्रवेश करने से पहले इंजेक्ट बटन दबाएं और सुई के उद्घाटन पर छोटी बूंद की कल्पना करें।
- यदि सुई भरी हुई हो जाती है, तो सुई को साफ़ करने के लिए साफ़ करें बटन दबाएं और ड्रॉपलेट विज़ुअलाइज़ेशन परीक्षण को दोहराएं। आवश्यकतानुसार दबाव को समायोजित करें यदि सुई की नोक खोलने से यह सुनिश्चित करने के लिए थोड़ा बड़ा हो जाता है कि बूंद का आकार छोटा रहता है।
- एक सुई के साथ ~ 40-50 अंडे इंजेक्ट करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि फ़िल्टर पेपर हर समय नम रहता है। सुई को साफ रखने के लिए उस पर पर्याप्त पीठ का दबाव रखें। एक सुई जिसे अनलॉग नहीं किया जा सकता है, उसे एक नई सुई के साथ बदल दिया जाना चाहिए। भ्रूण प्लेसमेंट, सुई सम्मिलन और इंजेक्शन को माइक्रोस्कोप के साथ आसान बनाया जाता है जिसमें चरण के क्षैतिज आंदोलन के लिए समाक्षीय नियंत्रण होते हैं(चित्रा 9)।
- इंजेक्शन पूरा होने के बाद, अंडे को फ़िल्टर पेपर के साथ पंक्तिबद्ध एक ग्लास कंटेनर में कुल्ला करें और विआयनीकृत एच2ओ(चित्रा 10)के 50 मिलीलीटर से भरा हुआ है।
नोट: भ्रूण इंजेक्शन के बाद 2 दिनों के लिए हैचिंग शुरू कर देगा और 3-5 दिनों तक का समय लग सकता है। हैच किए गए पहले इंस्टार लार्वा को तुरंत स्थानांतरित किया जाना चाहिए (दैनिक 2 बार जांचें) पानी और भोजन के साथ एक साफ कंटेनर में।
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Representative Results
वर्णित माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल के आवेदन का एक प्रतिनिधि उदाहरण Carballar-Lejarazú et al5में पाया जा सकता है। यहां इरादा एक प्रयोगशाला तनाव, जी 3, An. gambiaeके जर्मलाइन में एक स्वायत्त जीन-ड्राइव प्रणाली डालने के लिए किया गया था। प्रणाली को इस प्रजाति में तीसरे गुणसूत्र पर कार्डिनल ऑर्थोलॉग लोकस(एजीजीडी)को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जो एक हीम पेरोक्सीडेस को एन्कोड करता है जो 3-hydroxykynurenine के रूपांतरण को xanthommatin में उत्प्रेरित करता है, जो ओम्मोक्रोम जैवसंश्लेषण में अंतिम चरण है(चित्रा 11)। होमोजीगस जीन ड्राइव-युक्त मच्छर लार्वा, प्यूपे और नए उभरे वयस्कों के साथ नुकसान-ऑफ-फंक्शन कार्डिनल म्यूटेंट होते हैं, जिनमें लाल आंख फेनोटाइप होता है। एक प्लास्मिड, pCO37, जिसमें ड्राइव सिस्टम होता है, स्ट्रेप्टोकोकस प्योजीनेस कैस 9 (SpCas9) एंडोन्यूक्लिएज को एक गाम्बिया नैनो जीन ऑर्थोलॉग के नियामक तत्वों के नियंत्रण में व्यक्त करता है, एक 23-न्यूक्लियोटाइड गाइड आरएनए (जीआरएनए) एक एन गाम्बिया यू 6 जीन प्रमोटर के नियंत्रण में और एक 3XP3-CFP प्रमुख मार्कर कैसेट ट्रांसजेनिक संतानों की पहचान करने के लिए सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करता है। Agcd डीएनए टुकड़े जीआरएनए लक्ष्य कटौती साइट flanking जीनोमिक क्षेत्रों के लिए सजातीय संभव होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत- (HDR) मध्यस्थता एकीकरण बनाते हैं।
सात सौ अस्सी जंगली प्रकार An. gambiae भ्रूण SpCas9 प्रोटीन के साथ pCO37 प्लास्मिड के साथ इंजेक्ट किया गया था। एक सौ छियालीस इंजेक्ट किए गए भ्रूण (18.7%); जी0)वयस्क चरण तक बच गया और बाद में विपरीत लिंग के जंगली-प्रकार के सदस्यों के लिए आउटक्रॉस किया गया। अगली पीढ़ी (जी1) संतानोंकी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप स्क्रीनिंग ने 3,428 (0.09%) में से तीन की पहचान की जो सीएफपी मार्कर जीन के लिए सकारात्मक थे, जिनमें से केवल दो, एक पुरुष और महिला, बच गए। आणविक दृष्टिकोण (जीन प्रवर्धन, डीएनए अनुक्रमण) ने डीएनए के ~ 10 केबी के सटीक सम्मिलन को सत्यापित किया और परिणामस्वरूप तनाव को AgNosCd-1 नामित किया गया था। व्यापक अनुवर्ती विश्लेषण से पता चला है कि AgNosCd-1 ड्राइव में अत्यधिक कुशल था, कुछ प्रतिरोधी एलील बनाया और जीन-ड्राइव सिस्टम5के एकीकरण और अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप कोई प्रमुख आनुवंशिक लोड (फिटनेस लागत) नहीं था। PCO37 प्लास्मिड मलेरिया परजीवी संचरण को रोकने के लिए An. gambiae के जनसंख्या संशोधन उपभेदों के विकास के लिए रीढ़ की हड्डी के रूप में कार्य करता है।
चित्रा 1:अंडा संग्रह डिवाइस. अंडा संग्रह उपकरण फिल्टर पेपर, नायलॉन जाल, दंत फिल्म और एक retrofitted 50 mL शंक्वाकार ट्यूब से बना है। डिवाइस मच्छरों को एस्पिरेटर द्वारा सुरक्षित रूप से कंटेनर में दंत फिल्म में भट्ठा के माध्यम से जमा करने की अनुमति देता है। फिल्टर पेपर और नायलॉन जाल पानी को अवशोषित करने की अनुमति देता है, जो एक नम प्रदान करता है, लेकिन ओवीपोज़िशन के लिए बाढ़ वाली सतह नहीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: Anopheles गैम्बिया भ्रूण. ए)परिपक्वता के विभिन्न चरणों में भ्रूण का एक बैच। बी)तीर पीछे के ध्रुव को इंगित करते हैं, भ्रूण के भीतर का स्थान जिसमें जर्मलाइन कोशिकाएं होती हैं, जो परिवर्तन के लिए इच्छित लक्ष्य हैं। स्केल बार ~ 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3:अंडा संग्रह. एक बार जब मच्छरों को अंडा संग्रह उपकरण के अंदर रखा जाता है, तो इसे एक पेट्री डिश में ले जाया जाता है जिसमें डीडीएच2ओ के साथ नम फिल्टर पेपर की एक परत होती है। पानी की मात्रा को समायोजित करें ताकि पानी का स्तर टोपी की ऊंचाई ~ 1/4 तक बढ़ जाए। अंडा संग्रह उपकरण और पेट्री डिश को फिर एक अंधेरे इनक्यूबेटर में रखा जाता है और मच्छरों को कुल 45 मिनट के लिए ओविपोसिट करने की अनुमति दी जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4:भ्रूण विकास। भ्रूण केवल एक छोटी समय खिड़की के दौरान इंजेक्शन के लिए उपयुक्त हैं। अंडे जो विकास में समय से पहले इंजेक्ट किए जाते हैं, वे बहुत नाजुक होते हैं और नुकसान का सामना करेंगे और हैच नहीं करेंगे। अंडे जो बाद में उनके विकास में इंजेक्ट किए जाते हैं, कठोर हो जाते हैं और सुई को तोड़ सकते हैं जिससे अंडे में बहुत अधिक आनुवंशिक सामग्री इंजेक्ट की जा सकती है। इसके अतिरिक्त, विकास में बाद में इंजेक्शन जर्मलाइन में स्थायी परिवर्तन का कारण बनने की संभावना कम होती है क्योंकि ध्रुव कोशिकाएं तेजी से आगे की प्रतिकृति और भेदभाव से गुजरती हैं। तस्वीरें 45 मिनट के ओवीपोज़िशन समय के बाद हर 10 मिनट में ली गई थीं। तारांकन (*) अंडे को इंगित करता है जो इंजेक्शन के लिए उपयुक्त हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5:झिल्ली स्लाइड असेंबलिंग. अंडे नायलॉन झिल्ली के साथ संरेखित होते हैं, जो एक समर्थन संरचना प्रदान करता है ताकि अंडे इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान स्थानांतरित न हों। फिल्टर पेपर यह सुनिश्चित करने के लिए पानी के लिए एक जलाशय के रूप में कार्य करता है कि अंडे पूरे इंजेक्शन में नम रहें। फिल्टर पेपर और नायलॉन झिल्ली को ग्लास स्लाइड के किनारे के करीब रखें, जिससे अंडे और पानी दोनों के लिए जगह मिल सके जो उन्हें जलमग्न करता है। यदि झिल्ली और फ़िल्टर पेपर स्लाइड के किनारे से बहुत दूर हैं, तो भ्रूण और सुई के बीच सही कोण प्राप्त करना मुश्किल होगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6:माइक्रोइंजेक्शन के लिए भ्रूण अभिविन्यास। ए)भ्रूण पूर्वकाल की तुलना में कम पीछे के ध्रुवों के साथ संरेखित होते हैं, झिल्ली के नीचे चल रहे हैं। बी)भ्रूण पानी में डूबे हुए हैं; अंडे के ऊपर पानी की रेखा की चौड़ाई को समायोजित करने के लिए लगभग एक औसत भ्रूण की चौड़ाई एक आठवीं से एक चौथाई होने के लिए। C)भ्रूण के साथ सुई कोण की क्लोज-अप छवि। स्केल बार ~ 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 7:असामान्य भ्रूण। भ्रूण जो रंग या बनावट में असामान्य दिखाई देते हैं, वे हैच नहीं करेंगे; उन्हें इंजेक्ट न करें। जो भ्रूण पीले रंग के होते हैं, वे ठीक से मेल नहीं खाते हैं। चिकनी भ्रूण में कम हैचिंग भी देखी गई है जिसमें सामान्य दिखने वाले अंडे के छिलके (क्यूटिकल्स) नहीं होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 8:microinjections के दौरान सुई की स्थिति. ए)इंजेक्शन चरण का वाइड-एंगल दृश्य। B,C)सुई को इस प्रकार रखें कि संरेखित भ्रूण इंजेक्शन सुई के साथ 15° का कोण बनाते हैं। माइक्रोइंजेक्शन उपकरण की बांह को ऊपर न उठाएं जो सुई को माइक्रोस्कोप चरण की तुलना में काफी अधिक रखता है ताकि सुई और भ्रूण युक्त स्लाइड के बीच उचित एंगलिंग सुनिश्चित हो सके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 9:सह-अक्षीय नियंत्रण और सुई धारक। ए)सह-अक्षीय नियंत्रण (तीर) प्रत्येक इंजेक्शन के लिए सुई के सटीक प्लेसमेंट को सुनिश्चित करने के लिए सुई के 3-आयामी आंदोलन के लिए अनुमति देते हैं। स्लाइड्स को स्विच करते समय सुई को लंबवत रूप से उठाने के लिए सह-अक्षीय नियंत्रण का उपयोग करना महत्वपूर्ण है ताकि सुई मंच पर जगह में डालते समय नई स्लाइड से टकरा न जाए। पार्श्व सह-अक्षीय नियंत्रण पीछे के ध्रुव में सुई के सटीक प्रवेश के लिए अनुमति देते हैं। बी)इंजेक्शन के लिए कोण दिखाते हुए सुई धारक की छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 10:अंडे सेने के लिए कक्ष. ए, बी)ध्यान से एक बेलनाकार कंटेनर में इंजेक्ट किए गए भ्रूण को डबल-आसुत पानी के साथ एक चौथाई गहराई तक भरकर धोएं और फिल्टर पेपर के साथ पंक्तिबद्ध करें। सी,डी) कंटेनर के आंदोलन के अंडे स्वाभाविक रूप से फिल्टर पेपर का पालन करने का कारण बनता है। हैचिंग के लिए कंटेनर छोड़ने से पहले, सुनिश्चित करें कि फ़िल्टर पेपर के ऊपर उच्च स्तर का पालन करने वाले किसी भी अंडे को धीरे-धीरे पानी के स्तर पर वापस धोया जाता है। नीला अंडाकार सापेक्ष आकार दिखाने के लिए कई जमा अंडे को चिह्नित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 11| Anopheles गैम्बिया कार्डिनल (Agcd)जीन ortholog, pCO37 जीन ड्राइव निर्माण और परिणामस्वरूप फेनोटाइप। शीर्ष) Agcd जीन: मैरून ब्लॉक, एक्सोन (E1-4); खाली ब्लॉक, 3'- और 5-अअनुवादित क्षेत्र (यूटीआर); मोटी काली रेखा, introns और intergenic डीएनए. मध्य) pCO37 प्लास्मिड: Agcd जीन से होमोलॉजी हथियार: मैरून ब्लॉक, नीले ब्लॉक, प्रमुख मार्कर जीन घटकों (3XP3 और CFP); टैन ब्लॉक, ड्राइव घटकों(nanos प्रमोटर और SpCas9 प्रोटीन एन्कोडिंग अनुक्रम); हरे रंग के ब्लॉक, आरएनए घटकों का मार्गदर्शन (U6 प्रमोटर और gRNA अनुक्रम)। जीन और pCO37 की विशेषताएं पैमाने पर नहीं हैं। पुनर्संयोजन (मैरून तीर) के परिणामस्वरूप होमोलॉगी निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) SpCaS9 / gRNA-मध्यस्थता कट साइट (हरे एरोहेड) पर शुरू किया गया जीन ड्राइव निर्माण के एकीकरण में परिणाम देता है। नीचे) जीन ड्राइव एकीकरण के परिणामस्वरूप दिखाई देने वाले फेनोटाइप: (बाएं) सीएफपी+ (सफेद / नीला तीर) और लार्वा में होमोजीगस एजीजीडी-उत्परिवर्ती (लाल तीर) फेनोटाइप और एजीसीडी-उत्परिवर्ती (लाल तीर) फेनोटाइप ्स प्यूपे में। (दाएँ) होमोजीगस Agcd उत्परिवर्ती फेनोटाइप वयस्कों में "लाल आंख"। Carballar-Lejarazú et al से अनुकूलित। (2020) और अनुमति के साथ उपयोग किया जाताहै 5। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
CRISPR / Cas9 जैसी सटीक और लचीली आनुवंशिक इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकियों की बढ़ती उपलब्धता के साथ, ट्रांसजेनिक जीवों को पहले से अधिक सरल और स्थिर तरीके से विकसित किया जा सकता है। इन उपकरणों ने शोधकर्ताओं को मच्छर वैक्टर के ट्रांसजेनिक उपभेदों को बनाने की अनुमति दी है जो रोगजनकों (जनसंख्या संशोधन) या वंशानुगत बांझपन (जनसंख्या दमन) के लिए या तो अपवर्तकता के वांछित गुणों को प्राप्त करने के बहुत करीब हैं। हालांकि, सबसे सुरक्षित और स्थिर आनुवंशिक रूप से संशोधित मच्छरों को विकसित करने के लिए, अतिरिक्त ट्रांसजेनिक लाइनों को बनाया और मूल्यांकन करने की आवश्यकता है ताकि क्षेत्र के अध्ययन के लिए इष्टतम लाइनों का चयन किया जा सके। वर्णित प्रोटोकॉल एनोफिलीज़ गैम्बिया ट्रांसजेनिक्स उत्पन्न करने की दक्षता को बढ़ा सकता है ताकि जनसंख्या संशोधन और दमन रणनीतियों के लिए अतिरिक्त उम्मीदवारों को विकसित किया जा सके।
वर्णित माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया उन उपकरणों और सामग्रियों का उपयोग करती है जो संभवतः एक प्रयोगशाला में उपलब्ध हैं जो नियमित रूप से मच्छरों या अन्य आर्थ्रोपोड वैक्टर के माइक्रोइंजेक्शन करते हैं। पूरे प्रोटोकॉल में विस्तार पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है। गुणवत्ता द्वारा अंडे का चयन करने या दूसरे डीएनए वर्षा जैसे चरणों को छोड़ने जैसे चरणों के माध्यम से दौड़ना परिणामों को खराब कर देगा और कम हैचिंग और कम परिवर्तन दक्षता का कारण बनेगा। इसके अलावा, प्रक्रिया के साथ कई कठिनाइयां पैदा हो सकती हैं यदि मच्छर पालन में देखभाल नहीं की जाती है। मच्छर जो भीड़-भाड़ वाली परिस्थितियों में या पोषक तत्वों की कमी के साथ पाले जाते हैं, वे खराब गुणवत्तावाले 14के कम अंडे देंगे, जो माइक्रोइंजेक्शन वर्कफ़्लो में बाधाएं पैदा करता है और इंजेक्ट किए गए भ्रूण की वांछित संख्या तक पहुंचने के लिए आवश्यक समय को बढ़ाएगा।
एनोफिलीज़ स्टीफेंसी12के माइक्रोइंजेक्शन के लिए वर्णित तरीकों के विपरीत, इस विधि को भ्रूण के तेल के पनडुब्बी की आवश्यकता नहीं होती है और तेल-आधारित विधि द्वारा आवश्यक अतिरिक्त चरणों के बिना कम समय में अधिक भ्रूण इंजेक्ट किया जा सकता है। तेल-आधारित विधि की तुलना में इस विधि की एक सीमा माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान खराब विज़ुअलाइज़ेशन है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि इंजेक्शन सामग्री या भ्रूण साइटोप्लाज्म सुई में वापस नहीं बह रहा है, इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान हर समय सुई के पीछे के दबाव पर ध्यान दिया जाना चाहिए।
अफ्रीकी मलेरिया वेक्टर ऐतिहासिक रूप से अन्य एनोफिल्स एसपीपी की तुलना में आनुवंशिक रूप से हेरफेर करना मुश्किल रहा है, फिर भी यह दुनिया भर में मलेरिया के मामलों में सबसे बड़ा योगदानकर्ता है। मलेरिया उन्मूलन प्रयासों का समर्थन करने के लिए उपन्यास उपकरणों की आवश्यकता होती है और मच्छरों की आबादी को संशोधित करने या दबाने के लिए डिज़ाइन किए गए ट्रांसजेनिक मच्छर उन्मूलन प्राप्त करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं। क्षेत्र-आधारित मलेरिया उन्मूलन अध्ययनों के लिए सर्वश्रेष्ठ ट्रांसजेनिक उम्मीदवारों का चयन करने के लिए, कई लाइनों का मूल्यांकन किया जाना चाहिए ताकि उनकी तुलना की जा सके और इष्टतम प्रभावकारिता और सुरक्षाकेलिए चुना जा सके। बढ़ी हुई refractoriness या दमन के साथ ट्रांसजेनिक लाइनों को बनाने के लिए आवश्यक आनुवंशिक और आणविक बिल्डिंग ब्लॉकों की विशेषता और उपलब्ध हैं। यह प्रोटोकॉल उस गति को बढ़ाने में मदद करेगा जिस पर इन दुर्दम्य या दमनकारी लाइनों को बनाया जा सकता है ताकि सत्यापन के प्रयास निकट भविष्य में क्षेत्र परीक्षणों के लिए एक उम्मीदवार का चयन करना शुरू कर सकें।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम मच्छर पालन के लिए Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish पॉवेल और Madeline Nottoli के आभारी हैं। वित्त पोषण कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन मलेरिया पहल द्वारा प्रदान किया गया था। AAJ कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन में एक डोनाल्ड ब्रेन प्रोफेसर है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Microinjection Buffer | - | - | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75x26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
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