Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Håndteringsteknikker til reduktion af stress hos mus

Published: September 25, 2021 doi: 10.3791/62593
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 4, 5, 1,2,3, 1,2
1Campbell Family Mental Health Research Institute of CAMH, 2Department of Psychiatry, University of Toronto, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 4Departamento de Investigación, Universidad Central de Queretaro, 5Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 5287, Institut de Neurosciences Cognitives et Intégratives d'Aquitaine, Université de Bordeaux

Summary

Dette papir beskriver en håndteringsteknik hos mus, 3D-håndteringsteknikken, som letter rutinemæssig håndtering ved at reducere angstlignende adfærd og præsenterer detaljer om to eksisterende relaterede teknikker (tunnel- og halehåndtering).

Abstract

Forsøgsdyr udsættes for flere manipulationer af forskere eller dyreplejeudbydere. Den stress, dette forårsager, kan have dybtgående virkninger på dyrs trivsel og kan også være en forvirrende faktor for eksperimentelle variabler såsom angstforanstaltninger. I årenes løb er håndteringsteknikker, der minimerer håndteringsrelateret stress, blevet udviklet med særligt fokus på rotter og lidt opmærksomhed på mus. Det har dog vist sig, at mus kan vænnes til manipulationer ved hjælp af håndteringsteknikker. At vænne mus til håndtering reducerer stress, letter rutinemæssig håndtering, forbedrer dyrs trivsel, reducerer datavariationen og forbedrer eksperimentel pålidelighed. På trods af gavnlige virkninger af håndtering anvendes haleopstyrtningen, som er særlig stressende, stadig i vid udstrækning. Dette papir giver en detaljeret beskrivelse og demonstration af en nyudviklet musehåndteringsteknik, der har til formål at minimere den stress, som dyret oplever under menneskelig interaktion. Denne manuelle teknik udføres over 3 dage (3D-håndteringsteknik) og fokuserer på dyrets evne til at vænne sig til eksperimentatoren. Denne undersøgelse viser også effekten af tidligere etablerede tunnelhåndteringsteknikker (ved hjælp af en polycarbonattunnel) og haleopspørgningsteknikken. Specifikt undersøgt er deres virkninger på angstlignende adfærd ved hjælp af adfærdstest (Elevated-Plus Maze og Nyhed undertrykt fodring), frivillig interaktion med eksperimentatorer og fysiologisk måling (kortikosteronniveauer). 3D-håndteringsteknikken og tunnelhåndteringsteknikken reducerede angstlignende fænotyper. I det første eksperiment, ved hjælp af 6 måneder gamle mandlige mus, forbedrede 3D-håndteringsteknikken eksperimenterinteraktionen betydeligt. I det andet eksperiment, ved hjælp af 2,5 måneder gammel kvinde, reducerede det kortikosteronniveauer. 3D-håndteringen er således en nyttig tilgang i scenarier, hvor interaktion med eksperimentatoren er påkrævet eller foretrukket, eller hvor tunnelhåndtering muligvis ikke er mulig under eksperimentet.

Introduction

Mus og rotter er væsentlige aktiver til prækliniske undersøgelser1,2 til flere formål, herunder endokrinale, fysiologiske, farmakologiske eller adfærdsmæssige undersøgelser2. Fra det stigende antal undersøgelser, der involverer dyr, opstod det , at ukontrollerede miljøvariabler, herunder menneskelig interaktion, påvirker forskellige resultater i biomedicinsk forskning3,4,5. Dette er ansvarlig for betydelig variation observeret på tværs af eksperimenter og forskningslaboratorier4,5, udgør en stor advarsel i dyreforskning.

Der er gennemført forskellige tilgange med det formål at begrænse virkningen af miljøstressorer og reducere reaktiviteten til menneskelig interaktion. For eksempel, for at begrænse virkningen af miljøstressorer, standardisering af boligforhold og automatiserede boligsystemer6,7 er blevet implementeret på tværs aflaboratorier. Med hensyn til interaktion med mennesker havde almindeligt anvendte tilgange til håndtering og transport af dyr ringe hensyntagen til ubehag og stress hos dyr. For eksempel øger opplukning af dyr i halen eller ved hjælp af pincet8 baseline angst9,10,11, reducerer efterforskning9,12 og bidrager i høj grad til inter-individuelle variabilitet i og på tværs af undersøgelser13,14. Som følge heraf blev der udviklet andre tilgange, såsom kophåndteringsteknikken, som gælder for mus og rotter. I denne tilgang er dyrene "cupped" ud af deres bur og holdes af forsøgerne med deres hænder, der danner en kop9,10,11. Et andet nyttigt alternativ til halehåndtering indebærer brug af en polycarbonattunnel til overførsel af mus9,10,15. Denne fremgangsmåde eliminerer direkte interaktion mellem musen og eksperimentatoren. Både kop og tunnel tilgange viste effekt i at reducere angst-lignende adfærd og frygt for experimenter, der kan overdrives af aversive håndtering teknikker, såsom hale pick up / hale håndtering9,10.

Derfor viser stigende dokumentation nytten af korrekt musehåndtering for at reducere variationen mellemindividerne 9,11og forbedredyrevelfærden 10. De teknikker, der er nævnt ovenfor, står dog stadig over for begrænsninger. Kophåndteringsteknikken er implementeret med tidsplaner fra 10 dage (10 sessioner over 2 uger16) op til 15 uger17, hvilket er en betydelig mængde tid for facilitetspersonale og eksperimenter. Derudover, effektiviteten af kop håndtering varierer efter stamme9 og konventionelle kop håndtering i åbne hænder kan føre til naive mus eller særligt nervøse stammer til at hoppe fra hånden9,18. Tunnelhåndtering resulterer i mere konsistente og generelt hurtigere resultater i gentling19. Tunneler bruges også som hjemme bur berigelse. De hjælper dyr med at vænne sig til at håndtere hurtigt og give de ekstra fordele ved berigelse. Tunnelhåndtering har imidlertid begrænsninger ved overførsel af dyr mellem apparater. Interessant nok viste Hurst og West9, og Henderson et al.20, at brug af blid og kort manuel håndtering til at overføre dyr fra tunnelen til apparatet ikke påvirker deres fænotype.

For at give et alternativ til eksisterende metoder, med opnåelig tilvænning på kort tid, beskriver denne artikel en ny teknik, der udvider kophåndteringsteknikken og derfor ikke kræver noget bestemt udstyr. Denne tilgang bruger milepæle til at måle niveauet af komfortmus har med håndteringsprocessen. Det viser effekt ved faldende musereaktivitet og stress (på adfærdsmæssige og hormonelle niveauer), letter rutinemæssig håndtering og bidrager til at reducere variationen mellem dyr. Detaljer om denne teknik leveres her, og dens effektivitet ved at reducere angstlignende adfærd, forbedre interaktionen med eksperimentatorer og begrænse perifer stresshormon (corticosteron) frigivelse demonstreres i to separate undersøgelser (mandlige og kvindelige mus), sammenlignet med tunnelhåndtering (positiv kontrol) og halehåndteringsteknikker (negativ kontrol).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsøg med dyreforsøg blev godkendt af CAMH's dyreplejeudvalg og gennemført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Det Canadiske Råd for Dyrepleje.

BEMÆRK: Den håndteringsmetode, der er beskrevet heri, kan anvendes i forskellige musestammer, herunder ikke-transgene (C57/BL6, BalbC, CD1, SV129 osv.) og transgene linjer. Det kan også bruges med unge eller gamle mus og bemærke, at unge voksne (4-6 uger gamle) mus har tendens til at være lidt mere aktive end voksne eller gamle mus, især på dag 1.

1. Eksperimentel forberedelse

  1. Før undersøgelsen påbegyndes, tildeler i henhold til ARRIVE-retningslinjerne21tilfældigt mus til hver håndteringsgruppe (3D-håndtering, tunnelhåndtering eller halehåndtering).
  2. Identificer det rum, der skal håndteres. Det kan udføres i boligrummet eller i et separat rum. Hvis håndteringen udføres i et separat rum, som kræver, at dyrene skal flyttes på en vogn i bevægelse, skal dyrene vænne sig til det nye rum i 20-30 minutter inden igangsætning af håndteringsprotokollen.
  3. For gruppehusdyr skal du bruge et midlertidigt bur til at huse mus efter håndteringen, før du omgrupperer dem alle i deres oprindelige hjemmebur. Dette reducerer potentielle kampe mellem dyr før håndtering (især hos mænd).
  4. Arbejde på en tæller (helst en ryddet bordplade) eller i et biosikkerhedsskab, hvor staldburet er væk fra dyret, der håndteres. Tæt på staldburet øger risikoen for at hoppe. Hvis dyrene er gruppe-opstaldet, hoppe af musen, der håndteres i hjemmet buret kan forårsage stress til bur-hjælpere.
    BEMÆRK: At arbejde i et biosikkerhedsskab begrænser risikoen for, at mus hopper på gulvet, og kan være påkrævet i visse faciliteter. Denne teknik kan bruges i et biosikkerhedsskab, der sørger for altid at udføre alle trin inde i biosikkerhedsskabet og undgå mus, der går på håndtererarme.

2. DAG 1: 5 min pr. mus

  1. Åbn forsigtigt buret og læg låget på siden, fjern redematerialer og anden berigelse såsom løbehjul eller husly.
  2. Indfør en behandsket åben hånd til hjemmeburet, og placerer langsomt hånden langs den ene side af burvæggen (væggen tættest på håndtereren, Figur 1A).
    1. Forsøg ikke straks at samle musen op.
  3. Forbliv immobil og lad dyret vænne sig til tilstedeværelsen af hånden i buret i ca. 30 s.
  4. Forsøg at samle musen op i håndfladen (dvs. undgå at samle dyret op i halen).
    1. Hvis musen ikke let afhentes efter 3 forsøg, skal du guide musen til et hjørne og en kop med begge hænder.
    2. Flyt forsigtigt de cupped hænder mod musen for at forsøge at samle den op.
    3. Hvis det ikke lykkes efter maksimalt 3 forsøg med begge hænder, skal du forsigtigt samle musen op ved bunden af halen og overføre den til underarmen eller den flade hånd.
  5. Hold hånden så flad og åben som muligt med musen i hånden.
    BEMÆRK: Dette giver en flad platform for musen at træde ind på, og begrænser risikoen for bid.
  6. Hold hånden åben og flad med håndfladen oppe, placer den anden side ved siden af hånden, der holder musen, og lad musen bevæge sig frit fra hånd til hånd uden nogen tilbageholdenhed (Figur 1B).
  7. Lad musen udforske og bevæge sig mellem hænderne i 1 minut.
    1. På dette tidspunkt mus kan forsøge at springe væk. Placer hænderne på en sådan måde, at hvis musen hopper, lander den på en bordplade i stedet for gulvet.
    2. Hvis en mus ser ud som om den forbereder sig på at hoppe (bevæger sig mod kanten af hånden og opdræt på bagbenene), skal du langsomt placere den anden hånd foran den og forsøge at guide den til at gå på denne hånd. Undgå pludselige bevægelser, da det øger deres risiko for at hoppe.
    3. Hvis en mus hopper, skal du forsøge at samle den op og undgå halehåndtering og genoptage håndteringssessionen. Hvis musen forbliver på gulvet eller ude af hænderne i mere end 10 s, skal du tilføje ekstra tid til håndteringssessionen for at kompensere for enhver tid, hvor musen var ude af hænderne.
    4. Tag noter af springet. Det samlede antal spring kan bruges til at vurdere potentiel variation mellem dyr.
  8. Efter 1 minutters håndtering med flade hænder, slappe af håndfladen, og lidt kop musen i hånden, før forsigtigt rullende musen mellem hænderne (Figur 1C).
    1. For at "rulle" skal du placere musen i håndfladen på en flad hånd vinkelret på fingrene.
    2. Luk langsomt hånden og placere fingrene på bagsiden af musen.
    3. Placer den frie hånd direkte under hånden, der holder musen.
    4. Drej/roter langsomt hånden med musen for forsigtigt at overføre musen til den anden side (180° flip).
    5. Gentag dette frem og tilbage mellem hænderne.
  9. Skift fra blid rulning mellem hænder og fri udforskning på åbne hænder i 60 s, skiftevis mellem teknikker omkring hver 20 s.
  10. Udfør en "sheltertest" (Figur 1D).
    1. Lad musen flytte til kanten af hånden og derefter bringe de 2 hænder sammen.
    2. Meget langsomt, kop dem, så musen passer ind i et "husly" dannet af hænderne. Lad en åbning stå, så musen kan slippe ud, hvis det er nødvendigt.
    3. Tilstræbe at holde musen i læ for 5-10 s, uden nogen tilbageholdenhed.
    4. Skift mellem husly test, rulle mellem hænder og fri udforskning af åbne hænder til en anden 60 s, og sørg for at udføre husly trin 3 eller flere gange.
  11. I alle de procedurer, der er beskrevet i 2.10, skal du ikke fremskynde processen. Hvis musen ser stresset ud (dvs. forsøgsvis at undslippe, hopper fra hænderne, undgår kontakt med hænder osv.) ved at være indespærret i hænderne, skal du fortsætte med at rulle mellem hænderne og fri udforskning i 20 s og derefter prøve igen.
  12. Milepæl: Udfør mindst 1 vellykket sheltertest på 10 s for at afslutte dag 1.
    1. Overvej en husly test vellykket, når musen forbliver i hænderne. Hvis musen springer hovedet ud og vender tilbage til husly, er det stadig en vellykket test. Hvis dyret helt kommer ud af huslyet, er det en fiasko.
  13. Tillad gratis udforskning i hænderne i 30 s.
  14. Udskift forsigtigt musen i buret. Hvis gruppen har til huse, skal du placere musen i det midlertidige bur, indtil alle burkammerater håndteres. Returner musene til deres oprindelige bur ved at samle dem op i håndfladen. Brug ikke en haleopspøring.
  15. Rengør bænken toppen af potentielle afføring og urin med 70% ethanol.
  16. Skyl handsker grundigt med 70% ethanol (eller passende rengøringsopløsning) eller skift handsker inden håndtering af den næste mus (det er muligt at holde de samme handsker til burkammerater).
    BEMÆRK: Det anbefales at udføre håndteringen med et rimeligt antal dyr for at undgå træthed fra håndtereren. Håndtering af 24 mus tager omkring 2 timer, og det anbefales ikke at overstige 24 mus pr. Handler. Hvis der skal håndteres flere dyr, anbefales det enten at have flere håndterer eller at opdele håndteringsprocedurerne i undergrupper over flere dage.

3. DAG 2: 3 til 5 min pr. mus

  1. Forsøg at samle musen op i håndfladen. På dette stadium bør det allerede være muligt, og mus bør ikke hoppe ud af hånden.
  2. Start med håndfladen åben som på dag 1, så musen kan udforske frit i 20 s.
  3. Rul derefter musen mellem hænderne et par gange (4-5 gange).
  4. Udfør "sheltertesten" i 5 s.
  5. Gentag sheltertesten flere gange (~5-6) over en periode på 2 til 3 minutter.
  6. I løbet af samme 2 til 3 minutters periode skiftes med rullen mellem hænder og fri udforskning af åbne hænder skridt fra dag 1 for at forbedre tilvænning.
    1. Rør musen på hovedet og ryggen (Figur 1E), 5-6 gange. Et tegn på tilvænning er, når musen lader dig røre ved den uden at forsøge at flygte.
    2. Udfør en "Næsestål": Prøv at røre ved musens snude, 2 til 3 gange (Figur 1F).
      1. Hvis musen forsøger at bide eller viser tydelige tegn på stress ved at blive rørt, må du ikke straks forsøge næsestikke igen. Skift i stedet med flad håndudforskning og rulle. "Habituation" afspejles af dyret, der ikke løber væk eller vender hovedet i tilfælde af menneskelig kontakt.
  7. I alle de procedurer, der er beskrevet i 3.4-3.6, skal du ikke haste processen. Hvis musen ser stresset ud ved at være indespærret i hænderne eller ikke ønsker at blive rørt, skal du fortsætte med at rulle mellem hænderne i 20-30 s og derefter prøve igen.
  8. Milepæle: Udfør mindst 1 vellykket næsestikke til 2-3 s for færdiggørelse af dag 2.
  9. Stop denne session efter ca. 3 minutters håndtering, hvis dyret reagerer godt på "huslyet", "hoved petting", "næsestikke", og hvis musen ser ud til at være villig til at udforske hænderne uden tegn på stress.
  10. Hvis musen fortsætter med at udvise tegn på stress eller ikke reagerer godt på "shelter test" eller "næse sækken" test, fortsætte sessionen, indtil de når 5 min som i dag 1.
  11. Udskift musen i buret, rengør bænketoppen og handskerne som i dag 1.

4. DAG 3: Ca. 3 min pr. mus

  1. På den tredje dag skal du fortsætte gennem de samme trin som i dag 2 i 2 til 3 minutter.
    1. Saml musen op i håndfladen.
    2. Overfør og rul musen mellem hænderne
    3. Udfør en internattest.
    4. Prøv at klappe musen på ryggen og hovedet.
  2. Skift mellem disse trin over ca. 1 til 2 min.
  3. Fortsæt proceduren, indtil musen er afslappet nok til at sidde i håndfladen uden at forsøge at flygte.
  4. Inden udgangen af dag 3 skal du gentage huslystesten og næsestikketesten som en test af tilvænning.
    1. Hvis begge test kan udføres på deres første forsøg, er tilvænningsprocessen afsluttet. Fortsæt forsigtigt med at håndtere musen i 30 s til et minut.
    2. Hvis musen i første omgang er modstandsdygtig over for begge test, gentages trin 4.1-4.3 i 20-30 s, før næsestikken og beskyttelsesprøven tages op igen.
    3. Hvis musen forbliver resistent over for disse test efter 3 minutter, kan den tredje dag gentages.
  5. Milepæle: Udfør mindst 2 vellykkede sheltertests på 10 s hver og 2 vellykkede næsestikketest til afslutning af dag 3 og afslutning af hele 3D-håndteringsproceduren.
  6. Sæt musen tilbage i buret, rengør bordpladen og handskerne.

5. Valgfri fremgangsmåde for dyr, der skal underkastes fastholdelsesanordning med henblik på injektion eller sonde

BEMÆRK: På dag 3 kan musene udsættes for nakkeklemseprøven, hvis dyret fastholdes til forsøgsformål (oral sonde, intra-peritoneal injektion osv.).

  1. Tag fat i nakken mellem tommel- og pegefingeren (Figur 1G).
  2. Løft musen 3-5 cm over hånden i 2-3 s.
    BEMÆRK: Dette er normalt en ikke-naturlig position for voksne mus, og hvis musene forbliver nær immobile, er de godt vant til håndtering og vil være lette at fastholde til eksperimentelle formål.
  3. Placer musen på igen i den flade hånd, eller hvis musen er reaktiv over for nakkeklem, kan du overveje at placere den på eksperimentatorens ærme, burlåg eller bordplade
    BEMÆRK: Hvis du arbejder i et biosikkerhedsskab, må du ikke placere musen på ærmet, eller den kan gå op og forlade biosikkerhedsskabet. Foretrækker at placere musen på bordpladen inde i biosikkerhedsskabet.
  4. Lad musen frit udforske eksperimentatorens hånd i 1 min.

6. Valgfri fremgangsmåde for yderligere dage med håndtering

  1. I tilfælde af en meget stresset muselinje tilsættes yderligere dage for at reducere dyrenes reaktivitet og stressniveau ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i dag 2/3.
    BEMÆRK: Mange faktorer kan påvirke dyrenes baseline stress, herunder stamme, tilstedeværelse af transgen modifikation, alder, køn og boligforhold. Hvis disse faktorer ikke er konsistente mellem grupper som f.eks.

7. Håndtering af tunneller

BEMÆRK: Denne teknik gælder kun for de tunnelreperede mus. Tunneler er polycarbonatrør ca. 13 cm i længden og 5 cm i diameter.

  1. Placer tunnelen i musens bur.
  2. Lad tunnelen stå i buret i 7 dage før håndtering.
  3. Åbn buret og læg låget på siden.
  4. Guide forsigtigt musen ind i polycarbonattunnelen (allerede i buret).
  5. Løft tunnelen fra buret, vandret. Dæk om nødvendigt tunnelens ender løst for at forhindre dyret i at hoppe/falde ud af tunnelen, hvilket potentielt kan falde tilbage i buret eller på gulvet.
  6. Flyt dyret i tunnelen væk fra hjemmeburet og hold det væk fra alle overflader i 30 s.
  7. Placer tunnelen tilbage i hjemmeburet, så musen kan forlade røret.
  8. Vent i 60 s, og gentag derefter trin 7.4-7.7 én gang.
  9. Skyl handsker grundigt med 70% ethanol eller skift handsker, før du vænner den næste mus.
  10. Gentag denne procedure i 10 på hinanden følgende dage.

8. Håndtering af haler

BEMÆRK: Denne teknik gælder kun for mus, der håndteres af halen. Det bruges til at overføre mus fra deres bur til et apparat og omvendt.

  1. Åbn buret og læg låget på siden.
  2. Tag fat i musene ved bunden af halen mellem tommelfinger og pegefinger.
  3. Løft musen fra buret.
  4. I 2-3 s overføres musen til eksperimentatorens modsatte underarm, samtidig med at du holder godt fast i halen for at undgå, at musen dingler.
  5. Når halehåndtering er påkrævet ved gennemførelsen af dette forsøg (f.eks. inden blodudtrækning til kortisoltest) overføres dyrene til forsøgsviserens underarm ved halehåndtering og holdes i 15 s, før de returneres til deres bur.

9. Forhøjet Plus Labyrint

  1. Opsætning af rum
    1. Placer labyrinten midt i rummet under et digitalt kamera udstyret med et hukommelseskort.
    2. Opsæt lyset i rummet på ~ 60 Lux ved hjælp af 2 stående lamper placeret bag labyrinten.
    3. Sluk for enhver overheadbelysning for at undgå direkte lys på labyrinten, der skaber refleksion og forstyrrer detektionen af dyrene i labyrinten.
    4. Når alt udstyr er sat op, skal du overføre dyrene til rummet og lade dem akklimatisere sig til lysindstillingerne og det nye miljø i 30 minutter.
  2. Prøvning
    1. Rengør labyrinten med 70% ethanol for at forhindre lugt fra støv eller fra dyret, der blev testet tidligere.
    2. Start kameraet.
    3. Brug et stykke papir med dyre-id'et til at optage id'et på videoen, før du placerer dyret i labyrinten (dette vil lette den korrekte identifikation af, hvilken mus der bliver filmet på hver video).
    4. Brug den relevante håndteringsteknik til hvert dyr for at overføre den til labyrinten.
    5. Placer musen på den centrale platform med en åben arm.
    6. Lad musen udforske apparatet i 10 minutter, uforstyrret.
    7. Efter 10 minutter skal du stoppe kameraet.
    8. Hent musen fra labyrinten og læg den tilbage i buret.
    9. Rens afføring og urin fra labyrinten med 70% ethanol.
    10. Når testen er afsluttet med alle mus, skal du overføre videoer fra hukommelseskortet til en computer til videosporing.
    11. Brug automatiseret dyresporingssoftware til at spore antallet af indgange til de åbne og lukkede arme og den tid, der bruges i åbne eller lukkede arme (her Ethovision XT 14).

10. Experimenter Interaction (afledt af Hurst og West9)

  1. Opsætning af rum
    1. Placer et bord midt i testrummet under et digitalt kamera udstyret med et hukommelseskort.
    2. Opsæt lyset på 50-70 Lux med 4 pærer placeret i hjørnet af rummet vender op til loftet. Sluk for ovenlys for at undgå direkte lys på labyrinten, der skaber refleksion og forstyrrer detektionen af dyrene i arenaen.
    3. Bring dyrene til værelset.
    4. Lad dem akklimatisere sig til rummet i 30 minutter.
  2. Eksperiment
    1. Placer hjemmeburet under det digitale kamera.
    2. Tag låget af.
    3. Fjern redemateriale og anden berigelse, der kan forstyrre sporing af dyr.
    4. Start kameraet.
    5. Brug burkortet med dyre-id'et til at identificere dyret på videoen.
    6. Placer en hånd i hjemmeburet langs burets væg i den forreste højre side.
      1. Sørg for, at handlerens hoved ikke blokerer kameraet for at filme musen.
    7. Start en timer.
    8. Hold hånden ubevægelig i 2 minutter, og lad musen udforske hånden.
    9. Fjern hånden fra buret i 15 s.
    10. Forsøg at samle musen op med cupped hænder og registrere, om musen flygter.
    11. Gentag det sidste trin op til fem gange, hvert 5. sekund, eller indtil musen tillader sig at blive afhentet.
    12. Registrer det antal forsøg, der kræves for at hente musen.
    13. Returner redemateriale og berigelse til buret.
    14. Rengør handsker med 70% ethanol eller skift handsker, før du går videre til det næste dyr.
    15. Efter test skal du overføre videoer fra hukommelseskortet til en computer.
    16. Brug automatiseret video tracking software, opdele buret i fire lige kvadranter og registrere den tid, musen i hver kvadrant (her, Ethovision XT 14).

11. Nyhed undertrykt fodring

  1. Madmangel
    1. 3 dage før testen skal der foretages en fuld burskift, og dyrene skal anbringes enkelt (enkelthus er at foretrække frem for at udføre testen af buret i hjemmet).
      BEMÆRK: Hvis der leveres frisk strøelse, fjernes potentielt støv eller små stykker mad, der akkumuleres i strøelse siden sidste burskift.
    2. Dagen før test, vejer alle dyr omkring 6 pm.
    3. Fjern al mad fra madbeholderen, og sørg for, at der ikke er madstykker i buret eller i strøelse.
  2. Opsætning af rum
    1. Placer NSF kammeret på et bord.
    2. Fyld kammeret med et tyndt lag majsstrøelse (eller andet sengetøj, der er forskelligt fra sengetøj, der bruges i dyrs hjemmebur).
    3. Opsæt lyset ved 70 Lux med 4 pærer placeret i hjørnet af bordet, hvor kammeret står, vender op til loftet. Sluk for ovenlys for at opretholde lav rumbelysning.
    4. Placer en pellet af standard chow, der anvendes i anlægget, på siden af kammeret står over for eksperimentatoren (≈ 10 cm fra væggen).
  3. Prøvning
    1. Om morgenen efter madmangel skal du bringe dyrene til rummet 30 minutter før test for at lade dem akklimatisere sig til lysindstillingerne og det nye miljø.
    2. Afveje alle dyr for at måle deres vægttab baseret på den vægt, der blev målt den foregående dag. Dyr skal tabe 8-12% natten over for at kunne udføre opgaven korrekt.
    3. Sorter dyrene pr vægttab, og screene dem startende fra musen, der mistede mest til musen, der mistede mindst vægt.
    4. Sørg for, at kammeret er fyldt med sengetøj og med en enkelt pellet.
    5. Placer dyret på den modsatte side af kammeret, væk fra fødevarepillen.
    6. Start timeren med det samme.
    7. Lad musen udforske kammeret i op til 12 minutter.
    8. Mål latenstid til tilgang og foder (dyr skal bide og spise) på fødevarepillen.
      1. Anser det for at være en tilgang, når dyret kommer tæt på pellet, lugter det og bider ikke.
      2. Definer en bid, som når dyret begynder at forbruge pellet.
    9. Registrer latenstid til at nærme sig og foder på pellet på få sekunder.
    10. Når musen har fodret på fødevarepillen, skal du fjerne musen fra kammeret.
    11. Kassér strøelse, men gemme pellet, der vil blive brugt til at teste appetit drev i musen hjem bur.
    12. Nulstil kammeret til det næste dyr og fortsæt med det næste dyr.
    13. 15 minutter efter testens afslutning i kammeret skal den pellet, der blev anvendt under testen, inde i musens hjemmebur, tabes mod væggen foran buret.
    14. Mål latenstid til foder på pellet, når pellet er i hjemmet buret. Dette er en foranstaltning for appetit drev.
      1. Det er at foretrække at fjerne nestematerialet for at sikre, at musen ser pelleten blive droppet i sit bur.

12. Serumsamling og Kortikosteronmåling

  1. Håndter dyr i 1 min ved hjælp af den tildelte teknik, 15 minutter før blodopsamling (dette kan gøres med gruppeopstaldede eller enkelthusdyr, idet man tager risikoen for kampe i betragtning ved omgruppering af mus).
    1. For tunnelen håndteres mus, guide dem til tunnelen, løfte tunnelen fra buret i 1 min, og erstatte musen i sit bur.
    2. For hale håndteres mus, tag musens halebase og fjern musen fra buret. Overfør musen til forsøgsbøsningsærmen i 1 minut, og vend musen tilbage til buret ved halehåndtering.
    3. Til 3D-håndterede mus skal du bruge cupped hænder til at fjerne musen fra sit bur. Hold musen i cupped hænder i 1 min, og returnere den til sit bur.
  2. 15 minutter efter håndtering, fortsæt med blodopsamling fra den submandibulære vene22.
  3. Fastgør musen, så musens hoved er sikkert immobiliseret.
  4. Find punkteringsstedet.
    1. Der er en lille hårløs smilehul langs underkæbe i ansigtet, der kan bruges som et vartegn for at finde punktering site. Tegning af en linje mellem kæbens bund og denne smilehul ligger punkteringsstedet bag denne smilehul mod øret med ca. 5 mm lige bag kæbens hængsel.
  5. Hold en ren 23 G nål vinkelret på punkteringsstedet, og brug en hurtig fast lancingbevægelse. Spidsen af nålen skal trænge ind i en dybde mellem 1-2 mm, blodet vil flyde straks, så snart venen er punkteret.
  6. Opsaml ~ 150 μL blod i EDTA belagte opsamlingsrør og opbevares på is.
  7. Påfør let tryk med en steril gazepude på punkteringsstedet i 5 s eller mere for at lade blodet størkne.
  8. Når blodet er størknet, returnere musen til sit hjem bur.
  9. Centrifugeblod ved 4 °C 3.500 x g i 10 min.
  10. Dekanter supernatanten.
  11. Supernatanten opbevares ved -20 °C til downstream-analyser.
  12. Mål kortikosteronniveauer ved hjælp af et kortikosteron-ELISA-sæt efter producentens protokol.
  13. Brug et spektrofotometer til at læse ELISA-resultaterne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

To separate undersøgelser blev udført med C57BL/6 mus. Undersøgelse #1 omfattede 6-måneder gamle mænd og Undersøgelse #2 omfattede 2,5 måneder gamle kvinder (N = 36/study) fra Jackson Laboratories (Cat #000664). Mus ankom til anlægget i en alder af 2 måneder. Mens undersøgelse #2 hunner blev håndteret og testet to uger efter ankomsten, blev Undersøgelse #1 mænd kun håndteret og testet i en alder af 6 måneder (forsinkelse på grund af global pandemilukning). I løbet af denne tid døde en mus fra Study #2, før den begyndte at håndtere eksperimenter. Undersøgelsen #1 mandlige mus blev passet af dyrefacilitetspersonale. Alle mus blev opretholdt på en 12 timers lys / mørk cyklus (7:00 ON, 19:00 OFF), givet adgang til mad og vand ad libitum. Deres hjemmebur var fyldt med genbrugsavis som strøelsesmateriale samt redemateriale. Mus blev opstaldet individuelt for at begrænse potentiel agonistisk adfærd hos gruppehus mænd under håndtering af session eller efter procedurer som blodopsamling eller adfærdstest. Mus blev randomiseret i tre grupper: halehåndtering, tunnelhåndtering og 3D-håndteringog håndteret i det åbne rum i henhold til udformningen af deres respektive gruppe (Figur 2). Tunnel-håndterede gruppe modtog tunnelen som en berigelse i 1 uge før håndtering session. De blev derefter håndteret i ti (10) på hinanden følgende dage, før adfærdsmæssige test. En uge efter afslutningen af de forskellige håndteringssessioner begyndte adfærdstest. På dag 16 blev mus testet i EPM og derefter i eksperimentatorinteraktionstesten. To dage senere blev mus testet i NSF. Endelig blev der på dag 24 trukket blod 15 minutter efter et minuts håndtering af samme type som den første håndtering.

Til adfærdstest blev tunnel-håndterede dyr overført fra deres bur til apparatet ved hjælp af tunnelen så meget som muligt. Men for Elevated-Plus Maze eksperiment, gjorde dimensionerne af labyrinten det vanskeligt at fjerne eller placere dyr i labyrinten ved hjælp af tunnelen. I dette tilfælde blev dyr overført fra tunneler til cupped hænder og transporteret til labyrinten. 3D-håndterede mus blev håndteret i løbet af de tre dage, samtidig med at dage 8-10 i tunnelhåndtering (Figur 2). Hale håndterede mus var ikke vant til håndtering, men blev hale håndteret under interaktioner med eksperimentatorer. I løbet af undersøgelsens tid blev der foretaget burskift af forsøgspersonen for at sikre brugen af den passende håndteringsteknik, der blev anvendt for hver gruppe.

I forsøgsinteraktionstesten blev dyrene testet for deres vilje til frivilligt at interagere med forsøgspersonen og for at lette håndteringen i forsøgssammenhæng (figur 3). ANOVA, der blev udført på antallet af forsøg på at hente musen fra buret, viste en signifikant effekt af håndteringsmetoden i undersøgelse #1 hanner (F(2,31)=6,36, p=0,004) og i undersøgelse #2 hunner (F(2,33)=12,21, p=0,0001). Scheffes post hoc-analyser viste, at antallet af forsøg på at afhente musene blev reduceret betydeligt med både 3D (p= 0,0061 i Undersøgelse #1 mænd, og p=0,0002 i undersøgelse #2 hunner) og tunnelhåndtering (p=0,04 i undersøgelse #1 mænd og p=0,003 i undersøgelse #2 hunner) sammenlignet med den hale, der håndteres gruppe (Figur 3A). ANOVA udført på den tid, der blev brugt i samme kvadrant som hånden, viste signifikant effekt af håndtering i undersøgelse #1 mænd (F(2,31)= 5,38, p = 0,009) og i undersøgelse #2 hunner (F(2,33)= 3,5, p = 0,04; Figur 3B). Scheffes post hoc-analyser viste, at Undersøgelse #1 mandlige mus håndteret med 3D-håndteringsteknikken brugte betydeligt mere tid i samme kvadrant end eksperimentatorens hånd sammenlignet med hale-håndterede mus (p = 0,012). Der var ingen signifikante forskelle mellem håndteringsgrupper i studie- #2, 2,5 måneder gamle kvinder. Graden af interaktion med eksperimentatoren demonstreres yderligere af de kombinerede varmekort over musenes midtpunkter (Figur 3C-E). Disse illustrerer, hvordan de 3D-håndterede hanmus fra Study #1 brugt mere tid på at proksimale til hånden, herunder områder nær hånden, mens hale håndterede mus havde den mindst samlede interaktion med hånden.

Virkningerne af 3D- og tunnelhåndteringen blev sammenlignet med halehåndtering i to tests af angstlignende adfærd, den nyhed undertrykte fodring (NSF) test og den forhøjede plus labyrint (EPM). I NSF-testen viste ANOVA udført på latenstid til tilgang en effekt af håndteringsteknik, der blev anvendt i undersøgelse #1 mænd (F(2,31)= 3,5, p = 0,04). Scheffes post hoc-analyser i Undersøgelse #1 mænd viste tendenser fra 3D-håndterede mus (p=0,08) og fra de tunnelrepræsenterede mus (p=0,08) med nedsat latenstid til indflyvning sammenlignet med mus håndteret med halen (Figur 4A). Der blev ikke observeret nogen virkninger i undersøgelses- #2. ANOVA udført på latenstid til at nærme sig i musens hjem bur (data ikke vist) viste ingen effekt af håndtering (p = 0,88 i Undersøgelse #1 mænd, og p = 0,16 i Undersøgelse #2 hunner). ANOVA udført på den procentvise tid i de åbne arme i EPM afslørede en betydelig effekt af håndtering i Undersøgelse #2 kvinder (F(2,33)= 3,5, p = 0,04). Der blev ikke observeret nogen virkninger hos forsøgspersoner #1 hanner(F (2,31)=2,1, p=0,1; Figur 4B). Scheffes post hoc-analyser afslørede kun en tendens til øget tid brugt i de åbne arme i tunnel håndterede mus fra Study #2 sammenlignet med hale håndterede mus (p = 0,07). Med hensyn til procentindgangene i de åbne arme (Figur 4C) viste ANOVA ingen effekt af håndtering, hverken i undersøgelse #1 mænd eller i undersøgelse #2 kvinder (F(2,31)= 1,12, p = 0,33; og F(2,33)= henholdsvis 1,3, p = 0,26). Adfærdsmæssige scores blev opsummeret i en z-score, som i Guilloux et al.23, informere om potentiel reduktion af angst-lignende adfærd i forhold til hale håndteres mus (Figur 4D). ANOVA på z-score viste en signifikant effekt af håndtering i Undersøgelse #1 mænd (F(2,31)= 5,6, p = 0,008), men ikke i Undersøgelse #2 kvinder (F(2,33)= 1,07, p = 0,35). Scheffes post hoc-analyser viste, at 3D-håndtering og tunnelhåndtering reducerede z-score betydeligt (henholdsvis p=0,04 og 0,01) sammenlignet med halehåndtering, hvilket tyder på, at begge tilgange reducerer angstlignende adfærd hos Undersøgelse #1 mænd.

Kortikosteronniveauet efter håndteringen blev også vurderet 15 minutter efter en kort håndteringssession (figur 5). ANOVA fandt en signifikant effekt af håndtering i undersøgelse #2 hunner (F(2,33)= 4,44, p = 0,01), men ikke i undersøgelse #1 mænd (F(1,31)= 0,53, p = 0,59). I undersøgelse #2 kvinder viste post hoc-analyser et betydeligt fald i kortikosteronniveauer hos mus fra 3D-håndteringsgruppen sammenlignet med halehåndteringsgruppen (p=0,02).

For at afgøre, om håndteringsteknikkerne havde en betydelig indvirkning på variationen af de opnåede data, anvendte vi Bartletts test af homogenitet af varians. Vores resultater fandt ingen signifikant forskel i variabilitet i undersøgelsen #2 hunmus på tværs af målinger (% tid EPM B(2,33)= 4,95, p = 0,087; % Poster EPM B(2, 33)= 3,68, p = 0,16; NSF B(2, 33)=0,20, p=0,91; CORT B(2, 33)=1,69, p=0,42). I undersøgelse #1 hanmus var der imidlertid en signifikant heterogen varians i NSF-testen (B(2,31)=8,08, p=0,0175) og i målte CORT-niveauer (B(2,32)= 11,63, p=0,0029), men ikke i nogen af foranstaltningerne for EPM (% tid EPM B(2,32)=1,16, p=0,56; % Poster EPM B(2,32)=2,79, p=0,25). Brug af F-testen til at sammenligne to varianser viste, at variansen for NSF-testen blev reduceret betydeligt for undersøgelse #1 hanner ved både 3D (F(1,21)= 4,22, p =0,04) og tunnelhåndteringsteknikker (F(1,22)= 4,01;p =0,03) i forhold til halehåndtering. For koncentrationen af CORT efter håndtering reducerede kun 3D-håndteringen signifikant variabiliteten (F(1,20)= 9,65, p =0,0019) sammenlignet med halehåndtering.

Figure 1
Figur 1. Repræsentative billeder af 3D-håndteringsproceduren.  Billederne illustrerer 3D-håndteringsproceduren. A) Hånd i bur: Eksperimentatorens hånd er placeret i buret og holdes stille, så musen kan vænne sig til tilstedeværelsen af hånden i buret. B) Flad hånd: Ved første fjernelse fra buret placeres musen på håndens flade håndflade. Musen kan frit gå rundt i håndfladen og bevæge sig mellem tilstødende flade hænder. C) Roll: Slap håndfladen til at danne en løs "kop" omkring musen. Forsigtigt vippe koppen i den modsatte hånd musen skal frit flytte til denne hånd, hvis ikke forsigtigt guide den ind i den anden hånd. D) Shelter: Placer musen på kanten af hånden derefter bringe begge hænder sammen og meget langsomt form kop omkring musen. Musen må ikke fastholdes, og der skal efterlades en åbning, så musen kan slippe ud. Hold for ~ 5-10 s og derefter åbne for flade hænder. E) Hoved/ryg-petting: Mens musen udforsker håndens flade håndflade, skal du forsigtigt klappe musen på hovedet og ryggen. Dette vænner musen til eksperimentatorens tilgang ovenfra. F) Næsesnål: Når musen ser ud til at være vant til håndtering, skal du forsøge forsigtigt at røre musen direkte på snuden. Hvis musen ikke bevæger hovedet væk, er den godt vant til håndtering. G) Det er muligt at udføre en kort (2-3 s) halsklem på den sidste dag for at måle dyrenes tilvænning i tilfælde af fremtidige indgreb, der kræver påstand. Når de er vant til håndtering, forbliver mus immobile under nakkeklem, mens ikke-beboede mus vil forsøge at flygte ved at dreje deres hale for at blive befriet fra påstanden. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Eksperimentelt design.  Efter ankomsten til anlægget modtog hale håndterede mus ingen tilvænning. Tunnel-håndterede mus blev vænnet til tunnelerne i deres hjem bur i en uge før starten af håndteringen. Tunnel håndterede mus blev håndteret med tunnelhåndteringsteknikken i 10 dage (Første håndteringsdag = Dag 1), mens 3D-håndterede mus blev beboet i tre dage (dag 8-10). Mus blev derefter udsat for den forhøjede plus labyrint (EPM) (Dag 16), eksperimentatorinteraktionstest (dag 19), nyhed undertrykt fodring (dag 21) og en kort håndteringssession efterfulgt af serumsamling til CORT-måling (dag 24). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Virkningen af de tre håndteringsteknikker på nem håndtering og vilje til at interagere med eksperimentator. A) Gennemsnitligt antal afhentningsforsøg, der kræves for at fjerne en mus fra buret. Undersøgelse #1 Han (venstre panel, Halehåndtering N= 12, TunnelHåndtering N=12 og 3D håndtering N=11) og Undersøgelse #2 kvindelige (højre panel, N = 12 pr. gruppe) mus fra både tunnel- og 3D-håndterede grupper viste en betydelig reduktion i antallet af forsøg, der kræves for at fjerne dem fra buret sammenlignet med hale håndterede mus. B) Gennemsnitlig tid, som et dyr tilbringer i samme kvadrant i buret som forsøgsviserens hånd. Undersøgelse #1 mandlige mus håndteres med 3D-teknikken viste en betydelig stigning i tid tilbragt i samme kvadrant som experimenter hånd. C-E) Gennemsnitlige varmekort over musecenterpunkt for tid gengivet i Ethovision XT 14 demonstrerede visuelt den øgede udforskning og interaktion med eksperimentatoren af undersøgelsen #1 3D-håndterede mandlige mus. Fejllinjer angiver SEM. *p<0.05, **p<0.01 sammenlignet med gruppen Hale håndteret. Klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 4
Figur 4. Virkningen af de tre håndteringsteknikker på angstlignende adfærd. A) Latenstid for at nærme sig og fodre på pellet i nyhed undertrykt fodring kammer i Undersøgelse #1 mandlige mus (Tail Handling N = 12, Tunnel Handling N = 12 og 3D håndtering N = 11) og i Undersøgelse #2 kvindelige mus (N = 12/group). Data fra undersøgelsen #1 hanmus i 3D-håndterings- og tunnelhåndteringsgrupperne viste en tendens til betydelig reduktion af latenstid for at nærme sig pellet. B) Midler til % af den tid, der tilbringes i de åbne arme af den forhøjede plus labyrint. Der var ingen signifikante forskelle mellem grupper i studie- #1 mænd, og en tendens til mere tid i åbne arme ved Study #2 hunner i tunnelhåndteringsgruppen. C) Indgange i de åbne arme: Der var ingen signifikante forskelle mellem grupper i studie- #1 mænd eller i studie #2 hunner. D) Z-score opsummerer angst-lignende adfærd. Ved hjælp af de data, der præsenteres i A, B og C, blev en z-score beregnet ved hjælp af tail-handled mus som reference. Fald i z-score tyder på et fald i angst-lignende adfærd målt ved NSF og EPM test. Undersøgelse #1 mandlige mus håndteres ved hjælp af 3D- eller tunnel teknik viste en reduceret angst-lignende fænotype i forhold til Tail-håndteres mus. Fejllinjer angiver SEM. *p<0.05 sammenligning med side-håndteret gruppe. t viser trending niveau af betydning (p<0,1) i forhold til hale håndteres gruppe. Klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 5
Figur 5. Niveauer af kortikosteron efter håndtering.  Serum blev indsamlet 15 minutter efter en kort håndteringssession, og derefter blev CORT-niveauer målt ved ELISA i både undersøgelse #1 han (Halehåndtering N = 12, Tunnelhåndtering N = 12 og 3D-håndtering N = 11) og i Undersøgelse #2 hunmus (N = 12/gruppe). Undersøgelse #2 kvindelige mus håndteres via 3D-håndtering teknik viste reduceret kortikosteron niveauer i forhold til mus håndteres af halen. ANOVA i undersøgelse #1 hanmus nåede ikke betydning for forskelle mellem grupper (p=0,5). Fejllinjer angiver SEM. *p<0,05 sammenlignet med gruppen Hale håndteret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Table 1
Tabel 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne undersøgelse og metodeudvikling er baseret på den observation, at håndteringsteknikker hos mus stadig overses af det videnskabelige samfund, og at nogle laboratorier stadig er tilbageholdende med at implementere tilvænnings- eller håndteringsteknikker for at reducere stress og reaktivitet hos deres dyr forud for forsøg. Samtidig med at dyrehåndteringen repræsenterer en tidsforpligtelse, giver den gavnlige virkning for dyrene, som kan bidrage til, at de forsøg, der skal udføres, bliver en succes, og forhindrer forsøg i at skulle udføres flere gange på grund af datavariation eller overreaktivitet hos dyr. Brugen af 3D-håndteringsteknikken reducerede flugtforsøg hos mus. Det øgede også interaktionen med eksperimentatoren og faldt angstlignende fænotyper i vores 6 måneder gamle mandlige mus. Desuden reducerede 3D-håndtering datavariationen og reducerede kortikosteronniveauet hos 2,5 måneder gamle hunmus efter kun 3 indledende dage med håndtering. Denne tilgang er afhængig af blide manipulationer for at vænne musen til håndtering af eksperimentatoren, hvilket letter glattere transport og lettere intervention.

Noget værd at understrege fra 3D-håndteringsteknikken er, at progressionen af håndteringsmetoder sker som reaktion på musens reaktivitet, afhængigt af opnåelsen af de milepæle, der er beskrevet ovenfor og i tabel 1. Dyr bør have reduceret reaktivitet til et håndteringstrin, før de går videre til næste trin. Forsøg på at gå for hurtigt frem til "husly" eller "næse-poke" trin på dyr, der ikke er tilstrækkeligt vant vil sandsynligvis resultere i øget stress og potentielt reducere effektiviteten af proceduren. På samme måde bør dyrets reaktivitet på hver håndteringsdag overvåges og overvejes, når det besluttes, om der kræves yderligere håndteringsdage. Hvis dyrene ikke reagerer godt på beskyttelsesprøven den første dag og ikke opfylder kriterierne for at nå den første milepæl, kan den første håndteringsdag gentages, indtil milepælen er afsluttet. Hvis dyrene ikke reagerer på næsestikkeprøven den anden dag, kan den anden dag også gentages. En anden advarsel at bemærke med denne tilgang er, at risikoen for mus hoppe væk er større på den første dag i håndteringen, især i nervøse stammer som C57BL6. Efter de retningslinjer, der er beskrevet ovenfor, bør reducere risikoen for at hoppe, og give måder at begrænse en sådan adfærd. Varigheden af håndteringen og progressionen gennem trinene kan variere afhængigt af stammerne, især hvis man arbejder med transgene modeller, der vides at udvise ængstelige fænotyper.

Flere faktorer kan bidrage til at reducere effektiviteten af den præsenterede 3D-håndteringsteknik. En sådan faktor er den potentielle frygt eller tøven fra eksperimentatoren, i tilfælde af at eksperimentatoren ikke er bekendt med musehåndtering eller er bange for mus. Derfor er effekten på håndtereren også noget at overveje. Den gradvise stigning i interaktionsniveauet med musene gør det dog muligt for nybegyndere at udvikle tillid og større færdigheder i at udføre håndteringsteknikken, når de fortsætter gennem håndteringstrinnene. De foreslåede trin/milepæle (shelter- og næsestikketestene) kan hjælpe med at modvirke potentiel menneskelig variation hos nybegyndere og sikre, at dyrene når samme grad af tilvænning. Det er blevet rapporteret, at fremme af positive samspillet mellem mennesker og dyr med dyr havde resulteret i større livskvalitet og medfølelsestilfredshed hos dyreplejepersonale24. Som sådan giver gentling fra håndtering fordele for både håndtereren og dyret under enhver generel interaktion eller intervention.

Med sin indvirkning på at reducere antallet af forsøg på at afhente musen, hos både 6 måneder gamle mænd og 2,5 måneder gamle kvinder, giver 3D-håndtering et alternativ til tunnelhåndtering eller andre teknikker, hvilket letter lettere overførsel af dyr fra deres bur til forsøgsapparat. 3D-håndteringsteknikken øgede også samspillet mellem 6 måneder gamle hanmus og eksperimentatoren. Dette blev ikke observeret hos 2,5 måneder gamle kvindelige mus, men kvindelige mus forblev lettere at afhente sammenlignet med hale-håndterede mus. Dette tyder på, at 3D-håndteringsteknikken kan være mere egnet til forsøg, der kræver direkte interaktioner mellem dyret og eksperimentatoren, såsom Morris vandlabyrinten (på trods af potentielle køns - / alders forvirrende faktorer, der diskuteres senere). Andre har udviklet og brugt manuelle håndteringsteknikker, der består i at samle dyrene op med cupped hænder uden yderligere manipulation10. Mens disse teknikker viste gavnlige virkninger, data i litteraturen ofte præsentere håndtering protokoller med tilvænning perioder over 10 dage9,16. Derudover er cupped-handling uden den raffinerede interaktion, der leveres af 3D-håndtering, muligvis ikke egnet til nervøse stammer, der fortsætter med at springe ud og væk fra hænderne. Selvom vi ikke foretog en direkte sammenligning i denne undersøgelse med kopmetoden, adresserer 3D-håndtering dette og er afhængig af raffinerede bevægelser for at fremme interaktionen mellem musen og håndtereren. Undersøgelsen af Ghosal et al.16 brugte en kophåndteringsteknik kombineret med massage i 5 dage og viste, at denne teknik begrænser stressens indvirkning på metaboliske slutpunkter og fremhæver behovet for raffinerede bevægelser og interaktion under håndtering for bedre effektivitet. Baseret på denne kop-massage teknik, 3D-håndtering bruger yderligere interaktion til habituate mus. Ved hjælp af 3D-håndteringsmetoden sikrer håndtererne, at alle mus når et lignende niveau af tilvænning ved at udføre standardiserede bevægelser og ved at tilpasse varigheden af proceduren til hvert dyr afhængigt af dets behov (i denne undersøgelse passerede alle mus milepælene og afsluttede 3D-håndteringsprotokollen om 3 dage). Denne tilgang kan betragtes som "personlig" til hver mus, så alle dyr når det ønskede niveau af tilvænning på hver håndteringsdag. Som tidligere nævnt, hvis dyrene ikke når de milepæle, der er beskrevet i protokollen, kan denne teknik justeres ved at øge antallet af dage. Denne teknik viste gavnlige virkninger for at reducere variabiliteten mellem dyr i adfærdsundersøgelser og fysiologiske målinger (CORT-niveauer), hvilket tyder på, at denne tilgang kan bidrage til reduktion af variabilitet inden for undersøgelsen og reducere virkningen af eksperimentelle fejl, der potentielt kan drive partiske resultater i prækliniske undersøgelser.

Understøttende resultater antydede, at mus, der udsættes for 3D- og tunnelhåndtering, udviser reduceret angst i den nyheds undertrykte fodringstest sammenlignet med hale-håndterede mus. I betragtning af kombinerede data fra NSF og EPM viste begge tilgange betydelige virkninger ved at reducere angst hos 6 måneder gamle mandlige mus. Dette gentager de fund, som dyr, der vænnes til tunnelhåndtering, havde forbedret ydeevnen i test for angst9,15 efter 10+ dages håndtering og yderligere demonstrerer potentialet i 3D-håndteringen til at udvise lignende virkninger. Dette viste også, at 3D-håndterede 6 måneder gamle mandlige mus nærmer sig og frivilligt interagerer mere med deres eksperimentator end 6 måneder gamle mandlige mus, der udsættes for tunnel- og halehåndtering. Det er vigtigt, at 2,5 måneder gamle hunmus, der blev udsat for 3D-håndtering, havde reduceret niveauet af CORT, hvilket er i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte resultater9. De to undersøgelser (Undersøgelse #1 i 6 måneder gamle mænd og Undersøgelse #2 i 2,5 måneder gamle kvinder) bekræftede, på to forskellige måder, at håndteringen har gavnlig indvirkning på angst-lignende fænotyper (enten på adfærdsmæssige resultater i Undersøgelse #1, eller på CORT niveauer i Undersøgelse #2).

En mulig medvirkende faktor til effekten er eksperimentatorens køn, i dette tilfælde mand. Det har af Sorge et al.25 vist sig, at tilstedeværelsen af mandlige forsøgspersoner kan føre til en stigning i CORT og angst som adfærd hos mandlige, men ikke kvindelige mus. Dette står i modsætning til resultaterne af denne undersøgelse. Den væsentligste forskel mellem denne undersøgelse og undersøgelsen fra Sorge et al.25 er, at den her beskrevne fremgangsmåde består i at vænne musene til håndtering ved at fremme positiv (ikke-forstærket) interaktion med eksperimentatoren, mens Sorge et al.25 brugte naive gnavere, der aldrig interagerede med mennesker. Man kan forvente, at naive mus kunne have en stærk reaktion mod menneskelige eksperimentatorer, hvis de ikke lærer, at eksperimentatoren ikke udgør en trussel. Denne undersøgelse blev imidlertid kun udført med en mandlig forsøgsperson, og fremtidige undersøgelser bør undersøge, om sådanne virkninger kan reproduceres med en kvindelig forsøgsperson. Selvom isolering af disse faktorer ligger uden for dette papirs anvendelsesområde, er det værd at fremhæve vigtigheden af at identificere sådanne kilder til variabilitet, når man implementerer håndteringsvanisering eller i eksperimentelt design mere generelt.

Denne undersøgelse bekræftede også effekten af tunnelhåndteringsteknikken til reduktion af angstlignende adfærd og CORT-niveauer hos mus9,10,11. En yderligere fordel ved denne tilgang er , at tunnelen kan efterlades i buret som berigelse26, hvilket også kan bidrage til en reduceret stress/ angstrespons , der helt bidrager til forbedret velfærd10,11. I dette tilfælde er eksperimentatorens rolle kun at manipulere tunnelen med hvert dyr i et minut. Som beskrevet af Gouveia etal. 19behøver tunnelen imidlertid ikke nødvendigvis at forblive i hjemmeburet og kan i stedet kun præsenteres for dyrene, når det kræves for at overføre dyret uden at forårsage yderligere stress. Begge tilgange, tunnelen og 3D-håndteringsteknikker, giver fordele, der bør vurderes af laboratoriet og forsøgsfolkene for at afgøre, hvilken tilgang der er den mest hensigtsmæssige til deres behov. I denne undersøgelse blev tunnelen efterladt i buret, og de virkninger, vi observerede på angstlignende adfærd, kan skyldes en kombination af tunnelhåndtering og berigelse.

Mens begge giver gavnlige virkninger, er 3D- og tunnelhåndteringsteknikkerne ikke uden begrænsninger. En fælles begrænsning er, at det kan være tidskrævende og potentielt afskrækkende for dyrefaciliteter at gennemføre sådanne procedurer. De ekstra fordele er imidlertid uvurderlige, hvilket forbedrer dyrevelfærden ved at reducere stress og forbedre samspillet med forsøgs- og dyreplejeudbydere (som beskrevet i Spangenberg og Kelling27) og forskningsmæssige pålidelighed og reproducerbarhed. Beviser fra vores anlæg tyder på, at denne teknik forbedrer samspillet mellem dyr og opdræt personale, lette bur forandring og sundhedsovervågning. Fra andre brugere i vores facilitet rapporteres påstand og generel manipulation som værende betydeligt lettere med håndterede mus, i overensstemmelse med vores resultater om, at mus håndteret med 3D-teknikken er mindre tilbøjelige til at flygte, når de bliver hentet, og i vores eksempel er 6 måneder gamle mænd mere tilbøjelige til at interagere med deres eksperimentator. Opfølgende undersøgelser kunne kvantificere sådanne virkninger for yderligere at påvise teknikkens anvendelighed. I alt bidrager denne 3D-håndteringsmetode såvel som tunneltilgangen til reglen om 3R'erne, især ved at forfine rutinemæssige dyreinteraktioner for at minimere stresset som reaktion på håndtering. I betragtning af den observerede reduktion i dataenes variation har dette også potentiale til at reducere antallet af dyr, der er nødvendige for at opnå ensartede resultater og forfine den metode, der anvendes til at begrænse variabiliteten.

Et andet diskussionspunkt baseret på de fremlagte data er, at denne undersøgelse blev udført med dyr, der var enkelthus. Enkelthus blev foretrukket, da det begrænser den potentielle agonistiske adfærd (især hos mandlige mus), der kan bidrage til inter-individuel variation28,29. For konsistens mellem grupper var alle dyr enkelthus. Det er også interessant at bemærke, at positive forsøgs-dyr interaktioner hos rotter i form af rotte kildrende, var i stand til at afbøde nogle af virkningerne af social isolation i enkelthus rotter30,31. Det er muligt, at håndteringsteknikker, der involverer direkte kontakt mellem dyr og forsøgspersoner, såsom 3D-håndteringsteknikken eller kopmassageteknikken beskrevet af Ghosal et al.11, kan have en lignende virkning. Fremtidige undersøgelser kunne undersøge dette spørgsmål ved at sammenligne virkningerne af håndteringsteknikker i enkelt- og gruppehusdyr. Tidligere undersøgelser undersøgte virkningen af kop- og tunnelhåndteringsmetoder med mus i en gruppeopstaldet indstilling og opnåede lignende resultater7,8. Dette bekræfter, at det er muligt at bruge de håndteringsprotokoller, der er beskrevet heri, med dyr, der holdes i enkelthus- eller gruppehusforhold, idet man holder sig muligheden for agonistisk adfærd, når man tager et dyr ud af buret og placerer det tilbage i (især hos mandlige mus eller i aggressive muselinjer). I sådanne tilfælde anbefales det at bruge et midlertidigt bur, før du samler alle dyrene sammen.

Afslutningsvis vil jeg sige, at den foreslåede 3D-håndteringsmetode bidrager til at reducere reaktivitet og stress hos mus. Det øger også datapålideligheden ved at reducere variationen efter 3 dages håndtering. Lignende resultater kan observeres med tunnelhåndteringen, i vores tilfælde efter 10 dages tunnelhåndtering. I sammenligning med tunnelhåndteringsteknikken gav 3D-håndteringsteknikken fordelen ved at øge samspillet med en eksperimentator i vores 6 måneder gamle hanmus, hvilket i nogle tilfælde kan være kritisk. Hvis 3D- eller tunnelhåndteringsteknikken blev implementeret i alle dyrefaciliteter, ville det være en væsentlig forbedring for datagenereringen og i høj grad bidrage til at reducere brugen af dyr til forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Animal Care Committee of CAMH for at støtte dette arbejde, samt dyrepassere af CAMH, der gav omfattende feedback om nytten af proceduren, motivere gennemførelsen af de beskrevne eksperimenter og indsendelse af den detaljerede protokol for andre brugere. Dette arbejde blev delvist finansieret af CAMH BreakThrough Challenge, tildelt TP, og af interne midler fra CAMH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel. BD 2546-CABD305145 Needles for Blood collection
BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk BD 367841 EDTA Coated tubes for blood collection
Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding Bed-O-Cobs BEDO1/4 Novel bedding for novelty suppressed feeding
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5424 R For centrifugation of blood.
Corticosterone ELISA Kit Arbor Assays K003-H1W
Digital Camera Panasonic HC-V770 Camera to record EPM/Experimenter interactions
Elevated Plus Maze Home Made n/a Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor
Ethanol Medstore House Brand 39753-P016-EA95 Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning
Ethovision XT 15 Noldus n/a Automated animal tracking software
Laboratory Rodent Diet LabDiet Rodent Diet 5001 Standard Rodent diet
Memory Card Kingstone Technology SDA3/64GB For video recording and file transfer
Novelty Suppressed Feeding Chamber Home Made n/a Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall .
Parlycarbonate tubes Home Made n/a 13 cm in length and 5cm in diameter
Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding Purina n/a Standard Bedding
Spectrophotometer Biotek Epoch Microplate Reader

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936 (2006).
  2. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  3. Martic-Kehl, M., Ametamey, S., Alf, M., Schubiger, P., Honer, M. Impact of inherent variability and experimental parameters on the reliability of small animal PET data. EJNMMI Research. 2 (1), 26 (2012).
  4. Howard, B. R. Control of Variability. ILAR Journal. 43 (4), 194-201 (2002).
  5. Toth, L. A. The influence of the cage environment on rodent physiology and behavior: Implications for reproducibility of pre-clinical rodent research. Experimental Neurology. 270, 72-77 (2015).
  6. Golini, E., et al. A Non-invasive Digital Biomarker for the Detection of Rest Disturbances in the SOD1G93A Mouse Model of ALS. Frontiers in Neuroscience. 14 (896), (2020).
  7. Singh, S., Bermudez-Contreras, E., Nazari, M., Sutherland, R. J., Mohajerani, M. H. Low-cost solution for rodent home-cage behaviour monitoring. PLoS One. 14 (8), 0220751 (2019).
  8. Stewart, K., Schroeder, V. A. Rodent Handling and Restraint Techniques. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
  9. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  10. Gouveia, K., Hurst, J. L. Improving the practicality of using non-aversive handling methods to reduce background stress and anxiety in laboratory mice. Scientific Reports. 9 (1), 20305 (2019).
  11. Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999 (2017).
  12. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  13. Wahlsten, D., et al. Different data from different labs: lessons from studies of gene-environment interaction. Journal of Neurobiology. 54 (1), 283-311 (2003).
  14. Nature Neuroscience. Troublesome variability in mouse studies. Nature Neuroscience. 12 (9), 1075 (2009).
  15. Sensini, F., et al. The impact of handling technique and handling frequency on laboratory mouse welfare is sex-specific. Scientific Reports. 10 (1), 17281 (2020).
  16. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  17. Novak, J., Bailoo, J. D., Melotti, L., Rommen, J., Würbel, H. An Exploration Based Cognitive Bias Test for Mice: Effects of Handling Method and Stereotypic Behaviour. PLoS One. 10 (7), 0130718 (2015).
  18. Gouveia, K., Waters, J., Hurst, J. L. Mouse Handling Tutorial. NC3Rs. , (2016).
  19. Gouveia, K., Hurst, J. L. Reducing Mouse Anxiety during Handling: Effect of Experience with Handling Tunnels. PLoS One. 8 (6), 66401 (2013).
  20. Henderson, L. J., Smulders, T. V., Roughan, J. V. Identifying obstacles preventing the uptake of tunnel handling methods for laboratory mice: An international thematic survey. PLoS One. 15 (4), 0231454 (2020).
  21. Percie Du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLOS Biology. 18 (7), 3000410 (2020).
  22. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
  23. Guilloux, J. P., Seney, M., Edgar, N., Sibille, E. Integrated behavioral z-scoring increases the sensitivity and reliability of behavioral phenotyping in mice: relevance to emotionality and sex. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 21-31 (2011).
  24. LaFollette, M. R., et al. Laboratory Animal Welfare Meets Human Welfare: A Cross-Sectional Study of Professional Quality of Life, Including Compassion Fatigue in Laboratory Animal Personnel. Frontiers in Veterinary Science. 7 (114), (2020).
  25. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  26. Bailoo, J. D., et al. Effects of Cage Enrichment on Behavior, Welfare and Outcome Variability in Female Mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, (2018).
  27. Spangenberg, E. M., Keeling, L. J. Assessing the welfare of laboratory mice in their home environment using animal-based measures - a benchmarking tool. Laboratory Animals. 50 (1), 30-38 (2016).
  28. Theil, J. H., et al. The epidemiology of fighting in group-housed laboratory mice. Scientific Reports. 10 (1), 16649 (2020).
  29. Weber, E. M., Dallaire, J. A., Gaskill, B. N., Pritchett-Corning, K. R., Garner, J. P. Aggression in group-housed laboratory mice: why can't we solve the problem. Lab Animal. 46 (4), 157-161 (2017).
  30. Cloutier, S., Baker, C., Wahl, K., Panksepp, J., Newberry, R. C. Playful handling as social enrichment for individually- and group-housed laboratory rats. Applied Animal Behaviour Science. 143 (2), 85-95 (2013).
  31. Panksepp, J., Burgdorf, J. 50-kHz chirping (laughter?) in response to conditioned and unconditioned tickle-induced reward in rats: effects of social housing and genetic variables. Behavioural Brain Research. 115 (1), 25-38 (2000).

Tags

Funktionsmåde problem 175
Håndteringsteknikker til reduktion af stress hos mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marcotte, M., Bernardo, A., Linga,… More

Marcotte, M., Bernardo, A., Linga, N., Pérez-Romero, C. A., Guillou, J. L., Sibille, E., Prevot, T. D. Handling Techniques to Reduce Stress in Mice. J. Vis. Exp. (175), e62593, doi:10.3791/62593 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter